背景技術：
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已有的研究表明，線粒體是生物生命活動中非?；钴S的細胞器，在生長發(fā)育過程中，不僅其形態(tài)會發(fā)生一定的變化，在數量上也會發(fā)生明顯的變化。本質上，在生長發(fā)育的不同階段，生物體必然面臨著細胞的增殖和凋亡過程，而這種細胞的周期性活動，也調節(jié)著細胞內的線粒體活動。目前的研究表明，當生物機體的細胞處于不同狀況下時，其中的線粒體基因組(mtDNA)拷貝數也會發(fā)生變化，并且這種變化的差異很大，一個細胞內的mtDNA拷貝數可以從幾個到數千個不等。這主要取決于細胞對能量代謝的需求不同，正常情況下，耗能高的組織細胞中mtDNA含量較高，反之較低。如在離體培養(yǎng)中，家鼠胚胎纖維母細胞中的mtDNA數量會隨著培養(yǎng)時間的延長而降低；在疾病和老化過程中，細胞中線粒體基因組的拷貝數也會發(fā)生減少。除此之外，很多的研究表明，生物體的生殖細胞發(fā)生、個體發(fā)育等各方面均伴隨著mtDNA拷貝數的變化。在鼠的卵細胞發(fā)育過程中，一個細胞中的mtDNA甚至會逐步累積達到175000個拷貝，而如果mtDNA拷貝數量不足，則會造成卵細胞的不育，可見mtDNA拷貝數在生長發(fā)育過程中具有重要的作用，測定mtDNA拷貝數可以了解生物個體的生長發(fā)育狀況、對疾病進行監(jiān)控和檢測，甚至作為一個新的選育指標為水產生物的遺傳輔助育種提供指導幫助。

然而如何測定mtDNA拷貝數卻是一個難題，其原因在于線粒體細胞器很小，其基因組DNA更小，同時一個細胞內可以有多套線粒體基因組DNA，因此借助于電子顯微鏡或者染色等物理和化學的方法很難實現定量計數。目前，實時定量PCR技術的發(fā)展為解決這一問題提供了思路，如已經利用此技術解決了不同質 量人類精子細胞中mtDNA拷貝數的問題。其中的原理主要是通過在核基因組和線粒體基因組中各尋找一種單拷貝基因，然后通過制備標準曲線，定量分析線粒體基因組拷貝數與核基因組拷貝數的相對比值；由于一個細胞只有一個核基因組，因此這個比值可以認為是一個細胞中所具有的線粒體基因組DNA的平均拷貝數。由于不同生物mtDNA和核基因組中單拷貝基因在種類和DNA序列上存在差異，因此上述線粒體DNA拷貝數檢測方法具有種屬特異性，需要針對不同生物開發(fā)其特有的mtDNA拷貝數檢測方法。目前水產生物中mtDNA拷貝數檢測方法僅在少數魚類中有報道，未見海洋甲殼類中有相關的研究。

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)是一種重要的海洋經濟蝦類，具有繁殖周期短(3-4個月可繁殖1代)、生長速度快(1年內可多茬養(yǎng)殖)和環(huán)境適應性廣(廣溫、廣鹽和廣食)等優(yōu)點，相比于中國對蝦等一年才繁殖一代的大型蝦類而言，可以在短時間內觀察到不同發(fā)育期脊尾白蝦的生長特征，因此以此蝦為生物模型展開遺傳育種和甲殼類基礎遺傳學方面的研究越來越多。作為細胞能量工廠的“線粒體”，其基因組DNA(mtDNA)的多少與生物的生理生化狀況及遺傳特征密切相關，因此如果能發(fā)明其拷貝數的定量檢測方法，就可以追蹤相應的生理活動，也可以研究不同個體或家系的遺傳特征，為新品種的選育提供技術指導。

技術實現要素：
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本發(fā)明描述了一種脊尾白蝦線粒體基因組拷貝數的定量檢測方法，為定量分析脊尾白蝦不同組織細胞中的線粒體基因組拷貝數提供了方法，主要內容為分別選取脊尾白蝦核基因組DNA和線粒體基因組中的一個單拷貝基因，根據單拷貝基因序列設計適于相應基因實時定量PCR反應的引物和Taqman探針；把各基因實時定量PCR引物擴增區(qū)間的序列片段轉入到質粒中，經擴大培養(yǎng)質粒、 提取含有轉入PCR片段的質粒、測量提取后質粒的拷貝數，獲得用于制作熒光實時定量PCR反應中的DNA模板參考標準品；在同一個實時定量PCR反應中，分別以未知樣品和這些標準品為DNA模板進行定量分析，以標準品PCR擴增的Ct值制作標準曲線，與該曲線相比較，就可以計算出未知樣品中核基因組DNA的拷貝數和線粒體基因組DNA的拷貝數；由于脊尾白蝦的基因組是二倍體，因此一個細胞中的線粒體基因組DNA數量就可以通過如下公式獲得：每個細胞中的線粒體基因組拷貝數＝2×線粒體基因組拷貝數/核基因組DNA拷貝數。

本發(fā)明需要對以下實驗條件進行優(yōu)化篩選：

1、單拷貝基因的篩選：脊尾白蝦細胞核基因組單拷貝基因從ANT(腺苷酸轉移酶)和Try(絡氨酸)兩個基因中進行挑選，最終確定ANT基因是最佳候選基因；線粒體單拷貝基因從ATP6，ND1，COII和D-loop中進行挑選，最終確定ATP6基因是最佳候選基因。

2、引物篩選：針對ANT和ATP6基因各設計3對引物，經PCR驗證每個單拷貝基因各確定1對適合實時定量PCR反應的引物對。該引物對為短片段序列，PCR擴增的片段長度在90-130bp之間，這樣的目的是：使標準品的PCR擴增效率和受檢樣品的擴增效率盡可能同步，以便提高檢測的靈敏度和準確性。

3、Taqman探針濃度的優(yōu)化：在熒光實時定量PCR反應中探針的濃度直接影響著實驗結果，共測試了探針的五個濃度梯度0.2ng/μl、0.4ng/μl、0.6ng/μl、0.8ng/μl、1ng/μl，最終確定探針的最適濃度為0.6ng//μl。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明能直接定量脊尾白蝦受檢測樣本組織中每個細胞線粒體基因組的拷貝數，從而實現脊尾白蝦不同個體、組織中線粒體基因組拷貝數的快速檢測；本發(fā)明方法特異性高，操作簡單，只需熒光定量PCR儀就能完成不同個體、組 織中線粒體基因組的快速檢測。

附圖說明：

圖1是由脊尾白蝦細胞核基因組單拷貝ANT基因標準品制作的熒光實時定量PCR反應標準曲線：圖中橫坐標顯示了標準品的稀釋倍數，縱坐標顯示了Ct值，圖中斜線上的點自下至上分別指示了稀釋倍數為10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001時的Ct值；

圖2是由脊尾白蝦線粒體基因組單拷貝ATP6基因標準品制作的熒光實時定量PCR反應標準曲線：圖中橫坐標顯示了標準品的稀釋倍數，縱坐標顯示了Ct值，圖中斜線上的點自下至上分別指示了稀釋倍數為10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001時的Ct值。

具體實施方式：

本發(fā)明可以通過以下幾個操作步驟實現：

1、根據脊尾白蝦核基因組(nDNA)單拷貝基因(這里選擇兩個：腺苷酸轉移酶基因(ANT)和胰蛋白酶基因(trypsin))和線粒體基因組(mtDNA)單拷貝基因(選擇四個：ATP6、ND1、COII和D-loop)序列，設計相應的針對于每個基因片段的PCR擴增引物，片段大小為90-130bp之間。經常規(guī)PCR反應，驗證所設計引物的擴增效果，并對引物擴增DNA片段測序以確定是否為相應基因的目的擴增區(qū)域，根據擴增條帶的清晰度和擴增的特異性，并結合這些單拷貝基因在后續(xù)熒光實時定量PCR反應中定量的穩(wěn)定性特征，最終選擇核基因組上的腺苷酸轉移酶基因(ANT)和線粒體基因組中的ATP6基因作為本發(fā)明中使用的單拷貝基因(一個單拷貝基因的拷貝數代表著其所在基因組DNA的拷貝數)。從以上兩個基因獲得的用于實時定量PCR分析的引物序列為：ANT基因的正向引物(ANT-F)序列為5’-GGGTTGAAAGAGGGAATG-3’，反向引物(ANT-R)序列為：5’-CAAGCATTATATTTTGTACAGAC-3’；ATP6基因的正向引物(ATP6-F)序列為5’-TGCATGGTCCTCTCTCACGCT-3’，反向引物 (ATP6-R)序列為5’-AGTGAGACGAAGACAAGGGTGCC-3’。

2、根據引物特異性擴增區(qū)域的DNA序列，分別設計ANT和ATP6的Taqman探針如下：ANT為5’-CTTACTACAGGGCATGTCGCTCC-3’、ATP6為5’-CCTTTTAGGGCCAGCCAACC-3’；送交公司，分別在探針的5’端標記上FAM(一種熒光集團)、3’端標記上TAMRA(一種熒光淬滅集團)。

3、質粒標準品模板制備：分別利用上述步驟“1”中的ANT基因引物對(ANT-F和ANT-R)和ATP6基因引物對(ATP6-F和ATP6-R)通過常規(guī)PCR方法擴增脊尾白蝦肌肉組織中提取的總DNA(含核基因組DNA和線粒體基因組DNA)，把獲得的PCR擴增產物分別進行低熔點瓊脂糖凝膠電泳純化回收；根據pEASY-T3載體試劑盒說明，把相應的回收片段連接到質粒載體中，再進一步把質粒轉化入E.coli DH5α感受態(tài)細胞，利用藍白斑篩選、鑒定，獲得陽性克隆菌株。挑取含有陽性克隆的單克隆菌落擴大培養(yǎng)，用質粒提取試劑盒抽提重組質粒。利用核酸蛋白測定儀(Nanodrop 2000)測定提取的重組質粒的濃度，稀釋成20ng/μl，進一步利用雙鏈DNA拷貝數計算器(http：//cels.uri.edu/gsc/cndna.html)將質粒質量換算成拷貝數(拷貝數/μl)，此即為分別用于ANT和ATP6基因定量分析的nDNA和mtDNA標準品模板。

4、用于實時定量PCR分析的標準品制備：用無DNAase ddH₂O分別把上述nDNA和mtDNA標準品模板按10倍梯度稀釋成10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷貝(每個梯度終體積為1000μl)。分別以此稀釋后的樣本為DNA模板，在熒光實時定量PCR儀上擴增，便可以制作出相應基因的標準曲線，此處要求標準曲線的相關系數達到0.997-0.999之間，否則需要重新制作標準曲線。

5、未知樣本中線粒體基因組拷貝數的檢測：先把待測未知樣品的DNA濃度均一化為20ng/μl，然后在同一個PCR反應板上，同時執(zhí)行標準品和未知樣品的實時定量PCR反應，具體按如下操作：PCR反應體系總體積為20μl，其中包括10μl Premix Ex Taq^TM(TaKaRa)，0.8μl正、反向引物，0.4μl 2×Rox Reference Dye，2μl模板DNA，1μl Taqman探針(0.6ng/μl)，最后用ddH₂O補足至20μl總體積。每個DNA樣品設置3個重復，每個PCR反應板上同時設置3個 空白對照(不含任何DNA模板)。反應程序為：95℃預變性20s；隨后95℃變性1s，60℃延伸20s，共40個循環(huán)。

6、mtDNA含量計算

根據質粒標準品得到的標準曲線，對未知待測樣品中的mtDNA拷貝數和nDNA拷貝數分別進行定量，由于脊尾白蝦基因組為二倍體，故可以通過下列公示計算出平均每個細胞中mtDNA的拷貝數：mtDNA拷貝數/細胞＝2×ATP6拷貝數/ANT拷貝數。