本發(fā)明涉及腫瘤基因領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)宮頸癌的引物組及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是是全世界第三大常見(jiàn)惡性腫瘤，在女性常見(jiàn)腫瘤中，宮頸癌發(fā)病率位居第二位，僅次于乳腺癌。每年宮頸癌新發(fā)病例數(shù)約為50萬(wàn)。現(xiàn)已明確，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是宮頸癌主要的致病原因。其中HPV16，HPV18是最常見(jiàn)的亞型，在所有陽(yáng)性的宮頸癌標(biāo)本中二者共占98％。研究發(fā)現(xiàn)，病人的診斷年齡、疾病程度以及分型都影響了宮頸癌的治療效果。宮頸癌具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，可在不經(jīng)治療的情況下自行消退，也可表現(xiàn)極具侵襲的惡性表型，對(duì)多種治療手段沒(méi)有反應(yīng)而迅速惡化，因此對(duì)宮頸癌的早期診斷十分必要。目前宮頸癌的診斷方法包括影像學(xué)檢查，細(xì)胞病理學(xué)和組織病理學(xué)診斷，影像學(xué)檢查包括X射線、CT掃描、核磁共振檢查等，但是其效率較低并且檢測(cè)準(zhǔn)確度不高。通常的細(xì)胞和組織病理學(xué)檢測(cè)包括細(xì)胞活檢，如巴氏涂片細(xì)胞學(xué)技術(shù)在過(guò)去的五十年里已廣泛地應(yīng)用于宮頸癌篩查，然而該方法需要通過(guò)外科手術(shù)或者穿刺的方法從患者上獲取組織的檢材，不但不方便，而且會(huì)對(duì)患者造成人體傷害。近來(lái)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CirculatingTumorCells，CTCs)檢測(cè)的出現(xiàn)給患者的檢測(cè)帶來(lái)了新的希望。CTCs是從腫瘤病灶脫離并移位至血液中的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要因素。與其他組織學(xué)標(biāo)本如骨髓等相比，外周血標(biāo)本容易獲取，且對(duì)患者創(chuàng)傷小，是臨床上常規(guī)檢測(cè)較為理想的標(biāo)本來(lái)源。CTCs檢測(cè)有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評(píng)估抗腫瘤藥物的療效及制定個(gè)體化治療方案。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，CTCs檢測(cè)可更加敏感地發(fā)現(xiàn)疾病的變化，且對(duì)患者沒(méi)有副作用。CTC的檢測(cè)通常通過(guò)抽取一定體積的血液進(jìn)行。檢測(cè)分為兩類，包括不捕獲(富集)直接檢測(cè)和先捕獲(富集)后檢測(cè)，其中后者為主流的檢測(cè)方法。先捕獲(富集)后檢測(cè)的方法也分為兩類，即正選和負(fù)選。正選主要是通過(guò)CTC表面標(biāo)志物或細(xì)胞的物理性質(zhì)(大小、密度)進(jìn)行捕獲；前者是基于免疫磁球技術(shù)和微流控芯片技術(shù)，后者是基于過(guò)濾、離心的原理。負(fù)選則是通過(guò)白細(xì)胞表面標(biāo)志物間接捕獲CTC。然而基于先捕獲(富集)后檢測(cè)的方法有著明顯的缺陷。它嚴(yán)重依賴于腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，因此無(wú)法捕獲未表達(dá)表面腫瘤標(biāo)記物的CTC細(xì)胞。采用RT-PCR的方法檢測(cè)CTC細(xì)胞的特異性基因是CTC細(xì)胞檢測(cè)的另外一種方式。首先抽取一定體積的血液，通過(guò)密度梯度離心的方式富集CTCs，然后通過(guò)RT-PCR的方式檢測(cè)特定基因的mRNA，以此判斷CTCs是否存在，并通過(guò)檢測(cè)CT值的變化給CTCs定量。這種方法檢測(cè)CTCs費(fèi)用低，敏感度高，而且容易自動(dòng)化。目前采用RT-PCR方法檢測(cè)卵巢癌CTCs的標(biāo)準(zhǔn)還沒(méi)有完全建立。我們通過(guò)檢測(cè)宮頸癌患者的CTCs特征基因，確定宮頸癌CTCs的檢測(cè)方法和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。這些檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立有助于腫瘤患者的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評(píng)估抗腫瘤藥物，包括NK和CAR-T免疫治療的療效及制定個(gè)體化治療方案。針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明開(kāi)發(fā)一種高靈敏的多基因聯(lián)合檢測(cè)方法，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)EPCAM、CK19、CK20、MUC1、EGFR、CEA、C-Met、HPV16、HPV18九個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)腫瘤的早期檢測(cè)。本發(fā)明設(shè)計(jì)和運(yùn)用靶特異性引物組，大幅度提高檢測(cè)的靈敏度。該檢測(cè)方法的檢出率可達(dá)到95％，同時(shí)具備了靈敏度高，特異性好，快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測(cè)宮頸癌的引物組及檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種用于檢測(cè)宮頸癌的引物組，包含：本發(fā)明的引物組可通過(guò)以下兩種方法實(shí)現(xiàn)宮頸癌的檢測(cè)。方法1：PCR方法。(1)將權(quán)利要求1所述的9對(duì)引物分別加入到單個(gè)PCR反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的條件為94攝氏度、30s；55攝氏度、30s；72攝氏度、10s；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測(cè)。方法2：熒光定量PCR方法(1)將權(quán)利要求1所述的9對(duì)引物分別加入到單個(gè)PCR反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；分別加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的條件為95攝氏度、10s和60攝氏度、30s；40個(gè)循環(huán)；每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，并實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光；(3)根據(jù)熒光檢測(cè)結(jié)果計(jì)算出的Ct值，判斷是否有標(biāo)志物靶基因表達(dá)于樣品中。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)特異性PCR引物，開(kāi)發(fā)出用于宮頸癌早期檢測(cè)的多基因聯(lián)合檢測(cè)方法。此方法：(1)建立的PCR體系可對(duì)EPCAM、CK19、CK20、MUC1、EGFR、CEA、C-Met、HPV16、HPV18基因進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)；(2)通過(guò)同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)宮頸癌檢出率可達(dá)到95％；(3)靈敏度高，低至1-5拷貝的基因表達(dá)水平均可檢出；(4)特異性強(qiáng)，正常人或非宮頸癌病人樣本不會(huì)產(chǎn)生非特異性信號(hào)；(5)檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例中健康人外周血樣本檢測(cè)陰性PCR圖。圖2為實(shí)施例中非宮頸癌患者外周血樣本檢測(cè)陰性PCR圖。圖3為實(shí)施例中非宮頸癌組織樣本檢測(cè)陰性PCR圖。圖4為實(shí)施例中宮頸癌患者外周血檢測(cè)陽(yáng)性PCR圖。圖5為實(shí)施例中宮頸癌患者腫瘤組織檢測(cè)陽(yáng)性PCR圖。圖中，M.100bpmarker；1.B2M；2.EPCAM；3.CK19；4.CK20；5.MUC1；6.EGFR；7.CEA；8.C-Met；9.HPV16；10.HPV18。具體實(shí)施方式本發(fā)明針對(duì)目前宮頸癌中的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)EPCAM、CK19、CK20、MUC1、EGFR、CEA、C-Met、HPV16、HPV18九個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)宮頸癌的早期檢測(cè)。針對(duì)目前檢測(cè)方法靈敏度低，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜繁瑣，檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)法滿足臨床檢測(cè)的實(shí)際需求。針對(duì)上述問(wèn)題，設(shè)計(jì)出用于檢測(cè)上述九個(gè)基因的一整套特異性引物組。根據(jù)上述2個(gè)基因的參考序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，其PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度最優(yōu)是在180-200bp之間，退火溫度不高于60度，GC含量在40-60％之間，符合一般引物設(shè)計(jì)軟件的要求。通過(guò)采用實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因聯(lián)合的高靈敏檢測(cè)，其檢測(cè)方法如下所述。本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，2001年)、《RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，2004年)、《免疫檢測(cè)技術(shù)》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，1991)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來(lái)實(shí)施。其中，所用的(帶標(biāo)記的)探針、引物可以委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1:基因選擇多項(xiàng)研究表明，單基因篩查敏感度約為20-40％，大部分用于腫瘤早期篩查的單個(gè)基因檢測(cè)，其檢測(cè)敏感度或特異度偏低，不能滿足臨床需要。采用多基因聯(lián)合檢測(cè)可以有效解決敏感度低的問(wèn)題，提高腫瘤早期篩查和診斷的準(zhǔn)確度。ClaudiaPfitzner等人(ClaudiaPfitzner,CorneliaScheungraber,etal.Digital-Direct-RT-PCR:asensitiveandspecificmethodforquantificationofCTCinpatientswithcervicalcarcinoma.SCIENTIFICREPORTS,4:3970,DOI:10.1038.)同時(shí)檢測(cè)HPV16、HPV18基因，結(jié)果表明聯(lián)合檢測(cè)兩個(gè)基因用于宮頸癌早期診斷的敏感度為68％，準(zhǔn)確率達(dá)72.3％。我們通過(guò)基因篩選發(fā)現(xiàn)56個(gè)基因在宮頸癌中表達(dá)量升高。為了提高早期腫瘤的檢出率，提高腫瘤患者的治愈率，改善病人預(yù)后，我們對(duì)宮頸癌和正常組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。我們通過(guò)大量比對(duì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CK7、CK19、CK20、MUC1、EGFR、CEA、C-Met、VEGF和VEGFR2組成的基因組對(duì)宮頸癌具有較高的檢出率，達(dá)到98％，相對(duì)于現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)，產(chǎn)生了意想不到的技術(shù)效果，具有顯著的進(jìn)步。實(shí)施例2:引物篩選(1)設(shè)計(jì)引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具體為：利用生物信息學(xué)軟件對(duì)靶基因A-I序列進(jìn)行分析，利用序列分析軟件設(shè)計(jì)特異性引物組，利用NCBI引物搜索軟件檢測(cè)各配對(duì)引物在人基因組中的特異性，分別設(shè)計(jì)出3對(duì)特異性擴(kuò)增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3。表1：PCR檢測(cè)引物(2)外周血樣品的處理收集某醫(yī)院收治并經(jīng)病理證實(shí)的宮頸癌患者外周血，清晨7點(diǎn)，空腹，經(jīng)肘靜脈采集新鮮血液，存放于抗凝管中，搖勻，常溫下保存≤4hr。2.1將抗凝管中的全血樣本加入等體積PBS(pH7.0)，于室溫3000rpm離心5min，去除上層血漿；2.2向保留液體中，加入等體積氯化銨紅細(xì)胞裂解液(可購(gòu)自碧云天)，于室溫200rpm離心8min混勻后，以3000rpm室溫離心5min，棄去上清；2.3將下層血細(xì)胞和生理鹽水按照體積比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分離液，混合液與Ficoll分離液的體積比為1:2～2:1，離心力為700g，離心20～40min；2.4吸棄上清，取細(xì)胞沉淀，洗滌，即得到PBMC；2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保護(hù)劑重懸，保存于-20度。(3)核酸的提取3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μLBufferRLTPlus，吹打混勻；3.2將裂解液轉(zhuǎn)移至gDNA清除離心型柱中，8000×g(10,000rpm)離心30s。收集流穿液，棄離心柱；3.3加入1倍體積的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混勻；3.4將樣品轉(zhuǎn)移至RNeasyMinElute離心柱，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.5在RNeasyMinElute離心柱中加入700μLBufferRW1，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.6在RNeasyMinElute離心柱中加入500μLBufferRPE，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.7將RNeasyMinElute離心柱置于新的2mL收集管中，打開(kāi)蓋子，全速離心5min，使乙醇揮發(fā)；3.8將RNeasyMinElute離心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，蓋緊蓋子，全速離心1min洗脫RNA。(4)模板cDNA的獲得4.1準(zhǔn)確測(cè)得樣品RNA濃度；4.2嚴(yán)格按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)在冰上制備反轉(zhuǎn)錄體系；成分體積5×Mix8μLRNA500ngRNase-freeH2O至40μL4.3輕柔混勻以上反應(yīng)體系，并利用離心機(jī)短暫離心，55度20min，85度2min，獲得模板cDNA；(5)普通PCR擴(kuò)增用TaqDNA聚合酶配置反應(yīng)體系，用引物為a-i和人內(nèi)參基因(B2M)進(jìn)行PCR擴(kuò)增各樣品，產(chǎn)物用1％凝膠檢測(cè)；擴(kuò)增體系PCR反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性3分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃變性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。(6)熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增根據(jù)設(shè)計(jì)的特異引組a-i，通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，體系如下：成分體積2×ChamQSYBRqPCRMasterMix10μLcDNA2μL引物-F0.4μL引物-R0.4μLRNase-freeH2O7.2μLTotal20μL95℃預(yù)變性20s，1個(gè)循環(huán)；95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)；每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔；根據(jù)步驟5和6的PCR結(jié)果，篩選出以下引物組，作為本發(fā)明用于檢測(cè)宮頸癌的引物組。實(shí)施例3：效果驗(yàn)證根據(jù)實(shí)施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對(duì)100個(gè)腫瘤樣本進(jìn)行檢測(cè)。其中，CK8的正向引物為CGCCTGGAAGGGCTGACCGA，反向引物為GTTGGCAATATCCTCGTACT；CK18的正向引物為GAGCTAGACAAGTACTGGTC，反向引物為CCTCAGGCTGTTCTCCAAGC；N-cadherin的正向引物為CCTTAACTGAGGAGTCAGTG，反向引物為CAGACCTGATCCTGACAAGC；VEGF的正向引物為GTGCCCGCTGCTGTCTAATG；反向引物為CACATCTGCAAGTACGTTCG。1～9號(hào)引物組的檢出率如上表所示，從表中可以看出，引物組中，隨著引物數(shù)量的增加，在一定程度上可以提高其檢出率。進(jìn)一步地，通過(guò)比較5～9號(hào)引物組可以發(fā)現(xiàn)，引物組內(nèi)的組合對(duì)于檢出率的高低有重要影響。同時(shí)在相同的檢測(cè)基因數(shù)量情況下，5號(hào)引物組的檢出率高于6～9號(hào)引物組。因此，我們優(yōu)選5號(hào)引物組的基因組合用于宮頸癌的檢測(cè)。進(jìn)一步通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，5號(hào)引物組中，EPCAM、CK19、CK20的表達(dá)可提示上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤；表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在眾多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，成為目前腫瘤研究新熱點(diǎn)之一；c-Met作為受體酪氨酸激酶與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡相關(guān)；MUC1在腫瘤組織中多出現(xiàn)異常表達(dá)，在炎癥和腫瘤的進(jìn)展中起著重要的作用；CEA是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物。由上可知，本發(fā)明并不是將9對(duì)引物進(jìn)行簡(jiǎn)單疊加組合，9對(duì)引物相鋪相成，在功能上彼此支持，使得檢出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技術(shù)效果。綜上所述，本發(fā)明中選擇的基因涉及腫瘤的代謝、增殖、侵襲等方面，可較為全面的檢測(cè)出宮頸癌的細(xì)胞生物學(xué)特征。實(shí)施例4：特異性分析根據(jù)實(shí)施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對(duì)正常人外周血樣本(圖1)、非宮頸癌病人的外周血(圖2)、非宮頸癌病人的癌組織樣本(圖3)、宮頸癌病人的外周血樣本(圖4)和組織樣本(圖5)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖1-5所示，從圖中可見(jiàn)所述的引物組在正常人外周血(圖1)、非宮頸癌病人的外周血樣本(圖2)及組織樣本(圖3)中均未檢測(cè)到基因的表達(dá)，而在宮頸癌病人的外周血和腫瘤組織樣本中可檢測(cè)到多個(gè)基因的表達(dá)，分別為7/9和9/9，說(shuō)明本發(fā)明中所述引物組具有高度的特異性。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3