專利名稱：含過(guò)氧氧化還原酶和/或β－微管蛋白的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用過(guò)氧氧化還原酶(硫醇特異性抗氧劑)和/或β-微管蛋白作為防止腸蟲(chóng)寄生物的保護(hù)性抗原。
每種家畜都可能被許多不同類腸蟲(chóng)所寄生，這一過(guò)程通常會(huì)引起疾病。例如，肝片吸蟲(chóng)Fasciola hepatica被認(rèn)為是引起諸如牛和羊等反芻動(dòng)物經(jīng)濟(jì)上重要疾病，片吸蟲(chóng)病的原因之一。寄生蟲(chóng)通過(guò)滲透至腸壁而進(jìn)入哺乳動(dòng)物宿主，且在遷移進(jìn)入膽管之前，需要約7周時(shí)間在肝臟上攝食并通過(guò)肝臟穴居。感染之后，寄主的免疫性發(fā)育就會(huì)減緩，而且已感染的寄主只部分對(duì)再感染有抵抗力或根本沒(méi)有抵抗力。其它寄生吸蟲(chóng)包括大片吸蟲(chóng)(Fasciola gigantica)和雙腔吸蟲(chóng)(Dicrocoelium)spp.、擬單片吸蟲(chóng)Paramphistomum spp.，也包括血吸蟲(chóng)Schistosoma spp.、比如牛血吸蟲(chóng)S.bovis和曼氏血吸蟲(chóng)(S.mansoni)。
線蟲(chóng)，如鉤蟲(chóng)(如板口線蟲(chóng)屬(Necator)、鉤口線蟲(chóng)屬(Ancylostoma)、鉤蟲(chóng)屬(Uncinaria)和仰口線蟲(chóng)屬(Bunostomum SPP.)也會(huì)導(dǎo)致疾病。
在血液攝食線蟲(chóng)中，血矛線蟲(chóng)(Haemonchus)屬會(huì)引起貧血和失重，若不治療，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致死亡。被非血液攝食線蟲(chóng)胃線蟲(chóng)屬(Ostertagia)所感染的動(dòng)物同樣不能茁壯成長(zhǎng)，若不治療就會(huì)導(dǎo)致死亡。
具有經(jīng)濟(jì)重要性的其它寄生腸蟲(chóng)包括下列各類腸蟲(chóng)屬毛圓線蟲(chóng)屬(Trichostrongylus)、細(xì)頸線蟲(chóng)屬(Nematodirus)、網(wǎng)尾線蟲(chóng)屬(Dictyocaulus)、古柏線蟲(chóng)屬(Cooperia)、蛔蟲(chóng)屬(ascaris)、惡絲蟲(chóng)屬(Dirofilaria)、鞭蟲(chóng)屬(Trichuris)和圓線蟲(chóng)屬(Strongylus)。除家畜外，相伴的動(dòng)物和人類也會(huì)被感染，致命結(jié)果并非罕見(jiàn)，所以，腸蟲(chóng)傳染和感染就提出了一個(gè)相當(dāng)重要的世界性問(wèn)題。
目前，控制食草家畜的腸蟲(chóng)寄生主要依賴于使用抗腸蟲(chóng)藥與放牧管理相結(jié)合。這種方法通常是不能令人滿意的，首先因?yàn)榭鼓c蟲(chóng)藥必須經(jīng)常供給，其次因?yàn)榧倚髮?duì)抗腸蟲(chóng)藥的抗藥性在不斷增加，第三個(gè)原因在于合適的放牧管理在某些農(nóng)場(chǎng)常常是不可能的，即使可能，也會(huì)影響對(duì)可放牧食草的充分利用。
關(guān)于用免疫方法控制家畜的腸蟲(chóng)寄生已經(jīng)作出許多努力。但除極少數(shù)的例外(如牛肺腸蟲(chóng)，田螺網(wǎng)尾線蟲(chóng)(Dictyocaulus viviparus))，這種方法尚未證明其可行性。
專利WO90/08819已經(jīng)提出了一種抗肝片吸蟲(chóng)的疫苗，包含著取自于肝片吸蟲(chóng)的作為抗原的一種谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。在專利WO94/09142、WO94/28925和PCT/GB95/02350中提出了另一些抗肝片吸蟲(chóng)的疫苗，分別包含著取自于肝片吸蟲(chóng)的作為抗原的一種組織蛋白酶L、一種二肽酶和一組血蛋白。
Bennett(英國(guó)專利，專利號(hào)為2169606B)通過(guò)一種從存在于幼年期到成年期生物體中的抗原中分離出對(duì)幼年期吸蟲(chóng)特異的多種抗原方法，從片吸蟲(chóng)各種組織中提取了各種抗原。
更進(jìn)一步，在某些環(huán)境下的原始的體外排泄/分泌(E/S)物可以給予大鼠以免疫性(Rajaseksriah等，寄生蟲(chóng)學(xué)(Parasitol.),79(1979),p.393-400)。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，用相對(duì)不純的血蛋白制劑給動(dòng)物接種以預(yù)防肝片吸蟲(chóng)，與PCT/GB95/02350中所描述的純的制品產(chǎn)生了對(duì)腸蟲(chóng)的過(guò)氧氧化還原酶和β-微管蛋白的抗體。這一發(fā)現(xiàn)提供了制備抗肝片吸蟲(chóng)和其它腸蟲(chóng)的疫苗的可能性，這一方法基于使用其它腸蟲(chóng)寄生物所產(chǎn)生的過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子和/或相應(yīng)的蛋白來(lái)作為抗原。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于哺乳動(dòng)物抗腸蟲(chóng)寄生感染的疫苗配方，其抗原材料包括一種過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子，至少為部分純化形式、或一種抗原片段或抗原決定簇、組分、前體、類似物、變異體或與其功能相當(dāng)?shù)难苌?，與載體和/或佐劑一起組成抗原材料。
本發(fā)明還提供一種用于哺乳動(dòng)物抗腸蟲(chóng)寄生感染的方法，包括根據(jù)本發(fā)明所述的一種疫苗對(duì)所述的哺乳動(dòng)物給藥，其用量足夠抗所述感染。
另一方面，本發(fā)明提供在制備哺乳動(dòng)物抗腸蟲(chóng)寄生感染的疫苗配方中所描述的分子的應(yīng)用。
所述的哺乳動(dòng)物優(yōu)選反芻動(dòng)物，如?；蜓?，但是，本發(fā)明的疫苗配方和方法也可用于人類及其相伴的動(dòng)物如狗和貓、或其它家畜。
過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子優(yōu)選取自吸蟲(chóng)，如片吸蟲(chóng)或雙腔吸蟲(chóng)，特別是取自于肝吸蟲(chóng)肝片吸蟲(chóng)。另外，過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子應(yīng)能激起免疫應(yīng)答，這種免疫應(yīng)答將對(duì)片吸蟲(chóng)或雙腔吸蟲(chóng)是有效的，特別是肝片吸蟲(chóng)和大片吸蟲(chóng)，從其它物種得到的過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子能提供交叉保護(hù)的免疫應(yīng)答，因而形成本發(fā)明的一個(gè)特別值得稱道的方面。
下文所表明的肝片吸蟲(chóng)過(guò)氧氧化還原酶和β-微管蛋白分子具有cDNA序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列，分別如圖2和圖4所示，它們特別適用于本發(fā)明的疫苗配方和方法。
根據(jù)本發(fā)明，摻入到疫苗中的過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子至少為部分純化的形式。本發(fā)明的分子優(yōu)選至少為75％純度，更優(yōu)選至少為95％純度。一旦得到至少為95％純度的過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子，就與一種或多種進(jìn)一步純化的抗原蛋白質(zhì)混合以便形成一種多價(jià)疫苗。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗中的過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子可為抗原形式、抗原片段形式、或抗原決定簇、組分、前體、類似物、或與其功能相當(dāng)?shù)难苌铩?br> 根據(jù)本發(fā)明的多價(jià)疫苗的優(yōu)選形式含有上文定義的過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白多肽，與一種組織蛋白酶L型抗原或一種二肽酶抗原或一組血蛋白分子相結(jié)合，國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/09142更詳細(xì)描述了組織蛋白酶L型抗原，國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/28925更詳細(xì)描述了二肽酶抗原，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/GB95/02350更詳細(xì)描述了一組血蛋白分子。這樣，組織蛋白酶L型和/或二肽酶和/或血蛋白優(yōu)選取自于吸蟲(chóng)，如片吸蟲(chóng)或雙腔吸蟲(chóng)，特別優(yōu)選取自于肝吸蟲(chóng)肝片吸蟲(chóng)。這樣一種多價(jià)疫苗通過(guò)在寄主體內(nèi)對(duì)兩個(gè)或多個(gè)腸蟲(chóng)寄生物侵入誘導(dǎo)免疫性，將顯著增加抗腸蟲(chóng)的可能性，并顯著減少發(fā)生感染的機(jī)會(huì)。
根據(jù)本發(fā)明的單價(jià)疫苗可能對(duì)腸蟲(chóng)寄生物也具有抗生殖力效應(yīng)，而多價(jià)疫苗的這種效應(yīng)將更為顯著。
在一個(gè)優(yōu)選方面，所述多價(jià)疫苗包括根據(jù)本發(fā)明的過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子，以及一種分子量為27kDa(用WO94/09142中公開(kāi)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定)的組織蛋白酶L1，和/或一種分子量為29.5kDa(用WO94/09142中公開(kāi)的相同方法測(cè)定)的組織蛋白酶L2，和/或分子量為200kDa(用WO94/28925中公開(kāi)的相同方法測(cè)定)的二肽酶，或一種或多種分子量至少為200kDa(用PCT/GB95/02350中公開(kāi)的凝膠過(guò)濾色譜方法測(cè)定)的一組血蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以使用常規(guī)的載體和/或佐劑，而且本發(fā)明也提供一種制備該疫苗的工藝，該工藝將上文所述的純化過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子以及一種或多種佐劑或載體組成一體。在一種或多種藥物可接受的載體或稀釋劑存在下，合適的佐劑包括氫氧化鋁、皂苷(ISCOMs)、quil A和它們更純化的形式、胞壁?；?、礦物和植物油、DEAE葡聚糖、非離子共聚物或脂質(zhì)體，比如Novasomes(MicroVesicular System公司的商標(biāo))。相應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的過(guò)氧氧化還原酶或β-微管蛋白分子的抗原決定簇的肽序列載體抗原可以是蛋白質(zhì)，諸如乙型肝炎核抗原多抗原肽，或脂肪肽，諸如三棕櫚-S-甘油半胱氨?；z氨?；z氨酸(P3CSS)。合適的稀釋劑包括液態(tài)介質(zhì)，諸如適合用作媒介物的鹽水溶液。也可以包括附加組分，如保存劑。
可以通過(guò)任何常規(guī)的方式向寄主供給疫苗，比如，口服、或腸胃以外吸收如肌肉注射，可選擇間隔時(shí)間，比如在7到35天之內(nèi)注射兩次。當(dāng)用注射供給疫苗時(shí)，合適的劑量按蛋白質(zhì)的量計(jì)算，可以在10-500μg范圍內(nèi)。
另一方面，本發(fā)明提供肝片吸蟲(chóng)過(guò)氧氧化還原酶分子或抗原片段、抗原決定簇、組分、前體、類似物或其變異體，以及功能相當(dāng)?shù)难苌镆缘挚挂粋€(gè)或多個(gè)腸蟲(chóng)寄生物而保護(hù)性抗原活性，其特征如下(a)至少具有一部分本質(zhì)上對(duì)應(yīng)于如圖4所示的氨基酸序列；(b)由核苷酸序列編碼的，至少一部分本質(zhì)上對(duì)應(yīng)于圖4所示的序列；雖然用于根據(jù)本發(fā)明的疫苗的過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子優(yōu)選為通過(guò)從腸蟲(chóng)中分離制備，但也可以方便地采用重組DNA技術(shù)制備，重組DNA技術(shù)在生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大和重現(xiàn)性方面具有人們共知優(yōu)點(diǎn)。這樣，本發(fā)明也可以提供通過(guò)重組DNA技術(shù)制備的上述過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子。
因此，本發(fā)明一方面提供對(duì)本發(fā)明的過(guò)氧氧化還原酶或β-微管蛋白分子或抗原部分進(jìn)行編碼的核酸序列，本質(zhì)上對(duì)應(yīng)于所有或部分核苷酸序列如圖4所示為過(guò)氧氧化還原酶的核苷酸序列，圖2所示為β-微管蛋白分子的核苷酸序列，或?qū)δc蟲(chóng)過(guò)氧氧化還原酶或β-微管蛋白抗原進(jìn)行編碼的序列，本質(zhì)上是同源的，或能與任何一種所述序列雜交。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一種核酸可以是單股或雙股DNA、cDNA或RNA。
在過(guò)氧氧化還原酶或β-微管蛋白編碼的核苷酸序列中可能出現(xiàn)一個(gè)物種中腸蟲(chóng)的不同株之間的變異體、一種腸蟲(chóng)生活期的不同階段(如，幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)階段)之間的變異體、不同地理源的相似株之間的變異體，也可在相同腸蟲(chóng)內(nèi)部出現(xiàn)變異體。這種變異體包括在本發(fā)明的內(nèi)容中。
這里使用的“本質(zhì)上同源”包括那些具有約50％或更多，如60％或更多的序列同源的序列，也包括功能相當(dāng)?shù)牡任蛔儺愺w，和通過(guò)單個(gè)或多個(gè)堿基取代、增加和/或缺失修飾的相關(guān)序列?！肮δ芟喈?dāng)”的含義是對(duì)具有抗氧劑或β-微管蛋白功能的多肽進(jìn)行編碼的核酸序列，所述的多目太是指有相似的免疫性，即增加寄主抵抗腸蟲(chóng)的保護(hù)性抗體。
與圖2和圖4所示的序列雜交的核酸分子或與上文定義的任何本質(zhì)上同源或功能相當(dāng)?shù)男蛄幸舶ㄔ诒景l(fā)明的內(nèi)容中。這里，“雜交作用”的含義是在非嚴(yán)格條件下(室溫下，6×SSC/50％甲酰胺)與那些序列結(jié)合，在低嚴(yán)格條件(室溫下，2×SSC，或更優(yōu)選為42℃下，2×SSC)、或更嚴(yán)格條件下，如65℃下，2×SSC(這里SSC=0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉，pH7.2)，進(jìn)行洗滌的核酸序列。
通過(guò)如點(diǎn)突變、隨機(jī)突變、或核酸的酶解和/或連接來(lái)制備這種核酸在工藝上是人所共知的，這種修飾的核酸是否與目標(biāo)序列具有顯著的同源性就是通過(guò)雜交作用來(lái)決定的。
根據(jù)本發(fā)明的一種核酸分子提供能夠得到大量的以前不能得到的重組過(guò)氧氧化還原酶或β-微管蛋白或其致免疫片段，從而允許開(kāi)發(fā)抗腸蟲(chóng)疫苗。
本發(fā)明的另一方面在于提供包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列對(duì)一個(gè)或多個(gè)能產(chǎn)生抗腸蟲(chóng)寄生的保護(hù)性抗體的多肽進(jìn)行編碼，該序列與來(lái)自于如圖2和圖4所示的編碼過(guò)氧氧化還原酶或β-微管蛋白一個(gè)或多個(gè)的抗原決定簇區(qū)的序列結(jié)合為一體。
本發(fā)明也延伸至合成多肽，包括一個(gè)或多個(gè)組成過(guò)氧氧化還原酶或β-微管蛋白分子或其抗原部分的氨基酸序列，本質(zhì)上對(duì)應(yīng)于部分或全部如圖2和圖4所示的核苷酸序列，或一種功能相當(dāng)?shù)淖儺愺w。
與上文相關(guān)的本發(fā)明的另一些方面包括含有一個(gè)或多個(gè)定義如上的核苷酸序列的載體；由這樣的載體，比如桿狀病毒載體轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞，例如細(xì)菌E.Coli，或酵母細(xì)胞，如沙門(mén)菌屬spp.，或更優(yōu)選為真核細(xì)胞；用于制備重組過(guò)氧氧化還原酶和β-微管蛋白多肽或抗原片段或抗原決定簇的工藝，該工藝包括培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞和從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離所述過(guò)氧氧化還原酶或β-微管蛋白多肽或抗原片段或抗原決定簇。
一個(gè)改變了活性的或失活的疫苗配方可以包含一種減毒的或有毒的病毒或一種寄主細(xì)胞，比如，象細(xì)菌這樣的微生物，插入根據(jù)本發(fā)明的一種核酸分子(如一種DNA分子)，用于由被插入核酸分子編碼的多肽刺激一個(gè)免疫應(yīng)答。特別優(yōu)選一種細(xì)菌載體，該載體可誘出對(duì)一種吸蟲(chóng)抗原的局部腸粘膜的免疫性，進(jìn)而阻塞幼蟲(chóng)吸蟲(chóng)的遷移，其顯著的品種如沙門(mén)菌屬。
本疫苗中還可以存在其它的抗原物質(zhì)，從而給出對(duì)所述寄生腸蟲(chóng)的一個(gè)增強(qiáng)的保護(hù)作用，或?qū)σ环N或多種其它寄生蟲(chóng)感染的聯(lián)合保護(hù)作用。
本發(fā)明的另一方面提供單克隆或多克隆抗體，當(dāng)所述哺乳動(dòng)物服用后，這些抗體能夠誘導(dǎo)出哺乳動(dòng)物對(duì)過(guò)氧氧化還原酶或β-微管蛋白分子的免疫性，此類抗體具有對(duì)一種或多種進(jìn)一步的抗體的可變區(qū)的親和力，所述進(jìn)一步的抗體具有對(duì)所述硫醇特異的過(guò)氧氧化還原酶或β-微管蛋白分子的親和力。
這一方法即所謂“抗一個(gè)體基因型”方法，該方法允許完全不采用原始抗原配制一種疫苗的配方，且可以在安全性、防止副作用和方便制造方面提供更多的優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1免疫選擇PCR擴(kuò)增插入gtll克隆的。陽(yáng)性克隆是由采用通用λ正向和逆向引物的PCR擴(kuò)增的。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)每個(gè)PCR反應(yīng)樣品進(jìn)行了分析。
道1,12,23pGem DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品道2 克隆D6道3和4 克隆B5、D5道5-11 克隆A1、A4、A5、B1、B4、B6、E3道13克隆C4道14-17 克隆C2、D1、D7、E2道18克隆D8道19和20克隆C1、D3道21克隆A8道22克隆E4圖2β-微管蛋白(克隆D6)的核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列。
圖3
克隆D6對(duì)弓形蟲(chóng)屬β-微管蛋白預(yù)測(cè)氨基酸序列的排列。
部分D6序列推導(dǎo)的氨基酸序列與來(lái)自弓形蟲(chóng)屬gondii(基因庫(kù)編號(hào)P10878,Nagel和Boothroyd,1988)的β-微管蛋白是匹配的。方框圈出了同源的部分，圖中有一些中斷線是為了給出最大的匹配。Z=未確定。
圖4過(guò)氧氧化還原酶(克隆B1)的核苷酸序列和預(yù)測(cè)氨基酸序列的。
圖5克隆B1的預(yù)測(cè)氨基酸序列的排列。
克隆B1推導(dǎo)的氨基酸序列與大鼠的硫醇特異抗氧化劑(TSA，基因庫(kù)編號(hào)P35704)、人的天然的殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子B(NKEF B編號(hào)P31945)、人的增殖相關(guān)基因(PAG，編號(hào)X67951)。人的TSA(Lim等，1994，編號(hào)P35704)和盤(pán)尾絲蟲(chóng)屬腸扭轉(zhuǎn)TSA(編號(hào)U09385)是匹配的。方框表示保守的殘基，圖中有一些中斷線是為了給出最大的匹配。箭頭指示活性中心半胱氨酸殘基。
圖6克隆B1融合蛋白的表達(dá)。
A. 野生型噬菌體(道1)和克隆B噬菌體(道2)洗滌上清液的SDSPAGE平板電泳和銀染。
B. 電泳之后，SDS凝膠被轉(zhuǎn)印至硝化纖維素上并用抗β-半乳糖苷酶抗體進(jìn)行檢測(cè)。道1含有野生類噬菌體的上清液，道2含有克隆B1上清液。大箭頭指示β-半乳糖苷酶的位置。小箭頭指示B1重組融合蛋白的位置。
圖7肝片吸蟲(chóng)和牛肝的總RNA的Northern blot分析結(jié)果。
肝片吸蟲(chóng)(道1)和牛肝(道2)的總RNA在甲醛瓊脂糖凝膠中電泳，轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜，并用32P標(biāo)記的400bp片段探針進(jìn)行檢測(cè)。圖上標(biāo)出了RNA的大小。
圖8
肝吸蟲(chóng)勻漿對(duì)谷氨酰胺合成酶抗DTT/Fe3+體系的保護(hù)。0.5U谷氨酰胺合成酶(GS)在失活液IS(15μM FeCl3和5mM DTT)存在的條件下，分別加0.3mg、0.6mg和0.9mg肝吸蟲(chóng)勻漿(LFH)，在37℃保溫10分鐘。然后測(cè)定反應(yīng)物殘留的谷氨酰胺合成酶活性。
發(fā)明的詳述1.材料α32P dATP購(gòu)自Amersham,RNAzolTMB購(gòu)自AMS生物工程有限公司，X-Omat X射線膠片、FX40定影液、LX24顯影劑667寶麗來(lái)膠卷都從Kodak公司購(gòu)得。瓊脂糖、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的鼠抗-β半乳糖苷酶抗體、ApaⅠ、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷酶(X-Gal)、dNTP’s、EcoRⅠ、HindⅢ、異丙硫醇-β-D-半乳糖苷酶(IPTG)、pGem DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品、pGem載體系統(tǒng)、Prime-a-Gene系統(tǒng)、SacⅠ、TaqDNA聚合酶、WizarDTMλpreps、WizarDTMDNA純化系統(tǒng)均購(gòu)自Promega公司。腺嘌呤二磷酸(ADP)、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的兔抗牛IgG、二乙基焦碳酸鹽(DEPC)、二硫蘇糖醇(DTT)、谷氨酰胺、谷氨酰胺合成酶、溶菌酶、蛋白酶K、鮭魚(yú)精DNA都購(gòu)自Sigma化學(xué)公司。
2．肝片吸蟲(chóng)λgt11 cDNA表達(dá)庫(kù)的免疫篩選λgt11 cDNA庫(kù)的制備λgt11 cDNA庫(kù)通過(guò)下述標(biāo)準(zhǔn)方法(Promega手冊(cè))制備。采用RNAzoLTM從成熟的成年吸蟲(chóng)中分離出總RNA，通過(guò)一種寡DT柱分離出mRNA。采用RiboclonecDNA合成試劑盒從mRNA產(chǎn)生雙股cDNA。EcoRⅠ粘著末端加至cDNA，再連接至gt11粘著末端并使用Packgene系統(tǒng)將它包裝到λ頭內(nèi)。滴定包裝的噬菌體，然后通過(guò)用稀釋的噬菌體感染噬菌體感受態(tài)E.Coli Y1090細(xì)胞(在含有0.2％麥芽糖和10mM MgSO4的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng))，室溫下培養(yǎng)20分鐘，然后將細(xì)菌涂布在含有100μg ml-1氨芐青霉素的LB瓊脂板上。對(duì)所包裝的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增。
血紅蛋白餾分部的制備在愛(ài)爾蘭的一個(gè)本地屠場(chǎng)宰殺牛，從其感染的肝的膽管中取出成熟的肝片吸蟲(chóng)。該吸蟲(chóng)在pH值為7.3的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌6次，然后在37℃下，于pH值為7.3、含有2％葡萄糖、30mM HEPES和25mgml-1慶大霉素的RPMI-1640中培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)。經(jīng)過(guò)該培育期之后，除去培養(yǎng)液，12,00xg離心30分鐘，收集上清液(ES產(chǎn)物)并在-20℃貯存。
在Amicon8400超濾裝置(Danvers,MA,USA)上用YM3膜將500ml的ES產(chǎn)物濃縮至15ml。濃縮產(chǎn)品以離心力為12,000xg進(jìn)行離心30分鐘，并加載至340ml的Sephacryl S-200柱上，該柱用pH值為7.0的0.1M的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液在4℃平衡。在死體積(110ml)通過(guò)之后分部收集(5ml)。洗脫液使用Atto UV監(jiān)測(cè)器選用280nm進(jìn)行監(jiān)測(cè)。那些含有血蛋白的分部(黃色)合并收集并在Amicon8050超濾裝置上濃縮至5ml。該濃縮物稱為血紅蛋白分部(Hf)。
用于免疫篩選的血清的制備使用來(lái)自于接種上述血紅蛋白分部(Hf)的動(dòng)物的合并血清對(duì)cDNA庫(kù)進(jìn)行了免疫篩選。所述血清是在三次接種Hf之后和寄生蟲(chóng)攻擊之前得到的。使用前，血清經(jīng)過(guò)預(yù)吸附以除去所有與E.coli蛋白反應(yīng)的抗體。這是通過(guò)用含有結(jié)合E.coli蛋白的硝化纖維素圓片在室溫下與血清保溫6小時(shí)而實(shí)現(xiàn)的。該吸附步驟重復(fù)三次。該圓片的制備工藝如下于4℃下，在超聲萃取(10×30秒bursts，萃取周期0.7秒)E.coli細(xì)胞液中培養(yǎng)圓片24小時(shí)，然后用1％的BSA/T-PBS阻塞剩余的位點(diǎn)。血清與圓片保溫、取血清、離心后、并在4℃貯存?zhèn)溆谩?br> λ庫(kù)的免疫篩選用1∶50稀釋的噬菌體感染噬菌體感受態(tài)E.coli Y1090。在室溫下培養(yǎng)20分鐘之后，將細(xì)胞鋪在含氨芐青霉素的LB瓊脂板上并在42℃培養(yǎng)，直到能看到噬菌斑(約3小時(shí))。已在10mM的IPTG中浸泡過(guò)并在空氣中干燥的硝化纖維素圓片被輕輕置于上述板上，它們的位置由三個(gè)針狀刺標(biāo)出。將上述板在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)，然后小心地取下硝化纖維素圓片，在1％的BSA/T-PBS中阻塞過(guò)夜，用預(yù)吸附的?？寡?1∶500的稀釋液)進(jìn)行測(cè)試。在T-PBS中洗滌之后，抗體用堿磷酸酯標(biāo)記的抗牛IgG和NBT和BCIP底物檢測(cè)結(jié)合的抗體。陽(yáng)性噬菌斑表現(xiàn)為紫色圓圈。用無(wú)菌巴斯德吸管將這些噬菌斑作為瓊脂栓移去，轉(zhuǎn)移到1ml噬菌體緩沖液中(10mM MgSO4、100mM NaCl、20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH7.4)，并在4℃下擴(kuò)散過(guò)夜。單個(gè)的噬菌體重新鋪板并再重復(fù)兩次抗體篩選，或直到獲得純的噬菌斑，即板上所有噬菌斑都與抗體進(jìn)行反應(yīng)。
3．λ溶胞產(chǎn)物的制備和DNA的分離被分離的噬菌斑放入200微升0.1xSM緩沖液中(0.01％明膠，8mMMgSO4,100mM NaCl,50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH7.5)4℃下培養(yǎng)過(guò)夜，100微升用于感染競(jìng)爭(zhēng)體Y1090細(xì)胞，這些細(xì)胞是如同上述方法鋪板的，并在42℃下培養(yǎng)直到觀察到溶菌為止(約5小時(shí))。4毫升0.1xSM緩沖液加到該板上，在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜之后移去緩沖液。加入氯仿(最終濃度為0.5％)，溶胞產(chǎn)物在4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 4．λDNA的PCR分析使用通用λ引物，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)用于分離和測(cè)定從噬菌體庫(kù)插入物的大小。這些引物來(lái)自λgt11載體的EcoRⅠ克隆位的側(cè)面序列。20微升儲(chǔ)備λ溶胞產(chǎn)物加入到180微升的水中并煮沸10分鐘，然后，每50微升PCR使用1微升該溶胞產(chǎn)物。每個(gè)PCR管裝有下列混合物10x多聚酶緩沖液 5.0微升dNTP(每種1mM)5.0微升MgCl2(25mM) 6.0微升無(wú)菌蒸餾水 30.7微升λ進(jìn)向引物(50ngμl-1) 1.0微升λ反向引物(50ngμl-1) 1.0微升Taq多聚酶(5U μl-1) 0.3微升λ溶胞產(chǎn)物DNA1.0微升每個(gè)混合都用70微升的礦物油復(fù)蓋，放入Hybaid OmnigeneThermal Cycler中，PCR如下進(jìn)行階段1(變性作用)94℃下4分鐘階段2(變性作用)94℃下30秒(退火) 55℃下1分鐘(延伸) 74℃下1分30秒階段2重復(fù)35次階段3(延伸)74℃下4分鐘按照Sambrook等的詳細(xì)描述(1989)，用瓊脂糖凝膠電泳分析25微升的PCR反應(yīng)物。
5．PCR片段的亞克隆PCR擴(kuò)增的基因片段從凝膠上切下。用玻璃珠破碎該瓊脂糖，回收的DNA用WizardTMDNA純化系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行純化。然后，該片段直接亞克隆到pGem-T質(zhì)粒，如下所述1微升(25ng)pGem-T載體，8微升連接酶緩沖液(10mM ATP,100mM MgCl2,100mM DTT,300mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH7.8),1U T4 DNA連接酶和100ng插入DNA緩慢混合，并允許該連接于4℃下繼續(xù)過(guò)夜。
感受態(tài)細(xì)胞用下列方法之一進(jìn)行制備(a)氯化鈣轉(zhuǎn)化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli JM109細(xì)胞培養(yǎng)液被等分，放在冰上5分鐘，以12,000xg離心2分鐘，然后移去上清液。該細(xì)胞用1ml冷卻CaCl2緩慢再懸浮并在冰上培養(yǎng)30分鐘。該細(xì)胞再次離心并再次懸浮于0.5ml的冷卻CaCl2中。10微升的連接混合物緩慢加入到50微升的細(xì)胞等分液中并在冰上再放置30分鐘。然后將該細(xì)胞在42℃加熱振蕩90秒鐘，再返回到冰上放置2-5分鐘。轉(zhuǎn)化之后立即加入950微升的預(yù)熱LB培養(yǎng)液，并將該細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)離心濃縮并鋪在含有100μgml-1氨芐青霉素、0.5mM IPTG和40μg ml-1X-Gal(用于藍(lán)/白選擇)的LB板上。
(b)電激對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli XL1-藍(lán)色電激感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)離心濃縮后等分。2.5微升的連接反應(yīng)物加入到300微升細(xì)胞中，緩慢混合并置于0.2μm的電激杯中。該細(xì)胞在下列條件下通過(guò)電激轉(zhuǎn)化脈沖發(fā)生器設(shè)置為25μF、2.48kV和200Ω。這種設(shè)置下的一個(gè)脈沖導(dǎo)致一個(gè)12.5kV cm-1、時(shí)間常數(shù)約為4秒的脈沖。在如前所述的濃縮和鋪板之前，立即加入1ml的預(yù)熱SOC(含有20mM的葡萄糖)培養(yǎng)液，并將該細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。帶有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的板在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
6．重組質(zhì)粒的篩選采用X-Gal和IPTG顏色篩選，重組克隆應(yīng)為白色，而無(wú)插入DNA的為藍(lán)色。白色克隆放入2ml的含有100μg ml-1氨芐青霉素(和15μg ml-1用于藍(lán)細(xì)胞的四環(huán)素)的LB板中，并在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。用Sambrook等(1989)描述的煮沸或堿法從1ml這種微量制備培養(yǎng)液中分離質(zhì)粒DNA。該DNA用限制酶SacⅠ和ApaⅠ雙酶切，并在瓊脂糖凝膠電泳上觀察插入物。
7．質(zhì)粒DNA測(cè)序用WizardTMλpreps進(jìn)一步純化來(lái)自陽(yáng)性克隆的純化的質(zhì)粒DNA。該DNA送到Durham大學(xué)生物學(xué)系或都柏林Trinity學(xué)院的BioResearchIreland進(jìn)行序列分析。
8．融合蛋白的制備序列分析表明克隆B1是一種新的吸蟲(chóng)抗氧化劑蛋白質(zhì)(過(guò)氧氧化還原酶)，因此對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步表征。通過(guò)板洗滌上清液方法從λB1克隆中制備了融合蛋白。用10,000pfu重組噬菌體感染噬菌體感受態(tài)E.coli Y1090，并于室溫下培養(yǎng)20分鐘，然后倒入含氨芐青霉素的LB板上。該板在42℃培養(yǎng)3小時(shí)(溶菌幾乎連合)，然后將含有1mM EDTA、1mMPMSF、1mM碘乙酰胺和10mM IPTG的5ml噬菌體緩沖液加入到該板上并在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將緩沖液回收，而將頂部瓊脂刮入離心管中。旋轉(zhuǎn)振蕩20秒鐘之后以10,000xg在4℃離心10分鐘。將上清液移到microfuge管中再在12,000xg的條件下離心。將上清液于-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 該融合蛋白經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，通過(guò)銀染和用抗-β半乳糖苷酶第一抗體進(jìn)行免疫印跡分析。
9．放射性標(biāo)記DNA探針的制備通過(guò)比較過(guò)氧氧化還原酶抗氧化劑家族的蛋白質(zhì)序列，用下列一致的引物從克隆B1 DNA對(duì)一個(gè)400堿基對(duì)的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這些引物復(fù)蓋編碼保守的活性中心區(qū)域半胱氨酸47(VCP47)和半胱氨酸168(VCP168)。
VCP47進(jìn)向引物(Shem F)5’GAT TTY ACW TTY GTN TGT CCW ACW GAR-3’
VCP168反向引物(Sm TSAR)5’GGW CAN ACY TCW CCA TGY TC-3’這里，Y=T或C,W=A或G,N=TC、A或G該P(yáng)CR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠切下來(lái)并按前文所述進(jìn)行純化。采用Promega Prime-a-Gene系統(tǒng)通過(guò)隨機(jī)引物用α32P標(biāo)記該片段。該反應(yīng)混合物如下5X標(biāo)記緩沖液 10微升(250mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH8.0，25mM MgCl2,10mM DTT,1mM HEPES,pH6.6，26A260單位ml-1隨機(jī)六脫氧核糖核苷酸)dCTP dGTP dTTP(每種100mM)的混合物2微升乙?；疊SA 10mg ml-12微升變性DNA探針 25ng無(wú)菌水 25微升α32P dATP(50μCi,3,000Ci mMol-1) 5微升Klenow酶 5U將反應(yīng)管緩慢混合并于室溫下保溫1小時(shí)。加入200微升的0.5MEDTA，通過(guò)煮沸2分鐘使反應(yīng)終止?，F(xiàn)在探針就準(zhǔn)備好可用于雜交反應(yīng)。
10.RNA的分離和northern blottinga．成年吸蟲(chóng)RNA的分離成熟吸蟲(chóng)在pH7.3，含有2％葡糖、30mM HEPES和25mg/l的慶大霉素的RPMI-1640中培養(yǎng)過(guò)夜，以便清除可能含有寄主細(xì)胞的腸道容留物。將大約10個(gè)吸蟲(chóng)(1克組織)置于離心管中，加入5ml RNAzolTM，用一種Thyristor Regler TR50勻漿器以最快速度使吸蟲(chóng)勻漿化30秒。加入1ml的氯仿，劇烈搖動(dòng)該溶液15秒，然后置于冰上5分鐘。等分至microfuge試管之后，以13,000xg的離心力于4℃對(duì)該溶液離心15分鐘，形成兩層。將上部水相移至一個(gè)新試管，加入等體積的異丙醇，然后將該樣品于4℃放置15分鐘(或等分用于在-80℃下長(zhǎng)期貯存)。將它們?cè)俅坞x心15分鐘，移去上清液，用75％乙醇清洗RNA小球，然后進(jìn)行干燥并用200微升0.1％的DEPC處理過(guò)的水進(jìn)行重懸浮。采用相同步驟，以1克新鮮牛肝作為初始材料分離牛的RNA。按照Sambrook等人(1989)所述，采用含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳分析RNA。
b．Northern blotting電泳之后，用DEPC處理過(guò)的水淋洗凝膠以除去甲醛，采用Sambrook等人(1989)所述的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將RNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜上。在緩沖液的流動(dòng)中，RNA片段從凝膠中流出并沉積于硝化纖維素表面。轉(zhuǎn)移之后，通過(guò)在一個(gè)烘箱中于80℃2小時(shí)，使RNA固定至膜上。
c．放射性標(biāo)記探針的雜交硝化纖維素膜浸泡至6X SSC(0.9M NaCl,90mM檸檬酸鈉，pH7.0)中直到完全潤(rùn)濕并置于一個(gè)熱封袋中。然后，在該袋中加入200ml預(yù)雜交溶液(6X SSC、5X Denhardt試劑、0.5％SDS、100μg ml-1變性的、裂成片段的鮭魚(yú)精DNA)。從密封袋中擠出盡可能多的空氣，并將該袋于68℃保溫過(guò)夜。保溫之后，通過(guò)除去一個(gè)角而打開(kāi)該袋，并小心加入放射性標(biāo)記探針之后，將該密封袋置于第二個(gè)密封袋中并于68℃培養(yǎng)24小時(shí)。緩慢將該雜交溶液倒入一個(gè)合適的容器中，將膜并立即浸入300ml的2X SSC和0.1％SDS中。該膜于室溫下緩慢攪拌保溫15分鐘。清洗液更換兩次并重復(fù)保溫。然后，將0.1X SSC和0.5％SDS加到膜上，并于68℃進(jìn)一步保溫1小時(shí)。用0.1X SSC淋洗膜以便除去SDS，用紙巾將膜上溶液簡(jiǎn)單地吸掉并用保鮮膜包裹，然后在-80℃進(jìn)行X-射線膠片感光以獲得放射自顯影圖象。要獲得一個(gè)好圖象，需要用一個(gè)增光屏在-80℃感光24小時(shí)。
11．用于新型抗氧化劑活性的成熟吸蟲(chóng)萃取物的試驗(yàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)抑制谷氨酰胺合成酶的硫醇/鐵/氧中介的失活的能力來(lái)測(cè)定成熟肝吸蟲(chóng)萃取物中的抗氧劑活性。在失活溶液和保護(hù)質(zhì)蛋白(肝吸蟲(chóng)勻漿)存在或不存在條件下，在含有0.5U谷氨酰胺合成酶〔E.coli〕的100微升反應(yīng)體積的微滴板中進(jìn)行測(cè)試。失活溶液由15μM FeCl3和5mM DTT或14mM 2-硫氫基乙醇(最終濃度)組成。于37℃保溫10分鐘之后，通過(guò)加入100微升的γ谷氨?；D(zhuǎn)移酶測(cè)試混合物來(lái)測(cè)定剩余谷氨酰胺合成酶的活性。這含有在50mM咪唑鹽酸中的0.4mM ADP、150mM谷氨酰胺、10mM砷酸鉀、0.4mM氯化鎂、20mM氯化羥銨組分，pH7.0。該反應(yīng)于37℃保溫30分鐘之后，通過(guò)加入50微升終止混合物來(lái)終止反應(yīng)，該終止混合物由每升55克FeCl3.6H2O、20克三氯乙酸和21ml濃鹽酸組成。在540nm處測(cè)試γ谷氨?；u胺-Fe3+絡(luò)合物的吸光度。在缺少“保護(hù)質(zhì)蛋白”條件下，70至100％的谷氨酰胺合成酶活性都失掉。
12．肝片吸蟲(chóng)cDNA庫(kù)的免疫篩選和通過(guò)PCR和限制酶酶切對(duì)分離的克隆進(jìn)行分析以及限定性消化來(lái)自疫苗試驗(yàn)的牛血清用于篩選λgt11噬菌體構(gòu)建的肝片吸蟲(chóng)cDNA庫(kù)。所用的血清庫(kù)是在用血紅蛋白分部(Hf)免疫的動(dòng)物接種寄生物第11周那天得到的。這些動(dòng)物表明抵抗寄生攻擊的平均水平為43.8％。該血清應(yīng)當(dāng)含有能與血紅蛋白和任何其它存在于免疫分部中的抗原反應(yīng)的抗體。
采用1∶1500稀釋的預(yù)吸附血清進(jìn)行初篩時(shí)使用了十個(gè)板，每個(gè)板上有約2,000pfu。選擇了30個(gè)陽(yáng)性噬菌斑再進(jìn)行三到四輪的篩選，直到板上所有的噬菌斑都是陽(yáng)性的，這表明為純克隆。然后制備陽(yáng)性噬菌斑的溶菌產(chǎn)物，并使用λ進(jìn)向和逆向引物通過(guò)PCR分析DNA。在所選擇的30個(gè)陽(yáng)性噬菌斑中，只有20個(gè)產(chǎn)生PCR產(chǎn)物；故忽略掉剩下的10個(gè)。根據(jù)PCR片段(圖1)的大小將克隆分組。
組號(hào) PCR片段的大小克隆1 ～1700bpD62 ～1600bp B5和D53 ～1400bpA1、A4、A5、B1、B4、B6、E34 ～1100bpC45 ～1000bp C2、D1、D7、E26 ～900bp D87 ～700bp C1和D38 ～650bp A89 ～550bp E413.噬菌體插入物的亞克隆用第一組克隆(1700bp)的D6和第三組(1400bp)的B1進(jìn)行亞克隆。這兩個(gè)克隆的λPCR產(chǎn)物被直接亞克隆到pGem-T質(zhì)粒上。選取白色克隆并用SacⅠ和ApaⅠ限制酶雙酶切進(jìn)行篩選。從D6中分離出一個(gè)帶有一個(gè)1600-1700bp插入的克隆，從克隆B1中獲得了一個(gè)帶有一個(gè)1400-1500bp插入的克隆。
14．克隆D6的序列分析來(lái)自重組質(zhì)粒的DNA在純化后用WizardTMλprep進(jìn)行了商業(yè)測(cè)序。從克隆D6獲得了約420堿基的部分序列。推導(dǎo)出的141個(gè)氨基酸序列與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行了比較，并發(fā)現(xiàn)與來(lái)自各種生物的β-微管蛋白的C-末端有明顯的同系性。β-微管蛋白是長(zhǎng)度為440-450個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，對(duì)應(yīng)于約1320個(gè)堿基，故約1700個(gè)堿基的克隆D6可能含有整個(gè)肝片吸蟲(chóng)的β-微管蛋白基因。圖2顯示了部分D6序列與來(lái)自弓形蟲(chóng)屬gondii的β-微管蛋白的對(duì)位情況。在重疊部位，D6序列顯示了與來(lái)自原蟲(chóng)的微管蛋白C-末端有64％的一致性和73％的相似性。
15．克隆B1的序列分析通過(guò)使用λ引物的PCR擴(kuò)增估算克隆B的插入長(zhǎng)度為約1400bp。近似地，該插入物的1200個(gè)堿基以5’到3’方向上排序。這揭示了一個(gè)起始密碼ATG和一個(gè)約580堿基的開(kāi)放閱框架，一個(gè)在框內(nèi)的終止密碼TAG。終止密碼的下游是約20個(gè)腺嘌呤殘基(PolyA尾部)，其前面是兩個(gè)多腺嘌呤化序列，AAAATAAA和AATA，說(shuō)明該克隆在其3’端結(jié)束。該DNA具有一個(gè)約200堿基的5’非轉(zhuǎn)譯的部位和一個(gè)約700堿基的3’非轉(zhuǎn)譯的部位。
預(yù)期克隆B1編碼一個(gè)具有計(jì)算分子量為21,646Da的194個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。當(dāng)用于篩選蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，預(yù)期的氨基酸序列顯示了與一種新型的抗氧劑蛋白質(zhì)家族的高度同一性，該家族為過(guò)氧氧化還原酶家族。圖3所示為克隆B1與鼠硫醇特異抗氧劑(TSK，基因庫(kù)編號(hào)為P35704)、人的天然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子B(NKEF B，編號(hào)為P31945)、人的增殖相關(guān)基因(PAG，編號(hào)為X67951)、人類TSA(Lim等，1994，編號(hào)為P35701)、和盤(pán)尾絲蟲(chóng)屬腸扭轉(zhuǎn)TSA(編號(hào)為009385)的排位圖。
具有最高同一性的蛋白質(zhì)為大鼠TSA；57％和74.6％相似性。其它同一性如下人NKEF B 56.9％，(71.5％類似性)人PAG 53.8％(73.0％類似性)，人TSA 53.7％(71.0％類似性)和盤(pán)尾絲蟲(chóng)屬腸扭轉(zhuǎn)TSA2.0％(33.7％類似性)。在該序列的整個(gè)長(zhǎng)度都觀察到相似性，并觀察到兩個(gè)高度保守區(qū)域。第一個(gè)是在約40-60部位的16個(gè)氨基酸，-F Y P L DF T F V C P T E I I A-。第二個(gè)發(fā)現(xiàn)在約165-175部位的短區(qū)域一H G E V C P A-。
16.克隆B1對(duì)融合蛋白的表達(dá)板清洗上清液方法用于從克隆B1噬菌體中制備融合蛋白。在還原SDS PAGE上分析了所得的上清液和從已感染野生型噬菌體的E.coli所得的上清液(圖4A)。在野生型制品中，觀測(cè)到了具有與β-半乳糖苷酶相同分子量的一種蛋白質(zhì)(道1)。在B1上清液中，沒(méi)有這個(gè)蛋白，但是觀測(cè)到一個(gè)分子量約為160kDa的較大蛋白質(zhì)(道2)。該蛋白在野生型中未觀測(cè)到。為確定這個(gè)蛋白是否是融合蛋白，將凝膠吸至硝化纖維素紙上，并用抗β-半乳糖苷酶抗體(圖4B)進(jìn)行探測(cè)試。該抗體與大蛋白結(jié)合證實(shí)了作為β-半乳糖苷酶融合蛋白(道2)的同一性?？贵w也將野生型β-半乳糖苷酶分子(道1)和許多其它蛋白共同結(jié)合至這兩個(gè)上清液中。
17．Northern分析從抗氧化劑蛋白的保守區(qū)(在約50-170部位的VCP motifs周圍)設(shè)計(jì)的引物用于擴(kuò)增一個(gè)長(zhǎng)度約為400bp的DNA片段。該片段是32P標(biāo)記的，用于探測(cè)肝片吸蟲(chóng)和牛RNA，在一種瓊脂糖凝膠上對(duì)其進(jìn)行了分析。在肝片吸蟲(chóng)RNA(圖5，道1)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)約750kb的單個(gè)轉(zhuǎn)錄。在牛RNA(圖5，道2)中未觀測(cè)到類似過(guò)氧氧化還原酶結(jié)合。
18．成熟吸蟲(chóng)萃取物的抗氧劑活性抗氧劑活性是通過(guò)一個(gè)混合的鐵硫醇失活系統(tǒng)作為肝吸蟲(chóng)萃取物阻止谷氨酰胺合成酶失活的能力被測(cè)定的。圖6顯示了在各種濃度的肝吸蟲(chóng)勻漿(LFH)存在條件下，谷氨酰胺合成酶被鐵和DTT失活。用鐵和DTT與谷氨酰胺合成酶保溫導(dǎo)致了70％的酶活性損失。LFH的存在提供與劑量有依賴關(guān)系的保護(hù)，用0.3mg、0.6mg和0.9mg的LFH分別恢復(fù)50％、61％和75％的谷氨酰胺合成酶活性。
文獻(xiàn)目錄Lim.,Y.S.,Cha,M.K.,Kim,H.K.和Kim,I.H.1994，來(lái)自于人腦的硫醇特異抗氧劑蛋白質(zhì)基因克隆和保守的半胱氨酸部位分析?；颍?40,279-284。
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UK專利號(hào)為2169606BWO94/09142WO94/2892權(quán)利要求
1．一種用于抗哺乳動(dòng)物的腸蟲(chóng)寄生感染的疫苗配方，其特征在于抗原材料包括一種過(guò)氧氧化還原酶和/或一種β一微管蛋白分子，至少為部分純化形式，或一種抗原片段或抗原決定簇、組分、前體、類似物、變異體或與其功能相當(dāng)?shù)难苌?，還有一種載體和/或佐劑一起組成的抗原材料。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種疫苗，其特征在于所述抗原材料取自于大片吸蟲(chóng)或雙腔吸蟲(chóng)種。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種疫苗，其特征在于所述抗原材料取自于肝片吸蟲(chóng)。
4．根據(jù)權(quán)利要求1至3任何一條所述的疫苗，其特征在于參入疫苗的所述抗原分子至少為75％的純度。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種疫苗，其特征在于參入所述的疫苗的抗原分子至少為95％的純度。
6．根據(jù)權(quán)利要求1至5任何一條所述的疫苗，其特征在于進(jìn)一步包括一種或多種的抗原決定簇形成一種多價(jià)疫苗。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種疫苗，其特征在于可以是組織蛋白酶L型抗原和/或二肽酶抗原和/或一種血蛋白抗原的抗原決定簇。
8．在制備用于抗哺乳動(dòng)物的腸蟲(chóng)寄生感染的疫苗配方中使用的是吸蟲(chóng)的過(guò)氧氧化還原酶和/或一種β-微管蛋白分子。
9．一種抗哺乳動(dòng)物的腸蟲(chóng)寄生感染的方法，其特征在于包括所述權(quán)利要求1至7任何一條定義的哺乳動(dòng)物疫苗，其施用量能有效抵抗所述感染。
10．一種依權(quán)利要求1至7定義的任何一種疫苗的制備工藝過(guò)程，其特征在于包括純化了的過(guò)氧氧化還原酶和/或一種β-微管蛋白分子和一種或多種佐劑或載體。
11．編碼β-微管蛋白分子和/或過(guò)氧氧化還原酶分子的DNA分子或一個(gè)片段或其同源物的核苷酸序列如圖1、2所示。
12．一種如圖2或圖4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其多肽片段。
13．一種載體，其特征在于包括一種或多種如權(quán)利要求11所定義的核苷酸序列。
14．一種轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞，其特征在于包括權(quán)利要求13所述的載體。
15．一種合成多肽，其特征在于包括，一種或多種組成一種過(guò)氧氧化還原酶和/或一種β-微管蛋白分子的氨基酸序列及其抗原部分的氨基酸序列，本質(zhì)上對(duì)應(yīng)于圖2和/或圖4所示的氨基酸序列的全部或一部分，或與其功能相當(dāng)?shù)淖儺愺w。
16．一種制備重組過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白多肽或其抗原片段或抗原決定簇的工藝過(guò)程，其特征在于包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了的寄主細(xì)胞并從該培養(yǎng)細(xì)胞中分離出所述的過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白多肽或片段或抗原決定簇。
17．一種活的或失活的疫苗配方，其特征在于包括一種減毒或有毒性病毒，或一種寄主細(xì)胞，該寄主細(xì)胞已經(jīng)插入一種如權(quán)利要求11所述的核酸分子，并能激起一種對(duì)由插入核酸分子編碼的多肽的免疫應(yīng)答。
18．當(dāng)施用單克隆或多克隆抗體給哺乳動(dòng)物時(shí)，能夠誘導(dǎo)對(duì)過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子的免疫性，所述抗體具有對(duì)一種或更多種抗體的可變區(qū)域具有親和性，所述更多的抗體是對(duì)所述過(guò)氧氧化還原酶和/或β-微管蛋白分子具有親和性。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有過(guò)氧氧化還原蛋白酶和/或β－微管蛋白抗原物質(zhì)所組成的疫苗。肝片吸蟲(chóng)或雙腔吸蟲(chóng)的疫苗較適合用在抗哺乳動(dòng)物腸蟲(chóng)的寄生傳染。進(jìn)一步涉及編碼過(guò)氧氧化還原蛋白酶和/或β－微管蛋白分子的核苷酸序列及其氨基酸序列,包含新述的核苷酸序列的載體以及用該載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1221451SQ9719542
公開(kāi)日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年6月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月11日
發(fā)明者約翰·派厄斯·多爾通, 斯圖爾特·約翰·安德魯斯 申請(qǐng)人:約翰·派厄斯·多爾通, 斯圖爾特·約翰·安德魯斯