專利名稱：：抗mcp-1抗體、組合物、方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對至少一種人單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)蛋白質(zhì)或其片段特異的抗體，包括特定部分或變體，以及抗獨特型抗體，和編碼此類抗MCP-1抗體的核酸，互補核酸，載體，宿主細(xì)胞，以及制備和使用其的方法，包括治療制劑、施用和裝置。相關(guān)領(lǐng)域包含76個氨基酸殘基的8.6kDa蛋白質(zhì)人單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)(也稱為CCL-2),是細(xì)胞因子的趨化因子-P(或C-C)家族成員。趨化因子是低分子量(8-10kDa)、誘導(dǎo)型、分泌的、促炎趨化細(xì)胞因子，其已顯示在組織損傷位點處特定白細(xì)胞亞群的血管周圍變移和累積中起重要作用。取決于4個保守半胱氨酸的定位已定義了2個主要家族。CXC或a-趨化因子主要吸引嗜中性粒細(xì)胞，而CC或j3-趨化因子主要吸引單核細(xì)胞和除嗜中性粒細(xì)胞以外的其他白細(xì)胞(Leonard和Yoshimura等人，1990)。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)家族成員形成了趨化因子C-C家族的主要組分，且視為單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和活化的淋巴細(xì)胞募集中涉及的主要趨化因子?？紤]來自不同物種的MCP-1的同源性，人和猴MCP-1只有2個氨基酸不同，從而揭示了97%的序列同一性，而包含125個氨基酸殘基的13.8kDa蛋白質(zhì)-鼠MCP-l在分子大小和糖基化程度方面與人MCP-1不同。趨化因子受體屬于G蛋白偶聯(lián)的、7跨膜(7TM)結(jié)構(gòu)域受體(GPCRs，也稱為蛇形受體)大家族?；谟?996年趨化細(xì)胞因子戈登研討會(GordonResearchConference)確定的受體命名法，結(jié)合CXC5趨化因子的趨化因子受體被命名為CXCRs,且結(jié)合CC趨化因子的受體被命名為CCRs。MCP-1已知結(jié)合且通過趨化因子受體CCR2發(fā)信號。CCR2是在許多細(xì)胞上表達(dá)的7個跨膜跨越G蛋白偶聯(lián)受體，所述細(xì)胞包括單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。2種MCP-1特異性受體CCR2A和CCR2B已被克隆，所述受體響應(yīng)納摩爾(nM)濃度的MCP-1發(fā)信號。CCR2A(CC-CKR2A)和CCR2B(CC-CKR2A)代表編碼具有可變剪接的羧基尾的2種MCP-1特異性受體的2種cDNAs。MCP-1以高親和力結(jié)合2種同工型。MCP-1在表達(dá)CCR2B的細(xì)胞但不在表達(dá)CCR2A的細(xì)胞中誘導(dǎo)《丐流動。與表達(dá)CCR2A的細(xì)胞比較，5倍小的MCP-1在表達(dá)CCR2B的細(xì)胞中誘導(dǎo)趨化性。與人MCP-1具有某些功能和序列同源性的其他蛋白質(zhì)是已知的。與MCP-1(GenBankNP—002973)尤其相似的是MCP-2(GenBankNP—005614)和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)(GenBankP—51671);MCP-2與MCP-1具有61.8%的序列同一性，且嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-l與MCP-1具有63.2%的序列同一性。這些蛋白質(zhì)在人穩(wěn)態(tài)機制和病理學(xué)中的活性和受累譜范圍不如對于MCP-1同源物那樣充分了解。例如MCP-2(重新命名為CCL8)與MCP-1和MCP-3(重新命名為CCL8,GenbankNP—006264)緊密相關(guān)，且使用CCR1以及CCR2B作為其功能受體。MCP-3與命名為D6的受體結(jié)合。MCP-3還與CCR10和CCR1結(jié)合。MCP-3蛋白質(zhì)(97個氨基酸)序列顯示與MCP-174%的同一性，和與MCP-258%的同源性。分泌的MCP-3在N糖基化方面與MCP-1不同。MCP-4(重新命名為CCL13,GenbankNP—005399)與3種已知的單核細(xì)胞趨化蛋白共有56-61%的序列同一性，且與嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-160%相同。MCP-4的功能似乎與MCP-3和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的那些功能高度相似。如同MCP-3,MCP-4是對于單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的有效化學(xué)引誘物。它對于嗜中性粒細(xì)胞是無活性的。在單核細(xì)胞上，MCP-4與識別MCP-1、MCP-3、RANTES(CCL5)和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的受體(CCR1和CCR3受體)結(jié)合，且顯示與嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-1完全交叉脫敏。MCP-5是鼠CC-趨化因子且與人MCP-1最緊密相關(guān)(66%的氨基酸同一性)。關(guān)于MCP-5的基因符號是SCYA12(重新命名為CCL12)。用趨化因子受體CCR2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞已顯示對MCP-5應(yīng)答。關(guān)于細(xì)胞因子和趨化因子的一般信息，參見http:〃www.copewithcytokines.de/cope.cgi,且關(guān)于目前的分類系統(tǒng),參見ZlotnikA.,Yoshie0.2000.Chemokines:anewclassificationsystemandtheirroleinimmunity.Immunity12:121-127。125I-MCP-1與單核細(xì)胞結(jié)合，且斯卡查德圖分析表明單核細(xì)胞具有每個細(xì)胞1700個結(jié)合位點的最低限度，其Kd為~2nM(Yoshimura和Leonard,1990)。使用人單核細(xì)胞的隨后平衡結(jié)合實驗揭示每個細(xì)胞存在大約3000個結(jié)合位點，其Kd為~0.77nM(Ernst等人，1994)。125I-MCP-1還顯示與表達(dá)CCR2受體的dEoL-3細(xì)胞的高親和力結(jié)合，其Kd值為0.4nM(Sarau等人，1997),從而證實MCP-l與其受體的亞納摩爾親和力。為了鑒定MCP-l接觸其受體CCR2的區(qū)域，所有表面暴露的殘基用丙氨酸代替。某些殘基也突變成其他氨基酸，以鑒定特定位置處電荷、疏水性或芳香性的重要性。2個主要堿性殘基的簇(R24、K35、K38、K49和Y13)由35A疏水溝分開，使結(jié)合水平減少15-100倍。數(shù)據(jù)暗示其中MCP-l的大表面積接觸受體，且許多弱相互作用的累積導(dǎo)致對于野生型(WT)蛋白質(zhì)觀察到的35pM親和力的模型(Hemmerich等人，1999)。文獻(xiàn)中從2nM下降至35pM的親和力范圍可能是由于使用的測定和分別的測定限制。與人MCP-l具有某些功能和序列同源性的其他蛋白質(zhì)是已知的。與MCP-l(GenBankNP—002973)尤其相似的是MCP-2(GenBankNP—005614)和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(GenBankP—51671);MCP-2與MCP-l具有61.8%的序列同一性，且嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-1與MCP-l具有63.2%的序列同一性。這些蛋白質(zhì)在人穩(wěn)態(tài)機制和病理學(xué)中的活性和受累譜范圍不如對于MCP-1同源物那樣充分了解。例如MCP-2與MCP-l和MCP-3(GenbankNP—006264)緊密相關(guān)，且使用CCR1以及CCR2B作為其功能受體。MCP-3與命名為D6的受體結(jié)合。MCP-3還與CCR10結(jié)合。MCP-3蛋白質(zhì)(97個氨基酸)序列顯示與MCP-l74%的同一性，和與MCP-258%的同源性。分泌的MCP-3在N糖基化方面與MCP-l不同。MCP-4(GenbankNP—005399)與3種已知的單核細(xì)胞趨化蛋白共有56-61%的序列同一性，且與嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-l60%相同。MCP-4的功能似乎與MCP-3和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的那些功能高度相似。如同MCP-3,MCP-4是對于單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞7的有效化學(xué)引誘物。它對于嗜中性粒細(xì)胞是無活性的。在單核細(xì)胞上，MCP-4與識別MCP-l、MCP-3、RANTES(CCR2)的受體結(jié)合。在嗜酸性粒細(xì)胞上，MCP-4具有與MCP-3、RANTES和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子相似的功效和效力。MCP-4與嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子共有受體(CCR1和CCR3),且顯示與嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-1完全交叉脫敏。能夠結(jié)合MCP-1的其他抗體已一皮報道JP9067399公開了從分離的血細(xì)胞獲得的抗體，且JP05276986公開了分泌IgM抗人MCP-l的雜交瘤。最近能夠結(jié)合多個P-趨化因子包括MCP-1的抗體(WO03048083)以及也結(jié)合嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的MCP-1結(jié)合抗體(US20040047860)被公開。因此，需要提供對人MCP-1特異的人抗體，其用于在治療中使用，以減少或消除MCP-1依賴性疾病的癥狀，以及超過已知抗體或其片段的改善。發(fā)明概述本發(fā)明提供了如本文描述和使得可行的，與本領(lǐng)域已知的那些組合的，分離的人、靈長類動物、嚙齒類動物、哺乳動物、嵌合、人源化和/或CDR嫁接抗MCP-1抗體及其他免疫球蛋白衍生蛋白質(zhì)、片段、切割產(chǎn)物和其他特定部分及其變體，以及抗MCP-1抗體組合物、編碼或互補核酸、載體、宿主細(xì)胞、組合物、制劑、裝置、轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物，以及制備和使用其的方法。除了如本文描迷的本發(fā)明的抗體組合物之外，本發(fā)明的抗體由其對人MCP-1的親和力、對人MCP-1的特異性和阻斷人MCP-1的生物活性的能力限定。本發(fā)明還提供了至少一種分離的抗MCP-1抗體，例如但不限于，如本文描述的至少一種抗體、抗體融合蛋白或片段。根據(jù)本發(fā)明的抗體包括包含分子的任何蛋白質(zhì)或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少部分，例如但不限于，至少一個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如但不限于，如表4A、B、D和E(SEQIDNO:6-26中提供的重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈的互補性決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分；和任選地與構(gòu)架區(qū)(例如，表4C(SEQIDN0:2-5)中描述的FR1、FR2、FR3、FR4或其片段功能性結(jié)合，進(jìn)一步任選包含人免疫球蛋白的至少CH1、鉸鏈、CH2或CH3。至少一種抗體氨基酸序列可以進(jìn)一步任選包含如本文描述或如本領(lǐng)域已知的至少一種特定置換、插入或缺失。在實施方案中，抗體的配體結(jié)合部分包含SEQIDNO:27和28。在一個方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含包括SEQIDNOS:27或28的至少一個可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含(i)IDNOS:6、7和9的所有重鏈互補性決定區(qū)(CDR)氨基酸序列；或(ii)SEQIDNOS:13、14和16的所有輕鏈CDR氨基酸序列。在一個方面，本發(fā)明提供了包含編碼特異性抗MCP-1抗體的多核苷酸、與其互補或雜交的分離的核酸分子，其包含至少一種特定序列、結(jié)構(gòu)域、部分或其變體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含所述抗MCP-1抗體核酸分子的重組載體，包含此類核酸和/或重組載體的宿主細(xì)胞，以及制備和/或使用此類抗體核酸、載體和/或宿主細(xì)胞的方法。本發(fā)明的至少一種抗體結(jié)合對至少一種MCP-1蛋白質(zhì)或變體或衍生物例如SEQIDNO:1中提供的那些特異的至少一種特定表位。所述至少一種表位可以包含包括所述蛋白質(zhì)的至少一個部分的至少一個抗體結(jié)合區(qū)域，所述表位優(yōu)選包含其至少一個部分的至少l-5個氨基酸，例如但不限于，所述蛋白質(zhì)的至少一個功能性、細(xì)胞外、可溶、親水、外部或細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，或其任何部分。所述至少一種抗體可以任選包含如SEQIDNOS:6、7、9、13、14和16提供的至少一個互補性決定區(qū)(CDR)(例如分別如SEQIDNos:27和28提供的重或輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2或CDR3)的至少一個特定部分；和任選進(jìn)一步包含至少一個恒定或可變構(gòu)架區(qū)或其任何部分，其中所述抗體阻斷、抑制或阻止至少一種活性，例如但不限于，MCP-1與細(xì)胞表面上的受體結(jié)合、CCR2受體內(nèi)在化、MCP-1刺激的Ca2+動員或任何其他合適的已知MCP-1測定?？筂CP-1抗體因此可以根據(jù)已知方法篩選相應(yīng)活性，例如但不限于，針對MCP-1蛋白質(zhì)的至少一種生物活性。本發(fā)明進(jìn)一步提供了針對本發(fā)明的至少一種MCP-1抗體的至少一種MCP-1抗獨特型抗體?？躬毺匦涂贵w包括包含分子的任何蛋白質(zhì)或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少部分，例如但不限于，至少一個配體結(jié)合部分(LBP)，例如但不限于，重或輕鏈的互補性決定區(qū)9(CDR),或其配體結(jié)合部分，重鏈或輕鏈可變區(qū)，重鏈或輕鏈恒定區(qū)，構(gòu)架區(qū)，或其任何部分，它們可以摻入本發(fā)明的抗獨特型抗體內(nèi)。本發(fā)小鼠、兔、大鼠、4齒類動:、^長類動物等。一、在一個方面，本發(fā)明提供了包含編碼至少一種MCP-1抗獨特型抗體的多核苷酸、與其互補或雜交的分離的核酸分子，其包含至少一種特定序列、結(jié)構(gòu)域、部分或其變體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含所述MCP-1抗獨特型抗體編碼核酸分子的重組載體，包含此類核酸和/或重組載體的宿主細(xì)胞，以及制備和/或使用此類抗獨特型抗體核酸、載體和/或宿主細(xì)月包的方法。本發(fā)明還提供了用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)至少一種抗MCP-1抗體或MCP-1抗獨特型抗體的至少一種方法，其包括如本文所述的在其中至少一種抗MCP-1抗體以可檢測和/或可回收的量表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了至少一種組合物，其包含(a)如本文描述的分離的MCP-1抗獨特型抗體編碼核酸和/或抗體；和(b)合適的載體或稀釋劑。根據(jù)已知載體或稀釋劑，載體或稀釋劑可以任選是藥學(xué)可接受的。組合物可以任選進(jìn)一步包含至少一種另外的化合物、蛋白質(zhì)或組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了至少一種抗MCP-1抗體方法或組合物，如本領(lǐng)域已知的和/或如本文描述的，其用于施用治療有效量以調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種MCP-1相關(guān)狀況和/或在相關(guān)狀況之前、之后或期間。本發(fā)明還提供了遞送治療或預(yù)防有效量的根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗MCP-1抗體的至少一種組合物、裝置和/或方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了至少一種抗MCP-1抗體方法或組合物，如本領(lǐng)域已知的和/或如本文描述的，其用于診斷細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種MCP-1相關(guān)狀況和/或在相關(guān)狀況之前、之后或期間。本發(fā)明還提供了遞送根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗MCP-1抗體用于診斷的至少一種組合物、裝置和/或方法。在一個方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含包括SEQIDNOS:27或28的至少一個可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含(i)SEQIDNOS:6、7和8或9的所有重鏈互補性決定區(qū)(CDR)氨基酸序列；或(ii)SEQIDNOS:13、14和15或16的所有輕鏈CDR氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含(i)SEQIDNOS:6、7和8或9的所有重鏈互補性決定區(qū)(CDR)氨基酸序列；或(ii)SEQIDNOS:13、14和15或16的所有輕鏈CDR的氨基酸序列中的至少一個。所述至少一種抗體可以任選進(jìn)一步具有下列至少一種以選自至少10—9M、至少10-1QM、至少10—"M或至少1(T12M的至少一種的親和力結(jié)合MCP-1;基本上中和至少一種MCP-1蛋白質(zhì)的至少一種活性。還提供的是編碼至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體的分離的核酸；包含分離的核酸的分離的核酸載體，和/或包含分離的核酸的原核或真核宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以任選是選自NOS、COS-l、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、YB2/0、SP2/0、HeLa、骨髓瘤、或淋巴瘤細(xì)胞、或其任何衍生、無限增殖化或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的至少一種。還提供的是生產(chǎn)至少一種抗MCP-1抗體的方法，其包括在體外、體內(nèi)或原位條件下翻譯抗體編碼核酸，從而使得MCP-1抗體以可4企測或可回收的量表達(dá)。還提供的是包含至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體和至少一種藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑的組合物。還提供的是用于診斷或治療細(xì)胞、組織、器官或動物中的MCP-1相關(guān)狀況的方法，其包括(a)使組合物與細(xì)胞、組織、器官或動物接觸，或給細(xì)胞、組織、器官或動物施用組合物，所述組合物包含有效量的本發(fā)明的至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體。還提供的是包含本發(fā)明的至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體的醫(yī)學(xué)裝置，其中所述裝置適合于經(jīng)由選自下列的至少一種形式接觸或施用至少一種MCP-1抗體腸胃外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intrarticular)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、嚢內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)(intracelebellar)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、一見網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、病灶內(nèi)、快速灌注(bolus)、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮。還提供的是用于人藥物或診斷用途的制品，其包含包裝材料和容器，后者包含溶液、顆?；蚶鋬龈稍镄问降谋景l(fā)明的至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體。還提供的是用于生產(chǎn)本發(fā)明的至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體的方法，其包括提供能夠表達(dá)可回收量的抗體的宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明中進(jìn)一步提供的是通過上述方法生產(chǎn)的至少一種抗MCP-1抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本文描述的任何發(fā)明。序列表簡述SEOIDNO:描述1用于選擇抗MCP-1結(jié)合劑的人MCP-1(CCL2)和變體2VH1A重鏈可變序列FR1、CDR1、FR2、CDR2變體、FR3、CDR3、FR43VH3重鏈可變序列FR1、CDR1、FR2、CDR2變體、FR3、CDR3、FR44k3輕鏈可變序列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3變體、FR45輕鏈可變序列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3變體、FR46VH1ACDR1所有MOR034717VH1ACDR23781、3790、CNTO8888VH1ACDR238999VH1ACDR3所有MOR0347110VH3CDR1所有MOR0354811VH3CDR23744、374712VH3CDR3所有MOR0354813k3CDR1所有MOR0347114k3CDR2所有MOR0347115k3CDR3378116k3CDR33790、CNT088812<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>發(fā)明詳述本發(fā)明提供了至少一種純化的、分離的、重組和/或合成的抗MCP-l人、靈長類動物、嚙齒類動物、哺乳動物、嵌合、人源化、工程改造或CDR嫁接抗體和對于其的MCP-1抗獨特型抗體，以及包含至少一種多核芬酸的組合物和編碼核酸分子，所述多核香酸編碼至少一種抗MCP-1抗體或抗獨特型抗體。本發(fā)明進(jìn)一步包括但不限于，制備和使用此類核酸和抗體和抗獨特型抗體的方法，包括診斷和治療組合物、方法和裝置。引用本文引用的所有出版物或?qū)＠颊w引入本文作為參考，因為它們顯示本發(fā)明時的技術(shù)發(fā)展水平，和/或提供了本發(fā)明的描述和實現(xiàn)。出版物指任何科學(xué)或?qū)＠霭嫖铮蛞匀魏谓橘|(zhì)形式可獲得的任何其他信息，包括所有記錄的、電子的或印刷的形式。下列參考文獻(xiàn)整體引入本文4乍為參考Ausubel等人,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,NY(1987-2004);Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NY(1989);Harlow禾口Lane,antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY(1989);Colligan等人，eds.,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY(1994-2004);Colligan等人,CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,NY，(1997-2004)。縮寫aa:氨基酸；BSA:牛血清清蛋白；CDR:互補性決定區(qū)；ECL:電化學(xué)發(fā)光；HuCAL:人組合抗體文庫；HSA:人血清清蛋白；MCP-1:單核細(xì)胞趨化蛋白-l;Ig:免疫球蛋白；IPTG:異丙基(3-D-硫代半乳糖香；mAb:單克隆抗體；PBS:磷酸緩沖鹽水，pH7.4;SET:溶液平衡滴定；VH:免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；VL:免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；定義如本文4吏用的，"抗CCL2抗體"、"抗MCP-1抗體"、"抗MCP-1抗體部分"、或"抗MCP-1抗體片段"和/或"抗MCP-l抗體變體"等包括包含分子的任何蛋白質(zhì)或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少部分，例如但不限于，重鏈或輕鏈的至少一個互補性決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分，重鏈或輕鏈可變區(qū)，重鏈或輕鏈恒定區(qū)，構(gòu)架區(qū)，或其任何部分，或MCP-1受體或結(jié)合蛋白的至少一個部分，它們可以摻入本發(fā)明的抗體內(nèi)。此類抗體任選進(jìn)一步影響特定配體，例如但不限于其中此類抗體體外、原位和/或體內(nèi)調(diào)節(jié)、減少、增加、拮抗、激動(angonize)、緩和、減輕(deviates)、阻斷、抑制、消除和/或干擾至少一種MCP-1活性或結(jié)合，或MCP-1受體活性或結(jié)合。作為非限制性例子，本發(fā)明的合適的抗MCP-1抗體、特定部分或變體可以結(jié)合至少一種MCP-1、或其特定部分、變體或結(jié)構(gòu)域。如本文使用的，"表位"指能夠與抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)片段或特征。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團例如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及比電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于與前者而不是后者的結(jié)合在變性溶劑的存在下喪失。包括由MCP-1分子的構(gòu)象折疊產(chǎn)生的蛋白質(zhì)表位，所述蛋白質(zhì)表位在來自MCP-1分子線性序列的不同部分的氨基酸在3維空間中以緊密接近性集合時出現(xiàn)。"MCP-1"意指在NCBI記錄登記號NP一002973中參考的76個氨基酸的序列，且名稱不一地稱為MCP(單核細(xì)胞趨化蛋白)、SMC-CF(平滑肌細(xì)胞趨化因子)、LDCF(淋巴細(xì)胞衍生趨化因子)、GDCF(神經(jīng)膠質(zhì)瘤衍生單核細(xì)胞趨化因子)、TDCF(肺瘤衍生趨化因子)、HC11(人細(xì)胞因子11)、MCAF(單核細(xì)胞趨化及活化因子)?；蚍柺?4SCYA2，在人染色體17上的JE基因，且新名稱是CCL2(Zlotnik,Yoshie2000.Immunity12:121-127)。JE是人MCP-1/CCL2的小鼠同源物。如本文使用的，術(shù)語"人抗體，，指其中基本上蛋白質(zhì)的每個部分(例如CDR、構(gòu)架、CL、Ch結(jié)枸域(例如Ch1、Ch2、CH3)、鉸鏈、(VL、VH))都來源于人種系免疫球蛋白基因序列的重組事件或來自成熟人抗體序列的抗體。除了從人中分離的抗體以外，此類人抗體可以通過用人免疫球蛋白種系基因免疫能夠發(fā)動免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因小鼠來獲得(Lonberg等人,尺ev/m應(yīng)wo/13(1):65-93(1995)和Fishwald等人，A^B,o&c/wo/14(7):845-851(1996)),或可以如本文所述選自人抗體譜文庫。此類人基因序列的來源可以在任何合適的文庫中找到,例如VBASE,人抗體基因(http:〃www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc)或其翻i,產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫，或在http:〃people.crvst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/上,它給出了基于其氨基酸相似性分類成分組的人抗體。在這個定義的范圍內(nèi)的是復(fù)合抗體或人復(fù)合抗體的功能片段，后者包括來自一種或多種人抗體序列的構(gòu)架區(qū)和來自2種不同的人或非人來源的CDR區(qū)。在"人抗體"定義內(nèi)的是復(fù)合抗體或人復(fù)合抗體的功能片段，后者包含來自種系和重排人抗體序列的構(gòu)架區(qū)和來自2種不同來源抗體的CDR區(qū)。依照本公開內(nèi)容的人復(fù)合抗體或人復(fù)合抗體的功能片段包括來自一種或多種人抗體序列的構(gòu)架區(qū)，和來源于人或非人抗體序列的CDR區(qū)，或可以是完全合成的。因此，人抗體不同于嵌合或人源化抗體。應(yīng)當(dāng)指出人抗體可以由能夠表達(dá)功能性重排的人免疫球蛋白(例如重鏈和/或輕鏈)基因的非人動物或原核或真核細(xì)胞產(chǎn)生。此外，當(dāng)人抗體是單鏈抗體時，它可以包含在天然人抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的接頭肽。例如，F(xiàn)v可以包含連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的接頭肽，例如2到約8個甘氨酸或其他氨基酸殘基。此類接頭肽視為具有人起源。"人源化"形式的非人(例如鼠)抗體是具有來源于非人免疫球蛋白的基本上置換的序列部分的嵌合抗體。在很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的CDR(互補性決定區(qū)，其也稱為高變區(qū))殘基由具有所需特異性、親和力和能力的來自非人物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的CDR殘基置換。在某些情況下，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人殘基置換。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。15進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步精制抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上所有至少一個，且一般是2個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有高變區(qū)對應(yīng)非人免疫球蛋白的那些，且所有或基本上所有FRS是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc),—般是人IgG免疫球蛋白的那種。關(guān)于更多的細(xì)節(jié)，參見Jones等人，Nature321:522-525(1986);Reichmann等人，Nature332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.StructBiol.2:593-596(1992)。如本文使用的，抗體的Kd指抗體對預(yù)定抗原的解離常數(shù)KD，且是抗體對特定把的親和力的測量。高親和力抗體對于預(yù)定抗原具有10—8M或更少的Kd,更優(yōu)選10^M或更少，且再更優(yōu)選10"Gm或更少。如本文使用的，術(shù)語"K化"或"KD"、或"Kd"意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。"Kd"是解禹速率(k2)也稱為"解離率(off-rate)(k。ff)"與結(jié)合速率(kl)或"結(jié)合率(on-rate)(k。n)"的比率。因此，KD等于k2/k!或k。ff/k。n，且表示為摩爾濃度(M)。它遵循下列原則，Kd越小，結(jié)合越強。因此與1(T9M(或InM)比較，1(T6M(或1微摩爾)的KD表明弱結(jié)合。如本文使用的，術(shù)語"對......特異"和"特異性結(jié)合"和"特異地結(jié)合"指抗體以比對于其他抗原或蛋白質(zhì)更大的親和力與預(yù)定抗原結(jié)合。一般地，抗體以10^M或更少的解離常數(shù)(KD)結(jié)合，且與預(yù)定抗原結(jié)合的KD為其與除預(yù)定抗原以外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)結(jié)合的Kd的至少1/2。短語"識別抗原的抗體"和"對抗原特異的抗體"在本文中可與術(shù)語"與抗原特異性結(jié)合的抗體"或"抗原特異性抗體"例如MCP-1特異性抗體互換使用。1.本發(fā)明的抗體的制備對人MCP-1蛋白質(zhì)或其片段，例如分離的和/或MCP-1蛋白質(zhì)或其部分(包括合成分子，例如合成肽)，特異的人抗體的制備可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適技術(shù)來進(jìn)行。人抗體可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來產(chǎn)生。在一個實施方案中，人抗體選自噬菌體文庫，其中那種噬菌體文庫表達(dá)人抗體(Vaughanetloal.NatureBiotechnology14:309-314(1996):Sheets等人PITAS(USA)95:6157-6162(1998));Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.，227:381(1991);Marks等人丄Mol.Biol.,222:581(1991))。人抗體還可以通過將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動物內(nèi)來制備，例如其中內(nèi)源性免疫球蛋白基因已被部分或全部滅活的小鼠。例如，包含功能性重排的人免疫球蛋白重鏈轉(zhuǎn)基因，以及包含來自可以經(jīng)歷功能性重排的人免疫球蛋白輕鏈基因座的DNA的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，可以用人MCP-1或其片段免疫以引發(fā)抗體的產(chǎn)生。需要時，抗體產(chǎn)生細(xì)胞可以被分離，且雜交瘤或其他無限增殖化的抗體產(chǎn)生細(xì)胞可以如本文描述的和/或如本領(lǐng)域已知的進(jìn)行制備?？商娲?，抗體、特定部分或變體可以使用編碼核酸或其部分在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)。用合適抗原攻擊后，觀察到人抗體產(chǎn)生，所述人抗體在所有方面都非常類似在人中可見的那種，包括基因重排、裝配和抗體譜。這種方法在例如美國專利號5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016,以及下列科學(xué)出版物中描述Marks等人，Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg等人，Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-13(1994);Fishwild等人，NatureBiotechnology14:845-51(1996);Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996);Lonberg和Huezar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)?？商娲兀丝贵w可以經(jīng)由產(chǎn)生針對耙抗原的抗體的人B淋巴細(xì)胞(此類B淋巴細(xì)參見，例i口Cole等人,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,第77頁(1985);Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95(1991);和美國專利號5,750,373?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞還可以從人或其他合適動物的外周血，或優(yōu)選脾或淋巴結(jié)獲得，所述人或其他合適動物已用目的抗原進(jìn)行免疫。任何其他合適的宿主細(xì)胞還可以用于表達(dá)編碼本發(fā)明的抗體、其特定片段或變體的異源或內(nèi)源核酸。融合細(xì)胞(雜交瘤)i通過有限;釋或細(xì)胞分選其他已:口方法進(jìn)行克隆。、產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的細(xì)胞可以通過合適測定(例如ELISA)進(jìn)行選擇。在一種方法中，雜交瘤通過使合適的無限增殖細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系，例如但不限于，Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-l、L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2SA3、Sp2MAI、Sp2SSl、Sp2SA5、U937、MLA144、ACTIV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、17COS、RAJI、NIH3T3、HL-60、MLA144、NAMAIWA、NEUR02A等，或異種骨髓瘤(heteromylomas),其融合產(chǎn)物，或由其衍生的任何細(xì)胞或融合細(xì)胞，或如本領(lǐng)域已知的任何其他合適的細(xì)月包系，參見，例如www.atcc.org，www.lifetech.com.,等,與抗體產(chǎn)生纟田月包融合來產(chǎn)生,所述抗體產(chǎn)生細(xì)胞例如但不限于分離或克隆的脾、外周血、淋巴、扁桃體、或其他免疫或包含B細(xì)胞的細(xì)胞，或任何其他細(xì)胞，它們表達(dá)重或輕鏈恒定或可變或構(gòu)架或CDR序列，作為內(nèi)源或異源核酸、作為重組或內(nèi)源的、病毒、細(xì)菌、藻類、原核生物、兩棲動物、昆蟲、爬^f亍動物、魚、哺乳動物、嚙齒類動物、馬、綿羊、山羊、羊、靈長類動物、真核生物、基因組DNA、cDNA、rDNA、線粒體DNA或RNA、葉綠體DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、單、雙、或三鏈、雜交的、等或其任意組合。參見，例如整體引入本文作為參考的Ausubel,同上，和Colligan,Immunology,同上，第2章。與人MCP-1結(jié)合且包含限定的重或輕鏈可變區(qū)的人抗體可以使用合適方法例如噬菌體展示(Katsube,Y.等人，/^JA^/.MeJ,1(5):863-868(1998))進(jìn)行制備。可以使用產(chǎn)生或分離具有所需特異性的抗體的其他合適方法，其包括但不限于從肽或蛋白質(zhì)文庫中選擇重組抗體的方法(例如但不限于，噬菌體、核糖體、寡核苷酸、RNA、cDNA等，展示文庫；例如如可乂人下歹'J獲4尋的CambridgeantibodyTechnologies,Cambridgeshire,UK;MorphoSys,Martinsreid/Planegg,DE;Biovation,Aberdeen,Scotland,UK;Biolnvent,Lund,Sweden;DyaxCorp.,Enzon，Affymax/Biosite;Xoma,Berkeley,CA;Ixsys。參見，例如EP368,684,PCT/GB91/01134;PCT/GB92/01755;PCT/GB92/002240;PCT/GB92/00883;PCT/GB93/00605;US08/350260(5/12/94);PCT/GB94/01422;PCT/GB94/02662;PCT/GB97/01835;(CA窗RC);WO90/14443;WO90/14424;WO90/14430;PCT/US94/1234;W092/18619;WO96/07754;(Scripps);W096/13583,WO97/08320(MorphoSys);WO95/16027(Biolnvent);WO88/06630;WO90/3809(Dyax);US4,704,692(Enzon);PCT/US91/02989(Affymax);WO畫6283;EP371998;EP550400;(Xoma);EP229046;PCT/US91/07149(Ixsys);或隨機產(chǎn)生的肽或蛋白質(zhì)-US5723323,5763192，5814476,5817483，5824514,5976862,WO86/05803,EP590689(Ixsys,現(xiàn)在的AppliedMolecularEvolution(AME),各自都完整地引入本文作為參考)，或依賴轉(zhuǎn)基因動物免疫接種的那種(例如SCID小鼠，Nguyen等人，Microbiol.Immunol.41:901-907(1997);Sandhu等人，Crit.Rev.Biotechnol.16:95-118(1996);Eren等人,Immunol.93:154-161(1998),各自整體引入本文作為參考。具體實施方案申請人例示了從噬菌體展示人Fab文庫開始選擇和制備人抗體的方法，所述人抗體具有針對人MCP-1的所需親和力、特異性和生物活性?？傊?，從所有10次淘選篩選17856個克隆，從而導(dǎo)致產(chǎn)生1104個初步命中和最后26個獨特Fabs。為了提供例示保持與天然存在的MCP-1受體結(jié)合能力的抗原的獨特配體，化學(xué)合成人MCP-1及其類似物或"突變蛋白質(zhì)"且進(jìn)行修飾以用于在選擇、親和力和生物測定中特別使用。人MCP-1lie41和人MCP-1Tyr"用于初步固相淘選以及抗體選擇和親和力成熟測定的其他方面，且與MCP-1突變蛋白質(zhì)的生物素化形式Ile41、Lys(生物素-PEG4)69)和(Ile41，Lys(生物素-PEGj75(SEQIDNO:1)—樣如本文描述。因為26個獨特Fabs中無一在特定的生物測定中具有測量為KD<0.5nM的親和力或所需IC5o值，所以成熟是必需的。用于親和力成熟的候選物作為Fabs進(jìn)行選擇，且分別的IgGs與成熟過程平行進(jìn)行分析。選擇標(biāo)準(zhǔn)是1)在整個細(xì)胞受體結(jié)合測定中的活性，2)在鈣動員測定中的活性，3)對人MCP-1的親和力，4)對人MCP-1的特異性，和5)對短尾猴(cyno)MCP-1的親和力和與天然MCP-1的結(jié)合。溶液中的MCP-1的Fab捕獲才莫式Biacore親和力測量對于4巴成熟候選物分等良好地起作用，且親和力在49-406nM范圍內(nèi)。最佳的親本Fab顯示50nM的親和力，從而表明親和力必須最優(yōu)化至少100倍以達(dá)到親和力成功標(biāo)準(zhǔn)。此外與短尾猴和天然人MCP-1的結(jié)合可以在Fab捕獲模式中檢測到，這是關(guān)于成熟的另外先決條件。與短尾猴MCP-1的親和力在與對于人MCP-1相同的范圍內(nèi)。由于可能的修飾，如例如糖基化，必須顯示抗體不僅識別合成或重組MCP-1,而且還識別天然MCP-1,所述天然MCP-1內(nèi)源性表達(dá)和從PANC-1人細(xì)胞上清液中純化。對MCP-1的特異性在Biacore的抗體捕獲才莫式中進(jìn)行測量，其中加入100nM各種趨化因子且檢測結(jié)合信號。用于成熟的大多數(shù)候選Fab是特異的，而2個顯示對同源物趨化因子相同的交叉反應(yīng)性。Fab的非常重要的特征是中和活性，且設(shè)立了幾種不同的測定以分析這種活性。1251MCP-1THP-1細(xì)胞結(jié)合測定是最靈敏的測定法，這在最優(yōu)化后是特別重要的。親本Fabs顯示10-650nM的ICso值。除了放射性配體結(jié)合測定之外，計劃了其他次級生物測定法以證明在MCP-1下游信號傳導(dǎo)途徑的不同水平上的中和活性。吸引單核細(xì)胞是MCP-1的主要功能之一，但最可能是由于缺少活性、共純化因子或內(nèi)毒素，親本Fabs在趨化性測定中不起作用，且因此同意只測試分別的IgGl,而不是在這種測定中設(shè)法使Fab起作用。另一個下游信號傳導(dǎo)事件是鈣釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。事實上在放射性配體結(jié)合測定中顯示中和活性的所有Fabs都在THP-1細(xì)胞中抑制MCP-1誘導(dǎo)的4丐動員，其IC5o為0.1-3pM。必須顯示親本Fabs的生物活性在轉(zhuǎn)化成IgG形式后被完全保留。如預(yù)期的，所有分別的IgG在放射性配體結(jié)合測定、鈣動員測定和甚至趨化性測定中都顯示活性，從而最終證明所有IgGs都保留了在Fab形式中可見的活性且甚至抑制MCP-1誘導(dǎo)的趨化性。對于親和力成熟，根據(jù)其特征選擇了在放射性配體結(jié)合測定中具有10-400nMKd和10-650nM1。5()值的7個不同F(xiàn)abs。隨后將它們分成3組用于文庫克隆和后續(xù)選擇。L-CDR3和H-CDR2最優(yōu)化平行進(jìn)行。產(chǎn)生高質(zhì)量的文庫。對于選擇過程使用溶液淘選，且選擇的嚴(yán)格性通過減少抗原、解離率選擇和非常長的洗滌步驟來增加。對于隨后的篩選過程，使用允許對最優(yōu)化結(jié)合劑高通量分等的BioVeris篩選。篩選對改善的結(jié)合劑的鑒定非常有效地起作用。此外可以鑒定在L-CDR3和H-CDR2中最優(yōu)化的Fabs，從而使得可能對MOR03471和MOR03548衍生物交叉克隆。特別是MOR03471衍生物的交叉克隆非常成功，從而導(dǎo)致與2個最優(yōu)化的起始Fabs比較再提高100倍的親和力。在17個最優(yōu)化Fabs中，選擇16個用于詳細(xì)表征，且最終符合所有成功標(biāo)準(zhǔn)的4個結(jié)合劑來源于親本MOR03471,2個僅在L-CDR3中最優(yōu)化，且2個來自交叉克隆。親和力成熟的候選物分析和序列在實施例3和4、表4-6、以及SEQIDNos:2-28中詳述。成熟后，最優(yōu)化結(jié)合劑的親和力不能在Biacore中進(jìn)行分析，這主要是因為達(dá)到了檢測極限。在MorphoSys，使用非常靈敏的Ko測定方20法，其是與BioVeris技術(shù)組合的溶液平衡滴定(SET)。單價解離常數(shù)可以通過對于Fab和IgG的合適擬合模型進(jìn)行計算。除親和力測量之夕卜，這種方法用于交叉反應(yīng)性研究。最終候選物的親和力在BioVeris中測量對于人和短尾猴MCP-1為10-320pM,且在Centocor通過KinexA證實。使用BioVeris的特異性測試顯示所有測試的16個Fabs和IgGs與人MCP-2沒有交叉反應(yīng)性。幾個Fab和IgG還顯示與人嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子沒有明顯的交叉反應(yīng)性。根據(jù)成功標(biāo)準(zhǔn)，特異性標(biāo)準(zhǔn)確定為在Biacore抗體捕獲才莫式中不與100nM同源物人MCP-2、3、4以及100nM人嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子1、2和3結(jié)合。在BiacoreFab捕獲沖莫式中，所有選擇的Fabs都顯示與MCP-2和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子不同程度的交叉反應(yīng)性。與IgGs比較Fabs推定的略微增加的不穩(wěn)定性和趨化因子的一般非特異性結(jié)合能力可能已促成非特異性結(jié)合。幾個選擇的IgG顯示與同源物趨化因子沒有顯著結(jié)合信號，且在BiacoreIgG捕獲模式中符合特異性成功標(biāo)準(zhǔn)。在溶液平衡滴定實驗中，使用BioVeris，甚至幾個Fabs顯示沒有交叉反應(yīng)性。為了分析在Biacore中檢測的對MCP-2的Fab結(jié)合活性是否轉(zhuǎn)變成中和活性，放射性配體全細(xì)胞結(jié)合測定在Centocor被開發(fā)。在這種測定中測試的Fabs顯示沒有顯著抑制1251標(biāo)記的MCP-2與Thp-1細(xì)胞上的CCR2受體結(jié)合(IC5022)。由于需要少量的lng/mlMCP-1,所以放射性配體結(jié)合測定是這個計劃中最靈敏的測定，測定的IC5o極限對于Fab為約100pM,且對于IgG甚至為20pM。除了親和力之外，這個測定中的活性用于分等和選擇最優(yōu)化結(jié)合劑用于詳細(xì)表征。在最優(yōu)化過程中活性中的整體改善最高達(dá)lOOOx倍，且最后1個MOR03471衍生的Fab-MOR03878顯示110pM的最高親和力。所有測試的IgG在放射性配體結(jié)合測定中保留活性。4個最終的IgG候選物MOR03781、MOR037卯、MOR03850和MOR03878的IC5o值為20-50pM,與Fabs的分別活性比較甚至略微更佳。關(guān)于改善的活性的一個原因是二價IgG每個分子中和2個MCP-l(系數(shù)2x)。IgGs來自純的按比例增大的產(chǎn)品且因此另一個原因可能是抗體的純度、穩(wěn)定性或活性。作為次級生物測定，成功開發(fā)了基于FACS的測定，其測量MCP-1誘導(dǎo)的CCR2受體內(nèi)在化的抑制。最后該測定甚至允許IC50測定和分等。最終的4個候選FabsMOR03790、MOR03850、MOR03781和MOR03878顯示3-5nM的ICso值。21需要天然MCP-1以證實針對合成或重組MCP-1分離的MCP-1抗體的活性。天然MCP-1從PANC1上清液中進(jìn)行純化且用于誘導(dǎo)鈣釋放。:鈣動員。所有MOR03;48衍生的預(yù)先選擇的Fabs在竟^ELISA中完全抑制C775與MCP1的結(jié)合。所有MOR03471衍生的預(yù)先選擇的Fabs在ELISA中顯示部分(~60%)竟?fàn)?，從而表明表位是至少重疊的。最終4個抗體MOR03781、MOR03790、MOR03850和MOR03878滿足所有的成功標(biāo)準(zhǔn)，包括特異性標(biāo)準(zhǔn)和天然MCP-1的中和。生產(chǎn)抗體的其他合適方法用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的其他方法如本領(lǐng)域已知的和/或如本文描述的能夠生產(chǎn)人抗體譜。此類技術(shù)包括但不限于核糖體展示(Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4937-4942(1997年5月)；Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14130-14135(1998年11月));單細(xì)胞抗體生產(chǎn)技術(shù)(例如選擇的淋巴細(xì)胞抗體法("SLAM")(美國專利號5,627,052，Wen等人,J.Immunol.17:887-892(1987);Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-7848(1996));;凝膠微滴和流式細(xì)胞術(shù)(Powell等人，Biotechnol.8:333-337(1990);OneCellSystems,Cambridge,MA;Gray等人，丄Imm.Meth.182:155國163(1995);Kenny等人，Bio/Technol.13:787-790(1995));B細(xì)胞選擇(Steenbakkers等人，Molec.Biol.Reports19:125-134(1994);Jonak等人,ProgressBiotech,第5巻,InVitroImmunizationinHybridomaTechnology,Borrebaeck,ed.，ElsevierSciencePublishersB.V.,Amsterdam,Netherlands(1988))。域眾所周知的。一般地，人源化或工程改造的抗體具有來自非人來源的一個或多個氨基酸殘基，所述非人來源例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人靈長類動物或其他哺乳動物。這些人氨基酸殘基通常稱為"輸入"殘基，它們一般取自已知人序列的"輸入"可變、恒定或其他結(jié)構(gòu)域。已知的人Ig序列是本領(lǐng)域眾所周知的且可以是任何已知序列。用于最優(yōu)化人工改造的人源化抗體的結(jié)合、構(gòu)象和減少的免疫原性的各種策略已得到描述，參見，例如Presta等人JImmunol.151:2623-2632,1993;WO200302019和WO2005080432。此類輸入序列可以用于減少免疫原性，或減少、增強或修飾如本領(lǐng)域已知的結(jié)合、親和力、結(jié)合率、解離率、抗體親抗原性、特異性、半衰期、或任何其他合適的特征。一般部分或全部非人或人CDR序列被維持，而可變和恒定區(qū)的非人序列用人或其他氨基酸置換。抗體還可以任選是人源化的，保留對抗原的高親和力和其他有利的生物學(xué)特性。為了達(dá)到這個目標(biāo)，人源化抗體還可以任選使用親本和人源化序列的三維模型通過親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物的分析過程進(jìn)行制備。三維免疫球蛋白模型通常是可用的且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟悉的。舉例說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序是可用的。這些展示的檢查允許分析在候選免疫球蛋白序列的功能發(fā)揮中殘基的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。以這種方式，可以從共有和輸入序列中選擇和組合FR殘基，從而使得達(dá)到所需抗體特征，例如對靶抗原增加的親和力。一般而言，CDR殘基直接且基本上大多數(shù)涉及影響抗原結(jié)合。本發(fā)明抗體的人源化或工程改造可以使用任何已知方法進(jìn)行，例如但不限于下列中描述的那些Winter(Jones等人，Nature321:522(1986);Riechmann等人，Nature332:323(1988);Verhoeyen等人，Science239:1534(1988)),Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987)，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992);Presta等人，J.Immunol.151:2623(1993),美國專利號5723323、5976862、5824514、5817483、5814476、5763192、5723323、5,766886、5714352、6204023、6180370、5693762、5530101、5585089、5225539;4816567、PCT/:US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755;WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP229246，各自整體引入本文作為參考，包括其中引用的參考文獻(xiàn)?？梢陨a(chǎn)與人抗原結(jié)合的人抗體譜的轉(zhuǎn)基因小鼠可以通過已知方法產(chǎn)生(例如但不限于授予Lonberg等人的美國專利號5,770,428、5,569,825、5,545,806、5,625,126、5,625,825、5,633,425、5,661,016和5,789,650;Jakobovits等人WO98/50433，Jakobovits等人WO98/24893,Lonberg等人WO98/24884,Lonberg等人WO97/13852,Lonberg等人23WO94/25585，Kucherlapate等人WO96/34096，Kucherlapate等人EP0463151Bl,Kucherlapate等人EP0710719Al,Surani等人美國專利號5,545,807,Bruggemann等人WO90/04036,Bruggemann等人EP0438474Bl,Lonberg等人EP0814259A2，Lonberg等人GB2272440A,Lonberg等人A^we368:856-859(1994),Taylor等人，/"f./mww"o/.6(4)579-591(1994),Green爭乂，7Wm^eGe"e"cs7:13-21(1994),Mendez等人，胸群G置"cs15:146-156(1997),Taylor等人，7Vwc/e/c爿c/t^尺^'earc/z20(23):6287-6295(1992),Tuaillon等人，/VocA^W爿cm/S"'t/&490(8)3720-3724(1993)，Lonberg等人，/"f"ev/mmw"o/13(1):65-93(1995)和Fishwald等人，Ato^Wec/mo/14(7):845-851(1996)，所述參考文獻(xiàn)各自整體引入本文作為參考)。一般地，這些小鼠包含包括來自至少一種人免疫球蛋白基因座的DNA的至少一種轉(zhuǎn)基因，所述基因座是功能性重排的，或可以經(jīng)歷功能性重排。此類小鼠中的內(nèi)源免疫球蛋白基因座可以被破壞或缺失以消除動物產(chǎn)生由內(nèi)源基因編碼的抗體的能力。與相似蛋白質(zhì)或片段特異性結(jié)合的抗體篩選可以方便地使用肽展示文庫來完成。這種方法涉及在大型肽集合中篩選具有所需功能或結(jié)構(gòu)的個別成員。肽展示文庫的抗體篩選是本領(lǐng)域眾所周知的。#皮展示的肽序列的長度可以是3-5000個或更多個氨基酸，通常為5-100個氨基酸長，且通常為約8-25個氨基酸長。除用于產(chǎn)生肽文庫的直接化學(xué)合成方法之外，幾種重組DNA方法已得到描述。一種類型涉及在噬菌體或細(xì)胞表面上展示肽序列。每個噬菌體或細(xì)胞包含編碼特定展示的肽序列的核普酸序列。此類方法在PCT專利公開號91/17271、91/18980、91/19818和93/08278中得到描述。用于產(chǎn)生肽文庫的其他系統(tǒng)具有體外化學(xué)合成和重組方法的2個方面。參見PCT專利公開號92/05258、92/14843和96/19256。還參見，美國專利號5,658，754;和5,643,768。肽展示文庫、載體和篩選試劑盒從此類供應(yīng)商如Invitrogen(Carlsbad,CA)和CambridgeantibodyTechnologies(Cambridgeshire,UK)商購可得。參見，例如美國專利號4704692、4939666、4946778、5260203、5455030、5518889、5534621、5656730、5763733、5767260、5856456，轉(zhuǎn)讓給Enzon;5223409、5403484、5571698、5837500,轉(zhuǎn)讓給Dyax,5427908、5580717,轉(zhuǎn)讓纟合Affymax;5885793,轉(zhuǎn)讓給CambridgeantibodyTechnologies;5750373,轉(zhuǎn)讓給Genentech,5618920、5595898、5576195、5698435、5693493、5698417,轉(zhuǎn)讓給Xoma,Colligan,同上；Ausubel,同上；或Sambrook，同上，上述專利和出版物各自整體引入本文作為參考。2.本發(fā)明的核酸使用本文提供的信息，例如編碼SEQIDNOS:2-5和27-28中至少一個的至少70-100%鄰接氨基酸的核苷酸序列、其特定片段、變體或共有序列，編碼至少一種抗MCP-1抗體的本發(fā)明的核酸分子可以使用本文描述的或如本領(lǐng)域已知的方法獲得。本發(fā)明的分離的核酸分子可以包括包含可讀框(ORF)的核酸分子，任選具有一個或多個內(nèi)含子，例如但不限于，至少一條重鏈(例如SEQIDNOS:6-12、22和23)或輕鏈(例如SEQIDNOS:13-21和24-26)的至少一個CDR,如CDR1、CDR2和/或CDR3的至少一個特定部分；包含抗MCP-1抗體或可變區(qū)(例如SEQIDNOS:2-5、27和28)編碼序列的核酸分子；和包含基本上不同于上述那些的核苷酸序列，但由于遺傳密碼簡并性，如本文描述的和/或如本領(lǐng)域已知的仍編碼至少一種抗MCP-1抗體的核酸分子。當(dāng)然，遺傳密碼是本領(lǐng)域眾所周知的。因此，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，產(chǎn)生編碼本發(fā)明的特異性抗MCP-1抗體的此類簡并核酸變體將是常規(guī)的。參見，例如Ausubel等人，同上，且此類核酸變體包括在本發(fā)明中。如本文指出的，包含編碼抗MCP-1抗體的核酸的本發(fā)明核酸分子可以包括但不限于，單獨編碼抗體片段的氨基酸序列的那些；關(guān)于完整抗體或其部分的編碼序列；關(guān)于抗體、片段或部分、以及附加序列的編碼序列，例如至少一種信號前導(dǎo)序列或融合肽的編碼序列，具有或不具有前述的附加編碼序列，例如至少一個內(nèi)含子，連同附加的非編碼序列一起，包括但不限于，非編碼的5，和3，序列，例如在轉(zhuǎn)錄、mRNA加工，包括剪接和多腺苷酸化信號(例如mRNA的核糖體結(jié)合和穩(wěn)定性)中起作用的轉(zhuǎn)錄的非翻譯序列；編碼附加氨基酸例如提供附加功能性的那些的附加編碼序列。因此，編碼抗體的序列可以與標(biāo)記序列例如編碼肽的序列融合，所述肽促進(jìn)包含抗體片段或部分的融合抗體純化。與如本文所述的多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸本發(fā)明提供了在選擇性雜交條件下與本文公開的多核苷酸雜交的分離的核酸。因此，這個實施方案的多核苷酸可以用于分離、檢測和/或定量包含此類多核苷酸25的核酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以用于在保藏的文庫中鑒定、分離、或擴增部分或全長克隆。在某些實施方案中，多核苷酸是分離的基因組或cDNA序列，或以其他方式與來自人或哺乳動物核酸文庫的cDNA互補。優(yōu)選地，cDNA文庫包含至少80%的全長序列，優(yōu)選至少85%或90%的全長序列，且更優(yōu)選地至少95%的全長序列。cDNA文庫可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以增加罕見序列的表現(xiàn)。低或中等嚴(yán)格雜交條件一般但不是唯一地用于相對于互補序列具有減少的序列同一性的序列。中等和高嚴(yán)格條件可以任選對于同一性更大的序列使用。低嚴(yán)格條件允許具有約70%的序列同一性的序列選擇性雜交，且可以用于鑒定直系同源或旁系同源序列。任選地，本發(fā)明的多核苦酸將編碼由本文描述的多核普酸編碼的抗體的至少部分。本發(fā)明的多核苷酸包含可以用于與編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸選擇性雜交的核酸序列。參見，例如Ausubel,同上；Colligan,同上，各自整體引入本文作為參考。核酸的構(gòu)建本發(fā)明的分離的核酸可以使用如本領(lǐng)域眾所周知的(a)重組方法、(b)合成技術(shù)、(c)純化技術(shù)、或其組合進(jìn)行制備。用于構(gòu)建核酸的重組方法本發(fā)明的分離的核酸組合物，例如RNA、cDNA、基因組DNA、或其任何組合，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何數(shù)目的克隆方法從生物學(xué)來源獲得。在某些實施方案中，在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的多核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸探針用于在cDNA或基因組DNA文庫中鑒定所需序列。RNA的分離、以及cDNA和基因組文庫的構(gòu)建是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的(參見，例如Ausubel,同上；或Sambrook,同上)。核酸篩選和分離方法cDNA或基因組文庫可以使用依據(jù)本發(fā)明多核苷酸序列例如本文公開的那些的探針進(jìn)行篩選。探針可以用于與基因組DNA或cDNA序列雜交以分離相同或不同生物中的同源基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解各種程度的雜交嚴(yán)格性可以在測定中使用；且雜交或洗滌介質(zhì)可以是嚴(yán)格的。隨著用于雜交的條件變得更嚴(yán)格，在發(fā)生雙鏈體形成的探針和靶之間必須存在更大的互補性程度。嚴(yán)格性的程度可以由溫度、離子強度、pH和部分變性溶劑例如甲酰胺的存在中的一種或多種加以控制。例如，雜交的嚴(yán)格性通過經(jīng)由例如將曱酰胺濃度操縱在260%-50%內(nèi)來改變反應(yīng)物溶液的極性方便地加以改變。可檢測的結(jié)合所需的互補性(序列同一性)程度將根據(jù)雜交介質(zhì)和/或洗滌介質(zhì)的嚴(yán)格性而變。互補性程度將最佳為100%、或70-100%、或其中的任何范圍或值。然而，應(yīng)當(dāng)理解探針和引物中較小的序列變異可以通過減少雜交和/或洗滌介質(zhì)的嚴(yán)格性進(jìn)行補償。擴增RNA或DNA的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且基于本文呈現(xiàn)的教導(dǎo)和指導(dǎo)無需過度實驗即可根據(jù)本發(fā)明使用。DNA或RNA擴增的已知方法包括但不限于，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和相關(guān)擴增方法(Mullis等人，美國專利號4,683,202(1987);和Innis等人,PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications,Eds.,AcademicPressInc.,SanDiego,CA(1990)。用于構(gòu)建核酸的合成方法本發(fā)明的分離核酸還可以通過已知方法通過直接化學(xué)合成進(jìn)行制備(參見，例如Ausubel等人，同上)。化學(xué)合成一jt&產(chǎn)生單鏈寡核苦酸，它可以通過與互補序列雜交，或用DNA聚合酶使用單鏈作為模板通過聚合轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到盡管DNA的化學(xué)合成可以限制于約100個或更多個堿基的序列，但較長的序列可以通過連接較短序列來獲得。關(guān)于編碼序列的化學(xué)合成的特別優(yōu)選方法在美國專利號6521427和6670127中教導(dǎo)。3.載體和表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明提供了包含編碼抗MCP-1抗體的核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體，或可以用于獲得包含各種抗體HC或LC基因或其部分的質(zhì)粒。如本文使用的，術(shù)語"載體"指能夠轉(zhuǎn)運與其連接的另一種核酸的核酸分子。一種載體類型是"質(zhì)粒"，這指另外的DNA片段可以連接到其內(nèi)的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種載體類型是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接到病毒基因組內(nèi)。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的分離的核酸分子的載體、用重組載體基因工程改造的宿主細(xì)胞、以及通過如本領(lǐng)域眾所周知的重組技術(shù)生產(chǎn)至少一種抗MCP-1抗體。參見，例如各自整體引入本文作為參考的Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上。對于抗體或其抗體片段的表達(dá)，編碼部分或全長輕和重鏈的DNAs可以插入表達(dá)盒或載體內(nèi)，從而使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可操作地連接。編碼抗體的盒可以作為構(gòu)建體進(jìn)行裝配。構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行制備。構(gòu)建體可以作為較大質(zhì)粒的部分進(jìn)行制備。此類制備允許以有效方式克隆和選擇正確構(gòu)造。構(gòu)建體可以位于質(zhì)?；蚱渌d體上的方便的限制位點之間，從而使得它們可以容易地與其余的質(zhì)粒序列分開。一般地，質(zhì)粒載體在沉淀物例如磷酸鈣沉淀物中，或在含DEAE-葡聚糖的帶電脂質(zhì)的復(fù)合物中被引入。如果載體是病毒，那么它可以使用合適的包裝細(xì)胞系在體外進(jìn)行包裝且隨后轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞內(nèi)。載體構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞內(nèi)還可以通過電穿孔或其他已知方法來實現(xiàn)。此類方法在本領(lǐng)域中得到描述，例如Sambrook,同上，1-4和16-18章;Ausubel，同上，1、9、13、15、16章。在這種背景中，術(shù)語"可操作地連接的"意指抗體基因被連接到載體內(nèi)，從而使得載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮其調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇與使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以被插入分開的載體內(nèi)，或更一詢殳地，2種基因一皮插入相同表達(dá)載體內(nèi)。抗體基因通過標(biāo)準(zhǔn)方法-波插入表達(dá)載體內(nèi)(例如抗體基因片段和載體上的互補限制位點的連接，或如果不存在限制位點，則為平端連接)。通過將本文所述抗體的輕和重鏈可變區(qū)插入已編碼所需同種型的重鏈恒定和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體內(nèi)，從而使得VH片段與載體內(nèi)的CH片段可操作地連接，且VI,片段與載體內(nèi)的CL片段可操作地連接，可重組表達(dá)載體可以編碼促進(jìn)抗體鏈從宿主細(xì)胞中分泌的信號肽?？梢詫⒖贵w鏈基因克隆到載體內(nèi)，從而使得信號肽與抗體鏈基因的氨基端框內(nèi)連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白的信號肽)。盡管理論上可能在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但抗體在真核細(xì)胞且最優(yōu)選哺乳動物宿主細(xì)胞中的表達(dá)是最優(yōu)選的，因為此類真核細(xì)胞且特別是哺乳動物細(xì)胞比原核細(xì)胞更可能裝配和分泌正確折疊和免疫活性的抗體。一般而言，哺乳動物表達(dá)載體將包含(1)調(diào)節(jié)元件，通常是病毒啟動子或增強子序列的形式，且特征在于寬的宿主和組織范圍；(2)促進(jìn)包含抗體編碼序列的DNA片段插入質(zhì)粒載體內(nèi)的"多接頭"序列；28和(3)負(fù)責(zé)mRNA轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子剪接和多腺苷酸化的序列。這種啟動子-多接頭-多腺苷酸化位點的鄰接區(qū)域通常稱為轉(zhuǎn)錄單位。載體將還可能包含(4)選擇標(biāo)記基因(例如，(3-內(nèi)酰胺酶基因)，通常賦予對抗生素(例如氨節(jié)青霉素)的抗性，從而允許在大腸桿菌(￡.co//)中選擇最初的陽性轉(zhuǎn)化體；和(5)促進(jìn)載體在細(xì)菌和哺乳動物宿主中復(fù)制的序列。包括質(zhì)粒復(fù)制起點用于在大腸桿菌中繁殖表達(dá)構(gòu)建體，且為了在Cos細(xì)力包中瞬時表達(dá)，將SV40復(fù)制起點包括在表達(dá)質(zhì)粒中。啟動子可以選自SV40啟動子(例如晚期或早期SV40啟動子、CMV啟動子(美國專利號5,168,062;5,385,839)、HSVtk啟動子、pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動子、EF-1a啟動子(美國專利號5,266,491)、至少一種人免疫球蛋白啟動子。表達(dá)載體將優(yōu)選但任選包括至少一種選擇標(biāo)記。此類標(biāo)記包括例如但不限于，對于真核細(xì)胞培養(yǎng)的氨曱蝶呤(MTX)、二氳葉酸還原酶(DHFR,美國專利號4,399,216;4,634，665;4,656,134;4,956,288;5，M9,636;5,179,017,氨節(jié)青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸、或谷氨酰胺合成酶(GS,美國專利號5,122,464;5,770,359;5,827,739)抗性,和對于在大腸桿菌和其他細(xì)菌或原核生物中培養(yǎng)的四環(huán)素或氨節(jié)青霉素抗性基因(上述專利整體在此引入作為參考)。關(guān)于上述宿主細(xì)胞的合適培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。合適的載體對于技術(shù)人員將是顯而易見的。當(dāng)使用真核宿主細(xì)胞時，一般向載體內(nèi)整合入多腺苷酸化或轉(zhuǎn)錄終止序列。終止序列的例子是來自牛生長激素基因的多腺苷酸化序列。還可以包括用于正確剪接轉(zhuǎn)錄物的序列。剪接序列的例子是來自SV40的VP1內(nèi)含子(Spmgue等人，J.Virol.45:773-781(1983))。此外，如本領(lǐng)域已知的，控制宿主細(xì)胞中的復(fù)制的基因序列可以整合入載體內(nèi)。同樣，為了避免重鏈分子的高表面表達(dá)，可能必需使用消除跨膜結(jié)構(gòu)域變體剪接的表達(dá)載體。附加元件包括增強子、Kozak序列以及側(cè)接用于RNA剪接的供體和受體位點的間插序列。高效率的轉(zhuǎn)錄可以使用下列來達(dá)到來自SV40的早期和晚期啟動子，來自逆轉(zhuǎn)錄病毒例如RSV、HTLVI、HIVI的長末端重復(fù)序列(LTRS),和巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動子。然而，也可以使用細(xì)胞元件(例如人肌動蛋白啟動子)。用于在本發(fā)明實踐中使用的合適表達(dá)載體包括例如，載體，例如pIRESlneo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN、或pLNCX(ClonetechLabs，PaloAlto,CA)、pcDNA3.l(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia,Uppsala,瑞典)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)?？商娲?，編碼抗體序列的核酸可以在包含整合到染色體內(nèi)的基因的穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)。與選擇標(biāo)記例如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素共轉(zhuǎn)染允許鑒定和分離表達(dá)大量編碼的抗體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記對于開發(fā)攜帶幾百或甚至幾千拷貝的目的基因的細(xì)胞系有用。另一種有用的選擇標(biāo)記是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等人，Biochem.J.227:277-279(1991);Bebbington等人，Bio/Technology10:169-175(1992))。使用這些標(biāo)記，哺乳動物細(xì)胞在選一奪性培養(yǎng)基中生長且選擇具有最高抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞系包含整合到染色體內(nèi)的擴增的基因。中國倉鼠卵巢(CHO)和NSO細(xì)胞通常用于生產(chǎn)抗體。本發(fā)明抗體生產(chǎn)中使用的DNA構(gòu)建體可以任選包括至少一種隔離子(insulator)序列。術(shù)語"隔離子"、"隔離子序列"和"隔離子元件"在本文中可互換使用。隔離子元件是隔離置于其作用范圍內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄但不會負(fù)面或正面干擾基因表達(dá)的控制元件。優(yōu)選地，隔離子序列插入待轉(zhuǎn)錄的DNA序列的任何一側(cè)上。例如，隔離子可以定位于距離啟動子5，約200bp-約1kb,且在目的基因3'末端處距離啟動子至少約1kb-5kb。隔離子序列與啟動子和目的基因3，末端的距離可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員取決于目的基因的相對大小、構(gòu)建體中使用的啟動子和增強子進(jìn)行確定。此外，超過一個啟動子序列可以定位于啟動子的5，或轉(zhuǎn)基因的3，末端處。例如，2個或更多個隔離子序列可以定位于啟動子的5，。轉(zhuǎn)基因3，末端處的一個或多個隔離子可以定位于目的基因的3'末端處，或3，調(diào)節(jié)序列例如3'非翻譯區(qū)(UTR)或3'側(cè)翼序列的3'末端處。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的例子包括pTrc(Amann等人，(1988)Gene69:301-315)和pETlid(Studier等人，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)60-89)。來自pTrc載體的靶基因表達(dá)依賴于從雜交trp-lac融合啟動子起的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。來自pETlld載體的耙基因表達(dá)依賴由共表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)的、從T7gnlO-lac融合啟動子起的轉(zhuǎn)錄。這種病毒聚合酶由來自定居X原噬菌體的宿主抹BL21(DE3)或HMS174(DE3)供應(yīng)，所述X原噬菌體具有在lacUV5啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下的T7gnl基因。在另一實施方案中，表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。用于在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)的載體例子包括pYepSecl(Baldari等人(1987)EMBOJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz、(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等人(1987)Gene54:113-123)、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)、和pPicZ(InvitrogenCorp,SanDiego,Calif.)?？商娲兀磉_(dá)載體是桿狀病毒表達(dá)載體?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人(1983)Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology170:31-39)。在再一實施方案中，本發(fā)明的核酸使用哺乳動物表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。哺乳動物表達(dá)載體的例子包括pCDM8(Seed(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987尼MBOJ.6:187-195)。當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中使用時，表達(dá)載體的控制功能通常由病毒調(diào)節(jié)元件提供。例如，常用的啟動子來源于多瘤、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。關(guān)于原核和真核細(xì)胞的其他合適表達(dá)系統(tǒng)，參見Sambrook等人，同上的16和17章。在另一實施方案中，重組哺乳動物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)核酸表達(dá)，優(yōu)選在特定細(xì)胞類型中，例如淋巴瘤細(xì)胞(例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞)。在特定細(xì)胞類型中，組織特異性調(diào)節(jié)元件用于表達(dá)核酸。組織特異性調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域已知的。合適的組織特異性啟動子的非限制性例子包括清蛋白啟動子(肝特異性;Pinkert等人(1987)GenesDev.1:268-277),淋巴樣特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235-275),特別是T細(xì)胞受體(Winoto和Baltimore(1989)EMBOJ.8:729-733)和免疫球蛋白(Banerji等人(1983)Cell33:729-740;Queen和Baltimore(1983)Cell33:741-748)啟動子，神經(jīng)元特異性啟動子(例如神經(jīng)絲啟動子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477),胰特異性啟動子(Edlund等人(1985)Science230:912-916),和乳腺特異性啟動子(例如乳清啟動子;美國專利號4,873,31631和歐洲申請公開號264,166)。還可以包含發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel和Gmss(1990)Science249:374-379)和曱胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)GenesDev.3:537-546)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含在反義方向上克隆到表達(dá)載體內(nèi)的DNA分子的重組表達(dá)載體。即，DNA分子以允許RNA分子表達(dá)(通過DNA分子轉(zhuǎn)錄)的形式與調(diào)節(jié)序列可操作地連接，所述RNA分子對編碼多肽的mRNA是反義的。可以選擇與在反義方向上克隆的核酸可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，它指導(dǎo)反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中的連續(xù)表達(dá)。例如，可以選擇病毒啟動子和/或增強子、或調(diào)節(jié)序列，它指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異性、或細(xì)胞類型特異性表達(dá)。反義表達(dá)載體可以是重組質(zhì)粒、噬菌粒、或減弱病毒的形式，其中反義核酸在高效率調(diào)節(jié)區(qū)的控制下生產(chǎn)，其活性可以由載體引入其中的細(xì)胞類型來決定。關(guān)于使用反義基因的基因表達(dá)調(diào)節(jié)的討論，參見Weintraub等人(Reviews—TrendsinGenetics,第1巻(1)1986)。在骨髓瘤細(xì)胞中的克隆和表達(dá)稱為cM-T412(整體引入作為參考的EP0511308)的針對人CD4的嵌合小鼠/人IgGlk單克隆抗體，被觀察到在轉(zhuǎn)染的小鼠骨髓瘤細(xì)胞中以高水平表達(dá)(Looney等人1992.HumAntibodiesHybridomas3(4):191-200)。在最優(yōu)化培養(yǎng)條件方面沒有大量努力，在1990年于Centocor,Inc.Malvern,PA容易地獲得>500mg/L的生產(chǎn)水平(在pg/細(xì)胞/天的基礎(chǔ)上的比生產(chǎn)力未知)?；谶@些表達(dá)載體的組分，開發(fā)了對HC和LC克隆有用的抗體克隆載體，它包括基因啟動子/轉(zhuǎn)錄起始核酸序列、5，非翻譯序列和翻譯起始核酸序列、編碼信號序列的核酸序列、用于信號內(nèi)含子和J-C內(nèi)含子的內(nèi)含子/外顯子剪接供體序列，以及J-C內(nèi)含子增強子核酸序列。質(zhì)粒pl39,pUC19質(zhì)粒包含從分泌完全小鼠M-T412Ab的C123雜交瘤細(xì)胞克隆的5.8kbEcoRI-EcoRI基因組片段；該片段包含cM-T412HC基因的啟動子和V區(qū)部分。用于LCV區(qū)載體工程改造的原材料是質(zhì)粒p39,包含從C123雜交瘤細(xì)胞克隆的3kbHindlll-Hindlll基因組片段的pUC質(zhì)粒；這個片段包含cM-T412LC基因的啟動子和V區(qū)部分。來源于p139和p39的工程改造的載體設(shè)計成使得能夠在2步過程中方便的裝配適合于在哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)的HC或LC基因，所述過程需要1)克隆編碼在V區(qū)載體中特別制備的限制位點之間的目的序列的DNA,由此V區(qū)編碼序列緊位于載體編碼的信號序列下游，以及部分或全部基因啟動子下游；和2)轉(zhuǎn)移在正確方向上跨越從V區(qū)載體到C區(qū)載體的插入序列的片段，由此所得到的質(zhì)粒構(gòu)成適合于在細(xì)胞中表達(dá)的最終表達(dá)質(zhì)粒(Scallon等人1995Cytokine7(8):759-769)。在CHO細(xì)胞中的克隆和表達(dá)質(zhì)粒pC4是質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC登記號37146)的衍生物。該質(zhì)粒包含在SV40早期啟動子控制下的小鼠DHFR基因。用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢或缺乏二氫葉酸活性的其他細(xì)胞，可以通過使細(xì)胞在補加了化學(xué)治療劑氨曱蝶呤的選擇培養(yǎng)基(例如alphaminusMEM,LifeTechnologies,Ga池ersburg,MD)中生長進(jìn)行選擇。在對氨甲蝶呤(MTX)抗性的細(xì)胞中擴增DHFR基因已得到充分證明(參見，例如，F(xiàn).W.Alt等人，J.Biol.Chem.253:1357-1370(1978);J.L.Hamlin和C.Ma,Biochem.etBiophys.Acta1097:107-143(1990);以及M.J.Page和M.A.Sydenham,Biotechnology9:64-68(1991))。在濃度漸增的MTX中生長的細(xì)胞由于DHFR基因擴增通過超量生產(chǎn)靶酶DHFR發(fā)展出對藥物的抗性。如果第二種基因與DHFR基因連接，那么它通常被共擴增和超表達(dá)。本領(lǐng)域已知的是這種方法可以用于開發(fā)攜帶超過1,000個擴增的基因拷貝的細(xì)胞系。隨后，當(dāng)氨曱蝶呤被取出時，獲得包含整合到宿主細(xì)胞的一個或多個染色體內(nèi)的擴增的基因的細(xì)胞系。質(zhì)粒pC4包含用于表達(dá)目的基因的勞斯肉瘤病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)的強啟動子(Cullen等人，Molec.Cell.Biol.5:438-447(1985))，加上從人巨細(xì)胞病毒(CMV)的立即早期基因的增強子分離的片段(Boshart等人，Cell41:521-530(1985))。啟動子的下游是允許基因整合的BamHI、Xbal和Asp718限制酶切割位點。在這些克隆位點之后，該質(zhì)粒包含3，內(nèi)含子和大鼠前胰島素原基因的多腺苷酸化位點。其他高效率的啟動子也可以用于表達(dá)，例如人b-肌動蛋白啟動子、SV40早期或晚期啟動子、或來自其他逆轉(zhuǎn)錄病毒例如HIV和HTLVI的長末端重復(fù)序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)和類似系統(tǒng)可以用于在哺乳動物細(xì)胞中以受調(diào)節(jié)的方式表達(dá)MCP-1抗體(M.Gossen和H.Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551(1992))。對33于mRNA的多腺普酸化，也可以使用例如來自人生長激素或珠蛋白基因的其他信號。4.用于生產(chǎn)抗體的宿主細(xì)胞如本領(lǐng)域眾所周知的，本發(fā)明的至少一種抗MCP-1抗體可以任選通過細(xì)胞系、混合細(xì)胞系、無限增殖化細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞的克隆群體來生產(chǎn)。參見,侈'j^口,Ausubel等人,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,NY(1987-2004);Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarbor,NY(1989);Harlow和Lane,antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY(1989);Colligan等人，eds.,CurrentProtocolsmImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY(1994-2004);Colligan等人，CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,NY,(1997-2004),各自整體引入本文作為參考。為了生產(chǎn)生物藥物產(chǎn)品，需要能夠有效和可重復(fù)表達(dá)重組多肽的生產(chǎn)細(xì)胞系。該細(xì)胞系是穩(wěn)定和可獲利的(bankable)。多種宿主細(xì)胞系可以用于這個目的。作為對細(xì)胞機器如何影響生物治療產(chǎn)品的最終量和組成的復(fù)雜性的理解，將賦予產(chǎn)品生產(chǎn)和組成所需屬性的宿主細(xì)胞系的選擇變得更明顯。與由連續(xù)基因組DNA序列轉(zhuǎn)錄的大多數(shù)基因不同，抗體基因由可以在種系中廣泛分開的基因片段裝配。具體地，重鏈基因由編碼抗體可變(V)、多變(D)和連接(J)/恒定(C)區(qū)的3個基因組片段重組形成。功能性輕鏈基因通過連接2個基因片段形成；一個編碼V區(qū)且另一個編碼J/C區(qū)。重鏈和K輕鏈基因座都包含估計跨越大大超過1000kb的多個V基因片段(估計大小為lOOs-lOOOs)。相反，X基因座小得多，且已顯示在小鼠染色體16上跨越大約300kb。它由2個可變基因片段和4個連接/恒定(J/C)區(qū)基因片段組成。功能性基因的形成需要V和J/C元件之間的重組。在其中抗體天然產(chǎn)生的b細(xì)胞中，重排的重和K輕鏈基因的轉(zhuǎn)錄控制依賴V區(qū)上游的組織特異性啟動子和位于J-C內(nèi)含子中的組織特異性增強子的活性。這些元件協(xié)同發(fā)揮作用。同樣，第二種B細(xì)胞特異性增強子已在K輕鏈基因座中鑒定。這個另外的增強子位于Ck下游9kb。34因此，使抗體表達(dá)基因無限增殖化的雜交瘤方法依賴親本B細(xì)胞譜系的內(nèi)源啟動子和增強子序列。可替代地，本發(fā)明的核酸可以在包含編碼本發(fā)明抗體的內(nèi)源DNA的宿主細(xì)胞中通過開啟(通過操縱)在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。此類方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如，如美國專利號5,580,734、5,641,670、5,733,746和5，733,761中描述的,所述專利整體引入本文作為參考。將抗體基因組DNA克隆到人造載體內(nèi)是制備能夠表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞的另一種方法。然而，在強啟動子之后的單克隆抗體表達(dá)增加鑒定高生產(chǎn)細(xì)胞系和獲得更高產(chǎn)量的單克隆抗體的機會。本發(fā)明的抗體可以使用例如如本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如Morrison,S.(1985)Science229:1202)在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中生產(chǎn)。用于在多種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)生物藥物包括抗體的系統(tǒng)是眾所周知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因植物和動物。在本領(lǐng)域中可用于表達(dá)異源多肽完整糖基化蛋白的哺乳動物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)、NSO小鼠黑素瘤細(xì)胞和衍生細(xì)胞系，例如SP2/0、YB2/0(ATCCRL-1662)大鼠骨髓瘤細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞(HEK)、人胚視網(wǎng)膜細(xì)胞PerC.6細(xì)胞、hepG2細(xì)胞、BSC-1(例如，ATCCCRL-26)、以及可從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas,Va(www.atcc.org)獲得的許多其他細(xì)胞。常見的優(yōu)選細(xì)菌宿主是大腸桿菌。哺乳動物細(xì)胞例如CHO細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、BHK細(xì)胞(BHK21,ATCCCRL誦IO)、小鼠Ltk-細(xì)胞、和NIH3T3細(xì)胞已經(jīng)常用于異源基因的穩(wěn)定表達(dá)。相反，細(xì)胞系例如Cos(COS-lATCCCRL1650;COS-7，ATCCCRL-1651)和HEK293常規(guī)地用于重組蛋白質(zhì)的瞬時表達(dá)。由于其高表達(dá)率，用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動物宿主細(xì)胞包括骨髓瘤細(xì)胞，例如Sp2/0、YB2/0(ATCCRL-1662)、NSO和P3X63.Ag8.653(例如SP2/0-Ag14)。具體地，對于與NSO骨髓瘤細(xì)胞的使用，另一種優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是WO87/04462、WO89/01036和EP338,841中公開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達(dá)載體引入哺乳動物宿主細(xì)胞中時，抗體通過使宿主細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時間段來產(chǎn)生，所述時間段允許抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)，或更優(yōu)選地，抗體分泌到宿主細(xì)胞在其中生長的培養(yǎng)基內(nèi)。抗體可以使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從i咅養(yǎng)基回收。用于生產(chǎn)抗體、其特定部分或變體的細(xì)胞培養(yǎng)物實例是哺乳動物細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)通常將是細(xì)胞單層的形式，盡管哺乳動物細(xì)胞懸浮液或生物反應(yīng)器也可以使用。能夠表達(dá)完整糖基化蛋白的許多合適的宿主細(xì)胞系已在本領(lǐng)域被開發(fā)，且包括COS-l(例如ATCCCRL1650)、COS-7(例如ATCCCRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCCCRL-10)、CHO(例如ATCCCRL1610)和BSC-1(例如ATCCCRL畫26)細(xì)胞系、Cos-7細(xì)胞、CHO細(xì)胞、hepG2纟田月包、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293細(xì)胞、HeLa細(xì)胞等，它們可從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas,Va(www.atcc.org)容易獲得。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括淋巴樣起源的細(xì)胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是P3X63Ag8.653細(xì)胞(ATCC登記號CRL-1580)和SP2/0-Ag14細(xì)胞(ATCC登記號CRL-1851)。CHO-K1和DHFR-CHO細(xì)胞DG44和DUK曙Bll(G.Urlaub,L.A.Chasin,1980.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77,4216-4220)用于高水平的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，因為目的基因擴增通過整合入選擇、可擴增標(biāo)記DHFR使用例如藥物氨甲蝶呤(MTX)能夠進(jìn)行(R丄Kaufman,1990.MethodsEnzymol.185:537-566)。DHFR-CHO細(xì)胞可以成功地用于以高水平生產(chǎn)重組mAbs。DHFR;CHO可以以80-110mg106細(xì)胞"天"或超過200mg106細(xì)胞"天"的速率生產(chǎn)抗MCP-1抗體。多種啟動子已用于在這些CHO細(xì)胞中獲得H-和L-鏈的表達(dá)，例如，b-肌動蛋白啟動子、人CMVMIE啟動子、Ad病毒主要晚期啟動子(MLP)、RSV啟動子和鼠白血病病毒LTR。用于mAb表達(dá)的許多載體在文獻(xiàn)中得到描述，其中2條Ig鏈由具有獨立選擇/可擴增標(biāo)記的2種不同質(zhì)粒攜帶。包含1條抗體鏈，例如與DHFR標(biāo)記連接的H-鏈，和具有Nec/標(biāo)記的L-鏈表達(dá)盒或反之亦然的載體可用于在旋轉(zhuǎn)器瓶中獲得最高達(dá)180mg的人源化mAbL"7眾所周知的。一般而言，高水平的mAb表達(dá)可以使用下列步驟獲得候選克隆的初始選擇和后續(xù)擴增，共選擇(例如在其中H-鏈和L-鏈表36達(dá)載體都攜帶DHFR表達(dá)單位的情況下)和擴增，使用不同可擴增標(biāo)記的共擴增，以及在大量培養(yǎng)中初始選擇和擴增，隨后為稀釋克隆法以鑒定個別高表達(dá)的克隆。因為整合位點可以影響H-鏈和L-鏈表達(dá)以及總體mAb表達(dá)的效率，所以已制備其中2個Ig-鏈表達(dá)單位串聯(lián)放置的單個載體。這些載體還攜帶顯性選4奪標(biāo)記，例如Nec/和DHFR表達(dá)盒。關(guān)于纟宗述,參見Ganguly,S.和A.Shatzman.ExpressionSystems,mammaliancellsIN:EncyclopediaofBioprocessTechnology:Fermentation,Biocatalysis,andBioseparation.1999byJohnWiley&Sons,Inc。Cockett等人(1990.Bio/Technology8,662-667)開發(fā)了GS系統(tǒng)用于在CHO細(xì)胞中高水平表達(dá)異源基因。將包含cDNA(在hCMV啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)和GS小基因(在SV40晚期啟動子的控制下)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到CHO-K1細(xì)胞內(nèi)(隨后用20mM-500mMMSX選擇)可以用于產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明抗體的克隆，其產(chǎn)量與DHFR-CHO系統(tǒng)的那種可比4交。GS系統(tǒng)整體或部分連同歐洲專利號0216846、0256055和0323997以及歐洲專利申i貪號89303964.4討論。作為非限制性例子，表達(dá)重組蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因煙草葉已成功地用于提供大量重組蛋白質(zhì)，例如使用誘導(dǎo)型啟動子。參見，例如Cramer等人，Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-118(1999)和其中引用的參考文獻(xiàn)。同樣，轉(zhuǎn)基因玉米已用于以商業(yè)生產(chǎn)水平表達(dá)哺乳動物蛋白質(zhì)，其生物活性等同于在其他重組系統(tǒng)中生產(chǎn)或從天然來源純化的那些。參見，例如Hood等人，Adv.Exp.Med.Biol.464:127-147(1999)和其中引用的參考文獻(xiàn)。也已由轉(zhuǎn)基因植物種子包括煙草種子和馬鈴薯塊莖大量生產(chǎn)了抗體，包括抗體片段，例如單鏈抗體(scFv，s)。參見，例如Conrad等人，PlantMol.Biol.38:101-109(1998)和其中引用的參考文獻(xiàn)。因此，本發(fā)明的抗體還可以使用轉(zhuǎn)基因植物根據(jù)已知方法進(jìn)行生產(chǎn)。還參見，例如Fischer等人，Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-108(Oct.,1999)，Ma等人,TrendsBiotechnol.13:522-7(1995);Ma等人，PlantPhysiol.109:341-6(1995);Whitelam等人,Biochem.Soc.Trans.22:940-944(1994);其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于抗體的植物表達(dá)一般還參見但不限于美國專利號5959177。上述參考文獻(xiàn)各自整體引入本文作為參考。5.抗體的純化抗MCP-1抗體可以通過眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行回收和純化，所述方法包括但不限于，A蛋白純化、辟u酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析法、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。高效液相層析("HPLC")也可以用于纟屯4t。參見,例i口Colligan，CurrentProtocolsinImmunology,或CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,NY,(1997-2001)，例如l、4、6、8、9、10章，各自整體引入本文作為參考。本發(fā)明的抗體包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成方法的產(chǎn)物、和通過重組技術(shù)由真核宿主生產(chǎn)的產(chǎn)物，所述真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。取決于在重組生產(chǎn)方法中使用的宿主，本發(fā)明的抗體可以是糖基化的或可以是非糖基化的，而糖基化的是優(yōu)選的。此類方法在許多標(biāo)準(zhǔn)實驗室手冊中描述，例如Sambrook,同上，17.37-17.42節(jié)；Ausubel,同上，10、12、13、16、18和20章，Colligan,ProtdnScience，同上，12-14章，所述參考文獻(xiàn)全部整體引入本文作為參考。6.本發(fā)明的抗體在本發(fā)明的方法和組合物中有用的抗MCP-l抗體(也稱為抗CCL-2抗體或MCP-l抗體)可以任選表征為與MCP-l的高親和力結(jié)合、與MCP-l的高特異性結(jié)合、抑制與MCP-l有關(guān)的一種或多種生物學(xué)活性的能力、并任選和優(yōu)選具有低毒性。本發(fā)明的抗體可以以廣泛范圍的親和力(KD)結(jié)合人MCP-1。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的至少一種人mAb可以任選以高親和力結(jié)合人MCP-1。例如，人mAb可以以等于或小于約1(T7M的KD結(jié)合人MCP-1,例如但不限于0.1-9.9(或其中的任何范圍或值)Xl(T7、IO-8、IO-9、l(T10、10—11、10—12、10—13或其中的任何范圍或值?？贵w對于抗原的親和力或抗體親抗原性可以使用任何合適的方法實驗上測定。(參見，例如Berzofsky等人，"Antibody-AntigenInteractions,"InFundamentalImmunology,Paul，W.E.，Ed.,RavenPress:NewYork,NY(1984);Kuby,JanisImmunology,W.H.Freemanand38Company:NewYork,NY(1992);和本文描述的方法)。如果在不同條件(例如，鹽濃度、pH)下測量，那么特定抗體-抗原相互作用的測量的親和力可以不同。因此，親和力和其他抗原結(jié)合參數(shù)(例如Kd、Ka、Kd)的測量優(yōu)選用抗體和抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液以及標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，例如本文描述的標(biāo)準(zhǔn)溶液和緩沖液來進(jìn)行。本發(fā)明的分離的抗體包含由任何合適的多核苷酸編碼的本文公開的抗體氨基酸序列，或任何分離的或制備的抗體。優(yōu)選地，人抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合人MCP-1,且由此部分或基本上中和蛋白質(zhì)的至少一種生物學(xué)活性。部分或優(yōu)選基本上中和至少一種MCP-1蛋白質(zhì)或片段的至少一種生物學(xué)活性的抗體或其特定部分或變體，可以結(jié)合蛋白質(zhì)或片段，且由此抑制通過MCP-1與MCP-1受體結(jié)合或通過其他MCP-1依賴性或介導(dǎo)的機制介導(dǎo)的活性。如本文使用的，術(shù)語"中和抗體"指取決于測定可以將MCP-1依賴性活性抑制約20-120%的抗體，優(yōu)選至少約10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或更多?？筂CP-1抗體抑制MCP-1依賴性活性的能力優(yōu)選通過如本文描述的和/或如本領(lǐng)域已知的至少一種合適的MCP-1蛋白質(zhì)或受體測定進(jìn)行評估。本發(fā)明的人抗體可以是任何種類(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同種型，且可以包含k或X輕鏈。在一個實施方案中，人抗體包含IgG重鏈或限定片段，例如至少一種同種型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。這種類型的抗體可以如本文描述的和/或如本領(lǐng)域已知的通過使用轉(zhuǎn)基因小鼠或其他轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物來制備，所述哺乳動物包含至少一種人輕鏈(例如IgG、IgA和IgM(例如yl、丫2、Y3、y4)轉(zhuǎn)基因。在另一實施方案中，抗人MCP-l人抗體包含IgGl重鏈和IgGl輕鏈。本發(fā)明的至少一種抗體結(jié)合對至少一種MCP-1蛋白質(zhì)、片段、部分或其任何組合特異的至少一種特定表位。至少一種表位可以包含包括蛋白質(zhì)的至少一個部分的至少一個抗體結(jié)合區(qū)域，所述表位優(yōu)選包含SEQIDNO:1鄰接氨基酸的至少1-3個氨基酸至整個特定部分。述抗原結(jié)合區(qū)域包含至少一個人互補性決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)或至少一個重鏈可變區(qū)變體，以及至少一個人互補性決定區(qū)(CDRl、CDR2和CDR3)或至少一個輕鏈可變區(qū)變體。作為非限制性例子，抗列的至少一個重鏈CDR3，和/或具有SEQIDNO:15-17、20或21的氨基酸序列的輕鏈CDR3。在具體實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段可以具有抗原結(jié)合區(qū)域，所述抗原結(jié)合區(qū)域包含具有相應(yīng)CDRs1、2和/或3的氨基酸序列(例如SEQIDNOS:6-12和/或22、23和26)的至少一個重鏈CDR(即，CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少部分。在另一所述抗原結(jié)合區(qū)域包含具有相應(yīng)CDRs1、2和/或3的氨基酸序列(例如SEQIDNOS:13-21和/或24和25)的至少一個輕鏈CDR(即CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少部分。在優(yōu)選實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段的3個重鏈CDRs和3個輕鏈CDRs具有來源于如本文所述的FabMOR0336、MOR03464、MOR03468、MOR03470、MOR03471、MOR03473、MOR03548中至少一個的相應(yīng)CDR的氨基酸序列，且重鏈構(gòu)架區(qū)來源于VH3抗體(SEQIDN0.2),且輕鏈構(gòu)架區(qū)來源于K型抗體(SEQIDN0.4)。此類抗體可以通過下列方法制備使用常規(guī)技術(shù)將抗體的各個部分(CDRs和構(gòu)架)化學(xué)連接在一起，使用重組DNA技酸分子。抗MCP-1抗體可以包含具有在構(gòu)架區(qū)中限定氨基酸序列的至少一個重或輕鏈可變區(qū)。例如，在優(yōu)選實施方案中，抗MCP-1抗體包含任選具有SEQIDNO:2或3的氨基酸序列的至少一個重鏈可變區(qū)和/或任選具有SEQIDNO:4或5的氨基酸序列的至少一個輕鏈可變區(qū)中的至少一個?？贵w種類或同種型(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)被給予由重鏈恒定區(qū)基因編碼的恒定區(qū)。在人IgG種類中，存在4個亞類或亞型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，按照其在血清中的天然豐度從最高到最低的順序命名。IgA抗體發(fā)現(xiàn)了2個亞類IgAl和IgA2。如本文使用的，"同種型轉(zhuǎn)換"也指IgG亞類或亞型之間的變化。本發(fā)明還涉及包含氨基酸序列的抗體、抗原結(jié)合片段、免疫球蛋白鏈和CDRs,所述氨基酸序列基本上與本文描述的氨基酸序列相同。優(yōu)選地，此類抗體或抗原結(jié)合片段和包含此類鏈或CDRs的抗體可以以高親和力(例如小于或等于約10—9M的KD)結(jié)合人MCP-1?；旧吓c本文所述序列相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸置換、以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸置換指用第二種氨基酸置換第一種氨基酸，所述第二種氨基酸具有的化學(xué)和/或物理性質(zhì)(例如電荷、結(jié)構(gòu)、極性、疏水性/親水性)與第一種氨基酸的那些相似。保守置換包括一種氨基酸用下列組內(nèi)的另一種置換賴氨酸(K)、精氨酸(R)和組氨酸(H);天冬氨酸(D)和谷氨酸(E);天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E;丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、曱硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G);F、W和Y;C、S和T。本發(fā)明的抗MCP-1抗體可以包括來自自然突變或人為處理的一種或多種氨基酸置換、缺失或添加，如關(guān)于來源于人種系基因序列且通過序列相似性分類成命名為VH1A、VH1B、VH2等的家族，且通過輕鏈分類為k或X亞群的可變區(qū)如本文詳細(xì)說明的或如Knappik等人US6828422中教導(dǎo)的?？梢栽诒景l(fā)明中使用的這些序列和其他序列包括但不限于，表l中呈現(xiàn)的構(gòu)型，如于2004年6月21日提交的PCT公開WO05/005604和US10/872,932的圖1-42中進(jìn)一步描述的，所述專利整體引入本文作為參考，其中參考的圖1-42顯示了重和輕鏈可變和恒定結(jié)構(gòu)域序列、構(gòu)架、亞結(jié)構(gòu)域、區(qū)域和置換的例子，所述部分可以在如本文教導(dǎo)的本發(fā)明的Ig衍生蛋白質(zhì)中使用。表1.人抗體構(gòu)型區(qū)域重鏈可變區(qū)FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4輕鏈可變區(qū)FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4IgAl、IgA2、IgD、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4恒定區(qū)cm鉸鏈l-4CH2CH3SIgA、IgMCH1鉸鏈l-4CH2CH3J-鏈IgECH1CH2CH3CH4技術(shù)人員可以制備的氨基酸置換數(shù)目取決于許多因素，包括上文描41述的那些。一般而言，對于任何給定的抗MCP-1抗體、片l殳或變體的氨基酸置換、插入或缺失數(shù)目將不超過40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個，例如1-30個或如本文指定的其中的任何范圍或值。在本發(fā)明的抗MCP-1抗體中對功能必需的氨基酸可以通過本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行鑒定，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(例如，Ausubel，同上，8、15章；Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989))。后面的方法在分子的每個殘基處引入單個丙氨酸突變。隨后測試所得到的突變分子的生物學(xué)活性，例如但不限于至少一種MCP-1中和活性。對抗體結(jié)合關(guān)鍵的位點也可以通過結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行鑒定，例如結(jié)晶、核磁共振或光親和標(biāo)記(Smith等人，J.Mol.Biol.224:899-904(1992)和deVos等人,Science255:306-312(1992))。本發(fā)明的抗MCP-1抗體可以包括但不限于，選自SEQIDNOS:2-5和27-28中至少一個的5至所有鄰接氨基酸的至少一個部分、序列或組合?？筂CP-l抗體可以進(jìn)一步任選包含SEQIDNOS:27和28中至少一個的多肽。在一個實施方案中，若非不改變抗MCP-1抗體的結(jié)合特異性的保守置換，免疫球蛋白鏈的氨基酸序列或其部分與SEQIDNOS:27-28中至少一個的相應(yīng)鏈的氨基酸序列具有約100%的同一性。例如，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列可以與SEQIDNO:4或5的序列進(jìn)行比較，或重鏈的氨基酸序列可以與SEQIDNO:2或3進(jìn)行比較。優(yōu)選地，氨基酸同一性使用如本領(lǐng)域已知的合適計算機算法進(jìn)行測定。如技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，本發(fā)明包括本發(fā)明的至少一種生物活性抗體。生物活性抗體具有天然(非合成)、內(nèi)源或相關(guān)和已知抗體比活性的至少20%、30%或40%,且優(yōu)選至少50%、60%或70%,且最優(yōu)選至少80%、90%或95%-1000%的比活性。測定和定量測量酶促活性和底物特異性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的且在本文中得到描述。在另一方面，本發(fā)明涉及通過共價附著有機部分進(jìn)行修飾、如本文描述的人抗體和抗原結(jié)合片段。此類修飾可以產(chǎn)生具有改善的藥物代謝動力學(xué)特征(例如增加的體內(nèi)血清半衰期)的抗體或抗原結(jié)合片段。有機部分可以是線性或分支的親水聚合基團、脂肪酸基團、或脂肪酸酯基團。在具體實施方案中，親水聚合基團可以具有約800-約120,000道爾頓的分子量，且可以是聚鏈烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，且脂肪酸或脂肪酸酯基團可以包含約8-約40個碳原子。本發(fā)明修飾的抗體和抗原結(jié)合片段可以包含與抗體直接或間接共價結(jié)合的一個或多個有機部分。與本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段結(jié)合的每個有機部分可以獨立地是親水聚合基團、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團。如本文使用的，術(shù)語"脂肪酸"包含單羧酸和二羧酸。"親水聚合基團"如該術(shù)語在本文使用的指在水中比在辛烷中更易溶的有機聚合物。例如，聚賴氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，通過共價附著聚賴氨酸修飾的抗體由本發(fā)明包含。適合于修飾本發(fā)明抗體的親水聚合物可以是線性或分支的，且包括例如聚鏈烷二醇(例如PEG、單曱氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如葡聚糖、纖維素、寡糖、多糖等)、親水性氨基酸聚合物(例如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚環(huán)氧鏈烷(例如，聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷等)和聚乙烯吡有約800-約150,000道爾頓的分子量。例如可以使用PEG5ooo和PEG20，000,其中下標(biāo)是以道爾頓表示的聚合物的平均分子量。親水聚合基團可以由l-約6個烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基團取代。由脂肪酸或脂肪酸酯基團取代的親水聚合物可以通過使用合適方法進(jìn)行制備。例如，包含胺基的聚合物可以與脂肪酸或脂肪酸酯的羧基偶聯(lián)，且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧基(例如用N,N-羰基二咪唑活化的)可以與聚合物上的羥基偶聯(lián)。適合于修飾本發(fā)明抗體的脂肪酸和脂肪酸酯可以是飽和的或可以包含一個或多個不飽和單位。適合于修飾本發(fā)明抗體的脂肪酸包括，例如正十二烷酸(C12,月桂酸)、正十四烷酸(C14,肉豆蔻酸)、正十八烷酸(C18,硬脂酸)、正二十烷酸(C2q,花生酸)、正二十二烷酸(C22,山崳酸)、正三十烷酸(C30)、正四十烷酸(C40)、順式-A9-十八烷酸(C18，油酸)、全順式-△5,8,11,14-二十烷四烯酸(eicosatetraenoate)(C2o，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合適的脂肪酸酯包括包含線性或分支低級烷基的二羧酸單酯。低級烷基可以包含1-約12個，優(yōu)選l-約6個碳原子。修飾的人抗體和抗原結(jié)合片段可以使用合適方法，例如通過與一種或多種改性劑反應(yīng)進(jìn)行制備。"改性劑"如該術(shù)語在本文中使用的指包含活化基團的合適有機基團(例如親水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。"活化基團"是化學(xué)部分或官能團，它們在合適條件下可與第二種化學(xué)基團反應(yīng)，由此在改性劑和第二種化學(xué)基團之間形成共價鍵。例如，胺反應(yīng)活化基團包括親電基團，例如曱苯磺酸酯、甲磺酸酯、鹵(氯、溴、氟、碘)、N-羥基琥珀酰亞胺基酯(NHS)等?？梢耘c辟L醇反應(yīng)的活化基團包括例如馬來酰亞胺、碘代乙?；⒈┧?acrylolyl)、吡啶基二疏化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛官能團可以與含胺或酰肼的分子偶聯(lián)，且疊氮基可以與三價含磷基團反應(yīng)以形成氨基磷酸酯或phosphorimide鍵。將活化基團引入分子的合適方法是本領(lǐng)域已知的(參見例4口Hermanson,G.T.,S/oco"/wgv^erec/zm'wes,AcademicPress:SanDiego,CA(1996))?；罨鶊F可以直接或通過接頭部分與有機基團(例如親水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)結(jié)合，所述接頭部分例如其中一個或多個碳原子可以由雜原子例如氧、氮或硫置換的二價C廣Cu基團。合適的接頭部分包括例如四甘醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH^^CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH-NH-。包含接頭部分的改性劑可以通過下述產(chǎn)生例如在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)的存在下，使單-Boc-烷基二胺(例如單-Boc-乙二胺、單-Boc-二氨基己烷)與脂肪酸反應(yīng)，以在游離胺和脂肪酸歡基之間形成酰胺鍵。Boc保護基團可以通過用三氟乙酸(TFA)處理從產(chǎn)物中去除，以暴露伯胺，所述伯胺如所述地可以與另一種羧基偶聯(lián)，或可以與馬來酐反應(yīng)，且所得到的產(chǎn)物環(huán)化以產(chǎn)生脂肪酸的活化馬來酰亞胺基(malenmdo)衍生物。(參見，例如Thompson等人，W092/16221,其完整教導(dǎo)引入本文作為參考。)本發(fā)明的修飾抗體可以通過使人抗體或抗原結(jié)合片段與改性劑反應(yīng)來產(chǎn)生。例如，有才幾部分可以通過使用胺反應(yīng)性改性劑例如PEG的NHS酯以非位點特異性方式與抗體結(jié)合。修飾的人抗體或抗原結(jié)合片段還可以通過使抗體或抗原結(jié)合片段的二硫鍵(例如鏈內(nèi)二硫鍵)還原來制備。還原的抗體或抗原結(jié)合片段隨后可以與硫醇反應(yīng)性改性劑反應(yīng)以產(chǎn)生本發(fā)明的修飾抗體。包含有機部分的修飾的人抗體或抗原結(jié)合片段可以使用合適方法進(jìn)行制備，所述有機部分與本發(fā)明抗體的特定位點結(jié)合，所述方法例如反向蛋白質(zhì)水解(Fisch等人，Swco"ywgafeOzem.,3:147-153(1992);Werlen爭乂，腸,y，^C/縫，5:411-417(1994);44Kumamn等人，尸raWw6(10):2233-2241(1997);Itoh等人，C7^m.,24(1):59-68(1996);Capellas爭乂，Ao&c/mo/.所oewg.，56(4):456-463(1997))，以及Hermanson，G.丁.,Aoco"y'wg"ferec/m—es，AcademicPress:SanDiego,CAU996)中描述的方法。7.針對抗MCP-1抗體的抗獨特型抗體除了單克隆或嵌合抗MCP-1抗體之外，本發(fā)明還涉及對本發(fā)明的此類抗體特異的抗獨特型(抗Id)抗體?？笽d抗體是識別一般與另一種抗體的抗原結(jié)合區(qū)域相關(guān)的獨特決定蔟的抗體?？笽d可以通過用抗體或其包含CDR的區(qū)域免疫與Id抗體來源相同的物種和遺傳類型(例如小鼠品系)的動物進(jìn)行制備。被免疫動物將識別且對免疫抗體的獨特型決定蔟應(yīng)答，且產(chǎn)生抗Id抗體。抗Id抗體還可以用作"免疫原"以在另一動物中i秀導(dǎo)免疫應(yīng)答，/人而產(chǎn)生所謂的抗抗Id抗體。8.包含另外的治療活性成分的抗體組合物組合物可以任選進(jìn)一步包含有效量的至少一種化合物或蛋白質(zhì)，所述化合物或蛋白質(zhì)選自皮膚病學(xué)藥物，消炎藥，止痛劑，腎藥(例如血管緊張素受體阻斷劑(ARB)或拮抗劑)，抗感染藥，心血管(CV)系統(tǒng)藥物，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物，自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)藥物，呼吸道藥物，胃腸(GI)道藥物，激素藥物，用于流體或電解質(zhì)平衡的藥物，血液學(xué)藥物，抗癌藥，免疫調(diào)諧藥物，眼、耳或鼻藥物，局部藥物，營養(yǎng)藥物等中的至少一種。此類藥物是本領(lǐng)域眾所周知的，包括關(guān)于本文提出的每一種的配制、適應(yīng)癥、給藥和施用(參見，例如，Nursing2001HandbookofDrugs,第21版,SpringhouseCorp.,Springhouse,PA,2001;HealthProfessional'sDrugGuide2001,ed.,Shannon,Wilson,Stang,Prentice-Hall,Inc,UpperSaddleRiver,NJ;PharmcotherapyHandbook,Wells等人，ed.，Appleton&Lange,Stamford,CT,所述參考文獻(xiàn)各自整體引入本文作為參考)。本發(fā)明的抗MCP-1抗體組合物可以進(jìn)一步包括任何合適和有效量的組合物或藥物組合物中的至少一種，所述組合物或藥物組合物包含對于需要此類調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動物或患者的至少一種抗MCP-1抗體，任選進(jìn)一步包含選自下列的至少一種至少一種TNF拮抗劑(例如但不限于TNF化學(xué)或蛋白質(zhì)拮抗劑，TNF單克隆或多克隆抗體或片段，可溶性TNF受體(例如p55、p70或p85)或其片段、融合多肽，或小分子TNF拮抗劑，例如TNF結(jié)合蛋白I或II(TBP-1或TBP-II),nerelimonmab,英夫單抗，enteracept,CDP-571,CDP-870,afelimomab,lenercept等)，抗風(fēng)濕藥(例如氨甲蝶呤、醋硫葡金、葡糖硫金、硫唑噪呤、etanercept、硫代蘋果酸金鈉、硫酸羥氯喹、來氟洛米、柳氮磺吡啶)，肌肉松弛藥，麻醉藥，非類固醇消炎藥(NSAID),止痛劑，麻醉劑，鎮(zhèn)靜劑，局部麻醉劑，神經(jīng)肌肉阻斷劑，抗微生物劑(例如氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生物劑、抗病毒劑、碳青霉烯、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、青霉素、磺胺藥物、四環(huán)素、另一種抗微生物劑)，抗牛皮褲劑，皮質(zhì)類固醇，促蛋白合成類固醇，糖尿病相關(guān)劑，礦物質(zhì)，營養(yǎng)物，曱狀腺劑，維生素，鈣相關(guān)激素，止瀉劑，止咳藥，止吐劑，抗?jié)兯帲彏a藥，抗凝劑，促紅細(xì)胞生成素(例如重組人類紅細(xì)胞生成素a)，非格司亭(例如G-CSF,重組人粒細(xì)胞集落刺激因子)，沙格司亭(GM-CSF,白細(xì)胞素)，慢性阻塞性肺病(COPD)劑，抗纖維變性劑，免疫接種，免疫球蛋白，免疫抑制劑(例如basiliximab、環(huán)孢菌素、daclizumab),生長激素，激素替代藥物，雌激素受體調(diào)節(jié)劑，散瞳劑，睫狀肌麻痹藥，烷化劑，抗代謝物，有絲分裂抑制劑，防輻射藥物，抗抑郁藥，抗躁狂劑，抗精神病藥，抗焦慮藥，催眠藥，擬交感神經(jīng)藥，興奮劑，多奈哌齊，單滿吖啶氨，哞喘藥，(3激動劑，吸入類固醇，白細(xì)胞三烯抑制劑，甲基黃。票呤，色甘酸，腎上腺素或類似物，阿法脫氧核糖核酸酶(Pulmozyme),細(xì)月包因子或細(xì);!包因子拮抗劑。此類細(xì)胞因子的非限制性例子包括但不限于IL-l-IL-29中任何一種。合適的劑量是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，Wells等人，eds.，PharmacotherapyHandbook,第2版,AppletonandLange,Stamford,CT(2000);PDRPharmacopoeia,TarasconPocketPharmacopoeia2000,DeluxeEdition,TarasconPublishing,LomaLinda,CA(2000),所述參考文獻(xiàn)各自整體引入本文作為參考。此類抗癌藥或抗感染藥還可以包括與本發(fā)明的至少一種抗體締合、結(jié)合、共配制或共施用的毒素分子。毒素可以任選起作用以選擇性殺死病理性細(xì)胞或組織。病理性細(xì)胞可以是癌或其他細(xì)胞。此類毒素可以是但不限于，純化或重組毒素或包含毒素的至少一個功能性細(xì)胞毒性結(jié)構(gòu)域的毒素片段，例如選自蓖麻毒蛋白、白喉毒素、毒液毒素、或細(xì)菌毒素中的至少一種。術(shù)語毒素還包括由任何天然存在的、突變型或重組細(xì)菌或病毒產(chǎn)生的內(nèi)毒素和外毒素，所述細(xì)菌或病毒可以在人和其他哺乳動物中引起任何病理狀況，包括毒素休克，這可以導(dǎo)致死亡。此類毒素可以包括但不限于，產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT),熱穩(wěn)定腸毒素(ST),志賀氏菌屬(S/z/ge//a)細(xì)胞毒素，氣單胞菌屬(Jerawo"M)腸毒素，中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1),葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素A(SEA)、B(SEB)、或C(SEC),鏈球菌(Streptococcal)腸毒素等。此類細(xì)菌包括但不限于下列物種的菌林產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC),腸出血性大腸桿菌(例如血清型0157:H7菌抹)，葡萄球菌屬物種(例如金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococcM"wrews)、化膿性葡萄球菌(5Va//^/ococcws/^oge"es)),志賀氏菌屬物種(例如痢疾志賀氏菌(S/n'ge〃at/，e"/enae)、弗氏志賀氏菌(5T^ge〃",駕n')、鮑氏志賀氏菌(S/nge〃a6—/)和宋內(nèi)氏志賀氏菌(幼/ge〃a))，沙門氏菌屬(Sa/m騰〃a)物種(例如傷寒沙門氏菌(Sa/m,〃a妙/n')、豬霍亂沙門氏菌(Sa/,we〃<2c/zo/era-纖's)、腸炎沙門氏菌(Sa/wowe〃aewfe"'"(3fo)),才炎菌屬(C7ov/W(i/wm)4勿種(例^口產(chǎn)氣莢月莫才炎菌(C7ostnWwm/e/yh'wge朋)、7艮只食才炎菌(C/cw/WJ/wm(^力'"7e)、肉毒才炎菌(C/oW"'(i/iwZ)o/Wz'"iw2)),G2m/7似06a"er物種(例如G2m//z/c^a"er7力'wm'、Caw//z/o6a"er/"us*),//W/o6""er4勿種(寸列^口//e/^^a"w/^/w7'),氣單胞菌屬物種(例如溫和氣單胞菌(爿^Zn'a)、嗜水氣單胞菌(/^&o;/n/a)、豚鼠氣單胞菌(JeramowcwcaWae)),尸/e/卵mowtws/^ge〃o/tfess小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌Ue薩嫌詢co/"謡),弧菌屬(m/w)物種(例如霍亂弧菌(P76n'cwc/zo/erae)、副'溶血孓瓜菌(Kz力n'as/ara/zemo〃cws)),克雷4白氏菌屬(^7e6w'e〃i3)4勿種,4同纟錄々支單月包菌(尸sei/(io附o"ay"en/gz'wosa)和鏈球菌(S^eptococc/)。參見，例如Stein,ed.,INTERNALMEDICINE,笫3版，第1-13頁，Little,BrownandCo.,Boston,(1990);Evans等人，eds.,BacterialInfectionsofHumans:EpidemiologyandControl,第2版，第239-254頁，PlenumMedicalBookCo.,NewYork(1991);Mandell等人,gi;inciplesandPracticeofInfectiousDiseases,第3版.,ChurchillLivingstone,NewYork(1990);Berkow等人,eds.,77zeMen:^:A/朋wa/,第16版，MerckandCo.,Rahway，N丄，1992;Wood等人，F(xiàn)EMSMicrobiologyImmunology,76:121-134(1991);Marrack等人，Science,248:705-711(1990),所述參考文獻(xiàn)的內(nèi)容整體引入本文作為參考。本發(fā)明的抗MCP-1抗體化合物、組合物或組合可以進(jìn)一步包含任何合適輔助劑中的至少一種，例如但不限于，稀釋劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑等。藥學(xué)可接受的輔助劑是優(yōu)選的。此類無菌溶液的非限制性例子和制備方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例》口/f旦不卩艮于Gennaro,Ed.,"e7m力g/w尸/zo777acew"'ca/5We"ces，第18版,MackPublishingCo.(Easton,PA)1990。如本領(lǐng)域眾所周知的或如本文描述的，可以常規(guī)選擇適合于抗MCP-1抗體、片段或變體組合物的施用方式、溶解性和/或穩(wěn)定性的藥學(xué)可接受的載體。在本組合物中有用的藥學(xué)賦形劑和添加劑包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物(例如糖，包括單糖、二、三、四和寡糖；衍生糖，例如糖醇、糖醛酸、酯化糖等；和多糖或糖聚合物)，它可以單獨或組合存在，單獨或組合地構(gòu)成1-99.99重量或體積％。示例性蛋白質(zhì)賦形劑包括血清清蛋白，例如人血清清蛋白(HSA)、重組人清蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白等。也可以在緩沖能力方面起作用的代表性氨基酸/抗體組分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。一種優(yōu)選的氨基酸是甘氨酸。果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖:口例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇(maltitol)、乳糖醇(lactitol)、木糖醇山梨糖醇(葡糖醇(glucitol))、肌醇等。糖?？筂CP-1抗體組合物還可以包括緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑；一般地，緩沖劑是由有機酸或堿制備的鹽。代表性緩沖劑包括有機酸鹽，例如檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、石友酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或鄰苯二曱酸的鹽；Tris,鹽酸三羥曱基氨基甲烷，或磷酸鹽緩沖劑。用于在本發(fā)明組48合物中使用的優(yōu)選緩沖劑是有機酸鹽，例如檸檬酸鹽。此外，本發(fā)明的抗MCP-1抗體組合物可以包括聚合賦形劑/添加劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、ficolls(聚合糖)、葡萄糖結(jié)合劑(例如環(huán)糊精，例如2-羥丙基-P-環(huán)糊精)、聚乙二醇、調(diào)味劑、抗微生物劑、增甜劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑(例如聚山梨醇酯，例如"TWEEN20"和"TWEEN80")、脂質(zhì)(例如磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如膽固醇)、和螯合劑(例如EDTA)。適合于在根據(jù)本發(fā)明的抗MCP-1抗體、部分或變體組合物中使用的這些和另外已知的藥學(xué)賦形劑和/或添加劑是本領(lǐng)域已知的，例如，如"Remington:TheScience&PracticeofPharmacy",第19版,Williams&Williams,(1995)以及"Physidan，sDeskReference",第52版，MedicalEconomics,Montvale,NJ(1998)中列出的，所述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容整體引入本文作為參考。優(yōu)選的載體或賦形劑材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和緩沖劑(例如檸檬酸鹽)或聚合劑。9.制劑如上文指出的，本發(fā)明提供了適合于藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)用途的穩(wěn)定制劑，其在藥學(xué)可接受的制劑中包含至少一種抗MCP-1抗體。如上文指出的，本發(fā)明提供了包含包裝材料和至少一個小瓶的制品，所述小瓶包含至少一種MCP-1抗體與指定緩沖劑和/或防腐劑任選溶于水性稀釋劑中的溶液，其中所述包裝材料包含標(biāo)明此類溶液可以在1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小時或更長時間段內(nèi)保存的標(biāo)簽。本發(fā)明進(jìn)一步包含制品，其包含包裝材料、包含冷凍干燥的至少一種抗MCP-1抗體的第一個小瓶、和包含指定緩沖劑和/或防腐劑的水性稀釋劑的第二個小瓶，其中所述包裝材料包含指導(dǎo)患者在水性稀釋劑中重構(gòu)至少一種抗MCP-1抗體，以形成可以在24小時或更長時間段內(nèi)保存的溶液的標(biāo)簽。如果在濕潤/干燥系統(tǒng)中，那么本發(fā)明產(chǎn)品中的至少一種抗MCP-1抗體的范圍包括重構(gòu)后產(chǎn)生約1.0pg/ml-約1000mg/ml的濃度的量，盡管更低和更高的濃度是可行的且取決于計劃的遞送載體，例如溶液制劑將不同于經(jīng)皮貼劑、肺、跨粘膜、或滲透或微量泵方法。水性稀釋劑任選進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受的防腐劑。優(yōu)選的防腐劑包括選自苯酚、間甲酚、對曱酚、鄰甲酚、氯曱盼、苯甲醇、對羥基苯曱酸烷基酯(alkylpamben)(甲基酯、乙基酯、丙基酯、丁基酯等)、芐扎氯銨、氯化千乙氧銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞、或其混合物的防腐劑。在制劑中使用的防腐劑的濃度是足以產(chǎn)生抗微生物作用的濃度。此類濃度取決于所選防腐劑且由技術(shù)人員容易確定。其他賦形劑例如等滲劑、緩沖劑、抗氧化劑、防腐劑增強劑，可以任選且優(yōu)選加入稀釋劑中。等滲劑例如甘油通常以已知濃度使用。優(yōu)選加入生理學(xué)耐受的緩沖劑以提供改善的pH控制。制劑可以覆蓋寬范圍的pHs,例如約pH4-約pH10,且優(yōu)選范圍是約pH5-約pH9，且最優(yōu)選的范圍是約6.0-約8.0。優(yōu)選地本發(fā)明的制劑具有約6.8-約7.8的pH。優(yōu)選緩沖劑包括磷酸鹽緩沖液，最優(yōu)選磷酸鈉，特別是磷酸緩沖鹽水(PBS)。其他添加劑例如藥學(xué)可接受的增溶劑如Tween20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯)、Tween40(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單棕櫚酸酯)、Tween80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、PluronicF68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)、和PEG(聚乙二醇)或非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188,Pluronicpolyls,其他嵌段共聚物，以及螯合劑例如EDTA和EGTA可以任選加入制劑或組合物中以減少聚集。如果使用泵或塑料容器施用制劑，那么這些添加劑是特別有用的。藥學(xué)可接受的表面活性劑的存在減輕了蛋白質(zhì)聚集的傾向。本發(fā)明的制劑可以通過如下方法來制備，所述方法包括使至少一種抗MCP-1抗體和緩沖溶液以足夠提供所需濃度的蛋白質(zhì)的量混合。這種方法的變化將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可認(rèn)識到的。例如，組分添加的順序、是否使用另外的添加劑、制劑制備時的溫度和pH都是可以對使用的濃度和施用方式進(jìn)行最優(yōu)化的因素。請求保護的制劑可以作為溶液或作為雙小瓶提供給患者，所述雙小瓶包含一小瓶冷凍干燥的至少一種抗-MCP-l抗體，所述抗體用第二個小瓶重構(gòu)，所述第二個小瓶包含在水性稀釋劑中的水、防腐劑和/或賦形劑，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液和/或鹽水和所選鹽。單個溶液小瓶或需要重構(gòu)的雙小瓶都可以多次再使用，且可以滿足患者治療的單個或多個循環(huán)，且因此可以提供比目前可用的更方便的治療方案。本發(fā)明請求保護的制品對于在立即-24小時或更長時間段內(nèi)的施用是有用的。因此，本發(fā)明請求保護的制品提供了對于患者的明顯優(yōu)點。本發(fā)明的制劑可以任選安全地貯存于約2-約40。C的溫度，且使蛋白質(zhì)的生物活性保持延長的時間段，從而允許包裝標(biāo)簽標(biāo)明溶液可以保持和/或在6、12、18、24、36、48、72或96小時或更長時間段內(nèi)使用。如果使用防腐的稀釋劑，那么此類標(biāo)簽可以包括最高達(dá)1-12個月、半年、一年半和/或2年的使用。請求保護的產(chǎn)品可以通過提供給藥房、門診部或其他此類機構(gòu)和設(shè)施、澄清溶液或雙小瓶間接提供給患者，所述雙小瓶包含一小瓶冷凍干燥的至少一種抗-MCP-l抗體，所述抗體用包含水性稀釋劑的第二個小瓶重構(gòu)。在這種情況下的澄清溶液的大小可以是最高達(dá)1升或甚至更大，從而提供較大儲庫(reservois),較小部分的至少一種抗體的溶液可以從其中一次或多次取出用于轉(zhuǎn)移到較小的小瓶內(nèi)、且通過藥房或門診部提供給它們的顧客和/或患者。包含這些單小瓶系統(tǒng)的公認(rèn)的裝置包括用于遞送溶液的那些筆式注射器裝置，例如BDPens、BDAutojector、HumajectNovoPen、B-DPen、AutoPen、和OptiPen、GenotropinPen、GenotronormPen、HumatroPen、Reco-Pen、RoferonPen、Biojector、Iject、J-tipNeedle-FreeInjector、Intraject、Medi-Ject,侈寸^口,^口BectonDickensen(FranklinLakes,NJ,www.bectondickenson.com)、Disetronic(Burgdorf,J島士,www.disetronic.com;Bioject,》皮蘭,Oregon(www.bioject.com);NationalMedicalProducts,WestonMedical(Peterborough，UK，www.weston-medical.com),Medi-JectCorp(Minneapolis，MN,www.mediject.com)制備或開發(fā)的。包含雙小瓶系統(tǒng)的公認(rèn)的裝置包括用于在藥筒中重構(gòu)冷凍干燥藥物用于遞送重構(gòu)溶液的那些筆式注射器系統(tǒng)，例如HumatroPen。本發(fā)明請求保護的產(chǎn)品包括包裝材料。包裝材料除了提供管理機構(gòu)要求的信息之外，還提供了產(chǎn)品可以在其中使用的條件。對于雙小瓶、濕潤/干燥產(chǎn)品，本發(fā)明的包裝材料提供了患者在水稀釋劑中重構(gòu)至少一種抗MCP-1抗體以形成溶液，且在2-24小時或更長時間l殳內(nèi)^f吏用溶液的說明書。對于單小瓶溶液產(chǎn)品，標(biāo)簽標(biāo)明此類溶液可以在2-24小時或更長時間段內(nèi)使用。本發(fā)明請求保護的產(chǎn)品對于人藥學(xué)產(chǎn)品使用有用。體的冷凍干燥粉末的澄清溶液。在非澄清溶液中的是包含顆粒懸浮液的制劑，所述顆粒是包含可變尺寸結(jié)構(gòu)的抗MCP-1抗體的組4、物，且名稱不一地稱為微球體、微粒、納米顆粒(nanoparticle)、納米球體(nanosphere)或脂質(zhì)體。如U.S.4,589,330中教導(dǎo)的，包含活性劑的此類相對同質(zhì)、基本上球形的顆粒制劑可以通過下列方法形成使包含活性物和聚合物的水相與非水相接觸，隨后蒸發(fā)非水相以導(dǎo)致顆粒從水相凝聚。如U.S.4,818,542中教導(dǎo)的，多孔微粒可以通過下列制備使用包含在連續(xù)溶劑中分散的活性物和聚合物的第一個相，和通過冷凍干燥或稀釋_提取_沉淀從懸浮液中去除所述溶劑。用于此類制劑的優(yōu)選聚合物是天然或合成共聚物或聚合物，它們選自gleatin瓊脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、清蛋白、膠原、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(s-己內(nèi)酯、e-己內(nèi)酯-乳酸共聚物、e-己內(nèi)酯-乙醇酸共聚物、聚(卩-羥基丁酸)、聚氧化乙烷、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(曱基丙烯酸羥乙酯)、聚酰胺、聚(氨基酸)、聚(2-羥乙基DL-aspartamide)、聚(酯脲)、聚(L-苯丙氨酸/乙二醇/l,6-二異氰酸己烷)和聚(甲基丙烯酸甲酯)。特別優(yōu)選的聚合物是聚酯，例如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚U-己內(nèi)酯、s-己內(nèi)酯-乳酸共聚物和s-己內(nèi)S旨-乙醇酸共聚物。對溶解聚合物和/或活性物有用的溶劑包括水、六氟異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、己烷、苯、或六氟丙酮倍半水合物。分散包含活性物的相與第二個相的方法可以包括施加壓力從而迫使所述第一個相通過噴嘴中的孔口以影響小滴形成。干粉制劑可以由不同于冷凍干燥的方法產(chǎn)生，例如通過噴霧干燥或通過蒸發(fā)提取溶劑或通過沉淀結(jié)晶組合物，隨后為去除水性或非水性溶劑的一個或多個步驟。噴霧干燥的抗體制劑的制備在U.S.6,019,968中教導(dǎo)?；诳贵w的干粉組合物可以通過在一定條件下噴霧干燥溶于溶劑的抗體和任選地賦形劑的溶液或漿，以提供可呼吸的干粉來生產(chǎn)。溶劑可以包括可以容易干燥的極性化合物，例如水和乙醇。抗體的穩(wěn)定性可以通過在不存在氧的情況下例如在氮氣層下，或通過使用氮作為干燥氣體進(jìn)行噴霧干燥操作得到增強。如WO9916419中教導(dǎo)的，另一種相對干燥的制劑是分散在懸浮介質(zhì)中的許多有孔微結(jié)構(gòu)的分散體，所述懸浮介質(zhì)一般包含氫氟烷推進(jìn)劑。穩(wěn)定化的分散體可以使用計量的吸入器施52用于患者的肺。在噴霧干燥藥物的商業(yè)制備中有用的設(shè)備由BuchiLtd或NiroCorp制造。本文所述的在穩(wěn)定或防腐制劑或溶液中的至少一種抗MCP-1抗體可以依照本發(fā)明經(jīng)由多種遞送方法施用于患者，所述遞送方法包括如本領(lǐng)域眾所周知的SC或IM注射；經(jīng)皮、肺、跨粘膜、植入、滲透泵、藥筒、微型泵、或技術(shù)人員理解的其他方法。10.治療應(yīng)用本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的至少一種MCP-1抗體調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種MCP-1相關(guān)疾病的方法，如本領(lǐng)域已知的或如本文描述的。本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種MCP-1相關(guān)疾病的方法，所述疾病包括但不限于，惡性疾病、代i射疾病、免疫或炎癥相關(guān)疾病、心血管疾病、傳染病、或神經(jīng)疾病中的至少一種。此類狀況選自但不限于，由細(xì)胞粘附和/或血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病或狀況。此類疾病或狀況包4舌免疫病癥或疾病，心血管病癥或疾病，傳染性、惡性和/或神經(jīng)病癥或疾病，或其他已知或特定MCP-1相關(guān)狀況。具體地，抗體對于治療下列疾病有用，所述疾病涉及血管發(fā)生，例如眼疾病和胂瘤性疾病，組織重建例如再狹窄，以及某些細(xì)胞類型的增殖特別是上皮和鱗狀細(xì)胞癌。具體適應(yīng)癥包括在動脈粥樣硬化、再狹窄、癌癥轉(zhuǎn)移、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病和黃斑變性治療中的用途。本發(fā)明的中和抗體還用于預(yù)防或治療不需要的骨再吸收或降解，例如如骨質(zhì)疏松癥中發(fā)現(xiàn)的或由某些腫瘤超表達(dá)PTHrP引起的?？贵w還可能在各種纖維變性疾病的治療中有用，例如特發(fā)性肺纖維變性、糖尿病腎病、肝炎和肝硬4b。因此，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的至少一種MCP-1抗體調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種MCP-1相關(guān)疾病的方法，如本領(lǐng)域已知的或如本文描述的。具體適應(yīng)癥在下文討-論肺部疾病本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種惡性疾病的方法，所述惡性疾病包括但不限于，下列中的至53少一種肺炎；肺膿腫；由粉塵、氣體或薄霧形式的試劑引起的職業(yè)性肺部疾病；哮喘，閉塞性纖維性細(xì)支氣管炎，呼吸衰竭，肺的超敏感性疾病包括超敏感性肺炎(外源性變應(yīng)性肺泡炎)，變應(yīng)性支氣管肺曲霉病，和藥物反應(yīng)；成人呼吸窘迫綜合征(ARDS),Goodpasture氏綜合征，慢性阻塞性氣道病癥(COPD),特發(fā)性間質(zhì)性肺病例如特發(fā)性肺纖維變性和結(jié)節(jié)病，脫屑性間質(zhì)性肺炎，急性間質(zhì)性肺炎，呼吸細(xì)支氣管炎相關(guān)性間質(zhì)性肺病，含機化性肺炎的特發(fā)性閉塞性細(xì)支氣管炎，淋巴細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎，郎格漢斯細(xì)胞肉芽腫病，特發(fā)性肺含鐵血黃素沉積癥；急性支氣管炎，肺泡蛋白沉積癥，支氣管擴張，胸膜病癥，肺膨脹不全，嚢性纖維變性，以及肺腫瘤和肺栓塞。惡性疾病本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種惡性疾病的方法，所述惡性疾病包括但不限于，下列中的至少一種白血病，急性白血病，急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，B細(xì)胞、T細(xì)胞或FABALL,急性髓細(xì)胞樣白血病(AML),慢性髓細(xì)胞性白血病(CML),慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，毛細(xì)胞性白血病，骨髓異常增生綜合征(MDS),淋巴瘤，何杰金病，惡性淋巴瘤，非何杰金淋巴瘤，Burkitt氏淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，卡波西肉瘤，結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，腎細(xì)胞癌，乳腺癌，鼻咽癌，惡性組織細(xì)胞增多癥，惡性胂瘤的腫瘤相關(guān)綜合征/高血鈣綜合征，實體瘤，腺癌，鱗狀細(xì)胞癌，肉瘤，惡性黑素瘤，特別是轉(zhuǎn)移性黑素瘤，血管瘤，轉(zhuǎn)移性疾病，癌癥相關(guān)的骨再吸收，癌癥相關(guān)的骨痛等。免疫相關(guān)疾病本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種免疫相關(guān)疾病的方法，所述免疫相關(guān)疾病包括但不限于，下列中的至少一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性發(fā)作的青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、胃潰瘍、血清陰性關(guān)節(jié)病、骨關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、全身性紅斑狼癡、抗磷脂綜合征、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經(jīng)炎、特發(fā)性肺纖維變性、系統(tǒng)性脈管炎/韋格納肉芽腫病、結(jié)節(jié)病、睪丸炎/輸精管切除術(shù)逆向才喿"f乍(vasectomyreversalprocedures)、變應(yīng)'1"生/4爭應(yīng)'1"生疾病、哞喘、變應(yīng)性鼻炎、濕滲、變應(yīng)性接觸性皮炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、超敏感性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身性炎性反應(yīng)綜合征、膿毒病綜合征、革蘭氏陽性膿毒癥、革蘭氏陰性膿毒癥、培養(yǎng)物陰性膿毒癥、真菌性膿毒癥、嗜中性白細(xì)胞減少性發(fā)熱、尿膿毒癥、腦膜炎球菌血癥、外傷/出血、灼傷、電離射線暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、酒精誘導(dǎo)的肝炎、慢性炎性病理狀態(tài)、結(jié)節(jié)病、Crohn氏病理狀態(tài)、鐮狀細(xì)胞貧血、糖尿病、腎病、特應(yīng)性疾病、超敏反應(yīng)、變應(yīng)性鼻炎、枯草熱、常年性鼻炎、結(jié)膜炎、子宮內(nèi)膜異位、哮喘、蕁麻滲、systematicanaphalaxis、皮炎、惡性貧血、溶血病、血小板減少癥、任何器官或組織的移植排斥、腎移植排斥、心臟移植排斥、肝移植排斥、胰移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、皮膚同種異體移植排斥、軟骨移植排斥、骨移植排斥、小腸移植排斥、胎兒胸腺植入物排斥、曱狀旁腺移植排斥、任何器官或組織的異種移植排斥、同種異體移植排斥、抗受體超敏反應(yīng)、Graves病、Raynoud氏病、B型胰島素抗性糖尿病、哮喘、重癥肌無力、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、III型超敏反應(yīng)、全身性紅斑狼瘡、POEMS綜合征(多發(fā)性神經(jīng)病、器官巨大癥、內(nèi)分泌病、單克隆丙種球蛋白病、和皮膚改變綜合征)、多發(fā)性神經(jīng)病、器官巨大癥、內(nèi)分泌病、單克隆丙種球蛋白病、皮膚改變綜合征、抗磷脂綜合征、天皰瘡、硬皮病、混合型結(jié)締組織病、特發(fā)性Addison氏病、糖尿病、慢性活動性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、白癜風(fēng)、脈管炎、MI后心切開術(shù)綜合征、IV型超敏反應(yīng)、接觸性皮炎、超敏感性肺炎、同種異體移植排斥、胞內(nèi)生物導(dǎo)致的肉芽瘤、藥物敏感性、新陳代謝/特發(fā)性、Wilson氏病、血色素沉著、a-l抗胰蛋白酶缺乏、糖尿病性一見網(wǎng)膜病、橋本曱狀腺炎、骨質(zhì)疏松癥、下丘腦-垂體-腎上腺軸評估、原發(fā)性膽汁性肝硬變、甲狀腺炎、腦脊髓炎、惡病質(zhì)、嚢性纖維變性、新生兒慢性肺疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、familialhematophagocyticlymphohistocytosis、皮膚病狀況、牛皮痺、禿頭、腎病綜合征、腎炎、腎小球性腎炎、急性腎衰竭、血液透析、尿毒癥、毒性、先兆子癇、OKT3療法、抗CD3療法、細(xì)胞因子療法、化學(xué)療法、放射療法(例如包括但不限于無力、貧血、惡病質(zhì)等)、慢性水楊酸中毒等。參見，例如MerckManual,第12-27版，Merck&Company,Rahway,NJ(1972,1977,551982,1987，1992，1999),PharmacotherapyHandbook,Wells等人，eds.,第2版，AppletonandLange,Stamford,Conn.(1998,2000),各自整體引入作為參考。心血管疾病本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種心血管疾病的方法，所述心血管疾病包括但不限于，下列中的至少一種心臟震昏綜合征、心肌梗死、充血性心力衰竭、中風(fēng)、缺血性中風(fēng)、出血、動脈硬化癥、動脈粥樣硬化、再狹窄、糖尿病性動脈硬化病、高血壓、動脈高壓、腎血管性高血壓、昏厥、休克、心血管系統(tǒng)梅毒、心力衰竭、肺源性心臟病、原發(fā)性肺動脈高壓、心律失常、心房異位搏動、心房樸動、心房纖顫(持續(xù)或陣發(fā)性)、灌注后綜合征、心肺分流術(shù)炎癥反應(yīng)、紊亂性或多源性房性心動過速、規(guī)則狹窄性QRS心動過速、特殊心律失常、心室纖顫、希氏束性心律失常、房室傳導(dǎo)阻滯、束支傳導(dǎo)阻滯、心肌缺血性病癥、冠狀動脈病、心絞痛pectoris、心肌梗死、心肌病、擴張性充血性心肌病、限制性心肌病、瓣膜心臟病、心內(nèi)膜炎、心包病、心臟腫瘤、主動脈和周圍性動脈瘤、主動脈壁夾層形成、主動脈炎癥、腹主動脈及其分支阻塞、外周血管病癥、阻塞性動脈病癥、外周動脈粥樣硬化病、血栓閉塞性血管炎、功能性外周動脈病癥、Raynaud氏現(xiàn)象和疾病、手足發(fā)紺、紅斑性肢痛病、靜脈疾病、靜脈血栓形成、曲張4爭脈、動靜脈瘺、lymphederma、脂肪水腫、不穩(wěn)定心絞痛、再灌注損傷、泵后綜合征(postpumpsyndrome)、缺血-再灌注損傷等。此類方法可以任選包括給需要此類調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動物或患者施用有效量的、包含至少一種抗MCP-1抗體的組合物或藥物組合物。神經(jīng)疾病本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種神經(jīng)疾病的方法，所述神經(jīng)疾病包括但不限于，下列中的至少一種神經(jīng)變性疾病，多發(fā)性硬化，偏頭痛，AIDS癡呆綜合征，脫髓鞘性病，例如多發(fā)性硬化和急性橫貫性脊髓炎；錐體束外和小腦病癥，例如脊髓皮質(zhì)系統(tǒng)損害；基底神經(jīng)節(jié)病癥或小腦病癥；運動機能亢進(jìn)性運動障礙，例如亨廷頓舞蹈病和老年性舞蹈病；藥物誘發(fā)的運動失調(diào)，例如由阻斷CNS多巴胺受體的藥物誘導(dǎo)的那些；運動機能減退性運動失調(diào)，例如帕金森??；進(jìn)行性核上麻痹；小腦結(jié)構(gòu)損害；脊髓小腦變性，例如脊推性共濟失調(diào)、弗里德賴希共濟失調(diào)、小腦皮質(zhì)變性、多系統(tǒng)變性(Mencel、Dejerine畫Thomas、Shi-Drager和Machado-Joseph);全身病癥(Refsum氏病、血卩脂蛋白缺乏癥)、共濟失調(diào)、毛細(xì)血管擴張、和線粒體多系統(tǒng)病癥)；脫髓鞘核心病癥，例如多發(fā)性硬化、急性橫貫性脊髓炎；以及運動單位病癥，例如神經(jīng)原性肌萎縮(前角細(xì)胞變性，例如肌萎縮性側(cè)索硬化癥、嬰兒脊髓性肌萎縮和青少年脊髓性肌萎縮)；阿爾茨海默氏?。恢心晏剖暇C合征；彌散性Lewy體??；Lewy體型老年性癡呆；Wernicke-Korsakoff綜合征；慢性酒精中毒；Creutzfeldt-Jakob?。粊喖毙杂不匀X炎、Hallerrorden-Spatz病；和拳擊員癡呆(Dementiapugilistica)等。此類方法可以任選包括給需要此類調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動物或患者施用有效量的、包含至少一種TNF抗體或特定部分或變體的組合物或藥物組合物。參見，例如MerckManual,第16版，Merck&Company,Rahway,NJ(1992)。纖維變性狀況除了上述狀況和疾病之外，本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)或治療各種病因的纖維變性狀況的方法，例如肝纖維變性(包括但不限于酒精誘發(fā)的肝硬化、病毒誘發(fā)的肝硬化、自身免疫誘發(fā)的肝炎)；肺纖維變性(包括但不限于硬皮病、特發(fā)性肺纖維變性)；腎纖維變性(包括但不限于硬皮病、糖尿病性腎炎、腎小球腎炎、狼瘡腎炎)；皮膚纖維變性(包括但不限于硬皮病、肥大性和瘢痕疙疼性瘢痕形成、灼傷)；骨髓纖維變性；神經(jīng)纖維瘤??；纖維瘤；腸纖維變性；和由外科手術(shù)操作引起的纖維變性粘連。本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種創(chuàng)傷、外傷或組織損傷或由其產(chǎn)生或與其相關(guān)的慢性狀況的方法，包括但不限于，下列中的任何一種身體損傷或與外科手術(shù)相關(guān)的外傷，所述手術(shù)包括胸、腹、顱或口腔外科手術(shù)；或其中所述創(chuàng)傷選自無菌創(chuàng)傷、挫傷、割傷、撕裂傷、非穿透傷、開放性創(chuàng)傷、穿透傷、貫通傷、刺傷、染毒創(chuàng)傷、梗塞形成和皮下創(chuàng)傷；或其中所述創(chuàng)傷選自缺血性潰瘍、褥瘡、瘺、嚴(yán)重咬傷、熱灼傷和供體部位創(chuàng)傷；或其中所述創(chuàng)傷是口瘡創(chuàng)傷、外傷性創(chuàng)傷或皰滲相關(guān)創(chuàng)傷。供體部位創(chuàng)傷是例如與從身體的一個部分切除硬組織至身體的另一部分有關(guān)，例如與移植有關(guān)發(fā)生的創(chuàng)傷。由此類手術(shù)產(chǎn)生的創(chuàng)傷是非常疼痛的且改善的愈合因此最有價值。創(chuàng)傷纖維變性也順應(yīng)抗MCP-1抗體療法，因為侵襲創(chuàng)傷區(qū)域的第一種細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞，隨后為由巨噬細(xì)胞活化的單核細(xì)胞。巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是有效的創(chuàng)傷愈合所必需的，因為它們還負(fù)責(zé)病原性生物的吞噬作用且去清除組織碎片。此外，它們釋放涉及后續(xù)愈合過程事件的眾多因子。巨噬細(xì)胞吸引起始膠原產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞。幾乎所有組織修復(fù)過程都包括早期結(jié)締組織形成、這個以及后續(xù)過程的刺激改善組織愈合，然而，結(jié)締組織和膠原的超量產(chǎn)生可以導(dǎo)致特征為非彈性和含氧量低的纖維變性組織。本發(fā)明的抗MCP-1抗體可以在用于調(diào)節(jié)、治療或預(yù)防此類創(chuàng)傷愈合后遺癥的方法中使用。心臟移植的慢性排斥中的至少一種癥狀的方法中使用。抗MCP-1抗體的其他治療用途本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種傳染病的方法，所述傳染病包括但不限于，下列中的至少一種急性或慢性細(xì)菌感染，急性和慢性寄生物或傳染性過程，包括細(xì)菌、病毒和真菌感染，HIV感染/HIV神經(jīng)病，腦膜炎，肝炎(曱型、乙型或丙型等)，膿毒性關(guān)節(jié)炎，腹膜炎，肺炎，會厭炎，大腸桿菌0157:h7,溶血尿毒癥綜合征/溶解血栓性血小板減少性紫癥，癡疾，登革出血熱，利什曼病，麻風(fēng)病，中毒性休克綜合征，鏈球菌性肌炎，氣性環(huán)疽，結(jié)核分枝桿菌，細(xì)胞內(nèi)鳥分枝桿菌，卡氏肺嚢蟲性肺炎，骨盆炎癥性疾病，睪丸炎/附睪炎，軍團桿菌，lyme病，a型流行性感冒，EB病毒，vital-associatedhemaphagocyticsyndrome,重要月畝炎/無菌'l"生月畝月莫炎等。本發(fā)明的任何方法都可以包括給需要此類調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動物或患者施用有效量的、包含至少一種抗MCP-1抗體的組合物或藥物組合物。此類方法可以任選進(jìn)一步選自下列的至少一種至少一種TNF拮抗劑(例如但不限于TNF抗體或片段，可溶性TNF受體或其片段、融合蛋白，或小分子TNF拮抗劑)，抗風(fēng)濕藥(例58如氨曱蝶呤、醋硫葡金、葡糖硫金、硫唑嘌呤、etanercept、硫代蘋果酸金鈉、硫酸羥氯喹、來氟洛米、柳氮磺p比咬)，肌肉松弛藥，麻醉藥，非類固醇消炎藥(NSAID),止痛劑，麻醉劑，鎮(zhèn)靜劑，局部麻醉劑，神經(jīng)肌肉阻斷劑，抗微生物劑(例如氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生物劑、抗病毒劑、碳青霉烯、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、青霉素、磺胺藥物、四環(huán)素、另一種抗微生物劑)，抗牛皮齊劑，皮質(zhì)類固醇(地塞米松)，促蛋白合成類固醇(睪酮)，糖尿病相關(guān)劑，礦物質(zhì)，營養(yǎng)物，甲狀腺劑，維生素，4丐相關(guān)激素，止竭劑，止咳藥，止吐劑，抗?jié)兯?，緩瀉藥，抗凝劑，促紅細(xì)胞生成素(例如重組人類紅細(xì)胞生成素a),非格司亭(例如G-CSF,重組人粒細(xì)胞集落刺激因子)，沙格司亭(GM-CSF，白細(xì)胞素)，免疫接種，免疫球蛋白(利妥希碼)，免疫抑制劑(例如basiliximab、環(huán)孢菌素、daclizumab),生長激素，激素拮抗劑，生殖激素拮抗劑(氟利坦、尼魯米特)，激素釋放調(diào)節(jié)劑(亮丙瑞林，性瑞林)，激素替代藥物，雌激素受體調(diào)節(jié)劑(他莫西芬)，類視黃醇(維曱酸)，拓樸異構(gòu)酶抑制劑(依托泊苷、依立替康)，cytoxin(阿霉素)，散瞳劑，睫狀肌麻痹藥，烷化劑(卡鉑)，氮芥(美法侖，苯丁酸氮芥(chlorabucil)),亞硝基脲(卡莫司汀、雌莫司汀)，抗代謝物(氨甲蝶呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶)，有絲分裂抑制劑(長春新堿、紫杉醇)，防輻射藥物(碘131-托西莫單抗(tositumomab)),輻射敏化劑(米索硝唑、替拉扎明)，抗抑郁藥，抗躁狂劑，抗精神病藥，抗焦慮藥，催眠藥，擬交感神經(jīng)藥，興奮劑，多奈哌齊，單滿吖啶氨，哮喘藥，卩激動劑，吸入類固醇，白細(xì)胞三烯抑制劑，甲基黃嘌呤，色甘酸，腎上腺素或類似物，阿法脫氧核糖核酸酶(Pulmozyme)，細(xì)胞因子(干擾素a-2、IL-2)或細(xì)胞因子拮抗劑(英夫單抗(inflixamab))。合適的劑量是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如Wells等人，eds.,PharmacotherapyHandbook,第2版，AppletonandLange,Stamford,CT(2000);PDRPharmacopoeia,TarasconPocketPharmacopoeia2000，DeluxeEdition,TarasconPublishing,LomaLinda,CA(2000)，所述參考文獻(xiàn)各自整體引入本文作為參考。agent)施用之前^同時和/或、之后共施用或組合治療^所述抗腫瘤藥例如烷化劑、氮芥、亞硝基脲(nitrosurea)、抗生素、抗代謝物、激素激動劑或拮抗劑、免疫調(diào)諧劑等。對于在轉(zhuǎn)移性黑素瘤和其他腫瘤性疾病中的使用，優(yōu)選組合是抗體與氮烯米胺、干擾素(X、白細(xì)胞介素-2、替莫唑胺、順鉑、長春堿、曱磺酸伊馬替尼(ImatinibMesylate)、卡莫司汀、紫杉醇等共施用。對于轉(zhuǎn)移性黑素瘤，氮烯米胺是優(yōu)選的。11.施用劑量和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的方法可以包括用于治療MCP-1介導(dǎo)的病癥的方法，包括給需要此類調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動物或患者施用有效量的、包含至少一種抗MCP-1抗體的組合物或藥物組合物。此類方法可以任選進(jìn)一步包括用于治療此類疾病或病癥的共施用或組合治療，其中所述至少一種抗MCP-1抗體、其特定部分或變體的施用進(jìn)一步包含在選自下列的至少一種施用之前、同時和/或之后施用腎藥、皮膚病學(xué)(dermatogical)藥物、抗血管生成藥、抗感染藥，心血管(CV)系統(tǒng)藥物，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物，自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)藥物，呼吸道藥物，胃腸(GI)道藥物，激素藥物，用于流體或電解質(zhì)平衡的藥物，血液學(xué)藥物，抗癌藥，免疫調(diào)諧藥物，眼、耳或鼻藥物，局部藥物，營養(yǎng)藥物等，至少一種TNF拮抗劑(例如但不限于TNF抗體或片段，可溶性TNF受體或其片段、融合蛋白，或小分子TNF拮抗劑)，抗風(fēng)濕藥(例如氨甲蝶呤、醋硫葡金、葡糖硫金、硫唑嘌呤、etanerc印t、硫代蘋果酸金鈉、硫酸羥氯p奎、來氟洛米、柳氮磺吡啶)，肌肉松弛藥，麻醉藥，非類固醇消炎藥(NSAID),止痛劑，麻醉劑，鎮(zhèn)靜劑，局部麻醉劑，神經(jīng)肌肉阻斷劑，抗微生物劑(例如氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生物劑、抗病毒劑、碳青霉烯、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、青霉素、磺胺藥物、四環(huán)素、另一種抗微生物劑)，抗牛皮褲劑，皮質(zhì)類固醇，促蛋白合成類固醇，糖尿病相關(guān)劑，礦物質(zhì)，營養(yǎng)物，曱狀腺劑，維生素，釣相關(guān)激素，止瀉劑，止咳藥，止吐劑，抗?jié)兯帲彏a藥，抗凝劑，促紅細(xì)胞生成素(例如重組人類紅細(xì)胞生成素a),非格司亭(例如G-CSF，重組人粒細(xì)胞集落刺激因子)，沙格司亭(GM-CSF,白細(xì)胞素),免疫接種，免疫球蛋白，免疫抑制劑(例如basiliximab、環(huán)孢菌素、daclizumab),生長激素，激素替代藥物，雌激素受體調(diào)節(jié)劑，散瞳劑，睫狀肌麻痹藥，烷化劑，抗代謝物，有絲分裂抑制劑，防輻射藥物，抗抑郁藥，抗躁狂劑，抗精神病藥，抗焦慮藥，催眠藥，擬交感神經(jīng)藥，興奮劑，多奈哌齊，曱滿吖啶氨，哮喘藥，卩激動劑，吸入類固醇，白細(xì)胞三烯抑制劑，曱基黃噤呤，色甘酸，腎上腺素或類似物，阿法脫氧核糖核酸酶(Pulmozyme),細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑。此類藥物是本領(lǐng)域眾所周知的，包括關(guān)于本文提出的每一種的配制、適應(yīng)癥、給藥和施用(參見，例如Nursing2001HandbookofDrugs,第21版，SpringhouseCorp.,Springhouse,PA,2001;HealthProfessional'sDrugGuide2001,ed.,Shannon,Wilson,Stang,Prentice-Hall,Inc,UpperSaddleRiver,NJ;PharmcotherapyHandbook,Wells等人,ed.，Appleton&Lange,Stamford,CT，所述參考文獻(xiàn)各自整體引入本文作為參考)。一般地，病理性狀況的治療通過施用有效量或劑量的至少一種抗MCP-1抗體組合物來完成，取決于組合物中包含的比活性，所述組合物總計為平均至少約0.01-500毫克至少一種抗MCP-1抗體/千克患者/劑，且優(yōu)選至少約0.1-100毫克抗體/千克患者/單次或多次施用?？商娲?，有效血清濃度可以包含0.1-5000ng/ml血清濃度/單次或多次施用。合適的劑量是醫(yī)學(xué)從業(yè)者已知的，且當(dāng)然將依賴具體疾病狀態(tài)、待施用組合物的比活性、以及接受治療的具體患者。在某些情況下，為了達(dá)到所需治療量，可能必須提供重復(fù)施用，即特定監(jiān)控或計量劑量的重復(fù)個別施用，其中所述個別施用可以重復(fù)直至達(dá)到所需日劑量或作用。伊乙選劑量可以4壬選包才舌0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100-500mg/kg/施用，或其任何范圍、值或分?jǐn)?shù)，或達(dá)到下列血清濃度:0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、6116、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000|ug/ml血清濃度/單次或多次施用，或其任何范圍、值或分?jǐn)?shù)?？商娲?，施用的劑量可以依已知因素而變，所述因素例如具體試劑的藥物動力學(xué)特征，及其施用方式和途徑；受體年齡、健康和重量；癥狀性質(zhì)和程度、目前治療種類、治療頻率和所需作用。通?；钚猿煞值膭┝靠梢允羌s0.1-100毫克/千克體重。通常0.1-50,且優(yōu)選0.1-10毫克/千克/施用或緩釋形式對于達(dá)到所需結(jié)果是有效的。作為非限制性例子，人或動物的治療可以在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或可替代地或另外地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周中至少一周，或可替代地或另外地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年中的至少一年，或其任何組合，使用單次、輸注或重復(fù)劑次，作為0.1-100mg/kg的一次或定期劑量的本發(fā)明至少一種抗體提供，例如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/天。適合于內(nèi)部施用的劑型(組合物)一般包含約0.001毫克-約500毫克活性成分/單位或容器。在這些藥物組合物中，活性成分一般將以基于組合物總重量的約0.5-99.999重量％的量存在。對于腸胃外施用，抗體可以配制為溶液、懸浮液、乳劑、顆粒、粉末或冷凍干燥粉末，它們與藥學(xué)可接受的腸胃外載體結(jié)合或分開提供。此類載體的例子是水、鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液、和1-10%的人血清清蛋白。也可以使用脂質(zhì)體和非水性載體，例如固定化油。載體或冷凍干燥粉末可以包含維持等滲性(例如氯化鈉、甘露醇)和化學(xué)穩(wěn)定性(例如緩沖劑和防腐劑)的添加劑。制劑可以通過已知或合適技術(shù)進(jìn)行滅菌。合適的藥學(xué)載體在Remington'sPharmaceuticalSciences,A.Osol的最近版本中得到描述，所述參考文獻(xiàn)是這個領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考文本?？商娲氖┯?。許多已知和開發(fā)的方式可以依照本發(fā)明使用以施用藥學(xué)有效量的根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗MCP-l抗體。盡管在下文說明書中使用肺施用，但其他施用方式也可以根據(jù)本發(fā)明使用，產(chǎn)生合適的結(jié)果。本發(fā)明的MCP-l抗體可以使用適合于通過本文描述的或本領(lǐng)域已知的吸入或其他方式施用的多種裝置和方法中的任何一種，在載體中作為溶液、乳劑、膠體或懸浮液、或作為干粉進(jìn)行遞送。腸胃外制劑和施用。用于腸胃外施用的制劑可以包含作為普通賦形劑的無菌水或鹽水、聚亞烷基二醇例如聚乙二醇、植物來源的油、氫化萘等。用于注射的水性或油性懸浮液可以通過使用合適的乳化劑或濕潤劑和懸浮劑根據(jù)已知方法進(jìn)行制備。用于注射的試劑可以是無毒的、非經(jīng)口施用的稀釋劑，例如溶于溶劑的水溶液或無菌注射液或懸浮液。作為可用的載體或溶劑，水、林格溶液、等滲鹽水等是允許的；作為普通溶劑或懸浮溶劑，可以使用無菌不揮發(fā)性油。為了這些目的，可以使用任何種類的不揮發(fā)性油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成甘油單酯、或甘油二酯、或甘油三酯。腸胃外施用是本領(lǐng)域已知的，且包括但不限于如本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)注射方法、氣壓無針注射裝置、或激光穿孔裝置(例如但不限于美國專利號5,851,198和美國專利號5,839,446中公開的材料和方法，所述專利整體引入本文作為參考)?？商娲倪f送。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過下列方式施用至少一種抗MCP-l抗體腸胃外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、嚢內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、病灶內(nèi)、快速灌注、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮方式。至少一種抗MCP-l抗體組合物可以制備用于腸胃外(皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi))或特別是以液體溶液或懸浮液的形式的任何其他施用；用于以陰道或直腸施用特別是半固體形式使用，例如但不限于乳膏和栓劑；用于口腔或舌下施用例如但不限于片劑或膠嚢的形式；或鼻內(nèi)，例如但不限于粉末、鼻滴劑或氣溶膠或某些試劑的形式；或經(jīng)皮，例如但不限于，凝膠、軟膏、洗劑、懸浮液或貼劑遞送系統(tǒng)，其含化學(xué)增強劑例如二曱基亞砜以修飾皮膚結(jié)構(gòu)或增加經(jīng)皮貼劑中的藥物濃度(Junginger等人In"DrugPermeationEnhancement";Hsieh，D.S.,Eds.，第59-90頁(MarcelDekker,Inc.NewYork1994,整體引入本文作為參考)，或含氧化劑，其使得包含蛋白質(zhì)和肽的制劑能夠應(yīng)用在皮膚上(WO98/53847),或應(yīng)用電場以產(chǎn)生瞬間轉(zhuǎn)運途徑，例如電穿孔，或增加帶電藥物通過皮膚的運動性，例如離子電滲療法，或應(yīng)用超聲，例如超聲波導(dǎo)入術(shù)(sonophoresis)(美國專利號4,309,989和4,767,402)(上述出版物和專利整體引入本文作為參考)。肺/鼻施用。對于肺施用，優(yōu)選至少一種抗MCP-1抗體組合物以有效用于達(dá)到肺或竇的下部氣道的顆粒大小遞送。根據(jù)本發(fā)明，至少一種抗MCP-1抗體可以通過本領(lǐng)域已知的用于通過吸入施用治療劑的多種吸入或鼻裝置中的任何一種遞送。能夠在患者的竇腔或肺泡中沉積氣溶膠化制劑的這些裝置包括計量劑量的吸入器、霧化器、干粉產(chǎn)生器、噴霧器等。適合于指引抗體的肺或鼻施用的其他裝置也是本領(lǐng)域已知的。所有此類裝置都可以使用適合于以用于以氣溶膠形式分配抗體施用的制劑。此類氣溶膠可以包含溶液(水性或非水性)或固體顆粒。計量劑量吸入器如Ventolir^計量劑量吸入器，一般使用推進(jìn)氣體且在吸氣期間需要啟動(參見，例如，WO94/16970，WO98/35888)。干粉吸入器如TurbuhalerTM(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由InhaleTherapeutics銷售的裝置，和Spinhale^粉末吸入器(Fisons),使用混合粉末的呼吸-啟動(US4668218Astra,EP237507Astra,WO97/25086Glaxo,WO94/08552Dura,US5458135Inhale,WO94/06498Fisons,所述專利整體引入本文作為參考)。霧化器如AERxTMAradigm、Ultravent⑧霧化器(Mallinckrodt)、和AcornII霧化器(MarquestMedicalProducts)(US5404871Aradigm,WO97/22376),上述參考文獻(xiàn)整體引入本文作為參考，由溶液產(chǎn)生氣溶膠，而計量劑量吸入器、干粉吸入器等產(chǎn)生小顆粒的氣溶膠。這些商購可得的吸入裝置的具體例子意在代表適合于本發(fā)明實踐的具體裝置，且不意在是本發(fā)明范圍的限制。優(yōu)選地，包含至少一種抗MCP-1抗體的組合物由干粉吸入器或噴霧器遞送。對于施用本發(fā)明的至少一種抗體，吸入裝置有幾個所需的特征。例如，通過吸入裝置遞送有利地是可靠的、可再現(xiàn)的和精確的。為了良好的可呼吸性，吸入裝置可以任選遞送小的干燥顆粒，例如小于約10ium,優(yōu)選約l-5]iim。實施例1:作為非限制性例子使用噬菌體展示產(chǎn)生對MCP-1特異的MCP-1抗體申請人先前已顯示鼠抗人MCP-1抗體的有利的治療特征，所述抗體命名為C775且在申請人共同未決的專利申請美國系列號11/170453(那個申請關(guān)于重和輕鏈可變區(qū)分別為SEQIDNO:7和8)和相關(guān)文件中描述。本次努力的目標(biāo)是從HuCALGOIX^中鑒定至少一種人抗體，所述抗體中和人細(xì)胞因子MCP-1的生物學(xué)活性且顯示相似屬性。C775抗體，以及因此所需的人抗MCP-1抗體的屬性由下文扭無述的成功標(biāo)準(zhǔn)限定。至少一種治療抗體的成功標(biāo)準(zhǔn)以固相形式與人MCP-1結(jié)合；特異性限定為在100nM時缺乏與同源蛋白質(zhì)人MCP-2、3、4以及人嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子1、2和3的結(jié)合；抑制人MCP-1與其在Thp-l細(xì)胞上的人受體CCR2的結(jié)合，且IC50值小于參考FabC775;抑制人MCP-1介導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的趨化性，且IC50值小于參考FabC775;在次級生物測定(例如Ca2+動員或CCL-2誘導(dǎo)的受體內(nèi)在化)中抑制人MCP-1介導(dǎo)的活性，作為定性的是/非標(biāo)準(zhǔn)，或在定量測定中具有與參考FabC775可比較的效力；與人MCP-1結(jié)合的Kd<0.5nM;與短尾猴MCP-1結(jié)合的KD<20nM,且優(yōu)選<10nM;以可比較的效力抑制天然人MCP-1和化學(xué)合成的人MCP-1的生物活性；在Fab再工程改造成IgG后、且在C775的全長IgG形式作為比較物(comparator)的基礎(chǔ)上保留標(biāo)準(zhǔn)1-8。選擇過程概述使用HuCALGOLD⑧進(jìn)行了10次不同的淘選，且篩選了17856個克隆，從而產(chǎn)生1104個初步命中。最后在ELISA中鑒定了結(jié)合合成的人MCP-1的26個獨特Fabs。在那些中，才艮據(jù)親和力、生物活性、特異性以及與短尾猴和天然人MCP-1的結(jié)合選擇7個不同的Fabs用于親和力成熟。親本Fabs的親和力為10-400nM，且在放射性配體結(jié)合測定中的IC5o值為10-600nM。材津牛和方法DNA限制和修飾酶以及聚合酶購自Invi加gen(Carlsbad,CA,USA)、NewEnglandBiolabs(Beverly,MA,USA)、RocheDiagnostics(Mannheim,德國)和MBIF匿entas(Vilnius,立陶宛)。特異性POD綴合的山羊抗人IgGF(ab，)2片段由Jacksons(WestGrove,PN,USA)提供，綿羊抗人IgG、Fd片段特異性抗體由TheBindingSite(Birmingham,UK)提供，且與堿性磷酸酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白(ZyMAXTM級別)由ZymedLaboratories(SanFrancisco,CA,USA)提供。重組人細(xì)胞因子hMCP-1、2、3、4以及hEotaxin1、2和3(R&Dsystems)試劑、配體和抗體mAb279，對MCP-1特異(R&Dsystems);合成hMCP-1(Bachem);mAbl小鼠抗hCCR2生物素(R&Dsystems);人y球蛋白(JacksonImmunoResearch);小鼠y^求蛋白(JacksonImmunoResearch);mAbmlgG2b同種型對照生物素(R&Dsystems);鏈霉抗生物素蛋白-PE(BDPharmingen);Versene(Invitrogen;PBS(Invitrogen).FCS(PAN);V底孔板(Greiner);和U底孔板(Nunc)。MCP-1多肽和類似物的制備。如申請人的共同未決的申請美國系列號No.60/682620和Kruszynski等人2006，JPeptideSci.12:25-32中描述的，分步固相肽合成和親和純化以提供分離的、全長、成熟(76個氨基酸)以及正確折疊和任選修飾的人MCP-1和變體，其具有生物學(xué)活性。設(shè)計成顯示天然表面拓樸學(xué)和肽主鏈結(jié)構(gòu)的變體包括A40S、V41I和F43Y?；瘜W(xué)合成也提供了使用K69和K75處的賴氨酸的s-氨基用于人MCP-1位點特異性生物素化的方法，所述賴氨酸不涉及受體結(jié)合或表面活性、在結(jié)構(gòu)中是紊亂的(美國系列號60/682620和Kruszynski等人2006,JPeptideSd.12:354-360)。4個乙烯氧基單位(PEG4)的親水間隔基插入生物素和賴氨酸殘基的e-氨基之間。從生物素酰胺到末端羰基的鏈長是19.2A。選擇間隔基以增加溶解性且提供足夠的間隔基長度以用于結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白綴合物。MCP-1和變體的序列在SEQIDNO:1中提供。測定變體保留在THP-1細(xì)胞中誘導(dǎo)Ca2+動員的能力。生物素-Lys69和生物素-Lys75MCP-1在篩選、固結(jié)和親和力測定中并排進(jìn)行比較，且沒有觀察到顯著差異。使用Biacore，35個最優(yōu)化的Fabs對鏈霉抗生物素蛋白芯片上固定的MCP-1lie41,Lys(生物素-PEG4)69和MCP-1lie41,Lys(生物素-PEG4)75平行進(jìn)行分析。一般而言對MCP-1K69和K75測量的親和力是可比4支的。噬菌體Fab文庫。噬菌粒文庫基于HuCAL⑧概念(Knappik等人，2000),且使用CysDisplayTM技術(shù)用于在噬菌體表面上展示Fab(Ldhnmg,2001)。文庫編碼作為與小外殼蛋白pIII的融合物、在M13噬菌體上展示的大約101()個獨特的Fabs。對于選擇，將HuCALGOLD⑧抗體-噬菌體分成包含不同VH主基因的3個庫。此外在1個庫(VH1-6)中使用完整文庫。對于每次淘選使用2X10"HuCALGOLD⑧輸入噬菌體。應(yīng)用4種不同的淘選策略，包括分別對人MCP-1類似物-1(V41I,Ile")和類似物-2(F43Y,Tyr43)的3輪淘選，以及按照1-2-1和2-1-2的順序?qū)︻愃莆锏?次交替淘選。固相淘選。在PBS,pH7.4中50貼/ml的100pl等分試樣的人MCP-1類似物-1(V41I)或類似物-2(F43Y)直接包^皮在Maxisorp⑧孔上(NalgenNunc,Rochester,NY)于4。C過夜。包^皮的孔進(jìn)行洗滌且用5%MPBS(PBS,5%低脂乳粉)封閉。每孔加入100pl封閉的HuCALGOU^噬菌體于RT2小時。幾個洗滌步驟后，結(jié)合的噬菌體通過溶于10mMTris/HCl，pH8.0的100[il20mMDTT進(jìn)行洗脫，于RT溫育10分鐘。洗脫物用于感染中期大腸桿菌TG1(Stratagene,Amsterdam,荷蘭)，且噬菌粒如所述的進(jìn)行擴增(Krebs等人，2001)。針對人MCP-1類似物-1(V41I)和類似物-2(F43Y)的半溶液淘選產(chǎn)生中和Fab分子。半溶液淘選通過下列進(jìn)行將2種生物素化的人MCP-1衍生物-V411,K69-PEG-生物素或V41I,K75-PEG-生物素(SEQIDNO:1)與HuCALGOLD⑧噬菌體在溶液中溫育，隨后使噬菌體抗原復(fù)合物捕獲至Reacti-BindNeutravidinCoatedPolystyrene微量滴定板條(PERBIO)。對于淘選，1.5mlEppendorf管于4°C用由PBSO/N1:1,希釋的Chemiblocker(ChemiconInternational)佳'于閉。下一天Reacti-BmdTMNeutrAvidinTM(Pierce,Rockford，IL，USA)微量滴定板條(結(jié)合能力25皮摩爾生物素/孔；PERBIO)用2x300|ulPBS漂洗，這是減少neutravidin結(jié)合劑的數(shù)目的2個預(yù)先吸附步驟所需的。每孔加入在10050%Chemiblocker(Chemicon),0.05%Tween20(Sigma)中來自HuCALGOLD文庫的2x1013個噬菌體，且于RT輕微振蕩封閉l小時。對于第2個預(yù)先吸附步驟，將噬菌體溶液轉(zhuǎn)移至新Reacti-BindNeutravidinCoatedPolystyrene微量滴定板條，且于RT輕微振蕩溫育1小時。隨后向預(yù)先封閉的1.5mlEppendorf管中加入預(yù)先吸附的噬菌體和生物素化的抗原(對于生物素化生物素與抗原的比率為3:1;終濃度為200nM),且于RT在旋轉(zhuǎn)輪上進(jìn)行1小時溫育。平行地，進(jìn)一步的Reacti-BindNeutravidinCoatedPolystyrene樣i量滴定4反條用2x300julPBS漂洗，用由PBS1:1稀釋的300plChemiblocker封閉1小時，且用1x30(^1PBS洗滌。100^1/孔的生物素-抗原-噬菌體復(fù)合物用移液管移液到微量滴定板條內(nèi)，且于RT輕微振蕩溫育1小時。幾個洗滌步驟后，結(jié)合的噬菌體通過溶于10mMTris/HCl，pH8.0的110pi20mMDTT進(jìn)行洗脫，于RT溫育10分鐘。洗脫物用于感染中期大腸桿菌TGI(Stratagene,Amsterdam,荷蘭)，且噬菌粒如所述的進(jìn)行擴增(Krebs等人，2001)。所選Fab片段的亞克隆和微量表達(dá)(Microexpression)。為了促進(jìn)可溶性Fab的快速表達(dá)，編碼所選HuCALGOLD噬菌體插入片段的Fab經(jīng)由J^al和EcoRI亞克隆到表達(dá)載體pMORPH⑧X9—FH內(nèi)。Fab片段攜帶C末端FLAG標(biāo)記(Prickett等人，1989)和作為第二個C末端標(biāo)記的6xHis標(biāo)記(Chen等人，1994)。TG1-F轉(zhuǎn)化后，如先前所述進(jìn)行包含HuCAL-Fab片段的周質(zhì)提取物的單個克隆表達(dá)和制備(Rauchenberger等人，2003)。如上所述進(jìn)行對人MCP-1類似物-1(V41I)的固相形式的結(jié)合測定法。封閉后加入周質(zhì)提取物。通過與山羊抗人IgG，F(xiàn)(ab')2片段特異性抗體溫育進(jìn)行Fab片段的檢測。對固定化的生物素化hMCP-1V411的篩選使用Reacti-BindTMNeutrAvidin384孔板(Pierce,Rockford，IL,USA)進(jìn)行，所述384孔板用在PBS,pH7.4中稀釋的20pi0.5pl/ml生物素化的hMCP-1類似物-1(V41I)或類似物-2(F43Y)包被，于4。C進(jìn)行16小時。用溶于TBS,0.05%Tween20(Sigma,St.Louis,MO,USA)中的1。/。BSA于RT封閉1小時后，加入周質(zhì)提取物。通過與山羊抗人IgG,F(ab')2片段特異性抗體溫育進(jìn)行Fab片段的檢測。對生物素化hMCP-l類似物-1(V41I)的固相篩選通過下列進(jìn)行用在PBS,pH7.4中l(wèi):1000稀釋的20pl綿羊抗人IgG,Fd片段特異性抗體于4。C包被Maxisorp(Nunc,Rocheoter,NY,USA)384孔板16小時。用溶于TBS，0.05%Tween20(Sigma，St.Louis,MO,USA)中的3%BSA于RT封閉2小時后，加入周質(zhì)提取物。隨后允許捕獲的HuCAL-Fab片段與溶于TBS中的0.2pg/ml生物素化的hMCP-1類似物-1(V41I)結(jié)合，所述結(jié)合通過與綴合至堿性磷酸酶的鏈霉抗生物素蛋白溫育，隨后力口入AttoPhos熒光底物(RocheDiagnostics,Mannheim,德國)進(jìn)行檢測。記錄用430nm處的激發(fā)在535nm處的熒光發(fā)射。生物活性測定細(xì)胞培養(yǎng)。所有細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)化條件下于37"和5。/。C02在濕潤培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。表達(dá)CCR2的細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長。另外，THP-1細(xì)胞(人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞)在包含2mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、10mMHEPES和1.0mM丙酮酸鈉，90%;10%胎牛血清(FBS;VitacellRPMI20-2001,ATCC,Manassas,VA)的RPMI中以4-8x105細(xì)胞/mL的密度于37°C和5%C02進(jìn)行培養(yǎng)放射性配體結(jié)合測定。竟?fàn)帨y定在微孔過濾器板(Millipore,Bedford,MA)中進(jìn)行。1x106THP曙1細(xì)胞/孔與125I-MCP-1(1ng/mL;PerkinElmerLifeScience,Boston,MA),連同不同濃度的重組人(rh)MCP-1(279-MC,R&DSystems,Minneapolis,MN)或合成蛋白質(zhì)溫育。所有試劑都在由RPMIMedium1640(InvitrogenCorp.,GrandIsland,NY)和0.iyoBSA組成的結(jié)合緩沖液中進(jìn)行稀釋。允許竟?fàn)幱赗T進(jìn)行1小時，且孔用150iuL/孔洗滌緩沖液(結(jié)合緩沖液+1MNaCl)洗滌3次。過濾器上的方丈射性4吏用WallacWizard1470AutomaticGammaCounter(PerkinElmerLifeSciencesInc.,Boston,MA)進(jìn)行計數(shù)。計算可變劑量的重組或合成MCP-1對125I-MCP-1與CCR2結(jié)合的抑制百分比。隨后將抑制百分比值輸入GraphpadPrism程序中，且使用S形劑量應(yīng)答曲線用可變斜率以及底部=0和頂端=100的常數(shù)進(jìn)行作圖。鈣動員測定。Ca^動員測定以96孔的形式進(jìn)行，其中使用the69FLEXstationTMCa2+PlusAssayKit(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)根據(jù)制造商關(guān)于非貼壁細(xì)胞的規(guī)程和FLEXstationTM(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)。將RFU峰值輸入GmphpadPrism中用于分析。MCP-1誘導(dǎo)的CCR2受體內(nèi)在化FACS測定。最優(yōu)化配體濃度(合成MCP-1的EC50~100ng/ml)和溫育時間(1小時后大多數(shù)內(nèi)在化已發(fā)生)后，通過加入不同濃度的抗體測定IC50。培養(yǎng)的CCR2表達(dá)細(xì)胞用PBS洗滌，且于37。C用Versene(Invitrogen)分離約10分鐘。細(xì)胞的所有離心步驟為約200Xg。細(xì)胞用FACS緩沖液(PBS/3%FCS)洗滌2次，計數(shù)且檢測生存力(臺盼藍(lán))。96V底孔板(Greiner)每孔裝滿在lOOpl中的2.5xl()s細(xì)胞且置于冰上。在96U底孔板(Nunc)中，抗體在細(xì)胞培養(yǎng)基(MEME)中進(jìn)行稀釋以產(chǎn)生一式三份樣品中的約200^g/ml直到0,001pg/ml。不同濃度的抗體與終濃度為100ng/ml的合成MCP-l(Bachem)于RT預(yù)溫育10分鐘。細(xì)胞用預(yù)溫育的100piMCP-1/抗體混合物重懸浮且于37匸在培養(yǎng)箱中溫育1小時用于受體內(nèi)在化。內(nèi)在化后，細(xì)胞用180iliI冷FACS緩沖液洗滌1次，且對于所有后續(xù)步驟板必須維持在水上以阻止進(jìn)一步的內(nèi)在化。生物素化的小鼠抗hCCR2mAb(R&DSystems)在FACS緩沖液中1:10稀釋。作為對照，小鼠IgG2b同種型生物素(IsotypeBiotin)mAb(R&DSystems)同樣在FACS緩沖液中1:10稀釋。將終濃度為10pg/ml的人和小鼠y球蛋白(JacksonImmunoResearch)的1:1混合物加入抗hCCR2和對照mAb以封閉Fc受體。細(xì)胞在抗CCR2"球蛋白混合物(或?qū)φ誌gG2b"球蛋白混合物)中重懸浮，且在水上溫育1小時。細(xì)胞用180plFACS緩沖液洗滌2次，在50pi1:400稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-PE(BDPharmingen)中重懸浮，且在黑暗中在冰上于4。C溫育1小時。細(xì)胞用180piFACS緩沖液洗滌2次，在100^12%PFA/PBS中重懸浮，且于4。C貯存過夜用于固定(可替代地?zé)o需PFA固定的直接測定也是可能的)。對于FACS測量，細(xì)胞用200plFACS緩沖液重懸浮且各自計數(shù)至少5000個細(xì)胞。親和力測定關(guān)于Kd測定的溶液平^軒滴定(SET)法和使用BioVeds的交叉反應(yīng)性研究。溶液中的親和力測定基本上如文獻(xiàn)(Friguet等人，1985)中所述的進(jìn)行。為了改善SET法的靈敏性和精確性，它從經(jīng)典ELISA轉(zhuǎn)移到基于ECL的BioVeris技術(shù)(Haenel等人，2005,被接受用于在爿w".(y〃ca/j5z'oc/zem/^7>7中出版)。lmg/ml山羊抗人(Fab)2或山羊抗小鼠IgG,Fc片段特異性抗體(JacksonImmunoResearch)用BV-tagTMNHS-Ester(BioverisEurope,Witney，Oxfordshire,UK)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行標(biāo)記。實-瞼在聚丙烯農(nóng)t量滴定板中進(jìn)行，且含0.5。/。BSA和0.02%Tween20的PBSpH7.4作為測定緩沖液。未標(biāo)記的抗原以4n系列進(jìn)行稀釋對于人和短尾猴MCP-1,選擇10pM-40nM的濃度范圍，且對于交叉反應(yīng)性對照(嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子和MCP-2)選擇40pM-160nM的濃度范圍。不含抗原的孔用于測定Sma;c值。加入100pMFab或IgG(在75終體積中的終濃度)后，混合物于RT溫育2小時。隨后每孔加入用0.25|ng/ml生物素化的MCP-1(K69)包被的25piDynabeads(0.4mg/mlM-280鏈霉抗生物素蛋白，DYNAL,Hamburg)、和對于抗人Fab終稀度為1:4000或?qū)τ诳剐∈驣gG終稀度為1:2000的BV標(biāo)簽標(biāo)記的4企測抗體的混合物。于RT在Eppendorf搖動器(700rpm)上溫育30分鐘后，使用M-384SERIESWorkstation(BioverisEur叩e)檢測電化學(xué)發(fā)光信號。數(shù)據(jù)使用Origin5.0(Microcal)軟件應(yīng)用定制的擬合模型進(jìn)行評估(對于Fab:Haenel等人，2005，被接受用于在」冊(y〃ca/^oc/2e,'W/7中出版；對于IgG:根據(jù)Piehler等人，1997)。對直接包被的抗原的BiacoreK。測定。動力學(xué)常數(shù)k如和k。ff使用與共價固定化MCP-1結(jié)合的系列稀釋的各自Fab、使用BIAcore3000儀器(Biacore,Uppsala,瑞典)進(jìn)行測定。對于共價抗原固定化，使用標(biāo)準(zhǔn)EDC-NHS胺偶聯(lián)化學(xué)。動力學(xué)測量在PBS(136mMNaCl,2.7mMKC1,10mMNa2HP04,1,76mMKH2P04pH7.4)中以20pl/分鐘的流速使用1.5-500nM的Fab濃度范圍進(jìn)行。關(guān)于每種濃度的注射時間是1分鐘，隨后為3分鐘的解離相。對于再生使用5^10mMHC1。所有傳感圖(sensograms)都使用BIA評估軟件3.1(Biacore)進(jìn)行擬合。對生物素-K69人MCP-1和短尾猴MCP-1的BiacoreKd測定。生物素-K69人MCP-1和生物素化的短尾猴MCP-1包被至鏈霉抗生物素蛋白芯片表面，且短尾猴MCP-1直接包被至CM5芯片。Fabs的結(jié)合使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)^f亍測試。在抗體捕獲才莫式中的BiacoreKo測定。Fabs在CM5芯片(流速5^1/分鐘)上用抗hFab(s.3.15)以500nM進(jìn)行捕獲，注射每種類似物(MCPl、2、3、4以及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-2和-3)的溶液。所有細(xì)胞因子是無載體的且以15-500nM的濃度(對于親本Fabs在最優(yōu)化前)用作分析物用于親和力測定。傳感圖使用BIAevaluation軟件進(jìn)行分析。在抗體捕獲模式中對MCP-1的Biacore親和力測定對于最優(yōu)化的結(jié)合劑是不可能的，因為達(dá)到了Biacore的檢測極限。對于Fabs的特異性分析，使用表面等離子體共振(Biacore3000,Uppsala,瑞典)，其中使用捕獲測定。Fabs被捕獲且各種蛋白質(zhì)(MCP-2、-3、-4以及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-1、-2和-3)用作分析物。在所有4個流動室上，CM5芯片(Biacore,瑞典)用6500-8000RU抗-F(ab)2(Dianova,AffipureF(ab)2片段山羊抗人IgG,F(ab)2片段特異性；10mM乙酸鹽緩沖液，pH4.5)包被，其中使用標(biāo)準(zhǔn)EDC-NHS胺偶聯(lián)化學(xué)。流動室2-4用特異性抗MCP-1Fabs(流速為10pl/ml的20pl500nMFab,產(chǎn)生300-400RU的捕獲密度)進(jìn)行捕獲。Fabs捕獲后，注射濃度為100nM的趨化因子(20^1,流速20(il/分鐘，PBSpH7.4)。趨化因子以小等分試樣貯存，且對于測量只使用具有最多l(xiāng)個凍融循環(huán)的新解凍的材料。為了避免由MCP-1的解離率、Fab特異性相互作用和抗Fab/Fab相互作用引起的解離率組合，注射緩沖液以測定抗Fab/Fab相互作用的解離。達(dá)到的血清傳感圖從特異性1中減去。應(yīng)答單位對在表面上的捕獲抗體量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在抗體捕獲模式中與天然MCP-1的結(jié)合。方法如上所述使用。天然MCP-1從PANC1上清液中進(jìn)行純化且用于結(jié)合分析。在Fab捕獲模式中與天然MCP-1的結(jié)合良好地在檢測極限上，然而，由于提取物中的雜質(zhì)混淆了天然MCP-1的正確濃度，所以真正的親和力測量是不可能的。至IgG的轉(zhuǎn)化為了表達(dá)全長IgG,重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變結(jié)構(gòu)域片段從Fab表達(dá)載體中亞克隆到合適的pMorphJiIg載體中用于人IgGl、人IgG4、嵌合人/小鼠IgGl和IgG2a。限制酶EcoRI、A^d、祝pl用于將VH結(jié)構(gòu)域片段亞克隆到pMorph—WgGl.l、pMorph—WgG4.1、pMorph—mIgGl.l或pMorph—mlgG2a.1內(nèi)，且EcoRV、5wWI用于將VL結(jié)構(gòu)域片萃殳分別亞克隆到pMorph_hIgK_l、pMorph—hlg人J、72pMorph—mlgK—1或pMorph—mlg人—1內(nèi)。所得到的IgG構(gòu)建體在CNTO表達(dá)。結(jié)果固相淘選對直接包^皮至Maxisorp板的hMCP-1(411)和hMCP-1(43Y)進(jìn)行。應(yīng)用各包含3輪選擇的4種不同的淘選策略。亞克隆到表達(dá)載體pMORPHx9—Fab—FH內(nèi)后，對直接包^L的hMCP-1(411)和生物素化的hMCP-1進(jìn)行固相篩選。在初步篩選中總共分析了8832個克隆，且獲得了983個初步命中。最后鑒定了5個獨特的Fabs,但所有5個Fabs在細(xì)胞測定中都不中和MCP-1,從而表明直接包被至Maxisorp可能損害了中和表位的構(gòu)象或至少可接近性。如所述的進(jìn)行半溶液淘選，在溶液中溫育生物素化的人MCP-1類似物-1(V41I)和類似物-2(F43Y)與HuCALGOLD⑧噬菌體，隨后捕獲噬菌體抗原復(fù)合物。應(yīng)用2種不同的主要淘選策略，包括分別對生物素化的人MCP-1蛋白質(zhì)類似物-l(V41I)和類似物-2(F43Y)的3輪淘選(無交替淘選)。在初步篩選中總共分析了9024個克隆，且獲得了121個初步命中，最后揭示了18個獨特的結(jié)合劑?；贚uminex對來自對生物素化的人MCP-1蛋白質(zhì)類似物-1(V41I)淘選的192個克隆的再篩選導(dǎo)致產(chǎn)生9個另外的初步命中和3個另外的獨特結(jié)合劑，從而顯示Lummex篩選是捕獲篩選的合適的可替代篩選方法。從半溶液淘選中鑒定總共21個獨特的結(jié)合劑，且這些結(jié)合劑中的14個顯示中和活性。來自HuCALGOLD⑧的所有中和Fabs都來源于這次淘選。HuCALGOLDFabs的表征。獨特Fabs^皮表達(dá)且純化以用于進(jìn)一步表征。hMCP-l的結(jié)合親和力通過BIAcore測定且Fabs在下列測定中進(jìn)行表征1)125I-CCL-2與Thp-l細(xì)胞結(jié)合的抑制和2)在Thp-l細(xì)胞中hMCP-2誘導(dǎo)的Ca2+動員的抑制。在基于細(xì)胞的測定中顯示中和活性的Fabs進(jìn)一步測試1)與合成短尾猴hMCP-2的結(jié)合；2)與hMCP-2家族相關(guān)人趨化因子的結(jié)合用于結(jié)合特異性(即MCP-2、3、4以及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子1、2、3);和3)與天然人hMCP-2的結(jié)合，以確保使用合成hMCP-2肽選擇的Fabs識別天然hMCP-2。選擇具有最佳特性的7個Fabs用于另外的親和力成熟。選擇用于親和力成熟的Fabs的特性在表2中概括。選擇用于親和力成熟的這7個Fabs分配到3個組用于文庫克隆和選擇。L-CDR3和H-CDR2最優(yōu)化平行進(jìn)行。輕和重可變鏈的平行最優(yōu)化產(chǎn)生了經(jīng)由交叉克隆組合改善的重和輕鏈以產(chǎn)生再進(jìn)一步改善的抗體的可能性。表2.選擇用于親和力成熟的Fab候選物的概括。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>實施例2:來自Fabs的高親和力、MCP-1特異性抗體的評估如指出的，用于親和力成熟的候選物選擇對游離Fab形式的候選物進(jìn)行。選擇標(biāo)準(zhǔn)是在放射性配體結(jié)合測定中的活性，在Ca2+動員測定中的活性，通過Biacore測量的對人MCP-1的親和力，對人MCP-1的特異性，對短尾猴MCP-1的親和力以及在Biacore中檢測的與天然MCP-1的結(jié)合。關(guān)于親本Fabs分組的另外標(biāo)準(zhǔn)是在ELISA中的C775竟?fàn)?，且基于可變重和輕鏈的構(gòu)架家族。成熟候選物作為IgG的表征，特別是在趨化性測定中，與成熟選擇過程平行進(jìn)行。選擇用于成熟的7個Fabs分成3個不同的序列種類。在1類(組1,表2)中，F(xiàn)abs03336、03464、03468和03470具有V入3輕鏈構(gòu)架與2個不同重鏈構(gòu)架中的1個。Fabs03336和03464具有VH3重鏈構(gòu)架，且Fabs03468和03470具有VH1B重鏈構(gòu)架。第2類Fabs(組2,表2),03471和03473具有VH1A重鏈構(gòu)架和Vk3輕鏈構(gòu)架。Fab03548具有與第1類中的2個Fabs相同的重和輕鏈構(gòu)架(VH3,VX3)但單獨維持(組3,表2),因為它具有特別有效的生物活性和與嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的結(jié)合交叉反應(yīng)性。關(guān)于本文使用的可變區(qū)序列分類的完整描述，參見整體引入作為參考的美國專利號6828422。后來成熟的目標(biāo)是在增加特異性的同時改善03548對CCL-2的親和力。成熟前，在BiacoreFab捕獲才莫式中只測定與短尾猴和天然人MCP-1的結(jié)合而不是親和力。所有7個親本Fabs都顯示與短尾猴和天然MCP-1結(jié)合，這是用于成熟的先決條件。親本IgGs的結(jié)合特異性。所有7個親本Fabs轉(zhuǎn)化成IgGl后，對IgG形式重復(fù)交叉反應(yīng)性研究。嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子3與傳感器芯片上的葡聚糖表面非特異性結(jié)合，且這種非特異性結(jié)合可以通過添加羧曱基葡聚糖竟?fàn)幨?。因為與其他趨化因子的葡聚糖表面的非特異性結(jié)合也是可能的，所以在所有Biacore特異性測定中添加羧曱基葡聚糖。與Fabs相反，2個IgGs沒有顯示與人MCP-1的顯著結(jié)合，有趣的是滿足所有成功標(biāo)準(zhǔn)的所有4個最后結(jié)合劑都來自l個親本Fab。MCP-1(應(yīng)答單位)的結(jié)合信號通過表面上的捕獲抗體的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化摩爾結(jié)合比率=(結(jié)合抗原的RU/抗原的MW)X(mAb的MW/表面上捕獲的mAb的RU),且小于0.5的摩爾結(jié)合比率預(yù)期是不顯著的。4個IgGs顯示與MCP-1的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)合比率>0.5且與所有同源趨化因子的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)合比率<0.5,且因此在IgG水平上稱為特異性的。l個IgG也顯示與MCP-2和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的某些結(jié)合，這在Fab水平上已得到4企測，但這種交叉反應(yīng)性在IgG水平上減少。MOR03468IgG的數(shù)據(jù)未顯示。I125MCP-1與THP-1細(xì)胞結(jié)合的抑制(CNTO)。IgGl形式的親本結(jié)合劑的中和活性首先在放射性配體結(jié)合測定中進(jìn)行測試。通過添加無關(guān)人IgGl封閉THP-1細(xì)胞上的Fc受體后，MCP-1結(jié)合的抑制對于所有親本IgGs都是可檢測的。4個IgGs顯示抑制放射性標(biāo)記的人MCP-1與THP-1細(xì)胞的抑制，其IC5o值在參考IgGC775的范圍內(nèi)。鈣動員的抑制(CNTO)。所有親本IgGs都抑制THP-1細(xì)胞中MCP-1誘導(dǎo)的鈣動員。4個IgGs顯示與參考IgGC775比較在較高的抗體濃度上抑制MCP-1誘導(dǎo)的鈣動員。MCP-1誘導(dǎo)的趨化性的抑制(CNTO)。因為親本Fabs在趨化性測定中無法測試，所以MCP-1誘導(dǎo)的趨化性的抑制以IgG形式測試。測試的所有親本IgGs在趨化性測定中都是有活性的，且4個IgGs顯示與參考IgGC775比較在較高的抗體濃度上抑制MCP-1誘導(dǎo)的趨化性。實施例3:所選Fab通過L=CDR3/H=CDR2盒平行交換的親和力成熟親和力成熟過程的扭無括在第1輪成熟中，L-CDR3最優(yōu)化和H-CDR2最優(yōu)化平行進(jìn)行。來自每類Fabs的DNA匯集用于成熟文庫構(gòu)建。來源重鏈CDR2和輕鏈CDR3序列對于每個DNA庫由隨機化序列置換，從而產(chǎn)生6個新文庫3個隨機化的H-CDR2和3個隨機化的L-CDR3文庫。6個文庫各自的多樣性超過108個獨特的Fabs。合成CCL-241I-生物素-K69肽用于溶液淘選或neutravidin包纟皮的塑料孔上捕獲的生物素-肽淘選。6個文庫各自在各種條件下淘選以富集具有緩慢解離率的Fabs(即延長的洗滌、減少的抗原濃度)。進(jìn)行36次平4亍淘選，包括溶液和半溶液淘選。減少抗原濃度、選擇解離率以及延長的洗滌導(dǎo)致產(chǎn)生嚴(yán)格淘選條件。親和力篩選借助于基于BioVeris(以前的IGEN)電化學(xué)發(fā)光(ELC)的平臺進(jìn)行，從而允許高通量的親和力分等和鑒定具有改善親和力的Fab分子。用于親和力成熟的文庫。因為H1A和H1B的重鏈H-CDR2文庫分別進(jìn)行克隆，所以克隆了7個不同的可變區(qū)文庫。2個H1A和H1B文庫隨后在選擇之前匯集，從而產(chǎn)生6個選擇文庫。文庫大小為108-8xl09。除了MOR03548X3L-CDR3文庫外，對于所有文庫覆蓋了所有理論多樣性，在所述MOR03548L-CDR3文庫中只覆蓋了0.625x的理論多樣性。文庫的質(zhì)量控制通過隨機挑選的克隆的測序來進(jìn)行。75個序列中的71個(95%)是正確和多樣的，而對于75個序列中的4個檢測出移碼。所有親本Fabs的衍生物都在其各自的文庫中找到。為了增加所選抗體片,殳的親和力和生物學(xué)活性，L-CDR3和H-CDR2區(qū)域通過盒誘變使用三核苷酸指導(dǎo)的誘變進(jìn)行平行最優(yōu)化(VirneMs等人，1994),而構(gòu)架區(qū)保持恒定?？寺∮糜谟H和力成熟之前，所有親本Fab片段都經(jīng)由ZMI/五coRI從相應(yīng)的表達(dá)載體(pMORPH⑤X9—FH)轉(zhuǎn)移到CysDisplay載體MORPH25—LHC內(nèi)。pMORPH25—LHC由HuCALGOLD⑧展示載體pMORPH23—LHC通過去除干擾文庫克隆進(jìn)行H-CDR2最優(yōu)化的1個AwHII位點來制備。對于親本Fab片l殳庫的L-CDR3最優(yōu)化，結(jié)合劑庫的輕鏈的L-CDR3、構(gòu)架4和恒定區(qū)(405bp)通過Sp/I/Sp/zI去除，且用多樣化的L-CDR3s譜連同構(gòu)架4和恒定結(jié)構(gòu)域置換。這種L-CDR3盒的設(shè)計、合成和克隆將在其他地方描述(準(zhǔn)備中的原稿)。5ng結(jié)合劑庫載體與3倍摩爾過量、攜帶多樣化的L-CDR3s的插入片段連接。在第2個文庫組中，H-CDR2(Z/7oI/^^//II)是多樣化的，而連接構(gòu)架區(qū)保持恒定。為了監(jiān)控克隆效率，在多樣化的H-CDR2盒克隆進(jìn)去之前，親本H-CDR2用虛設(shè)物置換。7個不同文庫的連接混合物在4ml大腸桿菌TOP10F細(xì)胞(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)中進(jìn)行電穿孔，從而產(chǎn)生1x108-8x109個獨立克隆。這個文庫大小確保了理論多樣性的覆蓋度。文庫擴增如先前所述(Rauchenberger等人，2003)進(jìn)行。對于質(zhì)量控制，隨機挑選單個克隆并進(jìn)行測序(SequiServe,Vaterstetten，德國)。針對人生物素-K69MCP-l(V41I)的半溶液淘選用于親和力成熟。從最優(yōu)化文庫中杏S救出的1x1013個噬菌體在Reacti-BindNeutravidinCoatedPolystyrene微量滴定板條上預(yù)先吸附2次，且隨后用ChemiBLOCKER(Chemicon,Temecula,CA,USA)去t閉。預(yù)先吸附的噬菌體和不同濃度的生物素-K69MCP-l(0.02-50nM)在溶液中于22。C溫育1.5小時，隨后使噬菌體-抗原復(fù)合物捕獲至Reacti-BindNeutravidinCoatedPolystyrene微量滴定板條(PERBIO)。于22。C的洗滌步驟延伸至最多12小時。通過溶于10mMTris/HCl，pH8.0的20mMDTT的洗脫、以及每輪淘選之間的噬菌粒擴增如上所述進(jìn)行。針對人生物素-K69MCP-l(V41I)的溶液淘選用于親和力成熟。如上所述從親和力成熟文庫中拯救出的1x1013個噬菌體用ChemiBLOCKER(Chemicon,Temecula,CA,USA)，0.05%Tween20(Sigma,St.Louis,MO,USA)封閉，且在通過不含Tween20的ChemiBLOCKER封閉的DynabeadsM-280Streptavidin(DynalBiotech,Oslo,挪威)上預(yù)先吸附2次。在3輪淘選期間應(yīng)用抗原減少，且生物素-K69MCP-1的濃度為0.01至最高5nM。封閉的Dynabeads和磁性顆粒分離器MPC-E(DynalBiotech,Oslo,挪威)用于捕獲與生物素化抗原結(jié)合的噬菌體。洗滌步驟(Rauchenberger等人，2003)、通過溶于10mMTris/HCl,pH8.0的20mMDTT的洗脫、以及每4侖淘選之間的噬菌粒擴增如上所述進(jìn)行。此外淘選嚴(yán)格性通過選擇解離率(Hawkins等人，1992)和通過延長的洗滌步驟(最高達(dá)6小時)進(jìn)一步增加。篩選了3312個克隆，且鑒定了來自7個親本Fabs中的4個的85個最優(yōu)化Fabs。鑒定在L-CDR3和H-CDR2中最優(yōu)化的Fabs,且對于2個不同親本克隆的衍生物進(jìn)行改良輕和重鏈的交叉克隆，從而導(dǎo)致產(chǎn)生親和力(Kd)最高達(dá)100倍的進(jìn)一步改善。Kd估計為~l-10nM的最高級別的結(jié)合劑(約100)進(jìn)行測序，從而導(dǎo)致鑒定了41個獨特的改善Fabs。大多數(shù)改善的結(jié)合劑來源于組III(03548)。在組I和II中進(jìn)行的I和II類結(jié)合劑。總之，在成熟過程中鑒定了來源于7個親本Fabs中的5個的87個獨特Fabs。表3概括了成熟淘選結(jié)果。表3.選擇具有與MCP-1的改善結(jié)合的Fab的概括。<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>成熟Fabs中的氨基酸變化位于親本克隆03741和03548的H-CDR2或L-CDR3中。隨后進(jìn)行Fabs最佳改善的重鏈CDR2與最佳輕鏈CDR3的交叉克隆，以設(shè)法產(chǎn)生具有甚至更高的親和力的Fabs。產(chǎn)生了大約36個交叉克隆。同樣篩選所有獨特Fab序列的預(yù)測N連接的糖基化位點。鑒定了對于重鏈CDR2中的糖基化具有NIS共有序列的少數(shù)Fabs。這些Fabs一皮從進(jìn)一步表征排除?？偣?4個Fabs在Morphosys^皮表達(dá)和純化，且轉(zhuǎn)移至Centocor用于生物學(xué)表征。利用最優(yōu)化Fabs達(dá)到了關(guān)于使用Biacore的親和力測量的靈敏性極限。因此親和力值通過基于ECL的溶液平衡滴定(SET)(Haenel等人，2004,被提交用于在J""(y"^/S,oc/^鹿:份少中出版)進(jìn)行測定。親和力成熟后，達(dá)到約10pM的Ko且使用KinexA證實所述值。在放射性配體測定中的Fab結(jié)合達(dá)到110pM的IC50。因此，與親本Fabs比較MCP-1親和力和結(jié)合動力學(xué)改善最高達(dá)1000倍。4個最優(yōu)化Fabs滿足所有9個成功標(biāo)準(zhǔn)。2個是L-CDR3最優(yōu)化的Fabs,且2個是由L-CDR3和H-CDR2最優(yōu)化鏈組成的交叉克隆。所有4個都被轉(zhuǎn)化成IgGl,且在所有測試測定中保留活性，其在放射性配體結(jié)合測定中最佳KD為10pM和最佳IC5Q為20pM。1個另外的交叉克隆MOR03899作為IgGl滿足所有成功標(biāo)準(zhǔn)，但作為Fab則不是。滿足成功標(biāo)準(zhǔn)的所有結(jié)合劑都來源于MOR03471親本Fab(SEQIDNos.2,4)。獨特的Fab-MOR03790選才奪用于IgG生產(chǎn)，按比例擴大的制備開發(fā)，和基于MOR03471在動物^t型中的體內(nèi)評估，且包含表4D中給出的重和輕鏈可變區(qū)序列以及SEQIDNos.6、7、9、13、14和16。在親和力成熟期間的BioVeris篩選。親和力改善的Fab克隆通過基于ECL的高通量親和力篩選BioVeris測定進(jìn)行鑒定。命中后，選擇4個亞克隆通過相同方法進(jìn)行鞏固。關(guān)于親和力成熟的淘選策略?？偣策M(jìn)行了36次不同的淘選。18次溶液淘選針對具有噬菌體-抗原復(fù)合物捕獲至鏈霉抗生物素蛋白珠的生物素-K69MCP-l(V41I)。選擇過程中的嚴(yán)格性通過減少抗原濃度、選一奪解離率和延長的洗滌來增加。此外，進(jìn)行針對生物素-K69MCP-1的18次半溶液淘選，使噬菌體-抗原復(fù)合物捕獲至Neutravidin板。在這些淘選中，嚴(yán)格性通過減少抗原和延長洗滌來增加。關(guān)于親和力成熟的BioVeris篩選。抗原生物素-K69MCP-1411在成熟淘選中且同樣對于基于BioVeris的篩選使用。篩選對鑒定改善的結(jié)合劑非常有效地發(fā)揮作用。對于36種淘選條件中的每一種，篩選92個克隆，從而導(dǎo)致產(chǎn)生3312個篩選的克隆?？偣茶b定了85個不同的獨特最優(yōu)化結(jié)合劑。發(fā)現(xiàn)了來自3個組的最優(yōu)化Fabs。此外，可以鑒定在L-CDR3和H-CDR2中最優(yōu)化的Fabs,從而使得命名為MOR03471和MOR03548的Fabs衍生物能夠交叉克隆。46個最優(yōu)化的Fabs來源于MOR03548,與11個L-CDR3最優(yōu)化的Fabs比較，來自H-CRD2最優(yōu)化的35個Fabs顯示了較高的親和力和活性。而且親本MOR03471在這種成熟中非常成功地最優(yōu)化，具有在L-CDR3中最優(yōu)化的23個Fabs和在H-CDR2中最優(yōu)化的l個Fabs。改善的Fabs來源于7個親本Fabs中的4個，/人而表明每個親本結(jié)合劑都具有被最優(yōu)化的不同潛力。滿足所有成功標(biāo)準(zhǔn)的最后4個Fabs來源于MOR03471,2個只在L-CDR3中最優(yōu)化且來自交叉克隆的2個在L-CDR3和H-CDR2中最優(yōu)化。最優(yōu)化Fab分子的交叉克隆。HuCAI^技術(shù)的模塊結(jié)構(gòu)允許簡單地通過在克隆步驟中組合2條最優(yōu)化鏈快速交叉克隆來源于相同親本克隆的最優(yōu)化Fabs的最優(yōu)化輕和重鏈。交叉克隆是可能獲得進(jìn)一步改善的抗體的快速方法，無需另外的成熟循環(huán)。一方面2個L-CDR3最優(yōu)化的MOR03548衍生物與6個H-CDR2最優(yōu)化的MOR03548進(jìn)行交叉克隆，從而導(dǎo)致產(chǎn)生12個交叉克隆。另一方面22個L-CDR3最優(yōu)化的MOR03471與1個可用的H-CDR2最優(yōu)化的MOR03471克隆進(jìn)行交叉克隆。在這個計劃中，交叉克隆是成功的，從而導(dǎo)致產(chǎn)生2個不同的MOR03471衍生的交叉克隆-MOR03850和MOR03878，它們最終符合所有成功標(biāo)準(zhǔn)。16個預(yù)先選4奪的抗體的詳細(xì)表征從親和力篩選中鑒定的85個最優(yōu)化Fabs和另外34個交叉克隆(參見上文)產(chǎn)生總共119個不同的獨特最優(yōu)化Fabs,所述獨特最優(yōu)化Fabs沒有全部通過所有可用測定進(jìn)行表征。因此，16個最優(yōu)化Fabs根據(jù)其在放射性配體結(jié)合抑制中的IC50、在《丐釋放測定中的活性、在CDRs中缺乏N糖基化位點(表4A和B)和親和力進(jìn)行預(yù)先選擇。進(jìn)一步的詳細(xì)表征包括特異性測試、與天然MCP-1的結(jié)合和中和、對人和短尾猴MCP-1的親和力、在趨化性測定中的活性以及所有轉(zhuǎn)化的IgGl的表征。代表最優(yōu)化Fabs的克隆由表4A-C中給出的序列表示，其中克隆MOR03471親本Fab具有VH3xk3構(gòu)架且MOR03548具有VH1Ax人3構(gòu)架。具有所需物理化學(xué)屬性(在CDRs中沒有N糖基化位點)以及親和力和生物活性的最優(yōu)化特性的17個所選Fabs,顯示在使用的構(gòu)架(VH3和VH1A)內(nèi)在HC-CDR2和LCCDR3序列中的某些交替的獨特CDR序列和代表性共有序列，以及更一般地在所有HC-CDR1中的共有序列。這些共有序列顯示于表4C-4E以及SEQINNos:2-26中。表4A:17個所選結(jié)合劑的重鏈CDR序列<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>4C.關(guān)于抗MCP-1V區(qū)的共有序列sEqia臉且CPR1EE2CDR^膽CDR3￡&42VH1ASGAEVKKP。SSVKVSCKASGISQGX)BWMGXIXPXXGRVTITADESTRSEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS3W3CVQLVELVQPGGSLRLSCAASGFTFRSY鵬WVRQAPQWVSNIRSD3SRFTIS咖SKNTIiYLOMWSLRAEDTJWTYCAR4K3DIVLTGSPATliSCRASQSVSWYQQKPGlitilYDASSRAGVPARFS(沾GSGTDFTIOTSYCFTFGOGTKVEIK工5入3DIELTQPPSVSVAPGQT磁SCWYQQKPG0APVSGNTATIiTISYCFGGGTKI/TVL82<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>通過Biacore測量的與天然MCP-1的結(jié)合。與天然MCP-1的結(jié)合在BmcoreFab捕獲模式中進(jìn)行測試，且所有選擇的Fabs都顯示與天然MCP-1結(jié)合。尤其是因為對于最優(yōu)化Fabs達(dá)到了在Biacore中關(guān)于KD測定的檢測極限，所以必須使用用于親和力測定和特異性證實的可替代方法。IgG轉(zhuǎn)化。選擇用于詳細(xì)表征的所有最優(yōu)化Fabs都^C轉(zhuǎn)化成IgGl形式，另外將4個Fabs亞克隆成IgG4形式。測試的人IgG4的表達(dá)數(shù)據(jù)和在不同測定中的活性與各自的IgGl—樣良好。使用BioVeris的溶液平衡滴定。作為用于靈敏KD測定的可替代方法，進(jìn)行使用BioVeris技術(shù)的溶液平衡滴定(SET)。單價解離常數(shù)通過關(guān)于Fab和IgG的合適擬合模型進(jìn)行計算。這種方法適合于親和力測量和交叉反應(yīng)性研究。所有選擇的16個結(jié)合劑都通過使用BioVeris的溶液平tf滴定(SET)進(jìn)行分析(表5和表6),且這些親和力值被視為最終親和力值。幾個結(jié)合劑包括作為Fab和IgG的MOR03757、MOR03781、MOR03790、MOR03850、MOR03878以及作為IgG的MOR03899，滿足4十對人MCP-1<0.5nM和4十對短尾猴MCP-1<20nM的親和力成功標(biāo)準(zhǔn)。對人MCP-1的最佳親和力是在Fab水平上20-40pM，和在IgG水平上10-20pM(表5)。對短尾猴MCP-1的最佳親和力是在Fab水平上10-40pM,和在IgG水平上20pM(表6)。使用BioVeris的特異性測試。除親和力之外，還在使用BioVeris的溶液平衡滴定(SET)中分析特異性，尤其是與嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子和MCP-2的交叉反應(yīng)性。對于所選的16個Fabs和15個測試的IgGs(16個所選IgGs中有1個是不可用的)中的任何一個沒有檢測到與人MCP-2的交叉反應(yīng)性。因為人MCP-1、人MCP-2主要與CCR2受體結(jié)合，而人嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子占優(yōu)勢地與CCR3受體結(jié)合。對于MOR03744,MOR03747、MOR03790和MOR03781Fab和IgG在BioVeris中沒有檢測到與人嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的交叉反應(yīng)性，而12個所選結(jié)合劑包括MOR03850以Fab或IgG形式顯示與嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的某些交叉反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未顯示)。最優(yōu)化抗體在Biacore抗體結(jié)合模式(CNTO)中的特異性。對于所選IgGs進(jìn)行特異性評估。在Biacore中，向捕獲的最優(yōu)化抗體中加入100nM人MCP-l、人MCP-2、3、4以及人嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子1、2和3。MOR03790、MOR03791、MOR03747、MOR03850、MOR03744、MOR03849、MOR03878、MOR03885、MOR3899和MOR03781IgG沒有顯示與同源物趨化因子的明顯結(jié)合信號，且滿足特異性成功標(biāo)準(zhǔn)(表6)。Fabs與MCP-2的結(jié)合不抑制125iMCP-2與Thp-l細(xì)胞的結(jié)合(CNTO)。為了分析在Biacore中檢測到的Fab與MCP-2和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的結(jié)合活性是否轉(zhuǎn)變成中和活性，在Centocor開發(fā)了放射性配體全細(xì)胞結(jié)合測定。I125MCP-2顯示與Thp-l細(xì)胞的良好結(jié)合，且結(jié)合被未標(biāo)記的MCP-2的添加抑制，而不被MCP-1特異性的參考抗體C775的添加抑制。結(jié)果提供了用于測試結(jié)合/中和特異性的重要功能測定。在受體結(jié)合測定中使用1ng/mlMCP-l,而在這種測定法中需要約100ng/mlMCP-2，因為MCP-2的標(biāo)記可能已引起活性的喪失。MOR03754顯示沒有顯著抑制1251標(biāo)記的MCP-2與Thp-l細(xì)胞上的CCR2受體的結(jié)合(IC5o^2^iM)。成熟的Fabs有效抑制I125MCP-1與Thp-l細(xì)胞的結(jié)合(CNTO)。由于需要低量的1ng/mlMCP-1，所以這種測定是這個計劃中最靈敏的測定，測定的IC5Q極限對于Fab為約100pM,且對于IgG甚至為20pM(表5)。最優(yōu)化后，F(xiàn)abs必須以低于參考FabC775的IC5。抑制人MCP-1與其在Thp-l細(xì)胞上的人受體CCR2的結(jié)合。親本MOR03471Fab顯示180nM的IC5o,且最優(yōu)化的MOR03471Fab衍生物(MOR03781為180pM、MOR03790為260pM、MOR03850為160pM、MOR03878為110pM和MOR03899為130pM)顯示在最優(yōu)化期間最高達(dá)1000倍的活性總體改善。盡管這種測定是這個計劃中可用的最靈敏的測定，但即使在這種測定中最優(yōu)化的結(jié)合劑似乎也已達(dá)到測定的極限。成熟的IgGs有效抑制I125MCP-1與Thp-l細(xì)胞的結(jié)合(CNTO)。通過添加無關(guān)的人IgGl封閉Fc受體結(jié)合位點對于放射性配體結(jié)合和鉤動員測定是重要的。所有測試的IgGl在放射性配體結(jié)合測定中保留活性。最優(yōu)化MOR03781的ICso值是20pM,對于MOR03790是30pM，對于MOR03850是50pM,對于MOR03878是30pM,且對于MOR03899是50pM。MCP-1誘導(dǎo)的CCR2受體內(nèi)在化的抑制FACS測定開發(fā)。受體內(nèi)在化測定使用表達(dá)CCR-2的細(xì)胞進(jìn)行，所述表達(dá)CCR-2的細(xì)胞顯示比THP-1細(xì)胞更高的CCR2的表達(dá)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生更佳的信噪比。首86先，合成的人MCP-1在該測定中進(jìn)行滴定以確定EC5o值。發(fā)現(xiàn)對于MCP-1的EC5。值是116ng/ml。因此，對于進(jìn)一步的FACS測定，選擇100ng/ml(~11nM)MCP-1。此外，獲得完全內(nèi)在化的最佳溫育時間于37。C進(jìn)行評估。大多數(shù)內(nèi)在化在最初30分鐘內(nèi)發(fā)生。因此在所有后續(xù)測定中使用l小時的溫育時間。該測定被成功開發(fā)以允許測定IC50。測量用于抑制MCP-1誘導(dǎo)的受體內(nèi)在化的0.001-200pg/ml的Fab或IgG的活性和分等。所選的最優(yōu)化結(jié)合劑顯示良好抑制MCP-1誘導(dǎo)的受體內(nèi)在化(數(shù)據(jù)未顯示)。2批不同的Fabs進(jìn)行平行測試，顯示了可再現(xiàn)性。對于使用Fabs的內(nèi)在化測定，對于MOR03790檢測到5nM的IC50,對于MOR03850是4nM,對于MOR03781是7nM,對于MOR03878是5.3nM，且對于MOR03899是3.3nM(表6)。MOR03781IgGl也顯示7nM,從而表明活性在IgG轉(zhuǎn)化后^皮保留。鈣動員的抑制(CNTO)。MCP-1在THP-1細(xì)胞中誘導(dǎo)鈣動員，這可以借助于熒光團(flur叩hore)進(jìn)行檢測。最優(yōu)化的抗體顯示有效抑制鈣動員，4個最終候選物MOR03781、MOR03790、MOR03850和MOR03878Fab顯示18-28nM的1。5()值。各自的IgGs再次保留活性，且由于每個IgG中和2個MCP-1分子的能力，顯示甚至略微更佳的約6-10nM的IC5o值。再次在約10nM時似乎達(dá)到測定的極限。天然MCP-1誘導(dǎo)的鈣動員的抑制。天然MCP-1從PANC1上清液中進(jìn)行純化且用于誘導(dǎo)釣釋放。與參考抗體C775比較，最優(yōu)化Fabs顯示以更高的活性抑制天然MCP-1-秀導(dǎo)的鈣動員。再次在約10-20nM天然MCP-1時似乎達(dá)到測定的極限。趨化性的抑制。由于潛在的非特異性作用，親本Fabs無法在趨化性測定中進(jìn)行測試，但成熟后所有測試的最優(yōu)化Fabs都特異性抑制趨化性，這可能是由于活性增加。測試的所有最優(yōu)化IgGs在趨化性測定中都是有活性的。因為測定是半定量的，所以無法測定正確的IC5。值。與參考抗體C775的結(jié)合竟?fàn)?。所有MOR03548衍生的預(yù)先選擇的Fabs在竟?fàn)幑滔嘈问街型耆种艭775與MCP1的結(jié)合。所有7個MOR03471衍生的預(yù)先選擇的Fabs在這個測定中顯示部分(~60%)竟?fàn)帯？偨Y(jié)數(shù)據(jù)表6:滿足成功標(biāo)準(zhǔn)的Abs的概況MOR37卯kMOR3850kMOR3781kMOR3878kMOR3899k成功標(biāo)準(zhǔn)FabIgGFabIgGFabIgGFabIgGFabIgGFabIgG#1,6MCP-lKd<0.5nMIGEN65,-0.12,0.070.04,0.010.03，0.020.320.27(0.81)0.34#2MCP-l特異性BIAcore(IgG)無，無(MCP-2/Eo),無(MCP-2/Eo),無(MCP-2/Eo)，無(MCP-2/Eo),無(MCP-2/Eo),無#3125IMCP-l抑制IC50<C77535.6，25.60.26,0.030.16,0.050.18,0.020.11,0.030.13,0.05#4趨化性的抑制是，是是，ND是，ND是，ND是，ND是，ND#5Ca2+動員的抑制IC50<C77571.5,62.325.02,4.2628.42,9.4721.8'10.920.24,6.717.54，5.85#7短尾猴MCP-lKd<10nMND，ND0.06,0.060.04,0.010.01，0.020.32,0.230.49,0.36#8天然MCP-l誘導(dǎo)的Ca2+的抑制是，ND是，ND是，ND是，ND是，ND是，ND延伸的測量-lC775竟?fàn)幨牵遣糠?，ND部分，ND部分，ND部分，ND部分，ND延伸的測量-2CCR2內(nèi)在化的抑制65，ND5,ND4,ND7,75.3，ND3.3，ND88實施例4:治療候選物的選擇最終治療候選物CNTQ888的選擇和產(chǎn)生。僅在其輕鏈CDR3序列方面不同的2個mAbs-3781和3790(表4B和D,SEQIDNos:15和16)在測定中顯示出幾乎等同的生物學(xué)活性。進(jìn)行計算機(/"w7/co)免疫原性分析。以鑒定潛在的HLAII類結(jié)合肽且確定候選物在HLA結(jié)合表位方面是否顯著不同。分析預(yù)測mAb3790呈現(xiàn)比mAb3781更低的免疫原性可能性。基于這點以及表6中顯示的其他生物化學(xué)和生物學(xué)分析，包含重鏈VH1A構(gòu)架區(qū)(SEQIDNO.2)和重鏈CDR區(qū)SEQIDNO.6、7和9;以及輕鏈k3構(gòu)架(SEQIDNO:4)和CDR區(qū)SEQIDNO:13、14和16的3790被選擇作為最終的治療mAb。由于在克隆過程中引入的氨基酸變化，mAb3790的N末端序列包含來自人種系序列的變異。此外，氨基酸密碼子(即DNA序列)偏向在原核細(xì)菌細(xì)胞中的最大表達(dá)。重新合成MAbDNA以校正與種系序列的有缺點的N末端比對，且使密碼子偏倚改變成在高度表達(dá)的人蛋白質(zhì)中有利的那些。序列修飾的3790mAb命名為CNTO888,其分別包含SEQIDNO:27和28以及下文(有下劃線的是CDRs)的重和輕鏈可變區(qū)序列，其中重鏈的N末端殘基是QVQ(Gln-Val-Gln)和或輕鏈的是EIV(Glu-Ile-Val)。CNT0888重鏈可變序列(SEQIDNO:27)ANYAOKFOGRVnTADBSTSTAYMBLSSLRSEDTAVYYCARYDGIYGBLDFWGOGTLVTVSSCNT0888輕鏈可變(SEQIDNO:28)P皿TfjSPATLSLSPGERATLSCRASOSVSDAYlAWYOOKPGOAPRLLIYDASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQXIQUiSFTFGQGTKVEIKCNT0888的生物化學(xué)和生物物理學(xué)表征。CNTO888是全長人IgGlk抗體。在該序列中沒有預(yù)測的N連接的糖基化位點。CNTO888(在HEK293細(xì)胞中瞬時表達(dá)且通過A蛋白親和層析進(jìn)行純化)的生物化學(xué)和生物物理學(xué)特性在SDS-PAGE、大小排阻層析(SEC)、質(zhì)譜(MS)和BIAcore中對于結(jié)合親和力(Kd)和特異性進(jìn)行表征。在SDS-PAGE中，天然CNTO888作為大約150kDa處的單一條帶遷移。還原的/alkalyatedIgG作為大約60kDa和33kDa處的2個條帶遷移。CNTO888的大小排阻層析證明IgG以與對于RemicadeIgG對照測量的那種相同的洗脫體積(數(shù)據(jù)未顯示)作為單個峰洗脫。最后，MS分析證明CNT0888具有147,000Da的質(zhì)量(數(shù)據(jù)未顯示)。BIAcore分析證明CNTO888與人和短尾猴CCL-2的結(jié)合親和力(Kd)分別是30和0pM。CNT0888在BIAcore中沒有顯示與CCL-2相關(guān)趨化因子，即MCP-2、3、4以及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子1、2和3的可才t測結(jié)合。CNTO888的體外表征。CNTO888的生物學(xué)活性在多種基于細(xì)胞的測定中進(jìn)行評估。在所有成功標(biāo)準(zhǔn)測定中評估的瞬時表達(dá)的CNTO888具有與親本mAb3790不能區(qū)別的活性(表5)。實施例5:抗MCP-1抗體的克隆和表達(dá)具有CNTO888質(zhì)粒p2844和p2882的等分試樣的大腸桿菌分別包含抗體的重和輕4連。質(zhì)粒p2844包含在抗CD4重鏈啟動子下的CNT0888編碼區(qū)的最優(yōu)化重鏈編碼序列，且質(zhì)粒p2882包含在抗CD4輕鏈啟動子下的CNTO888編碼區(qū)的最優(yōu)化輕鏈。2個構(gòu)建體都包括gpt選擇基因以給予針對MHX(霉酚酸、次黃。票呤和黃噪呤)的化學(xué)抗性。對每個質(zhì)粒進(jìn)行純化、表征、定量和測序。來自C463A宿主細(xì)胞系的指數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞與線性化的p2844和p2882共電穿孔，所述C463A宿主細(xì)胞系是適合在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中生長的Sp2/0衍生物(CD-雜交瘤)。48小時后，將細(xì)胞暴露于1xMHX(0.5mg/L霉酚酸、2.5mg/L次黃嘌呤和50mg/L黃噤呤)。選擇后3天，細(xì)胞生存力已減少到小于13%，在這時將-90,000個有生活力的細(xì)胞在曱基纖維素中進(jìn)行鋪平板。細(xì)胞不受千擾地培養(yǎng)8到13天，隨后使用Halo操作進(jìn)行篩選且挑取到24孔板內(nèi)。擴大培養(yǎng)且獲得24孔過度生長滴度。最高的親本細(xì)胞系(1C4)具有70mg/L的24孔過度生長滴度，和在搖瓶中108.5mg/L的滴度(在CD-雜交瘤培養(yǎng)基中)。選擇這個親本細(xì)胞系C1262A用于在搖瓶中的進(jìn)一步評估。將C1262A提交給細(xì)胞庫組(CellBankingGroup)用于產(chǎn)生開發(fā)細(xì)胞庫(DevelopmentCellBank)(DCB)。來自DCB、命名為C1262A:DCB;02SEP04的細(xì)胞對于支原體和無菌性測試陰性。為了支持進(jìn)一步的調(diào)查研究，從搖瓶(添加大豆蛋白胨)中的C1262A細(xì)胞生產(chǎn)CNTO888達(dá)到230mg/L的滴度且由2L培養(yǎng)物產(chǎn)生366mg純化CNTO888。平行地，C1262A細(xì)胞的另外9L培養(yǎng)物產(chǎn)生~2g粗CNTO888材料用于早期純化和制劑開發(fā)。親本細(xì)胞系C1262A使用Halo操作進(jìn)行亞克隆且產(chǎn)生5個高生產(chǎn)的亞克隆細(xì)胞系。最佳亞克隆細(xì)胞系(4D5)具有150.5mg/L的24孔過度生長滴度，和在搖瓶中167mg/L的滴度(在CD-雜交瘤中)。這個亞克隆細(xì)胞系編碼為C1262B。實施例6:用CNT0888治療人胰肝瘤這個研究調(diào)查腫瘤MCP-1(由人腫瘤衍生的細(xì)胞產(chǎn)生)的封閉是否抑制鼠異種移植物中的腫瘤生長。為了測量腫瘤以及宿主MCP-1同源物JE在惡性疾病的生長和進(jìn)展中的作用，測試抗人MCP-1和抗小鼠JE抗體在體內(nèi)抑制人胰肺瘤生長的能力。荷有BxPC-3胰腫瘤的小鼠用命名為CNT0888的人抗人MCP-1抗體進(jìn)行治療，所述抗體包含與人IgGl恒定區(qū)融合的可變區(qū)序列(SEQIDNos:27和28)。為了比較CNT0888與其中發(fā)現(xiàn)最有效抑制宿主作用的先前測試的鼠抗體的體內(nèi)活性，CNT0888和鼠抗人MCP-1(C775)與抗muJE(Cl142)組合施用?；谧罱K的胂瘤重量測量，人(CNT0888)和鼠(C775)抗人MCP-1Mabs都顯著抑制腫瘤生長。才才4牛和方法BxPC-3是人胰腺癌衍生的細(xì)胞。由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)胂瘤制備的MatrigelTM從BectonDickinson獲得(0.2EU/mg,Bedford,MA)。C775是小鼠抗人MCP-1Mab,且Cl142是大鼠/鼠嵌合抗小鼠JE抗體，其具有在申請人共同未決的專利申請美國系列號11/170453和相關(guān)文件中描述的大鼠可變和小鼠恒定區(qū)。對照抗體cVaM是由大鼠可變和小鼠恒定區(qū)組成的大鼠/鼠嵌合IgG^k,它充當(dāng)C1142和C775的同種型對照。臨床級別的人IgG從BeckettApothecaryandHomeHealthCare，Inc,SharonHill,PA獲得，且充當(dāng)CNT0888的對照。在本研究中使用從CharlesRiver(Raleigh,NC)獲得的雌性SCID小鼠(6-8周大)。小鼠在過濾器居于頂部的塑料籠中分組祠養(yǎng)且供應(yīng)91高壓滅菌的食物和水。BxPC-3細(xì)胞在包含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞在研究開始前48小時1:3分開。在研究當(dāng)天，細(xì)胞用胰蛋白酶處理以產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液，且細(xì)胞懸浮液用IO體積的完全培養(yǎng)基洗滌以中和胰蛋白酶。將細(xì)胞離心且重懸浮于無血清RPMI中。MatngelTMf4。C過夜解凍。Matrigel-腫瘤細(xì)胞懸浮液通過將等體積的MatrigelTM溶液和BxPC-3細(xì)胞混合進(jìn)4亍制備。癌細(xì)胞懸浮液的最終濃度是在5mg/mlMatrigel中5xl06細(xì)胞/ml。在第0天，80只雌性SCID小鼠皮下(s.c.)植入0.2mlBxPC-3細(xì)胞懸浮液。0.2ml細(xì)胞懸浮液包含lx106BxPC-3細(xì)胞和1.0mgMatrigelTM。使用冷注射器以避免MatrigelTM聚合。表7.抗腫瘤研究設(shè)計。<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>所有動物在研究開始時和在研究過程中每周一次進(jìn)行稱重。一旦觀察到腫瘤生長(3.0mm3),就用卡尺在2個維度(長度和寬度)測量腫瘤，單位為毫米(mm)。監(jiān)控小鼠的腫瘤生長，且基于式[長度x寬度x寬度]/2計算腫瘤體積(mm3)。在胂瘤細(xì)胞植入后第14天，具有約50mn^的平均腫瘤體積的小鼠隨機分成5組(11=10/組)。治療(表7)在第14天開始，且對于剩余部分的研究(第14天治療開始后52天)每周施用2次治療。對于剩余部分的研究每周測量一次腫瘤。在研究結(jié)束時，小鼠通過C02窒息實施安死術(shù)。腫瘤被解剖、在數(shù)字天平上稱重、且固定。腫瘤使用數(shù)碼相機進(jìn)行拍照。在第50天，組3中的1只小鼠具有超過在研究指導(dǎo)下可接受極限的腫瘤，且被處死。這個動物的體積和重量被包括在最終分析中。對于腫瘤重量，數(shù)據(jù)經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)線性模型和方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析。除非另有說明，對于所有檢驗和比較小于0.05的P值視為顯著的。使用對數(shù)尺度，因為更好地滿足相等方差和正態(tài)分布型的根本假設(shè)。對于沒有腫瘤的小鼠的6個零值由樣條插入值(0.007240538)替換，所;對于腫瘤體積,'重復(fù)6^測量模型對假定一階自相關(guān)協(xié)方差結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。使用天然樣條以靈活模擬時間曲線中的趨勢曲率。在每個時間點上進(jìn)行組內(nèi)的成對比較。通過R軟件環(huán)境進(jìn)行計算。結(jié)果PBS和cVam/huIgG陰性對照組顯示出相似的腫瘤生長，在51天后達(dá)到~350mm3。這表明用無關(guān)抗體的抗體治療不抑制肺瘤生長。3個測試組(C775/C1142和CNT0888/C1142)中的腫瘤生長比陰性對照組中更慢，從而表明抗CCL2/抗JE治療對腫瘤生長有影響。如從第18天到研究結(jié)束時通過腫瘤體積測量的，與PBS對照組比較，C775/C1142和CNT0888/C1142(2mg/kg)組顯示出明顯的肺瘤抑制。與PBS對照組比較，CNT0888/C1142(20mg/kg)組顯示出從第18天到笫39天的顯著抑制。在第51天研究結(jié)束時獲得腫瘤重量(表8)。在PBS組1(1只小鼠)、C775/C1142組3(3只小鼠)和CNT0888/C1142組4(2只小鼠)中存在無腫瘤小鼠。當(dāng)比較腫瘤重量時，與PBS對照組比較，CNT0888測試組各自顯示肺瘤重量中的顯著減少(表8)。以2mg/kg給藥的CNT0888/C1142組中的抑制百分比是80%(P=0.006),而對于以20mg/kg給藥的CNT0888/C1142組抑制是68。/o(P二0.046)。C775/C1142組也顯示腫瘤生長的顯著抑制(P=0.004)。腫瘤體積對腫瘤重量結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)解釋中可見的差異最可能是由于與從動物中切除的腫瘤稱重的精密度比較，用卡尺測量腫瘤體積中的不精確。表8.最終的腫瘤重量<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>總之，這些結(jié)果表明在確立的BxPC-3模型中，MCP-1和小鼠JE的封閉明顯抑制腫瘤生長，且CNT0888具有抗肺瘤活性。顯而易見的是本發(fā)明可以以與前述說明書和實施例中先前所述不同的其他方式進(jìn)行實踐。本發(fā)明的眾多修改和變化依據(jù)上述教導(dǎo)是可能的，且因此在附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)f胸T5ii^':ffotQ'她lii—淑6-暴'胸^￥^'.沐識加]^'喊阪^5g^(2曙.彌,ote:f顯,;5535^"j^謬^li^^i5^iiro3^T溫溪i^g:S5^,:編5F函W流W狙彌<image>imageseeoriginaldocumentpage95</image>^^^5^^^;M"iain^;，n汰fi^SShg，^i^5jr5i^AiBhaktkS^3竭^3^fere3idti"^S5"p[ioriocyfeclSmotac'tic^5tjfei"l廟ataffectsignalingthrpiikhthe]Tcc印^r:CCR2^ni^-SaiozFastB，J^ayofFJr，Ar在i^AJ^T(20i[)ltTr§ii^alingpathw"for咖no6^:cfi5tnqatfrkc^1^proteinl一加6idiat^5^xir^cenm151signah:efflifatedkinas6actjyation.MolPharinaco〗j(luò)lKnappik,A*，Ge,L.,Hon戰(zhàn)ger,A,，Pack，P,，F(xiàn)iseher，M,,^ellnfaofer，(3.'Hoess,A.，JjHuckthun,^，andVirnekas，B.(2000)，F(xiàn)ullysynthetichumancombinatorialantibodylityari"jjgt^C^L):edonModularyoqso加tisft^tnworksandgDRs卿JQm^5，ithtrjggcl一ide尹.j^oj蹈oJ296,57，86J^,.,M.:,'HoUi^ri.'j>,:,:''W1uiteiyG，.(l々9|6)vMifaaicldp:g—6mfttfc''hy^^pBjitetiop::,^￡fiiA^qt^uration'blf1Bg西:S5S5gSiE范^7備;脂l^r!g5^TS5^mi^涵gSli(M^iSi|^5^'!1碌喊11^^"^沐邁5^咖$|6^78'$就:端15戰(zhàn)￡23^莉jg^liigiiSrgv:MJM51^;雄爐，蔬《raoi^n:W織維S，'歸^]gMil^^^'A'蹄^巡,^!BHg^^lS巡Sg！jiuitibodies6伍oi^tlyinduce'饑ograiiiiii^i<fea^ofmaiimUntlympfiQJdcdls.NatMed,8(8)i861，7jfo;^aid:N,rfoof),tiTBRT-proitnd&rJbas^rtiimor-sipe^i^expj1—sS^noJEJ^^^-Ie設(shè)ecitiveiygeqsi&^jccjj"vic^[cancerccil3t0alowdpseofoispl雄tin，CancerGeneThe^11(l上4r刃jmammaiyt咖ora:M^!P-l-TNPalphao卿"柳labry:(pathway助dclo礎(chǔ)柳ressionofpromali幼an^j^adantimalig^^yiactors,IntJCan—,106(6):^9-86J兩^"gj^notoS,Ishib^shiM，UsuT&，InoueS，Hiasa^fe^^，l^hidaK'T^ShlgA'Ega^JJi^(2004),Monocytechemoattractantprotein-1isanessentialinflammatorymediatorinangiotensinILJgnducedfrogjgggjgqj[fgs扭blishgdatherosclerQsisinhyi)ercholestei:olen)icmice'Ai1ejlQsg[gtT^IQ^y!VascBJol.24(3):534-9—〗j(luò)^i^i^l^"^iiji^—￡^"g，NishiokaY,Y肌oS,MukaidaN，MatsushimaK，gopeS,(2000)*Natural^HIercell-dependedsuppressioiTofsysteiiilcspreadofhumanhmgadenocarcinomacellsbymonocyte)^KemoattractantgenetransfectioiainseverecombipedimmunodefidentmFce,5ancerRes〗Mon。cytech柳oat加ctaiUprotein-1Sxpr"ssioncorrelateswithcmcrophageiDfiliratkmand嫌3I^SSn^Sinhuman卿ftipcarcinbm^.IntJQl^5i,—22(4)加，gjHehler,'J,,M^^'A,，:Giefsch,《;jHpS,B'，.G叫g(shù)rJJ5T5.(1997)'Asse辟m油t.of礎(chǔ)qitycQnst^te.by!j^id鄰iid、pji扭《dete"t^)nof^J5IS^m5^dii^扭.a對ow.s;y鄉(xiāng)m.J:;Inmyi^l,-^fii::.20i[rf的-^)6〕一———抽g—Si"tu^6(pi^^辨Qn!f^H)^f^激34^！Geicm^Sie^role'otche聊kinesineejlfunctioiyJPiiafeiacolExplfer.283(l):4T'i>8〕jS扭lipyP,LosiS5iFf!3》,畫(2003),Moniop^tecii;md^;tract幼ttM:ol^in1inpb^i1y幼di站uUttresist加cj]l^cl^^r^^SciUSA.1(J5HI")—:7265隱70jjSchier，R，，Bye，J.,Apell，H^^11,Cj鵬，G,Pja^;ist,M.,Weiner,L.M7W^er〗Maito,J，D.(1996a),Iaolarionofhigh-affinitymonomerichumananti-c-erf>B-2singlech—Fvtisin^J^"inity-jrW^Vsekctioj^J.Mol,Biol.25S,28-431jSchier，R"A^CaH,A，Ad咖s，G,P"Marshal,K，W,，Merritt，H"Yim,M，Crawford,R>g.t，el^ET.M,,Marks,C,,Marks,Ef,.(19—96b).Isolationofpicomolaraffinityanti々erbB-2single-chainPvb><^TokcularevolutionofthecomplementarUydeterminingregionsinthecenteroftheantibodybinding^chmidtT,G.M.，Koepke，J,tFrank,R.andSkerryA.(199ft,MoleculariQtgracrionbet^^JTffi3gtr印-t^gaM5typ印tideanditsco幼atetargetstr印tavidin,i^lol.岳olJZ5虧,預(yù)-^jSlftr5^啦Jl^i:M卿吸絲』&傻—6二地:J^fl汲，^rf^SP^i^斑1^瓦^gr(^5疏陽^^ip^T^^);"^H^長scheaiia^ein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治療組合物、方法和裝置。文檔編號C07K16/00GK101511869SQ200680026291公開日2009年8月19日申請日期2006年5月19日優(yōu)先權(quán)日2005年5月19日發(fā)明者A·達(dá)斯,M·巴德羅夫,P·徐,R·斯威特申請人:森托科爾公司