本發(fā)明具體涉及一種用于高通量測序檢測化療藥物基因SNP變異文庫的構(gòu)建方法及其應用。

背景技術(shù)：

藥物體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)運及藥物作用靶點基因的遺傳變異及其表達水平的變化可通過影響藥物的體內(nèi)濃度和敏感性，導致藥物反應性個體差異。近年來隨著人類基因組學的發(fā)展，化療藥物學領(lǐng)域得到了迅猛發(fā)展，越來越多的化療藥物生物標記物及其檢測方法相繼涌現(xiàn)?；熕幬飳W已成為指導臨床個體化用藥、評估嚴重藥物不良反應發(fā)生風險、指導新藥研發(fā)和評價新藥的重要工具，部分上市的新藥僅限于特定基因型的適應癥患者。美國FDA已批準在140余種藥物的藥品標簽中增加化療藥物信息，涉及的化療藥物生物標記物42個。此外，部分行業(yè)指南也將部分非FDA批準的生物標記物及其特性(如MGMT基因甲基化)的檢測列入疾病的治療指南。藥物反應相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物的分子檢測是實施個體化藥物治療的前提。

藥理學與遺傳學結(jié)合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括藥物代謝動力學(pharmacokinetics，PK)和藥物效應動力學(pharmacodynamics，PD)兩方面。藥物代謝動力學主要是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，側(cè)重于闡明藥物的體內(nèi)過程；藥物效應動力學主要研究藥物對機體的作用、作用規(guī)律及作用機制，其內(nèi)容包括藥物與作用靶位之間相互作用所引起的生化、生理學和形態(tài)學變化，側(cè)重于解釋藥物如何與作用靶點發(fā)生作用。對藥物代謝酶和藥物靶點基因進行檢測可指導臨床針對特定的患者選擇合適的藥物和給藥劑量，實現(xiàn)個體化用藥，從而提高藥物治療的有效性和安全性，防止嚴重藥物不良反應的發(fā)生。

根據(jù)化療藥物生物標志物檢測指導個體化用藥主要包括兩種類型：一是根據(jù)個體的遺傳信息調(diào)整用藥劑量，以增加藥物療效，減少藥物不良反應的發(fā)生；二是根據(jù)個體的遺傳信息確定用藥的種類，避免應用針對特定基因型個體無效或可能產(chǎn)生嚴重藥物不良反應的藥物。藥物劑量的調(diào)整往往需根據(jù)隨機對照臨床研究的結(jié)果；對目前缺乏隨機對照臨床研究的遺傳變異，可依據(jù)基因型對藥物藥代動力學曲線下面積影響的大小估算用藥劑量；當一個藥物的反應性受多個基因或基因與環(huán)境因素間相互作用影響時，可根據(jù)國內(nèi)國際大規(guī)模臨床試驗推導出的、納入了個體基因型及其他因素的用藥劑量計算公式確定用藥劑量。常見藥物代謝酶和藥物作用靶點基因遺傳變異檢測結(jié)果對臨床用藥的指導建議。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種用于高通量測序檢測化療藥物基因SNP變異文庫的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供基于上述構(gòu)建方法的試劑盒。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種用于高通量測序檢測的化療藥物基因SNP變異文庫的構(gòu)建方法，具體包括如下步驟：

(1)針對目的基因DPYD、UGT1A1、MTHFR、ERCC1、UMPS、CDA、DYNC2H1、DHFR、GGH、GSTP1、CYP2B6、SLC22A16、TP53、XRCC1、C8orf34、ABCC4、MTR、CBR3、CYP2D6、ABCB1、ABCC2、SOD2、XPC、SLC19A1、FOLR3和FCGR3A上的總共33種遺傳性SNP位點設(shè)計一基本擴增引物組，該基本擴增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2～5個T，且該2～5個T的靠近3’端的第一個T具有PNA修飾，同時該第一基本擴增引物組的Tm值相差不超過1℃，具體的，所述基本擴增引物組包括GST-1-F、GST-1-R、FCG-1-F、FCG-1-R、DHF-1-F、DHF-1-R、DPY-1-F、DPY-1-R、XRC-1-F、XRC-1-R、XPC-1-F、XPC-1-R、TP53-1-F、TP53-1-R、MTH-1-F、MTH-1-R、MTR-1-F、MTR-1-R、SOD-1-F、SOD-1-R、CY2D6-1-F、CY2D6-1-R、SLC19-1-F、SLC19-1-R、ABB1-1-F、ABB1-1-R、ERC-1-F、ERC-1-R、CY2B6-1-F、CY2B6-1-R、CDA-1-F、CDA-1-R、DPY-2-F、DPY-2-R、CBR-1-F、CBR-1-R、ABC-1-F、ABC-1-R、DPY-3-F、DPY-3-R、DPY-4-F、DPY-4-R、UMP-1-F、UMP-1-R、ERC-2-F、ERC-2-R、CDA-2-F、CDA-2-R、DYN-1-F、DYN-1-R、C8O-1-F、C8O-1-R、SLC22-1-F、SLC22-1-R、ABC4-1-F、ABC4-1-R、MTH-2-F、MTH-2-R、DHF-2-F、DHF-2-R、GGH-1-F、GGH-1-R、FOL-1-F、FOL-1-R、UGT-1-F和UGT-1-R，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 66所示；

(2)設(shè)計一不對稱連接探針組與一不與人類基因組形成互補的通用引物，不對稱連接探針組含有多對不同的不對稱連接探針，每對不對稱連接探針均包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對的互補序列、一與所述通用引物互補配對的擴增序列和一與上述2～5個T相對應的粘性末端識別序列，同時各正向探針和反向探針均具有相應的標簽序列，上述每對不對稱連接探針的正向探針和反向探針的Tm值相差不超過1℃，具體的，所述不對稱連接探針組包括Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR，其序列依次如SEQ ID 67～SEQ ID 98所示，上述BC1～8分別表示八種不同的標簽序列；

(3)將模板、上述基本擴增引物組置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反應體系中進行擴增，純化后得擴增產(chǎn)物；將上述擴增產(chǎn)物、不對稱連接探針組、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合進行PCR，純化后獲得所述用于高通量測序檢測的化療藥物基因SNP變異文庫；

上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述基本擴增引物組由GST-1-F、GST-1-R、FCG-1-F、FCG-1-R、DHF-1-F、DHF-1-R、DPY-1-F、DPY-1-R、XRC-1-F、XRC-1-R、XPC-1-F、XPC-1-R、TP53-1-F、TP53-1-R、MTH-1-F、MTH-1-R、MTR-1-F、MTR-1-R、SOD-1-F、SOD-1-R、CY2D6-1-F、CY2D6-1-R、SLC19-1-F、SLC19-1-R、ABB1-1-F、ABB1-1-R、ERC-1-F、ERC-1-R、CY2B6-1-F、CY2B6-1-R、CDA-1-F、CDA-1-R、DPY-2-F、DPY-2-R、CBR-1-F、CBR-1-R、ABC-1-F、ABC-1-R、DPY-3-F、DPY-3-R、DPY-4-F、DPY-4-R、UMP-1-F、UMP-1-R、ERC-2-F、ERC-2-R、CDA-2-F、CDA-2-R、DYN-1-F、DYN-1-R、C8O-1-F、C8O-1-R、SLC22-1-F、SLC22-1-R、ABC4-1-F、ABC4-1-R、MTH-2-F、MTH-2-R、DHF-2-F、DHF-2-R、GGH-1-F、GGH-1-R、FOL-1-F、FOL-1-R、UGT-1-F和UGT-1-R組成。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述不對稱連接探針組由Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR組成。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述通用引物為C-primer，其序列如SEQ ID 99所示。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成，比例0.8～1.2∶0.8～1.2∶0.8～1.2。

進一步優(yōu)選的，所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成，比例1∶1∶1。。

一種基于上述構(gòu)建方法的試劑盒，包括：

一DNA富集反應組件，由所述基本擴增引物組組成；

一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成；

一Barcode1～8反應組件，由所述不對稱連接探針組和通用引物組成，具體包括連在一起的八個反應孔，每個反應孔分別裝有對應的標簽序列的不對稱連接探針和通用引物；

一陽性質(zhì)控品；

和一陰性質(zhì)控品。

本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明的構(gòu)建方法針對多個靶序列進行單管，快速完成文庫的構(gòu)建，整個文庫構(gòu)建過程僅需要2～3小時，手動時間僅僅需要15～30分鐘即可，結(jié)合高通量測序平臺可以十分有效的解決目前對于臨床上多種腫瘤疾病中在少量的臨床樣本基礎(chǔ)上需要對多基因、多靶點檢測這一難點，且成本低廉。

2、本發(fā)明的構(gòu)建方法所制備的文庫序列可被目前高通量測序系統(tǒng)識別并進行檢測，從而實現(xiàn)文庫構(gòu)建進行核酸序列的檢測的應用，該核酸檢測可應用于目前多種高通量測序平臺、基因芯片平臺、雜交檢測平臺。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的實施例構(gòu)建的核酸文庫進行高通量測序總數(shù)據(jù)圖。

圖2為本發(fā)明的實施例檢測化療藥物基因SNP的檢測均一性結(jié)果圖。

圖3為本發(fā)明的實施例檢測化療藥物基因SNP的檢測突變結(jié)果。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步的說明和描述。

下述實施例中的HotStar-Taq酶、T4DNA連接酶、DNA末端修飾酶、RingCap buffer、MgCl₂和dNTPs均購自中國大連寶生物公司。

實施例1

一種用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫的構(gòu)建方法，覆蓋人類基因DPYD、UGT1A1、MTHFR、ERCC1、UMPS、CDA、DYNC2H1、DHFR、GGH、GSTP1、CYP2B6、SLC22A16、TP53、XRCC1、C8orf34、ABCC4、MTR、CBR3、CYP2D6、ABCB1、ABCC2、SOD2、XPC、SLC19A1、FOLR3和FCGR3A上的總共33種SNP位點，該33種體細胞突變的信息如下表：

具體包括如下步驟：

(1)針對目的基因DPYD、UGT1A1、MTHFR、ERCC1、UMPS、CDA、DYNC2H1、DHFR、GGH、GSTP1、CYP2B6、SLC22A16、TP53、XRCC1、C8orf34、ABCC4、MTR、CBR3、CYP2D6、ABCB1、ABCC2、SOD2、XPC、SLC19A1、FOLR3和FCGR3A上的總共33種遺傳性SNP位點設(shè)計一基本擴增引物組，該基本擴增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2～5個T，且該2～5個T的靠近3’端的第一個T具有PNA修飾，同時該第一基本擴增引物組的Tm值相差不超過1℃；所述擴增引物組由GST-1-F、GST-1-R、FCG-1-F、FCG-1-R、DHF-1-F、DHF-1-R、DPY-1-F、DPY-1-R、XRC-1-F、XRC-1-R、XPC-1-F、XPC-1-R、TP53-1-F、TP53-1-R、MTH-1-F、MTH-1-R、MTR-1-F、MTR-1-R、SOD-1-F、SOD-1-R、CY2D6-1-F、CY2D6-1-R、SLC19-1-F、SLC19-1-R、ABB1-1-F、ABB1-1-R、ERC-1-F、ERC-1-R、CY2B6-1-F、CY2B6-1-R、CDA-1-F、CDA-1-R、DPY-2-F、DPY-2-R、CBR-1-F、CBR-1-R、ABC-1-F、ABC-1-R、DPY-3-F、DPY-3-R、DPY-4-F、DPY-4-R、UMP-1-F、UMP-1-R、ERC-2-F、ERC-2-R、CDA-2-F、CDA-2-R、DYN-1-F、DYN-1-R、C8O-1-F、C8O-1-R、SLC22-1-F、SLC22-1-R、ABC4-1-F、ABC4-1-R、MTH-2-F、MTH-2-R、DHF-2-F、DHF-2-R、GGH-1-F、GGH-1-R、FOL-1-F、FOL-1-R、UGT-1-F和UGT-1-R組成，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 66所示；

(2)設(shè)計一不對稱連接探針組與一不與人類基因組形成互補的通用引物，該不對稱連接探針組含有多對不同的不對稱連接探針，每對不對稱連接探針均包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對的互補序列、一與所述通用引物互補配對的擴增序列和一與上述2～5個T相對應的粘性末端識別序列，同時各正向探針和反向探針均具有相應的標簽序列，上述每對不對稱連接探針的正向探針和反向探針的Tm值相差不超過1℃；具體的，所述第一不對稱連接探針組由Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR組成，其序列依次如SEQ ID 67～SEQ ID98所示，上述BC1～8分別表示八種不同的標簽序列；所述通用引物為C-primer，其序列如SEQ D 99所示；

(3)將模板、上述基本擴增引物組置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反應體系中進行擴增，純化后得擴增產(chǎn)物；將上述擴增產(chǎn)物、不對稱連接探針組、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合進行PCR，純化后獲得所述用于高通量測序檢測的化療藥物基因SNP變異文庫；

(4)通過Ion torrent PGM高通量測序儀進行文庫上機檢測，獲得目標序列信息，通過VC軟件進行數(shù)據(jù)信息比對分析，得到樣本突變狀態(tài)。

上述模板所來自的樣品適用范圍包括非肝素抗凝外周血標本。

使用Qiagen公司血液DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取全血200μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，經(jīng)紫外分光光度計檢測提取質(zhì)量，并確定濃度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)調(diào)整DNA濃度到2ng/μl作為PCR擴增的模板。

基于上述構(gòu)建方法的試劑盒包括：

一DNA富集反應組件，由基本擴增引物組組成，每人份的DNA富集反應組件的配方如下表所示：

一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成，比例0.8～1.2∶0.8～1.2∶0.8～1.2，優(yōu)選比例1∶1∶1；

一Barcode1～8反應組件，由不對稱連接探針組和通用引物組成，具體包括連在一起的八個反應孔，每個反應孔分別裝有對應的標簽序列的不對稱連接探針和通用引物，每人份的Barcode1～8反應組件的配方如下表所示：

一陰性質(zhì)控品，無核酸水；

和一陽性質(zhì)控品，由20個陽性突變質(zhì)粒序列野生型基因組DNA混合而成，濃度為2ng/μL。

將上述試劑盒用前述的構(gòu)建方法進行實驗，實驗樣本為100份健康的全血樣品。

所述PCR反應體系的模板量(待測樣品、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品)為5uL，其余組分如下表所示：

PCR擴增程序設(shè)置如下表：

上述PCR反應體系所得的擴增產(chǎn)物的純化具體如下：

取出Agencourt AMPure XP試劑置于室溫，同時要打散磁珠，同時配制新鮮的70％的乙醇(230μL無水乙醇+100μL無核酸酶水)，必須是新鮮配制的。

純化步驟

(1)向上述吸取的上清液25μL中加入30μL(1.2x樣本體積)的Agencourt AMPure XP試劑，上下吸取吹打5次，完全混勻重懸DNA；

(2)室溫孵育5分鐘；

(3)放置在磁力架上面，孵育3分鐘，一直到溶液澄清，小心地吸走并棄掉上清，不要擾動磁珠；注意：磁珠上含有擴增文庫不要丟棄。

(4)加入150μl新鮮配制的70％乙醇，沒過磁珠樣品即可，離心管正反方向移動5次，然后磁力架上孵育2分鐘，去除上清液；

(5)重復上述步驟4，進行第二次洗滌；

(6)確保乙醇液滴已全部從孔中吸走，將板放置于磁力架上，室溫空氣干燥5分鐘，注意不要過度干燥。

(7)將樣品管從磁力架上拿開，在每孔中加入25μL TE(PH8.0)緩沖液充分浸潤磁珠。充分振蕩混勻，快速離心將液體收集到管底。(也可以選擇用槍吸取一半以上的液體上下吹打至少5次來混勻)；注意：上清液含有擴增文庫不要丟棄。

將樣品管置于磁力架上2分鐘。上清液中含有擴增產(chǎn)物。取出20μL上清。

上述純化所得的擴增產(chǎn)物制備文庫產(chǎn)物的PCR反應的模板量為5uL，RingCap-Taq酶(具體由HotStar-Taq酶、T4DNA連接酶和DNA末端修飾酶1∶1∶1的比例組成，物料濃度：5U/μL/每種)的加入量為0.25μL，其余組分如下表所示其余組分如下表所示：

PCR擴增程序設(shè)置如下表：

分別按純化擴增產(chǎn)物方法進行純化，制得所述用于高通量測序檢測的化療藥物基因SNP變異文庫。

上述變異文庫的檢測具體如下：

如圖1所示，采用Ion torrent PGM半導體測序儀(Thermofisher公司)一次可以檢測32份樣品(包括陰陽性對照)。

前述100份全血樣品經(jīng)本發(fā)明的體系檢測，有檢測到多種SNP類型，進一步證明了該方法的特異性。

如圖2和圖3所示，重復性試驗：每個反應分別加入突變細胞系DNA10ng、1ng和100pg，重復10次進行高通量測序檢測，10次結(jié)果一致，符合率100％。

以上可知本發(fā)明化療藥物多基因文庫構(gòu)建反應就可以同時檢測26個基因33個SNP位點，文庫構(gòu)建時間僅需3小時，因此本發(fā)明省時省力，準確性高，可滿足突變的快速診斷。而且，高通量測序法和傳統(tǒng)測序方法結(jié)果的符合率為100％。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。