本發(fā)明具體涉及一種用于高通量測序檢測的NK細胞多基因變異文庫的構建方法及其應用。

背景技術：

自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié)有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生。

結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤(extranodal NK/T cell lymphoma，nasal type；N-NK/T-L)是高發(fā)于亞洲，尤其是中國的一組與EB病毒感染密切相關的淋巴瘤，現(xiàn)認為活化的NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞可能為其正常對應細胞。目前對該病在臨床和組織病理學上已有一些認識，確切診斷需要依據臨床、病理、免疫表型特征和分子基礎進行綜合分析。研究表明NK/T細胞淋巴瘤與PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras基因突變相關，這些基因突變可以作為NK細胞淋巴瘤輔助診斷和用藥參考。因此臨床上迫切需要一種快速、高通量的檢測多基因多位點的方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術缺陷，提供一種用于高通量測序檢測的NK細胞多基因變異文庫的構建方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供基于上述構建方法的試劑盒。

本發(fā)明的具體技術方案如下：

一種用于高通量測序檢測的NK細胞多基因變異文庫的構建方法，覆蓋人類基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras上的基因突變位點，具體包括如下步驟：

(1)針對目的基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras設計一基本擴增引物組，該基本擴增引物組的正向引物和反向引物的5’端設有額外的2～5個T，且該2～5個T的靠近3’端的第一個T具有PNA修飾，同時該第一基本擴增引物組的Tm值相差不超過1℃，具體的，該基本擴增引物組包括KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、KIT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、KIT-5-F、KIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 50所示；

(2)設計一不對稱連接探針組與一不與人類基因組形成互補的通用引物，不對稱連接探針組含有多對不同的不對稱連接探針，每對不對稱連接探針均包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對的互補序列、一與所述通用引物互補配對的擴增序列和一與上述2～5個T相對應的粘性末端識別序列，同時各正向探針和反向探針均具有相應的標簽序列，上述每對不對稱連接探針的正向探針和反向探針的Tm值相差不超過1℃，具體的，所述不對稱連接探針組包括Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR，其序列依次如SEQ ID 51～SEQ ID 82所示，上述BC1～8分別表示八種不同的標簽序列；

(3)將模板、上述基本擴增引物組置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反應體系中進行擴增，純化后得擴增產物；將上述擴增產物、不對稱連接探針組、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合進行PCR，純化后獲得所述用于高通量測序檢測的NK細胞多基因變異文庫；

上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述基本擴增引物組由KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、KIT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、KIT-5-F、KIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R組成。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述不對稱連接探針組由Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR組成。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述通用引物為C-primer，其序列如SEQ ID 83所示。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成，比例0.8～1.2∶0.8～1.2∶0.8～1.2。

進一步優(yōu)選的，所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成，比例1∶1∶1。

一種基于上述構建方法的試劑盒，其特征在于：包括：

一DNA富集反應組件，由所述基本擴增引物組組成；

一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成；

一Barcode1～8反應組件，由所述不對稱連接探針組和通用引物組成，具體包括連在一起的八個反應孔，每個反應孔分別裝有對應的標簽序列的不對稱連接探針和通用引物；

一陽性質控品；

和一陰性質控品。

本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明的構建方法針對多個靶序列進行單管，快速完成文庫的構建，整個文庫構建過程僅需要2～3小時，手動時間僅僅需要15～30分鐘即可，結合高通量測序平臺可以十分有效的解決目前對于臨床上NK細胞淋巴瘤疾病中在少量的臨床樣本基礎上需要對多基因、多靶點檢測這一難點，且成本低廉。

2、本發(fā)明的構建方法所制備的文庫序列可被目前高通量測序系統(tǒng)識別并進行檢測，從而實現(xiàn)文庫構建進行核酸序列的檢測的應用，該核酸檢測可應用于目前多種高通量測序平臺、基因芯片平臺、雜交檢測平臺。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的實施例構建的核酸文庫進行高通量測序總數(shù)據圖。

圖2為本發(fā)明的實施例檢測NK細胞多基因的檢測均一性結果圖。

圖3為本發(fā)明的實施例檢測NK細胞多基因的檢測突變結果。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結合附圖對本發(fā)明的技術方案進行進一步的說明和描述。

下述實施例中的HotStar-Taq酶、T4 DNA連接酶、DNA末端修飾酶、RingCap buffer、MgCl₂和dNTPs均購自中國大連寶生物公司。

實施例1

一種用于高通量測序檢測的NK細胞基因變異文庫的構建方法，覆蓋人類基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras上的基因突變位點。

具體包括如下步驟：

(1)針對目的基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras設計基本擴增引物組，該基本擴增引物組的正向引物和反向引物的5’端設有額外的2～5個T，且該2～5個T的靠近3’端的第一個T具有PNA修飾，同時該第一基本擴增引物組的Tm值相差不超過1℃；所述擴增引物組由KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、KIT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、KIT-5-F、KIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R組成，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 50所示；

(2)設計一不對稱連接探針組與一不與人類基因組形成互補的通用引物，該不對稱連接探針組含有多對不同的不對稱連接探針，每對不對稱連接探針均包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對的互補序列、一與所述通用引物互補配對的擴增序列和一與上述2～5個T相對應的粘性末端識別序列，同時各正向探針和反向探針均具有相應的標簽序列，上述每對不對稱連接探針的正向探針和反向探針的Tm值相差不超過1℃；具體的，所述不對稱連接探針組由Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR組成，其序列依次如SEQ ID 51～SEQ ID82所示；

(3)將模板、上述基本擴增引物組置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反應體系中進行擴增，純化后得擴增產物；將上述擴增產物、不對稱連接探針組、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合進行PCR，純化后獲得所述用于高通量測序檢測的NK細胞多基因變異文庫；

(4)通過Ion torrent PGM高通量測序儀進行文庫上機檢測，獲得目標序列信息，通過VC軟件進行數(shù)據信息比對分析，得到樣本突變狀態(tài)。

上述模板所來自的樣品適用范圍包括非肝素抗凝外周血標本。

使用Qiagen公司石蠟組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取石蠟切片5片。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，經紫外分光光度計檢測提取質量，并確定濃度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)調整DNA濃度到2ng/μl作為PCR擴增的模板。

基于上述構建方法的試劑盒包括：

一富集反應組件，由基本擴增引物組組成，每人份的DNA富集反應組件的配方如下表所示：

一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成，比例0.8～1.2∶0.8～1.2∶0.8～1.2，優(yōu)選比例1∶1∶1；

一Barcode1～8反應組件，由不對稱連接探針組和通用引物組成，具體包括連在一起的八個反應孔，每個反應孔分別裝有對應的標簽序列的不對稱連接探針和通用引物，每人份的Barcode1～8反應組件的配方如下表所示：

一陰性質控品，無核酸水；

和一陽性質控品，由20個陽性突變質粒序列野生型基因組DNA混合而成，濃度為2ng/μL。

將上述試劑盒用前述的構建方法進行實驗，實驗樣本為100份健康的全血樣品。

所述PCR反應體系的模板量(待測樣品、陽性質控品和陰性質控品)為5uL，其余組分如下表所示：

PCR擴增程序設置如下表：

上述PCR反應體系所得的擴增產物的純化具體如下：

取出Agencourt AMPure XP試劑置于室溫，同時要打散磁珠，同時配制新鮮的70％的乙醇(230μL無水乙醇+100μL無核酸酶水)，必須是新鮮配制的。

純化步驟

(1)向上述吸取的上清液25μL中加入30μL(1.2x樣本體積)的Agencourt AMPure XP試劑，上下吸取吹打5次，完全混勻重懸DNA；

(2)室溫孵育5分鐘；

(3)放置在磁力架上面，孵育3分鐘，一直到溶液澄清，小心地吸走并棄掉上清，不要擾動磁珠；注意：磁珠上含有擴增文庫不要丟棄。

(4)加入150μl新鮮配制的70％乙醇，沒過磁珠樣品即可，離心管正反方向移動5次，然后磁力架上孵育2分鐘，去除上清液；

(5)重復上述步驟4，進行第二次洗滌；

(6)確保乙醇液滴已全部從孔中吸走，將板放置于磁力架上，室溫空氣干燥5分鐘，注意不要過度干燥。

(7)將樣品管從磁力架上拿開，在每孔中加入25μL TE(PH8.0)緩沖液充分浸潤磁珠。充分振蕩混勻，快速離心將液體收集到管底。(也可以選擇用槍吸取一半以上的液體上下吹打至少5次來混勻)；注意：上清液含有擴增文庫不要丟棄。

將樣品管置于磁力架上2分鐘。上清液中含有擴增產物。取出20μL上清。

上述純化所得的擴增產物制備文庫產物的PCR反應的模板量為5uL，RingCap-Taq酶(具體由HotStar-Taq酶、T4 DNA連接酶和DNA末端修飾酶1∶1∶1的比例組成，物料濃度：5U/μL/每種)的加入量為0.25μL，其余組分如下表所示：

PCR擴增程序設置如下表：

分別按純化擴增產物方法進行純化，制得所述用于高通量測序檢測的NK細胞多基因變異文庫。

上述文庫產物的檢測具體如下：

如圖1所示，采用Ion torrent PGM半導體測序儀(Thermofisher公司)一次可以檢測16份樣品(包括陰陽性對照)。

前述100份石蠟組織樣品經本發(fā)明的體系檢測，有檢測到多種基因突變類型，進一步證明了該方法的特異性。

如圖2和圖3所示，重復性試驗：每個反應分別加入突變細胞系DNA10ng、1ng和100pg，重復10次進行高通量測序檢測，10次結果一致，符合率100％。

以上可知本發(fā)明NK細胞多基因文庫構建反應就可以同時檢測8個基因突變位點，文庫構建時間僅需3小時，因此本發(fā)明省時省力，準確性高，可滿足突變的快速診斷。而且，高通量測序法和傳統(tǒng)測序方法結果的符合率為100％。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內。