本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，尤其是涉及一種用實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR法檢測(cè)Wistar大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的方法，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH/XO)是體內(nèi)核酸代謝中一種重要的酶，在嘌呤代謝過(guò)程中催化嘌呤代謝的最后兩步，從黃嘌呤和次黃嘌呤形成尿酸代謝終產(chǎn)物尿酸。該酶廣泛分布于各種動(dòng)物及人類體內(nèi)，主要存在于肝臟中。

高尿酸血癥是由于尿酸鹽沉積或尿酸代謝障礙所致血清尿酸水平增高所引起的一種疾病，近年來(lái)發(fā)病率不斷上升。研究表明其不但是痛風(fēng)發(fā)作的病理基礎(chǔ)，還與糖尿病、高血壓、代謝紊亂綜合征、胰島素抵抗綜合癥等疾病有密切的關(guān)系，動(dòng)物模型作為研究疾病發(fā)病機(jī)制和藥理藥效的一種方法在科學(xué)發(fā)展中有著非常重要的作用。探討高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)理和建立動(dòng)物模型對(duì)于攻克高尿酸血癥尤為重要。

文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH/XO)的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)、序列、功能及抑制物上，近來(lái)越來(lái)越重視其轉(zhuǎn)錄水平的研究，小鼠，樹(shù)鼩的檢測(cè)方法都已有研究。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基因擴(kuò)增法已被廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)錄水平的定量研究。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。

為研究大鼠體內(nèi)黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH/XO)的轉(zhuǎn)錄水平，需建立一種能夠精確對(duì)黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH/XO)mRNA定量檢測(cè)的方法，為大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH/XO)的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR法檢測(cè)大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的方法，以在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因進(jìn)行定量檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)下列技術(shù)方案完成：以樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，利用PCR引物組合進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)反應(yīng)體系中熒光的變化情況定量黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平。

本發(fā)明的具體方案是：一種RT-qPCR檢測(cè)Wistar大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的方法，其特征在于包括下列步驟：

(1)設(shè)計(jì)下列引物：

大鼠XDH/XO基因表達(dá)水平的特異性上、下游引物組合及對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為：

XDH/XO F：5＇-ATGCGGACCCTGAAACAACA-3＇

XDH/XO R：5＇-TGTTCTGAAGACGGTCATACTTGGA-3＇；

作為內(nèi)參基因的大鼠GAPDH基因的特異性上、下游引物組合及對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為：

GAPDH F：5＇-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3＇

GAPDH R：5＇-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3＇；

(2)以大鼠新鮮肝臟組織提取的總RNA為模板，按常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄合成得大鼠肝臟組織cDNA第一鏈；

(3)建立大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因標(biāo)準(zhǔn)曲線：以Esidilution梯度稀釋步驟(2)大鼠肝臟組織cDNA第一鏈，分別稀釋為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍濃度，以原始cDNA第一鏈及稀釋后的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，以步驟(1)中的XDH/XO F和XDH/XO R以及GAPDH F和GAPDH R為特異性引物，分別在下列PCR擴(kuò)增體系下：25μL體系，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)12.5μL，正向、反向引物各1μL，cDNA模板1μL，去離子水9.5μL，進(jìn)行下列實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性30s，94℃變性5s、59℃退火30s、40個(gè)循環(huán)，59℃到94℃每5s采集一次熒光，得到大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因的溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)大鼠肝臟提取的總RNA經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)收集熒光與步驟(3)所得溶解峰標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即得到Wistar大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平。

本發(fā)明具備的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。應(yīng)用本發(fā)明所公開(kāi)的引物序列可實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因的特異性擴(kuò)增，對(duì)材料中非目的基因沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)，通過(guò)本發(fā)明的引物可對(duì)大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的變化情況實(shí)施定量檢測(cè)，其操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，特異性強(qiáng)，靈敏度好。本發(fā)明為研究大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因的功能及影響因素提供了有效工具。

附圖說(shuō)明

圖1為大鼠RNA完整性測(cè)定的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2為大鼠XDH/XO基因溶解曲線；

圖3為大鼠XDH/XO mRNA RT-qPCRc產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖4為大鼠GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5為大鼠XDH/XO基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖6為大鼠mRNA XDH基因表達(dá)水平變化。

具體實(shí)施方法

下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所使用的材料試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為商業(yè)途徑得到。

1、本實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)Wistar大鼠，雌性，40只。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及給藥：健康的雌性大鼠40只，隨機(jī)分成5組，8只/組，第一組腹腔注射300mg/kg劑量37.5mg/ml濃度的氧嗪酸鉀(OA)作為OA組，第二組腹腔注射22mg/kg劑量2.75mg/ml的別嘌醇(ALLO)作為ALLO組，第三組腹腔注射1％的CMC-Na作為對(duì)照組，第四組腹腔注射300mg/kg劑量氧嗪酸鉀和22mg/kg劑量的別嘌醇作為OA+ALLO22mg/kg組，第五組腹腔注射300mg/kg劑量氧嗪酸鉀和3mg/kg劑量0.4mg/ml濃度的別嘌醇作為OA+ALLO3mg/kg，每只大鼠之間給藥時(shí)間間隔10分鐘，并于每組隨機(jī)挑選2只大鼠，給藥1.5h后處死各取肝臟0.1g，用于黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH/XO)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。

3、實(shí)驗(yàn)方法

3.1大鼠肝臟組織的采集

分離并摘取肝臟組織置于RNA助溶劑(Tripure，Roche公司)用于黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH/XO)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。

3.2肝臟總RNA的提取

取新鮮肝臟0.1g于勻漿器中，加入1ml tripure在室溫下充分勻漿，靜置5min，再將其轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中靜置5min，加入200ul-20℃預(yù)冷的氯仿，漩渦震蕩充分，靜置15min后4℃、12000r/m離心25min，吸取上清液450ul于另一只1.5mlEP管中，等體積加入-20℃預(yù)冷的異丙醇，充分混勻靜置10min，4℃、12000r/m離心10min，棄上清液，待管內(nèi)壁稍干，加1ml-20℃預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀，4℃、7500r/m離心5min，棄上清液，待管內(nèi)壁稍干，加入30ulDEPC水溶解沉淀，65℃水浴10min，所提取的總RNA樣品取1ul經(jīng)Nanodrop-1000超微量核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度及吸光度比值。測(cè)定濃度后加DEPC水稀釋至1000ng/ul，放入-80℃冰箱備用。

3.3RNA完整性檢測(cè)

隨機(jī)取3.2步驟所提取的總RNA樣品2μl進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳(120V，400mA)20min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察28S，18S和5S條帶亮度，分析RNA的完整性。結(jié)果可觀察到28S，18S和5S三條帶，見(jiàn)圖1，說(shuō)明所提取的RNA無(wú)降解，完整性好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4cDNA的合成

按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript^TMRT reagent Kit說(shuō)明操作，每10μl體系中依次加入5×PrimeScript Buffer 2μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μl，Oligo dT Primer 0.5μl，Random 6mers 0.5μl，總RNA(濃度稀釋為1000ng/μl)1μl，R NaseFree dH2O 5.5μl，逆轉(zhuǎn)錄條件為:37℃，15min，85℃，5s，4℃，10min。

3.5目的基因引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI基因庫(kù)中大鼠的XDH/XO和GAPDH的基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Pimer Express 5.0分別進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)北京百泰克公司合成，GAPDH作為內(nèi)參基因。

3.6本實(shí)施例大鼠XDH/XO基因表達(dá)水平定量用引物序列及片段大小見(jiàn)表1。

表1

3.7目的基因熒光定量PCR反應(yīng)體系的確定

按TAKARA生物有限公司產(chǎn)品PCR試劑(SYBR Premix Ex TaqII)，在實(shí)時(shí)熒光定量?jī)xCFX96Real-Time System上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析，PCR擴(kuò)增體系如下：XDH及GAPDH上、下游引物各1ul(10p)，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)12.5ul，滅菌去離子水9.5ul、cDNA 1ul；進(jìn)行下列PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性30s，94℃變性5s、59℃退火30s、40個(gè)循環(huán)，59℃到94℃每5s采集一次熒光。

3.8大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以Esidilution梯度稀釋步驟3.4逆轉(zhuǎn)錄合成的大鼠肝臟cDNA第一鏈，分別稀釋為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍濃度，以原始cDNA第一鏈及稀釋后的cDNA為模板，各做2個(gè)平行樣進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，按步驟3.7熒光定量PCR體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到XDH/XO基因和GAPDH基因的溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.9樣品基因表達(dá)差異分析

由標(biāo)準(zhǔn)曲線ct值可得各稀釋梯度cDNA的拷貝數(shù)，以樣品ct值對(duì)應(yīng)得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

4結(jié)果

4.1大鼠XDH/XO基因熒光定量PCR反應(yīng)的溶解曲線

由圖2和圖3可見(jiàn)，在XOD/XO基因擴(kuò)增過(guò)程中熒光定量PCR反應(yīng)的溶解曲線僅見(jiàn)單獨(dú)的峰，反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果僅見(jiàn)一條特意條帶，表明擴(kuò)增的目的片段特異性良好。

4.2大鼠XDH/XO基因和GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖4和圖5可見(jiàn)，大鼠XOD/XO基因和GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線R²均接近1，說(shuō)明以此標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量較準(zhǔn)確，由于熒光強(qiáng)度均較強(qiáng)，故能保證熒光強(qiáng)度的增加與PCR的擴(kuò)增相對(duì)同步，能準(zhǔn)確檢測(cè)PCR的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)源控制物，得到mRNA表達(dá)水平的變化。

4.3別嘌醇對(duì)氧嗪酸鉀所致的高尿酸血癥大鼠肝臟組織XDH/XO mRNA表達(dá)水平的變化的定量檢測(cè)

步驟2各組所獲得的新鮮肝臟組織所提取的RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，可得各組XDH/XO mRNA表達(dá)水平差異，腹腔注射300mg/kg劑量的氧嗪酸鉀，肝臟組織mRNA XDH基因表達(dá)上調(diào)，注射別嘌醇基因表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)，注射氧嗪酸鉀同時(shí)注射別嘌醇組基因表達(dá)相對(duì)對(duì)照組上調(diào)，相對(duì)氧嗪酸鉀OA組基因表達(dá)均下調(diào)。見(jiàn)圖6。

4.4氧嗪酸鉀(OA)是尿酸酶抑制劑，能通過(guò)抑制尿酸酶活性，減少尿酸的分解與排泄，使尿酸值升高，可造成小鼠、大鼠高尿酸血癥，在嚙齒類動(dòng)物造模中運(yùn)用較多，用于上述實(shí)施例可使XDH/XO mRNA表達(dá)上調(diào)；別嘌醇(ALLO)通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶的活性使尿酸生成減少,血中及尿中的尿酸含量降低到溶解度以下的水平，主要用于治療痛風(fēng)和防止痛風(fēng)性腎病、繼發(fā)性高尿酸血癥以及重癥癲癇的輔助治療，用于上述實(shí)施例可使XDH/XO mRNA表達(dá)下調(diào)。步驟4.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與氧嗪酸鉀和別嘌醇對(duì)大鼠的影響結(jié)果一致，說(shuō)明本發(fā)明可用于XDH/XO mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，為研究大鼠XDH/XO基因的功能及影響因素提供了有效工具，為高尿酸血癥等疾病的研究提供可靠手段。

XDH/XO基因特異性上游引物：

XDH/XO F：5＇-ATGCGGACCCTGAAACAACA-3＇

XDH/XO基因特異性下游引物：

XDH/XO R：5＇-TGTTCTGAAGACGGTCATACTTGGA-3＇

內(nèi)參基因GAPDH特異性上游引物：

GAPDH F：5＇-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3＇

內(nèi)參基因GAPDH特異性下游引物：

GAPDH R：5＇-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3＇

所擴(kuò)增的大鼠XDH/XO基因片段的核苷酸序列：

atgcggacc ctgaaacaac acttctggtc tacctgagaa gaaagttggg gctatgtggg accaagcttg gctgtggaga aggtggctgt ggggcatgca ccgtgatgat ctccaagtat gaccgtcttc agaaca

所擴(kuò)增的大鼠內(nèi)參基因GAPDH片段的核苷酸序列：

ggcacagtc aaggctgaga atgggaagct ggtcatcaac gggaaaccca tcaccatctt ccaggagcga gatcccgcta acatcaaatg gggtgatgct ggtgctgagt atgtcgtgga gtctactggc gtcttcacca ccat