本發(fā)明涉及一種香蕉冠腐病菌分子檢測引物及其檢測方法，專用于香蕉冠腐病菌的快速分子檢測，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)田間及采后香蕉冠腐病菌的早期診斷和病菌的監(jiān)測鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測和生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

香蕉（Musa AAA Group）為芭蕉科芭蕉屬多年生單子葉草本植物，具有速生和生物量高等特點(diǎn)，栽培品種都是天然單性結(jié)果，一般沒有種子。芭蕉屬植物按果實(shí)食用性可分為三類。第一類是纖維用香蕉，又稱麻蕉，果實(shí)極小，有種子，味澀不可食。第二類是供觀賞的，果實(shí)細(xì)小，其蕉葉婆娑多姿、蕉花奇特美麗，如美人蕉、紅花蕉等。第三類果蔬類香蕉，果實(shí)大，無種子或極個(gè)別敗育種子，果肉香甜味美，可作為果品食用，或配作菜肴。這類香蕉只有香蕉（中國矮蕉、香牙蕉）和甘蕉（芭蕉、大蕉）二個(gè)種。香蕉是世界鮮果貿(mào)易量最大的水果，產(chǎn)量第二位，僅次于柑橘。香蕉也是栽培面積最廣的水果之一。據(jù) FAO 統(tǒng)計(jì)，2005 年香蕉產(chǎn)量達(dá) 10613萬t，其中產(chǎn)量排名前列的國家是:印度、烏干達(dá)、巴西、厄瓜多爾、中國、菲律賓、哥倫比亞、印度尼西亞、盧旺達(dá)和加納。近幾年來，全球香蕉生產(chǎn)量都在穩(wěn)步增長。我國南部是香蕉原產(chǎn)地之一，有 2000 年以上的栽培歷史，現(xiàn)在香蕉已成為我國南亞熱帶地區(qū)的大宗水果，主產(chǎn)地在北緯 22 度附近，主要分布在廣東、廣西、福建、海南、云南等?。▍^(qū)）。此外在四川、貴州等省的南部也少量栽培。

香蕉冠腐病，主要為害香蕉果冠，使香蕉果冠變褐，后期變黑褐色、黑色。病部無明顯界限，發(fā)病后從果冠逐漸向指果的端部延伸。在香蕉切口發(fā)生大量白色絮狀的霉?fàn)钗铩⒚珷钗?，即病原菌的菌絲體和子實(shí)體，造成軸腐。延伸至果柄后，往往指果散落，果皮爆裂。香蕉采收后如用聚乙烯袋包裝，冠腐病發(fā)生頗為嚴(yán)重，運(yùn)輸過程中的機(jī)械傷也是該病的主要誘因之一，可造成70%-100%軸腐率，15%-30%的果腐率，已成為香蕉采后最主要的病害之一。造成香蕉冠腐病的病原菌為鐮刀菌屬中的多個(gè)種，包括為串珠鏈孢（Fusarium moniliforme）、串珠鏈孢亞黏團(tuán)變種（Fusarium moniliforme var. sulglutinans）、雙胞鐮孢（Fusarium dimeum）厚孢鐮孢（Fusarium chlamydosporum）和半裸鐮孢（Fusarium semitectum），其中串珠鏈孢為主要病原菌，半裸鐮孢致病性最強(qiáng)。采后香蕉的帶菌檢測及針對(duì)性的保鮮處理是預(yù)防香蕉冠腐病的最佳措施，因此，建立一種快速、靈敏的檢測方法用于香蕉冠腐病的早期診斷，將為病害的最佳防治時(shí)期提供技術(shù)支撐，有效減少香蕉冠腐病造成的損失。因此迫切需要建立一套方便快捷、結(jié)果可靠、靈敏度高的快速診斷技術(shù)。

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在植物病理學(xué)科不斷發(fā)展和應(yīng)用，一些分子標(biāo)記技術(shù)為植物病原菌的診斷檢測提供了新的途徑，其中PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)以特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷等特點(diǎn)被用于植物病原菌的診斷。真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）序列種內(nèi)的保守性和科屬種間可變性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR，對(duì)病原菌進(jìn)行快速檢測和鑒定的技術(shù)已受到廣泛的應(yīng)用，國內(nèi)外研究人員已成功開發(fā)出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘潰瘍病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方銹病菌等多種病原菌的特異性引物和檢測方法，實(shí)現(xiàn)了快速、靈敏和準(zhǔn)確的鑒定。但目前有關(guān)香蕉冠腐病菌分子檢測的研究尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)香蕉冠腐病菌的檢測和鑒定主要基于病原形態(tài)學(xué)特征，程序繁瑣、耗死長、對(duì)鑒定經(jīng)驗(yàn)要求高、準(zhǔn)確度低，難以滿足香蕉冠腐病診斷的實(shí)際需要問題，提供了一種香蕉冠腐病菌分子檢測引物及其檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明首先提供了一種香蕉冠腐病菌分子檢測引物，其核苷酸序列為：

上游引物FDF：5’-CCCGAGGACCCCTAAACTCT-3’；

下游引物FDR：5’-GCGGGTATTCCTACCTGATCC-3’。

所述引物FDF和FDR對(duì)香蕉冠腐病菌擴(kuò)增出400bp的產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供了一種香蕉冠腐病菌的快速檢測方法，包括以下步驟：

(1)從香蕉果冠或香蕉果柄中提取DNA；

用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時(shí)，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA；用于檢測香蕉果冠、果柄組織是否存在香蕉冠腐病菌時(shí)，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉果冠組織基因組DNA。

(2) 以提取香蕉果冠或香蕉果柄DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定檢測結(jié)果，如果能擴(kuò)增出400bp的產(chǎn)物，則可判定所述的香蕉果冠或香蕉果柄中存在香蕉冠腐病菌，否則所述的香蕉果冠或香蕉果柄中不存在香蕉冠腐病菌。

本發(fā)明的積極有益效果在于：

（1）準(zhǔn)確性高：本發(fā)明是根據(jù)真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種內(nèi)的高度保守性和科屬種間可變性的特點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)香蕉冠腐病菌具有特異擴(kuò)增作用的PCR 引物。已經(jīng)對(duì)不同地理來源的香蕉冠腐病菌、攜帶香蕉冠腐病菌的果冠組織、攜帶香蕉冠腐病菌的果柄和健康的香蕉組織進(jìn)行了檢測驗(yàn)證，只有香蕉冠腐病菌和攜帶該病菌的組織能地?cái)U(kuò)增出一條400 bp 的電泳條帶，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物用于檢測香蕉冠腐病菌準(zhǔn)確可靠；

（2）適用性強(qiáng)：本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對(duì)香蕉冠腐病菌具有很強(qiáng)的適用性，能夠用于區(qū)別香蕉冠腐病菌、香蕉炭疽病菌、焦腐病菌、黑孢冠腐病菌、輪枝菌冠腐病菌及酸腐病菌等香蕉上常見的病原菌，從而能有效區(qū)分發(fā)生在香蕉上癥狀特征相似的病害；

（3）靈敏度高：本發(fā)明將設(shè)計(jì)的特異引物與ITS 基因通用引物（ITS1/ITS4）聯(lián)合起來進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增后，對(duì)香蕉冠腐病菌的檢測靈敏度在DNA 水平上可達(dá)到10fg；

（4）實(shí)用性好：本發(fā)明的香蕉冠腐病菌的檢測方法，不僅能對(duì)病菌菌絲體進(jìn)行檢測，也能對(duì)感病的香蕉組織進(jìn)行檢測，可實(shí)現(xiàn)香蕉冠腐病菌的早期檢測，即在病害顯癥前進(jìn)行檢測，防治病害的爆發(fā)流行。

（5）、操作簡便快速：本發(fā)明只需進(jìn)行DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，一般整個(gè)檢測過程可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，操作簡便快捷。

附圖說明

圖1為本發(fā)明引物對(duì)香蕉冠腐病菌擴(kuò)增電泳圖：其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2、泳道3為香蕉冠腐病菌，泳道4-10分別為：香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)、陰性對(duì)照。

圖2為本發(fā)明引物香蕉冠腐病菌的靈敏性檢測擴(kuò)增電泳圖： A：普通PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-12分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照；B為巢式PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-12分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照。

圖3為本發(fā)明香蕉果冠組織和香蕉果柄中冠腐病菌檢測擴(kuò)增電泳圖，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-10分別為自然發(fā)病的香蕉果冠組織、自然發(fā)病香蕉果柄組織、人工接種發(fā)病的香蕉果冠組織、人工接種發(fā)病初期香蕉果冠組織、健康香蕉果冠組織、健康香蕉果柄組織、健康香蕉果皮組織、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1 分子檢測引物設(shè)計(jì)及香蕉冠腐病菌分子檢測方法的建立

1.香蕉冠腐病菌基因組DNA的提?。?/p>

采用 CTAB 法提取本實(shí)驗(yàn)室保存的7株香蕉冠腐病菌的基因組 DNA，具體步驟如下：

(1)取0.1 g菌絲粉于1.5 mL 離心管中，加入900 μL2%CTAB提取液，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴60min，室溫條件下，12000r/min離心15 min；

(2)取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液（各體積比為25:24:1），溫和搖動(dòng)，室溫條件下，8000 r/min離心10min ；

(3)取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，室溫條件下，8000 r/min離心10min；

(4)取上清液350 μL，加入1/10 體積3 mol/L NaAc 和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀60 min，4℃條件下，8000 r/min離心5 min ；

(5)棄去上清液，加入700μL 體積濃度為70%冰乙醇，輕搖10sec，4℃條件下，8000 r/min離心10sec，晾干，加入50 μL TE緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.香蕉冠腐病菌ITS序列測定：

以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為引物對(duì)提取香蕉冠腐病菌的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；所得PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序。

3.香蕉冠腐病菌特異分子檢測引物的設(shè)計(jì)：

根據(jù)香蕉冠腐病菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種間高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性，用Clustal X軟件將測序得到的7株香蕉冠腐病菌的ITS 序列與GenBank 中串珠鏈孢（Fusarium moniliforme）、串珠鏈孢亞黏團(tuán)變種（Fusarium moniliforme var.sulglutinans）、雙胞鐮孢（Fusarium dimeum）、厚孢鐮孢（Fusarium chlamydosporum）、半裸鐮孢（Fusarium semitectum）、F.roseum、F.graminearum、F.equiseti、F.moniliforme、F.oxysporum、F.solani等鐮刀菌屬多個(gè)種的ITS序列、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）ITS 序列、香蕉焦腐病菌(Botryodiplodia theobromae)ITS 序列、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)ITS 序列、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)ITS 序列、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)ITS 序列、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)ITS 序列進(jìn)行同源性分析和差異位點(diǎn)比較，用Primer Primer5軟件設(shè)計(jì)了對(duì)香蕉冠腐病菌具有擴(kuò)增作用的一對(duì)PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特異分子檢測引物的序列為：

上游引物FDF：5’-CCCGAGGACCCCTAAACTCT-3’；

下游引物FDR：5’-GCGGGTATTCCTACCTGATCC-3’

4.香蕉冠腐病菌快速分子檢測方法的建立：

(1)從香蕉果冠或香蕉果柄中提取DNA:

①用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時(shí)，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA;

②用于檢測香蕉果冠組織是否存在香蕉冠腐病菌時(shí)，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉果冠組織基因組DNA，具體步驟如下：

a.稱取待檢測的植物組織0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30 μL，將組織充分磨碎成糊；

b.將糊狀組織轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，12000r/min 離心6 min，取上清液5 μl；

c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均勻，取1.0 μL 作為PCR 模板進(jìn)行擴(kuò)增；

(2) 以提取香蕉果冠或香蕉果柄DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定檢測結(jié)果，如果能擴(kuò)增出400bp的產(chǎn)物，則可判定所述的香蕉果冠或香蕉果柄中存在香蕉冠腐病菌，否則所述的香蕉果冠或香蕉果柄中不存在香蕉冠腐病菌。

實(shí)施例2 香蕉冠腐病菌擴(kuò)增

1.采用CTAB 法提取2株香蕉冠腐病菌、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)的基因組DNA。

2. 以提取供試菌的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

3.適用性擴(kuò)增結(jié)果

如圖1所示，2株香蕉冠腐病菌可以擴(kuò)增出400bp的條帶，而香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)和陰性對(duì)照均無擴(kuò)增條帶，表明本發(fā)明的分子檢測引物可以將香蕉冠腐病菌與其他病原菌區(qū)分開來，具有很強(qiáng)的適用性。

實(shí)施例3本發(fā)明引物對(duì)香蕉冠腐病菌的靈敏性檢測

1.采用CTAB 法提取香蕉冠腐病菌的基因組DNA；

2.將提取的香蕉冠腐病菌的基因組DNA，經(jīng)分光光度計(jì)測定濃度后，用無菌超純水稀釋，配制成系列濃度，備用；

3. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

4. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增：

（1）第一輪PCR 擴(kuò)增：以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3' 為外引物對(duì)配制的成系列濃度DNA 進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；

（2）第二輪PCR擴(kuò)增：以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以FDF/FDR為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

5.檢測結(jié)果

如圖2所示，以本發(fā)明引物FDF/FDR為引物進(jìn)行常規(guī)PCR時(shí)，在25μL反應(yīng)體系中，10pg的香蕉冠腐病菌DNA可以獲得可視條帶，其檢測靈敏度可達(dá)到10pg（圖A）；而進(jìn)一步以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為外引物擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以本發(fā)明引物FDF/FDR為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增時(shí)，在25μL反應(yīng)體系中，10fg的香蕉冠腐病菌DNA可以獲得可視條帶，其檢測靈敏度可達(dá)到10fg(圖B)。

實(shí)施例4香蕉果冠及香蕉果柄中香蕉冠腐病菌的檢測

1.采用NaOH 快速裂解法提取香蕉果冠組織基因組DNA。

2. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

3. 檢測結(jié)果

如圖3所示，自然發(fā)病的香蕉果冠組織、自然發(fā)病香蕉果柄組織、人工接種發(fā)病的香蕉果冠組織、人工接種發(fā)病初期的香蕉果冠組織、陽性對(duì)照中均可產(chǎn)生400bp左右的可視條帶，而健康香蕉果冠組織、健康香蕉果柄組織、健康香蕉果皮組織、陰性對(duì)照均無任何條帶出現(xiàn)，表明本發(fā)明引物和檢測方法還可用于田間香蕉冠腐病發(fā)病植株的檢測。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 一種香蕉冠腐病菌分子檢測引物及檢測方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccgaggacc cctaaactct 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgggtattc ctacctgatc c 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccgtaggga acctgcgg 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20