本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種磁珠法提取唾液核酸的裂解液。

背景技術(shù)：

核酸提取方法包括傳統(tǒng)的酚—氯仿法、鹽析法、濾膜離心柱法等。傳統(tǒng)的核酸提取法各有其優(yōu)缺點，但提取效果欠佳。當(dāng)前主流的核酸提取方法有硅膠膜吸附柱法、抗DNA單克隆抗體的免疫親和法、自動化平臺廣泛應(yīng)用的磁珠法核酸提取方法等等。

磁珠法核酸提取是指以超順磁性氧化硅納米磁性微珠( 以下簡稱磁珠) 為載體，通過磁珠在高離液鹽溶液中吸附核酸而在低鹽溶液中核酸從磁珠表面解吸附的原理進行核酸提取的方法。其中磁珠具有的特點，如良好的表面效應(yīng)和體積效應(yīng)、良好的選擇性磁響應(yīng)性、物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等，使磁珠法核酸提取得到廣泛的應(yīng)用。然而不同的磁珠法核酸提取方法，又因其所選用的裂解液、結(jié)合液、洗滌液等組分和含量的不同而導(dǎo)致最終核酸提取效率差別很大。另一方面，基于待測樣品的多樣性，包括細胞、細菌、血清、血漿、精液、毛發(fā)、唾液、尿液或胸腹水等，不同的待測樣品采用同一種磁珠法核酸提取方法所得的提取效果和提取效率也存在很大差異。

其中唾液屬于較容易獲取的核酸提取待測樣品，其成分與血清、血漿中的成分存在巨大差異，唾液是無色、無味、無嗅的液體，偏酸性，PH值6~7，粘度比水大18~35倍。唾液中含有淀粉酶、溶菌酶、過氧化物酶、粘蛋白、粘多糖、磷脂等物質(zhì)。而粘蛋白、粘多糖是使唾液粘稠主要物質(zhì)，及其與他樣本類型最大的不同。而現(xiàn)有的磁珠法提取方法普遍針對血清、血漿，其直接用于唾液的核酸提取時所得核酸濃度欠佳，限制了磁珠法提取方法在唾液核酸提取中的高效應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種磁珠法提取唾液核酸的裂解液。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種磁珠法提取唾液核酸的裂解液，其由10~150mM的Tris-HCl、1~10M的高離液鹽、0.1~10％的陰離子表面活性劑、1~20％的非離子表面活性劑、0.1~4％的CTAB和1~100mM的螯合劑組成。

作為上述方案的進一步改進，所述裂解液優(yōu)選由50~100mM的Tris-HCl、3~8M的高離液鹽、0.1~5％的陰離子表面活性劑、1~10％的非離子表面活性劑、0.5~2％的CTAB和20~70mM的螯合劑組成。

唾液為粘稠狀液體，其含有較多的粘多糖、粘蛋白及食物殘渣。其中粘多糖是含氮的不均一多糖，是一種具有特定順序的重復(fù)單位的線型分子，亦是構(gòu)成細胞間結(jié)締組織的主要成分，化學(xué)組成為糖醛酸和酪氨基己糖交替出現(xiàn)，有時含硫鍵，也稱為糖胺聚糖。而粘蛋白主要由粘多糖組成，是一種高度糖基化修飾的高分子量蛋白家族，具有復(fù)雜的生物大分子結(jié)構(gòu)，其可以聚集形成凝膠狀，起到組織的潤滑及細胞信號的傳導(dǎo)等多種功能，可以形成化學(xué)屏障。因而唾液中的粘多糖、粘蛋白及食物殘渣均較大程度地影響唾液核酸提取效率，是造成唾液提取核酸效率低，純度低的重要因素。

在本發(fā)明技術(shù)方案中，創(chuàng)造性地添加特定量的CTAB以有效增加粘多糖、粘蛋白等的溶解度，同時通過特定量的陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑的復(fù)配，使粘多糖、粘蛋白及其它蛋白質(zhì)等雜質(zhì)可充分解離、沉降、穩(wěn)定等，且使核酸分子間靜電排斥力降低而易于被醇類沉淀，從而達到去除蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)的目的。

作為上述方案的進一步改進，所述高離液鹽選自異硫氰酸胍、鹽酸胍、硫氰酸鉀、氯化鋰、高氯酸鈉中的其中一種。

作為上述方案的進一步改進，所述陰離子表面活性劑選自SDS、月桂酸鈉、十二烷基苯磺酸中的其中一種。

作為上述方案的進一步改進，所述非離子表面活性劑選自NP-40、吐溫20、Triton-X-100中的其中一種。

具體地，高離液鹽可打開舒展蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，使得核酸蛋白復(fù)合物中的蛋白質(zhì)更易于被表面活性劑解離。而陰離子表面活性劑能中和核酸的負電荷，使核酸分子間靜電排斥力降低，使核酸易于被醇類沉淀及能有效的去除蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)；CTAB能增加粘多糖和粘蛋白等的溶解度，從而達到去除雜質(zhì)的目的，而且CTAB與陰離子表面活性劑有較好的復(fù)配性；非離子表面活性劑具有乳化、擴散、增溶、降阻、穩(wěn)定等作用，其不易受強電解質(zhì)存在的影響，也不易受酸、堿的影響，與其他類型表面活性劑有良好的相容性，其溶解度隨溫度升高而降低，同時具有一定的去蛋白能力。本發(fā)明中裂解液具有陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑和CTAB的復(fù)配體系，能使生物樣本的裂解和雜質(zhì)的解離沉降更充分，進一步提高核酸提取效率和核酸提取純度。進一步地，當(dāng)陰離子表面活性劑選自SDS、月桂酸鈉、十二烷基苯磺酸中的其中一種、非離子表面活性劑選自NP-40、吐溫20、Triton-X-100中的其中一種時，其與CTAB復(fù)配對生物樣本的裂解和雜質(zhì)的沉降解離具有優(yōu)異的效果，特別是對具有粘稠特性的生物樣本，特別是唾液樣本，從而有效提高提取的核酸純度。

作為上述方案的進一步改進，所述螯合劑選自乙二胺四乙酸，氨基三乙酸，檸檬酸鈉中的其中一種。

本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包括如上所述的裂解液、結(jié)合液和蛋白酶K。進一步地，所述結(jié)合液選自乙醇或異丙醇。具體地，裂解液、結(jié)合液和蛋白酶K復(fù)配成混合體系，該混合體系含有 “N”ul的裂解液（50≤“N”≤300）、“0.1N”ul的蛋白酶K和“N”ul的結(jié)合液。其中“N”值的選定可根據(jù)實際操作所需，“N”值過小或過大都不利于生物樣本的核酸提取，本發(fā)明中“N”值取200，其能有利于機械設(shè)備的自動化操作。

本發(fā)明的另一個方面是提供一種如上所述的磁珠法提取唾液核酸的裂解液的應(yīng)用。所述裂解液特別適用于提取唾液樣品中的核酸，其同時也適用于全血、細胞培養(yǎng)物、細菌培養(yǎng)物，拭子、組織等生物樣本的核酸提取。

作為上述方案的進一步改進，所述經(jīng)裂解液提取后的生物樣本的核酸可用于PCR、酶切、分子雜交、文庫構(gòu)建。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明中磁珠法核酸提取的裂解液在充分、有效地裂解細胞的同時可有效去除唾液中粘多糖、粘蛋白、食物殘渣等特殊雜質(zhì)及其他蛋白質(zhì)、脂脂、碳水化合物、鹽等常規(guī)雜質(zhì)，從而使核酸提取效果更好、核酸純度更高，保證后期的檢測更高效，檢測結(jié)果更準確。本發(fā)明的裂解液同時適用于全血、細胞培養(yǎng)物、細菌培養(yǎng)物，拭子、組織等生物樣本的核酸提取。

附圖說明

圖1為實施例1各樣本Real-time PCR檢測（檢測基因RNaseP）的檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行具體描述，以便于所屬技術(shù)領(lǐng)域的人員對本發(fā)明的理解。有必要在此特別指出的是，實施例只是用于對本發(fā)明做進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)熟練人員，根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出的非本質(zhì)性的改進和調(diào)整，應(yīng)仍屬于本發(fā)明的保護范圍。同時下述所提及的原料未詳細說明的，均為市售產(chǎn)品；未詳細提及的工藝步驟或制備方法為均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的工藝步驟或制備方法。

實施例1：以唾液作為生物樣本進行核酸提取及檢測

1、唾液樣本處理：唾液收集管為廣東國盛醫(yī)學(xué)科技股份有限公司的唾液保存管。取12份唾液樣本，不用進行前處理，上下顛倒數(shù)次混合均勻后，直接加到裂解液體系中進行裂解消化。

2、試劑：

a、按原料組分配比配制12份裂解液，如下表所示：

b、磁珠-結(jié)合液：將20ul的磁珠均勻分散于200ul異丙醇中所得的混合液；

c、洗滌液A：由50mM的Tris-HCl、3M的硫氰酸鉀、0.5％的CTAB、2％的PVP和40％的乙醇組成；

d、洗滌液B：70%的乙醇。

3、用上述試劑分別對12份唾液樣本進行磁珠法核酸提取，步驟如下：

分別將200ul的唾液樣本、200ul的與樣本對應(yīng)序號的裂解液、20ul的蛋白酶K分裝到1號核酸提取板中，在溫度為70℃裂解反應(yīng)20min，再加入220ul的磁珠-結(jié)合液，快速混合5min，吸磁3次；將500ul的洗滌液A分裝到2號核酸提取板中；將500ul的洗滌液B分裝到3號核酸提取板中；將50ul的TE溶液分裝到4號核酸提取板中；在磁力作用下，磁棒吸附1號核酸提取板中的磁珠轉(zhuǎn)移至2號核酸提取板中，釋放磁珠，快速混合2min，吸磁3次；后磁棒吸附磁珠轉(zhuǎn)移至3號核酸提取板中，釋放磁珠，快速混合2min，吸磁3次；后磁棒吸附磁珠轉(zhuǎn)移至4號核酸提取板中，釋放磁珠，快速混合2min，吸磁3次，即得提取好的核酸。

4、核酸檢測：

分別對實施例1中12份已提取好的唾液樣本進行核酸濃度檢測，檢測結(jié)果如下表1所示；分別對實施例1各唾液樣本Real-time PCR檢測（檢測人管家基因RNasep）的檢測結(jié)果圖如圖1所示，由圖1數(shù)據(jù)可得出，本發(fā)明的裂解液用于磁珠法核酸提取后的核酸樣本沒有抑制物，PCR效果好。

實施例2：以血液作為生物樣本進行核酸提取及檢測

1、血液樣本處理：血液收集于廣東國盛醫(yī)學(xué)科技股份有限公司的血液保鮮管中。收集10人體血液樣本，上下顛倒混合均勻后，直接加到裂解液體系中進行裂解消化。

2、試劑：

a、裂解液：由100mM的Tris-HCl、5M的氯化鋰、3％的月桂酸鈉、5％的Triton-X-100、1％的CTAB和50mM的氨基三乙酸混合而成；

b、磁珠-結(jié)合液：將10ul的磁珠均勻分散于100ul乙醇中所得的混合液；

c、洗滌液A：由100mM的Tris-HCl、5M的氯化鋰、1％的CTAB、0.2％的PVP和40％的乙醇組成；

d、洗滌液B：70%的乙醇。

3、用上述試劑分別對10份人體血液樣本進行磁珠法核酸提取，步驟如下：

分別將200ul的血液樣本、200ul的裂解液、20ul的蛋白酶K分裝到1號核酸提取板中，在溫度為70℃裂解反應(yīng)20min，再加入220ul的磁珠-結(jié)合液，快速混合5min，吸磁3次；將500ul的洗滌液A分裝到2號核酸提取板中；將500ul的洗滌液B分裝到3號核酸提取板中；將100ul的TE溶液分裝到4號核酸提取板中；在磁力作用下，磁棒吸附1號核酸提取板中的磁珠轉(zhuǎn)移至2號核酸提取板中，釋放磁珠，快速混合2min，吸磁3次；后磁棒吸附磁珠轉(zhuǎn)移至3號核酸提取板中，釋放磁珠，快速混合2min，吸磁3次；后磁棒吸附磁珠轉(zhuǎn)移至4號核酸提取板中，釋放磁珠，快速混合2min，吸磁3次，即得提取好的核酸。

4、核酸檢測：

對上述提取后的10份人體血液樣本進行核酸濃度檢測和通過Rael-time PCR檢測人管家基因RNasep，并與對比例，即采用進口試劑盒invitrogen對所述10份人體血液樣本進行核酸提取的結(jié)果進行比較，檢測結(jié)果如下表2所示。由表2可得本發(fā)明的裂解液的核酸提取效果對比進口試劑盒invitrogen的效果要好。