本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速無創(chuàng)檢測(cè)呼吸道以及空氣病原微生物的方法,主要利用快速升降溫模塊實(shí)現(xiàn)空氣或呼吸道樣品中致病菌的DNA釋放提取,然后通過恒溫?cái)U(kuò)增的方法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)病原體快速檢測(cè)。
背景技術(shù)：
通過空氣傳播的疾病成為人類的一大隱形殺手，呼吸系統(tǒng)感染每年造成幾百萬人的死亡，但其感染原因不明朗，且臨床上缺乏快速診斷技術(shù)，無法保證患者得到及時(shí)有效的治療。而通過呼吸暴露，機(jī)會(huì)致病菌可能乘虛而入，改變?nèi)梭w呼吸道存在的多種共生益生菌的含量，破壞呼吸道細(xì)菌微生態(tài)結(jié)構(gòu)，引發(fā)更多的呼吸系統(tǒng)感染。研究表明，細(xì)菌感染和病毒感染都可能導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)感染，兩者還存在并發(fā)感染；同時(shí)，真菌的定植又會(huì)加重呼吸道炎癥與過敏反應(yīng)。因此，吸道感染致病原復(fù)雜，感染的準(zhǔn)確分型難以實(shí)現(xiàn)。醫(yī)生大多根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)利用血常規(guī)檢測(cè)得到的白細(xì)胞水平和臨床癥狀如頭痛、咳嗽、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀對(duì)感染類型進(jìn)行判別，然而這種診斷方法缺乏充足的科學(xué)依據(jù)，無法使患者得到準(zhǔn)確及時(shí)的診療。而且，僅僅根據(jù)白細(xì)胞水平的增高將患者確診為細(xì)菌性感染會(huì)導(dǎo)致抗生素的濫用，進(jìn)而不僅造成經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)造成微生物抗藥性增強(qiáng)，同時(shí)也會(huì)抑制其他益生菌，導(dǎo)致人體更容易感染其它疾病。
臨床上常用的致病原檢測(cè)方法有膠體金法，可快速檢測(cè)甲、乙型流感，30分鐘內(nèi)可檢測(cè)病毒是否陽性，耗時(shí)短，但是假陽性和假陰性率高，在臨床上的實(shí)用價(jià)值低。此外，在特殊情況下，實(shí)驗(yàn)室還采用RT-qPCR以及基于PCR技術(shù)的高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)致病菌，或直接檢測(cè)細(xì)胞因子和血清降鈣素原來標(biāo)志細(xì)菌感染和病毒感染，但這幾種方法都存在耗時(shí)長、成本高等問題，難以在臨床上得以應(yīng)用。
綜上，針對(duì)臨床呼吸系統(tǒng)感染的病人，其致病菌的快速檢測(cè)顯得尤為重要，在發(fā)生大規(guī)模傳染病時(shí)，現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求也頗為迫切。近年來，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LMAP)日益被用于細(xì)菌、病毒的檢測(cè)。本發(fā)明主要結(jié)合樣本采集、LAMP以及樣品細(xì)菌DNA的快速提取，針對(duì)空氣以及呼吸道樣品中的致病菌進(jìn)行快速檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種現(xiàn)場(chǎng)快速無創(chuàng)檢測(cè)空氣以及呼吸道病原微生物的方法，該方法可用于公共場(chǎng)所空氣以及臨床呼吸系統(tǒng)感染的病人的致病菌的快速檢測(cè)，直接采集空氣或者病人的咽拭子和呼出氣樣本，使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，快速得到常見致病菌的種類，為臨床呼吸系統(tǒng)感染治療提供依據(jù)以及評(píng)估空氣的生物安全。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)空氣或呼吸道病原微生物的方法，包括以下步驟：
1)采集空氣樣本或者待檢者的咽拭子樣本或呼出氣樣本；
2)利用快速反復(fù)升降溫的方法提取樣本的DNA；
3)使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法對(duì)樣本DNA進(jìn)行檢測(cè)，得到致病菌種類信息。
上述步驟1)中，采集待檢者的咽拭子樣本可以使用通用的細(xì)菌采樣管；采集待檢者的呼出氣樣本可以使用呼出氣采樣盒，例如發(fā)明名稱為“一種呼出氣采樣盒和采樣方法”的中國專利ZL.201110020115.3公開的呼出氣采樣盒，在3-5min內(nèi)采集上呼吸道感染病人的呼出氣樣本；
上述步驟1)中，采集空氣樣本可以使用市售的空氣采樣器，例如安德森(Andersen)采樣器，在傳統(tǒng)瓊脂培養(yǎng)基上盛放有一定量無菌水，在一定的采集流量下收集空氣一段時(shí)間，獲得所需空氣樣品。
上述步驟2)中，反復(fù)升降溫的具體參數(shù)可以是：90～99℃3min，20～25℃2min，重復(fù)兩次或三次。
上述步驟3)可以根據(jù)具體情況和常見致病菌，設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明的方法在樣本的采集方面，無論是對(duì)于無創(chuàng)的咽拭子或呼出氣樣本，還是對(duì)于空氣樣品，都非常簡(jiǎn)便易得；反復(fù)升降溫法提取樣本DNA與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)的結(jié)合，大大縮短了樣本的處理和檢測(cè)時(shí)間，1小時(shí)內(nèi)可得到檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了空氣以及呼吸道樣品中致病菌的快速檢測(cè)，能夠方便快捷地為評(píng)估空氣的生物安全性和臨床呼吸系統(tǒng)感染治療提供依據(jù)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1：對(duì)發(fā)熱門診呼吸道感染病人的致病菌檢測(cè)
1)使用生物通用細(xì)菌采樣管，采集上呼吸道感染病人的咽拭子樣本，將采樣拭子放入轉(zhuǎn)存液后震蕩15min，取50μL樣本待測(cè)；
2)使用呼出氣采樣盒采集呼出氣樣本，采集并收集至1.5mL離心管中，取50μL待測(cè)；
3)利用升降溫方法，提取上述咽拭子和呼出氣樣本的DNA，具體反應(yīng)參數(shù)為：99℃3min，20℃2min，重復(fù)兩次；
4)對(duì)于提取完成的樣本，使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)的方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)流感嗜血桿菌。反應(yīng)體系為25μL，包含2μL DNA模板，1.6μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.8μM的LF和LB，8U Bst酶，以及12.5μL的2×RM，使用ddH2O補(bǔ)齊體積。將混合體系至于濁度儀(LA-500，Kyoto,Japan)中，64℃反應(yīng)60min，最后80℃加熱滅活處理2min。
5)共計(jì)檢測(cè)咽拭子和呼出氣樣本46份，平均每個(gè)樣本前處理與檢測(cè)時(shí)間在60-90min之內(nèi)。流感嗜血桿菌陽性率為45.7％(21/46)，其中咽拭子樣本陽性率為59.3％(16/27)。表明該檢測(cè)方法體系可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的快速檢測(cè)。
實(shí)施例2：對(duì)實(shí)驗(yàn)室空氣中致病菌的檢測(cè)
1)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，使用Andersen采樣器，在傳統(tǒng)瓊脂培養(yǎng)基上盛放有2mL無菌水，在采集流量為28.3L/min的情況下收集環(huán)境空氣10分鐘；
2)將上述2mL的水倒入試管中，獲得所需空氣樣品；
3)將上述空氣樣品離心濃縮至1mL；
4)取50μL上述空氣樣本，進(jìn)行升降溫反應(yīng)，具體反應(yīng)參數(shù)為：99℃3min，20℃2min，重復(fù)兩次；
5)對(duì)提取的樣本，使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)的方法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL，包含2μL DNA模板，1.6μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.8μM的LF和LB，8U Bst酶，以及12.5μL的2×RM，使用ddH2O補(bǔ)齊體積。將混合體系至于濁度儀(LA-500，Kyoto,Japan)中，64℃反應(yīng)60min，最后80℃加熱滅活處理2min。
共計(jì)檢測(cè)空氣樣本10例，流感嗜血桿菌和銅綠假單胞菌均呈現(xiàn)陰性，反應(yīng)體系陽性對(duì)照正常。