專利名稱：使用過氧化物氧化還原酶1(prx1)作為佐劑的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及免疫治療領域，更明確而言，本發(fā)明涉及使用Prxl作為佐劑來增強針對抗原的免疫反應。
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背景技術：
Prxl是典型的2-半胱氨酸過氧化物氧化還原酶家族的ー員，其主要的胞內功能是通過其過氧化物酶的活性作為過氧化氫信號通路的調控因子和作為蛋白質的伴侶蛋白。Prxl的表達在各種癌癥中會上調，包括食管癌、胰腺癌、肺癌、甲狀腺濾泡癌和口腔癌。PrxI水平的升高與臨床結果不理想和病人整體存活情況降低相關。最近的研究證實Prxl可以由非小細胞肺癌細胞分泌，該分泌可能通過ー種非經(jīng)典的分泌途徑。然而，分泌的Prxl的作用至今尚未知曉，之前也未就治療目的加以探索。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了用于激發(fā)免疫反應的組合物和方法。這種組合物包括抗原和分離的Prxl蛋白?？乖蚉rxl蛋白可以以復合物的形式提供，或者它們可以彼此共價連接。Prxl蛋白在復合物中可以以多聚體的形式存在。在一個實施方式中，所述多聚體是十聚體。組合物還可以包括接觸過抗原和/或Prxl蛋白的抗原呈遞細胞?？乖梢允怯糜诩ぐl(fā)所需要的免疫反應的任何抗原，包括但不限于傳染源或癌細胞表達的抗原。在一個實施方式中，抗原由腫瘤細胞表達。在個體中激發(fā)針對抗原的免疫反應的方法包括給予該個體包含該抗原和分離的Prxl蛋白的組合物。所激發(fā)的免疫反應可強于該抗原在不給予分離的Prxl蛋白時所激發(fā)的免疫反應。激發(fā)的免疫反應可包括細胞介導的免疫反應、體液免疫及其組合。在一個實施方式中，激發(fā)針對抗原的免疫反應的個體是有風險發(fā)生、被懷疑患有或已經(jīng)診斷患有癌癥的個體。附圖簡要說明圖I. Prxl刺激巨噬細胞分泌細胞因子(A)采用流式細胞儀檢測TG誘出的巨噬細胞所表達的⑶llb、Grl和F4/80。示出3次獨立分離的代表性柱狀圖，顯示⑶Ilb+細胞的Grl和F4/80的表達情況。插入框中的數(shù)字表明是每個象限中CDllb+細胞的百分比。(B)將TG誘出的巨噬細胞和刺激物共同培養(yǎng)24小吋，收獲上清液后分析TNF- α (空心柱)和IL-6 (灰色柱)的水平。結果以pg/ml為單位，代表了三組獨立試驗，誤差線代表標準差。(C)將TG誘出的巨噬細胞分別如下培養(yǎng)24小時僅用培養(yǎng)基(黑色柱)；用IOOnM LPS或2000nM Prxl (空心柱)；用IOOnM LPS或2000nM Prxl，經(jīng)lOug/mL多粘菌素B預孵育20分鐘(陰影線柱)；100nM LPS或變性的2000nM Prxl (灰色柱)。星號表示與僅用Prxl或LPS處理過的細胞相比p彡O. 01。(D)將TG誘出的巨噬細胞分別以單獨的培養(yǎng)基、Prxl (50nM)或LPS(IOOnM)培養(yǎng)24小時，灰色柱表示培養(yǎng)時添加10%的FBS，空心柱表示未添加10%的FBS。收獲上清液，并分析IL-6的水平。結果以pg/ml為單位，誤差線代表標準差。圖2. Prxl刺激樹突狀細胞的成熟與激活。(A和B)將未成熟的骨髓來源的樹突狀細胞(iBMDC)分別以單獨的培養(yǎng)基、20-200nM Prxl或IOOnM LPS培養(yǎng)24小時。(A)培養(yǎng)后，通過流式細胞儀分析細胞中⑶Ilc和⑶86的表達情況。結果顯示為占所有細胞的百分比，誤差線代表標準差。(B)收獲上清液，并對TNF-α進行分析。結果以pg/ml為單位，代表三組獨立實驗，誤差線代表標準差。(C)將TG誘出的巨噬細胞與如下培養(yǎng)基共同培養(yǎng)收獲自培養(yǎng)轉染有編碼對照shRNA (亂序，Scramble)或Prxl特異性shRNA (shPrxl)的cDNA的前列腺腫瘤細胞系的培養(yǎng)基，或者是收獲自培養(yǎng)表達Prxl特異性shRNA的細胞的培養(yǎng)基(其中添加了 50nM外源性的Prxl，shPrxl+Prxl)。培養(yǎng)24小時后收獲上清液，對TNF-α進行分析。結果以Pg/ml為單位，代表三組獨立試驗，誤差線代表標準差。 林P彡O. 01，與僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞所分泌的TNF- α水平相比;## P ^ 0.01,與用獲自表達對照shRNA的細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞所分泌的TNF- α水平相比 PS0.0丨，與用獲自表達Prxl特異性ShRNA的細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞所分泌的TNF-α水平相比。圖3. Prxl誘導的細胞因子分泌依賴于TLR4。(A)從 C57BL/6 小鼠(TLR4+/+;空心柱)和 C57BL/10ScNJ 小鼠(TLR4+ ;實心柱)分離得到iBMDC，分別用200nM PrxlUOOnM LPS或IOOmM Pam3Cys激發(fā)。收集上清液，用IL-6ELISA試劑盒分析。(B)從C57BL/6小鼠(TLR4+/+;空心柱)和C57BL/10ScNJ小鼠(TLR4+;實心柱)分離得到TG誘出的巨噬細胞，分別用200nM PrxlUOOnM LPS或IOOmMPam3Cys激發(fā)。收集上清液，用IL-6ELISA試劑盒分析。結果以pg/ml為單位；誤差線代表標準差，星號表示P值小于O. 01。(C)向未處理的C57BL/6(TLR4+/+;空心柱)小鼠和C57BL/10ScNJ(TLR4^;實心柱)小鼠腹腔內注射200nm的Prxl。6小時后，采集血樣，用ELISA分析IL-6的存在。結果以pg/ml為單位；誤差線代表標準差，星號表示P彡O. 0002。圖4 =Prxl和TLR4的相互作用依賴于CD14和MD2。(A)從C57BL/6小鼠中分離得到TG誘出的巨噬細胞，在存在或不存在對照或針對Prxl、CD14或MD2的封閉抗體的情況下用50nM Prxl刺激24小吋。收集上清液，用IL-6ELISA試劑盒分析。結果以pg/ml為單位；誤差線代表SEM，星號表示P值小于O. 01。(B)收獲TG誘出的巨噬細胞，如材料和方法中所述，用針對TLR4、TLR2和小鼠/山羊IgG的抗體沉淀細胞裂解物；所得沉淀物經(jīng)SDS-PAGE分離并通過蛋白質印跡分析檢測Prxl的存在。還用TLR4或TLR2的抗體檢測印跡以作為內參照。(C)收獲TG誘出的巨噬細胞，如材料和方法中所述，將細胞裂解物與針對TLR4或小鼠/山羊IgG的抗體共孵育；所得沉淀物經(jīng)SDS-PAGE分離并通過蛋白質印跡分析檢測Prxl、⑶14和MD2的存在。還用TLR4抗體檢測印跡以作為內參照。圖5 :TLR4/Prxl相互作用的動力學。(A) TG誘出的巨噬細胞經(jīng)200nM的FITC-Prxl或PE連接的抗TLR4(PE-TLR4)激發(fā)。在指定的時間收集樣品。樣品和細胞群體通過安尼斯(Amnis)技術分析。圖示為在每個時間點下，代表性的免疫染色細胞和兩種染色合并后的圖像。最右邊的柱狀圖為通過所分析的每個細胞的像素統(tǒng)計分析(n=5，000)得出的像素柱狀圖，其中y軸表示的是細胞的數(shù)目，X軸表示的是Prxl和TLR4之間的相似系數(shù)。(B)圖示為每個時間點所有細胞的平均相似系數(shù)；誤差線表示標準差。圖6. Prxl結合TLR4是結構依賴性。(A)從TLR4+/+(白色柱)或TLR4+巨噬細胞(實心柱)中分離得到TG誘出的巨噬細胞，然后分別與培養(yǎng)基(無添加)、200nM的Prxl、200nM的PrxlC52S或200nM的PrxlC83S培養(yǎng)24小時，收獲上清液，分析TNF- α和IL-6的存在。⑶從TLR4+/+(白色柱)或TLR4+巨噬細胞(實心柱)中分離得到TG誘出的巨噬細胞，與2000nM的FITC標記的蛋白質共同培養(yǎng)20分鐘，然后用流式細胞儀分析。通過去除7-AAD高表達的細胞群選取活細胞用于分析。結果經(jīng)歸ー化處理，以除去FITC標記中的差異，結果以每nM蛋白質中的MFI/FITC表示，誤差線表示標準差。星號表示P彡O. 01。(C)TG誘出的巨噬細胞分別與各種濃度的FITC-BSA (正方形),Prxl (黒色圓圈)、PrxlC52S (灰色圓圈)和PrxlC83S(空心圓圈)共同培養(yǎng)20分鐘，并用流式細胞儀分析。結果經(jīng)歸ー化處理，以除去FITC標記中的差異，結果以每nM蛋白質中的MFI/FITC表示。每條曲線代表三次獨立試驗。(D)將TG誘出的巨噬細胞與IOOOnM的Prxl共培養(yǎng)，清洗后與遞增濃度的 如下競爭劑共培養(yǎng)0VA (正方形)、Prxl (黑色圓圈)、PrxlC52S (灰色圓圈)、PrxlC83S (空心圓圈)。結果以對于無競爭劑情況下FITC-Prxl的MFI百分比形式表示；誤差線表示標準差。所有的實驗都進行三次，綜合后的結果如圖所示。圖7. Prxl刺激巨噬細胞依賴于MyD88并導致NF κ B的核易位。(A)包含對照(空心柱)或MyD88DN(實心柱)表達質粒的RAW264. 7巨噬細胞系的穩(wěn)定感染子用IOOnM LPS或IOOOnM Prxl激發(fā)24小時，用ELISA分析得到的上清液中IL-6的表達。在三組獨立實驗中進行了 ELISA分析；誤差線表示標準差。星號表示P值彡0.001。(B)從C3H/HeNCr (TLR4+/+)和C3H/HeNJ (TLR4+)小鼠中分離得到TG誘出的巨噬細胞，在完全培養(yǎng)基中用200nM Prxl激發(fā)。在指定的時間點，用FITC連接的抗NFk B p65抗體和DRAQ5(核染劑)染細胞10分鐘，然后用安尼斯(Amnis)技術進行分析。最右邊的柱形顯示了基于NF κ B和核染色相似性的逐像素統(tǒng)計分析。(C)在每個時間點下，在C3H/HeNCr(實心圓圈)和C3H/HeNJ(空心圓圈)巨噬細胞中的的總體相似系數(shù)的平均數(shù)值；誤差線代表標準差。(D)將TG誘出的巨噬細胞與特定濃度的Prxl共孵育I小吋。按照實施例I所述進行EMSA分析。圖8.在PC-3M細胞中表達Prxl特異性shRNA導致Prxl的表達減少。(A)用凝膠電泳分離從表達對照(亂序)shRNA或Prxl特異性shRNA (shPrxl)的基因工程化PC-3M細胞(右圖)中得到的細胞裂解物，用Prxl特異性抗體進行印跡和探測。⑶表達Prxl特異性shRNA導致Prxl水平的降低。收獲表達對照shRNA (亂序)或Prxl特異性shRNA的基因工程化PC3-M細胞系，用蛋白質印跡分析Prxl或Prx2的表達。(C)Prxl激發(fā)的TG誘出巨噬細胞分泌IL-6依賴于CD14和MD2，其中CD14和MD2是TLR4的輔因子。從C57BL/6小鼠中分離得到TG誘出的巨噬細胞，在存在或不存在對照或者針對CD14或MD2的封閉抗體的情況下用LPS激發(fā)24小吋。收獲上清液后用IL-6ELISA試劑盒分析。結果以pg/ml為単位，誤差線代表標準差。圖9提供了用于顯示動物模型中Prxl抗腫瘤的佐劑效果的圖示。發(fā)明描述
本發(fā)明是基于以下意想不到的發(fā)現(xiàn)過氧化物氧化還原酶I (Prxl)是Toll樣受體4(TLR4)的配體，并且Prxl的這種功能使得它能作為ー種佐劑。本發(fā)明提供增強個體中針對抗原的免疫反應的組合物及方法。該組合物包括分離的Prxl和抗原。Prxl的氨基酸序列及其DNA和RNA編碼序列是本領域技術人員所熟知的。在一個實施方式中，分離的Prxl蛋白以十聚體的方式提供。這種分離的Prxl蛋白可包括191個氨基酸的序列或者由191個氨基酸的序列所組成，這種包括191個氨基酸的序列或由191個氨基酸的序列所組成的蛋白質具有過氧化物氧化還原酶的活性。在一個實施方式中，Prxl蛋白含有2009年8月23日登入的NCBI參考序列NP 859047. I所示的氨基酸序列，該序列通過引用納入本文。據(jù)信任何的剪接變體和/或Prxl異構體都可以用在本發(fā)明中。本發(fā)明的方法包括給予個體該組合物從而激發(fā)抗該抗原的免疫反應。這種激發(fā)的免疫反應可具有治療或預防的效果，可包括細胞介導的反應和/或體液反應，或其組合。這樣激發(fā)的免疫反應可強于用單獨的抗原激發(fā)的免疫反應。Prxl是ー種在大多數(shù)細胞類型中都存在的抗氧化劑和伴侶蛋白分子，并由轉化的 和活化的細胞分泌。TLR4是Toll樣受體(TLR)家族的ー員。TLR與其配體的相互作用啟動炎癥介質(如促炎細胞因子)的釋放以及啟動免疫反應細胞的成熟/活化。炎癥和免疫細胞的成熟/活化對于抗原特異性免疫(包括抗腫瘤免疫)的誘導都是必不可少的。在本領域中，能夠觸發(fā)炎癥和免疫細胞成熟/活化的試劑被稱為佐劑。在此，我們證明Prxl與負責誘導抗原特異的免疫反應的免疫細胞(例如樹突狀細胞和巨噬細胞)表面上表達的TLR4相互作用。我們還證明，Prxl和TLR4的相互作用導致產(chǎn)生樹突狀細胞和巨噬細胞的成熟/活化并導致分泌促炎細胞因子。因此，認為Prxl是免疫佐劑。重要的是，我們證實向抗腫瘤疫苗中添加Prxl增強了疫苗在動物中所起的效果。就此，用許多TLR激動劑來改善抗腫瘤免疫，包括TLR9激動劑CpG基序和TLR7激動劑咪喹莫特。CpG基序是包含未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤和側翼核苷酸的DNA寡脫氧核苷酸序列(ODN)，可以與TLR9相結合。咪喹莫特[1-(2-甲基丙基)-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4胺；AlderaTM;R-837, S26308]是合成的TLR7激動劑，其可以誘導DCs28的成熟與遷移，IFN-a ,TNF- α、IL-I α、IL-6, IL-12和IL-8的表達，以及增強CD8+T細胞的活化。咪喹莫特已成功用于治療基底細胞癌，最近的一項臨床試驗顯示局部應用咪喹莫特可以有效清除O期的黑素瘤。這兩種TLR激動劑都已列入美國國家癌癥研究所(NCI)進ー步開發(fā)作為抗癌疫苗用佐劑的優(yōu)先列表。Prxl顯示很多與CpG和咪喹莫特相同的活性,然而,Prxl所結合的受體TLR4的表達比與CpG和咪喹莫特相作用的TLR更廣泛。因此，Prxl有成為更有效的抗癌疫苗佐劑的潛力。預期本發(fā)明可以用于激發(fā)任何抗原所引起的免疫反應，因此，該抗原可以作為免疫源起作用?？乖ǖ幌薷傻鞍踪|、多肽或肽抗原。這種抗原可能已被充分表征，或者可能還未知，除了已知或者懷疑存在于(例如)細胞裂解物內的抗原，所述細胞裂解物來自包含或者可能包含該抗原的特定的細胞種類或任何其它生物組織樣品。在一個實施方式中，本發(fā)明激發(fā)引起的免疫反應所針對的抗原是腫瘤抗原。腫瘤抗原可以通過傳統(tǒng)的技術得到，如通過反復凍融腫瘤細胞/組織來制備腫瘤細胞裂解物而獲得所述腫瘤抗原，所述腫瘤細胞/組織獲自新鮮的腫瘤活檢組織或獲自體外組織培養(yǎng)所產(chǎn)生的腫瘤細胞。該腫瘤細胞裂解物可以通過離心和收集上清液得到。該腫瘤細胞裂解物既可以立即使用，也可以冰凍儲存?zhèn)溆?。這種抗原可以以純化的形式、部分純化的形式或以細胞裂解物形式存在的未純化形式使用。或者，可以通過重組DNA技術在眾多表達系統(tǒng)中的任何ー種中表達該抗原。因此，本領域技術人員應認識到可提供分離的Prxl蛋白以用于本發(fā)明中，從而使得個別的(discreet)、分離的Prxl蛋白與ー種或多種不同的抗原復合。這樣的復合物可以在各種條件下形成，如改變Prxl/抗原的比例，使用不同的緩沖液、孵育時間以及溫度。在一個實施方式中，Prxl蛋白和抗原在本發(fā)明的組合物中以復合物的形式存在，可以彼此共價或者非共價地連接。例如，Prxl蛋白及抗原可能通過化學鍵相互連接，如通過共價鍵、離子鍵、氫鍵和/或范德華鍵，或上述鍵的組合。形成含或不含共價鍵的蛋白質/抗原復合物的方法在本領域是已知的，并且這些方法可以用于形成分離的Prxl蛋白和一種或多種抗原的復合物。本發(fā)明中的復合物可包含分離的Prxl蛋白和抗原，或基本由Prxl蛋白和抗原所組成，或由分離的Prxl蛋白和抗原所組成。“分離的”指Prxl蛋白與其天然存在的環(huán)境相分離。分離的蛋白質不一定是純化的蛋白質。然而，為用于本發(fā)明，分離的Prxl蛋白仍然可純化到任何需要的純度。分離的Prxl蛋白包括通過重組的方法得到的Prxl蛋 白。根據(jù)本發(fā)明，Prxl多聚體，如十聚體，也被認為是分離的Prxl蛋白。此外，分離的Prxl蛋白還包括與抗原通過肽鍵相連的Prxl蛋白，例如在融合蛋白中。簡而言之，為了產(chǎn)生這樣的融合蛋白，可使用傳統(tǒng)的技術構建編碼Prxl蛋白和該抗原的DNA序列，并用任何適合的表達載體在適宜的細胞類型中表達。如此，這種融合蛋白即能在細胞內表達，且可使用任何本領域技術人員熟知的方法分離得到這種融合蛋白。在一個實施方式中，Prxl/抗原的融合蛋白可以由接頭序列間隔開。本發(fā)明中適合給予個體的組合物可以通過以下方法制備將分離的Prxl蛋白和/或抗原與任何合適的藥學上可接受的載體、賦形劑和/或穩(wěn)定劑混合。可在下列文獻中找到一些適用于混合試劑的組合物的例子Remington:The Science and Practice ofPharmacy (《雷明登藥物科學與實踐》)(2005)，第21版，賓夕法尼亞州費城，利平科特 威廉斯·威爾金斯出版公司(Lippincott Williams & Wilkins)。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明中的方法激發(fā)免疫反應的個體是有風險發(fā)生、被懷疑患有或已經(jīng)診斷患有癌癥的個體。因此，在各種實施方式中，與Prxl蛋白聯(lián)用的抗原是在任ー種癌細胞中表達的抗原，具體的例子包括但不限干纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假性粘液瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌，支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、腎母細胞瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突膠質瘤、腦脊膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜成神經(jīng)細胞瘤、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥和重鏈病。在一個實施方式中，個體具有帶傳染源的風險，或者疑似帶有傳染源，或者已被診斷帶有傳染源。因此，在多種實施方式中，用于本發(fā)明中的抗原可以是由傳染源所表達的那些抗原。此類傳染源的例子包括但不限干病毒、細菌、真菌和其它寄生生物。病毒的例子包括但不限于こ型肝炎或丙型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒(vaticella)、腺病毒、I型或II型單純皰疹病毒、牛瘟病毒、鼻病毒、艾柯病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞體病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒、細胞巨化病毒、棘狀病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、骨髓灰質炎病毒、人I型或II型免疫缺陷病毒。細菌的例子包括但不限干結核分枝桿菌、分枝桿菌、支原體、奈瑟氏菌和軍團桿菌。其它寄生生物的例子包括但不限于立克次體和衣原體。本發(fā)明的組合物可以通過任何適宜的給藥途徑給藥。一些非限制性的例子包括ロ服、胃腸道外給藥、皮下給藥、腹膜內給藥、肺內和鼻內給藥。胃腸外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內和皮下給藥。本發(fā)明的組合物的給藥可以和g在治療抗原相關的疾病或紊亂的常規(guī)治療聯(lián)合進行。例如，組合物可在常規(guī)抗癌治療之前、同時或之后給予。這些治療包括但不限于化療、手術干預和放療。 總體而言，適宜的劑量和治療方案提供有效量的該組合物以激發(fā)免疫反應，從而提供治療或者預防益處。這種反應可以通過臨床結果的改善監(jiān)測到，如抑制腫瘤的生長和/或轉移、增強對感染的抵抗力、促進免疫細胞的活化、和/或對于本領域技術人員而言顯而易見的其它參數(shù)，取決于所治療病狀。在此公開的治療用組合物的給藥途徑、頻率及劑量在不同個體之間各不相同，但使用標準的技術可以很方便的確定。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含分離的抗原呈遞細胞(APC)群和包含分離的Prxl和抗原的復合物。Prxl/抗原復合物可以被用于致敏APC，如樹突狀細胞。給予個體經(jīng)致敏APC可以獲得增強的免疫反應。因此，包含分離的APC群和復合物(所述復合物包含分離的PrxI蛋白和抗原)的組合物中細胞的全部、基本全部、或者部分是樹突狀細胞。據(jù)此，組合物中的細胞可以100%是樹突狀細胞，也可以10%-100%(包括之間所有的整數(shù))是樹突狀細胞。在一個實施方式中，給予個體包含分離的APC群和復合物(所述復合物包含分離的Prxl蛋白和抗原)的組合物以在該個體中激發(fā)預防性或治療性免疫反應。給予個體的APC可以是異基因的或同基因的。以下實施例是為了說明而非限制本發(fā)明。實施例I本實施例提供了實施本發(fā)明具體實施方式
中使用的材料和方法的描述。材料脂多糖(LPS,大腸桿菌(Escherichia coli)血清型026:B6)多粘菌素B硫酸鹽、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)購自西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich，密蘇里州圣路易斯)。7-氨基-放線菌素D(7-AAD)和硫代こ醇酸鹽布氏改良培養(yǎng)基購自BD公司(加利福尼亞州拉霍亞)(Becton Dickinson, La Jolla, CA)。Luminex分析系統(tǒng)中所使用的用于捕獲和檢測IL-6和TNF-α的抗體、以及蛋白質標準品購自英杰公司(加利福尼亞州卡爾斯巴德)(Invitrogen, Carlsbad, CA)。Q)llb、Gr-1> F4/80及所有的同種型的特異性抗體購自法明基公司(加利福尼亞州山景城)(PharMingen, Mountain View, CA) 抗TLR2、TLR4和NF κ B亞基的抗體購自圣克魯斯生物技術公司(加利福尼亞州圣克魯斯)(SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 抗MD2和0)14的封閉抗體購自圣克魯斯生物技術公司。藻紅蛋白(PE)連接的抗TLR4抗體,購自易生物科學公司(eBioscience,加利福尼亞州圣地亞哥)?？筆rxl的特異性抗體購自實驗室前沿公司(Lab Frontier,首爾,韓國)；這種抗體為Prxl特異性，在表達Prxl的細胞的蛋白質印跡分析中只檢測一條條帶(圖8A)。動物和細胞 系C57BL/6NCr (TLR4+/+ 和 TLR2+/+)、C57BL/10ScNJ (TLR4+)、Β6· 129-Tlr2tmlKir/J(TLR2+)、C3H/HeNCr (TLR4+/+)和C3H/HeNJ(TLR4+)無病原體小鼠，購自美國杰克遜實驗室(The Jackson Laboratory,緬因州巴港)。動物飼養(yǎng)在置于層流柜中的微小_離飼育盒中，暴露在環(huán)境光下。小鼠飼養(yǎng)在羅斯維爾帕克癌癥研究所(Roswell Park CancerInstitute，美國紐約州布法羅)的無病原實驗室中。動物的護理和實驗均得到動物護理和使用委員會(The Institutional Animal Care and Use Committee)的批準。Prxl在體內的作用通過向C57BL/6NCr或C57BL/10ScNJ小鼠靜脈注射90ugPrxl (大約為IOOOnM)來測定。兩小時后進行心臟穿刺。如下獲得血清將血液在4°C下孵育過夜，然后離心樣品，收集上清液。培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞系(RAW264. 7)于37° C和5. 0%的CO2條件下培養(yǎng)于達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中，該培養(yǎng)基包含10%的特級胎牛血清和100U/ml的青霉素以及100ug/ml的鏈霉素。RAW264. 7細胞轉染了 pcDNA3. I質粒，該質粒包含對照或者包含編碼MyD88顯性陰性突變體(MyD88dominant negative, DN)的寡核苷酸,根據(jù)制造商的實驗設計，用FuGENE 6(英杰公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德)進行轉染。然后使用G418篩選轉染細胞中表達對照或MyD88DN的細胞。然后分別用緩沖液、Prxl或LPS發(fā)激細胞24小吋，培養(yǎng)基收獲后通過ELISA分析IL-6細胞因子。在肺癌細胞系(A549)中用于產(chǎn)生Prxl敲減的逆轉錄病毒感染過程和逆轉錄病毒短發(fā)夾RNA表達構建體是本領域技術人員已知的。(Kim等，(2007)CancerRes. 67:546-554 ；Park 等，Cancer Res. (2007) 67 :9294-9303 ; Park 等，2006. CancerRes. 66:5121-5129，其內容通過引用納入本文。分離巨噬細胞和樹突狀細胞小鼠腹腔誘出的巨噬細胞是通過腹腔內注射I. O毫升3. 0%(w/v)的硫代こ醇酸鹽培養(yǎng)基(TG)得到的。注射后四天，處死小鼠，灌洗腹腔收集巨噬細胞。巨噬細胞在完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基添加10%的特級FBS和100U/ml的青霉素以及100ug/ml的鏈霉素)中培養(yǎng)I小時通過貼壁篩選得到富集，然后通過FACS分析法用標準技術鑒定⑶llb、Grl以及F4/80的表達。⑶llb+GrrF4/80+型的細胞確認為巨噬細胞。使用標準技術在GM-CSF中培養(yǎng)骨髓來源的細胞從而產(chǎn)生未成熟的骨髄來源的樹突狀細胞。表達CDllc的細胞確認為樹突狀細胞。蛋白質純化重組人Prxl、PrxlC52S和PrxlC83S蛋白的純化方法如前所述(Kim等，2006.Cancer Res. 66:7136-7142;Lee 等，2007. J. Biol. Chem. 282:22011-22022，其各自掲示的內容通過引用納入本文)。簡而言之，將包含有重組蛋白的細菌細胞提取物上樣至DEAE瓊脂糖凝膠(GE健康護理公司，GE Healthcare，美國)，經(jīng)pH 7. 5的20mM Tris-Cl平衡。蛋白質經(jīng)PH6. 5的50mM磷酸鈉緩沖液(包含0. IM NaCl)透析。收集獲自DEAE柱的含Prxl、PrxlC52S或PrxlC83S的未結合蛋白，合并且上樣至Superdex 200 ((16/60，GE健康護理公司，美國)，經(jīng)ρΗ7· O的50mM的磷酸鈉緩沖液(包含O. IM NaCl)平衡。含有Prxl、PrxlC52S或PrxlC83S的部分收集后保存在-80攝氏度。根據(jù)制造商的指示，使用內毒素當試劑測定法(Limulus Amebocyte Lysate Assay)(龍沙公司，Lonza,馬里蘭州,沃克斯維爾)定量純化蛋白中內毒素的水平。測定后發(fā)現(xiàn)，Prxl、PrxlC52S和PrxlC83S中分別含有14. 14±O. 050EU/ml、14. 07±O. 67EU/ml 和 14. 17±O. 025EU/ml。細胞因子分析貼壁的TG誘出的巨噬細胞經(jīng)PBS清洗5至10次，以除去任何非貼壁的細胞。一經(jīng)清洗后，即加入含有特定濃度的純化的Prxl、PrxlC52S、PrxlC83S或LPS的完全培養(yǎng)基，其中存在或不存在Prxl、MD-2和CD14的封閉或對照抗體。在指定的實驗中，添加前將Prxl蛋白或LPS與多粘菌素B共同孵育或者先煮沸20分鐘。24小時后收集上清液，通過細胞因子特異的ELISA或Luminex多重分析系統(tǒng)進行分析。血清樣品依如上所述的方法收集并使用ELISA測定IL-6的水平。TNF- α和IL-6ELISA試劑盒購于BD生物科學事業(yè)部(美國新 澤西州富蘭克林湖市)(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ),測試依照制造商的說明書完成。Luminex 分析在研究所流式細胞實驗室(Institute Flow Cytometry Facility)完成，使用具有PVDF膜的96孔微量滴定板(多篩選HV板，Multiscreen HV plates)(密理博公司，Millipore,美國馬薩諸塞州，比萊瑞卡)，以帝肯基因西斯液體操作機器人(TecanGenesis liquid handling robot,三角研究園(Research Triangle Park),北卡羅來納州)完成所有的稀釋、試劑添加以及微量滴定板的操作。包被有捕獲抗體的微珠組被測試稀釋劑稀釋，收集，往每孔中加入各組的約1000枚微珠。從9000到I. 4pg/ml的重組蛋白質標準品使用稀釋劑用3倍稀釋法進行滴定。將樣品和標準品添加至含有珠子的孔中。將平板置于搖床上在環(huán)境溫度下孵育120分鐘，然后以多歧真空抽濾盒抽吸用稀釋劑清洗兩次。然后添加抗各種細胞因子的生物素化測試抗體，孵育平板60分鐘，并照之前所述的方法進行清洗。最后，向每個孔中添加PE連接的鏈霉親和素，孵育平板30分鐘并進行清洗。珠子在100 μ I的清洗緩沖液中重新懸浮,在Luminex 100系統(tǒng)(路明克斯公司(LuminexCorp.)，得克薩斯州，奧斯汀)上進行分析。每個樣品都測試兩次，且從所有讀數(shù)中減去空白值。采用讀珠(BeadView)軟件(密理博)，依據(jù)珠子的MFI值對重組蛋白標準品的濃度計算出對數(shù)回歸曲線。將偏離最佳擬合曲線的點，即低于測試極限或超過飽和度的點，從曲線中剔除。樣品中的細胞因子的濃度通過將它們的珠子的平均熒光強度內插至所得最佳擬合曲線中計算得到。值超過測試極限的樣品稀釋后重新測定。用FITC標記蛋白質將BSA、Prxl、PrxlC52S和PrxlC83S蛋白通過FITC連接試劑盒(西格瑪公司，密蘇里州，圣路易斯)連接至FITC上。將20倍過量的FITC和単獨蛋白質溶解至0. IM的碳酸氫鈉/碳酸鈉緩沖液(pH調至9.0)中；混合物在室溫下溫和搖動孵育2小吋。過量的游離FITC用Sephadex G-25凝膠柱(法瑪西亞公司(Pharmacia),新澤西州，皮斯卡塔維)移除。蛋白質的量通過標準的Lowry檢測法定量。F:P (熒光強度蛋白質)比根據(jù)制造商的說明書進行計算，F(xiàn)ITC吸收率和蛋白質的吸收率分別為在495nm和280nm下的光學密度。BSA、PrxU PrxlC52S 和 PrxlC83S 的每 nM 蛋白質的 FITC 值分別為 31. 00± I. 92,38. 52±2· 39、74. 49±2· 64 和 44. 44±2· 64。飽和度分析FITC 連接的 BSA、Prxl、PrxlC52S 和 PrxlC83S 用含 I. 0% 的 BSA 的 PBS 稀釋至特定濃度，反應的總體積為100 μし這些混合物與I. OX IO6個細胞/mL (的細胞)于冰上孵育20分鐘，以防止內化。細胞用含1%BSA的PBS清洗兩次，并進行孵育以顯示相對于帶有7-AAD的無活力細胞的存活性，然后在少于30分鐘內用FACsCalibur檢測。數(shù)據(jù)從至少20，000例細胞中得到，以并排列表(collateral list)模式儲存，并用WinList處理程序(VSH公司(Verity Software House, Inc.),緬因州特普杉,Topsham)分析。7-AAD 陽性(無活力)的細胞被排除出事件外。FITC-連接的BSA被用于作為陰性結合對照，對于突變研究，F(xiàn)ITC標記中的變化以每nM蛋白質中的FITC的標記歸一化。競爭試驗
將未標記的OVA、Prxl、PrxlC52S和PrxlC83S與和FITC相連的Prxl以特定濃度在100 μ I含I. 0%BSA的PBS中短暫混合。該混合物在冰上孵育20分鐘，然后用含I. 0%BSA的PBS清洗兩次。接著，將細胞與7-AAD共孵育，在30分鐘內用流式細胞儀檢測。在所有的競爭試驗中，OVA都用作陰性競爭對照。數(shù)據(jù)從至少20，000例細胞中得到，以并排列表模式儲存，并用WinList處理程序(VSH公司，緬因州特普杉)分析。當使用WinList分析結果時，7-AAD陽性的細胞被排除出事件外。免疫沉淀取500 μ g細胞裂解物和4 μ g抗TLR4或抗TLR2在4攝氏度培養(yǎng)過夜進行免疫沉淀。添加25 μ L的蛋白G瓊脂糖(圣克魯斯生物技術公司)后，將裂解物繼續(xù)孵育4小吋。為了驗證有特異性蛋白質相互作用，使用山羊IgG(圣克魯斯生物技術公司)或小鼠IgG(圣克魯斯生物技術公司)作為陰性對照。珠子用裂解緩沖液清洗三次，用SDS-PAGE分離，用Prxl特異性的抗體進行免疫印跡。使用ECL系統(tǒng)(伯樂公司(Biorad))檢測蛋白質。Prxl/TLR4的共定位及NF κ B的易位如下進行共定位實驗將200nM FITC標記的Prxl和PE連接的抗TLR4加入含有TG誘出的巨噬細胞的培養(yǎng)基中，置于37攝氏度下，孵育指定的時間，然后轉移至冰上，固定并分析。免疫染色檢測NF κ B核易位的方法如下。來源于C3H/HeNCr (TLR4+/+)和C3H/HeNJCTLIM+)小鼠的TG誘出的巨噬細胞經(jīng)200nM Prxl處理。在37。C下孵育指定時間后，將細胞刮下并收集至試管中，用清洗緩沖液(含2%FBS的磷酸鹽緩沖鹽水)清洗兩遍，然后在常溫下的固定緩沖液(含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水)中固定10分鐘。清洗后，細胞用含10 μ g/ml抗NF B p65抗體(圣克魯斯生物技術公司)的Perm洗滌緩沖液(含
0.1%曲通X-100、3%FBS、0. 1%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖鹽水)于室溫下重新懸浮20分鐘。細胞再用Perm洗滌緩沖液進行清洗，并在室溫下于含7. 5 μ g/ml FITC接合的F(ab)2驢抗兔IgG的Perm洗漆緩沖液中重新懸浮15分鐘。細胞再用Perm洗漆緩沖液清洗兩次,于室溫下在含5μΜ DRAQ5核染劑(生物態(tài)公司，BioStatus)的1%的多聚甲醛中重新懸浮5分鐘。圖像分析用ImageStream 多光譜成像流式細胞儀(安尼斯公司，華盛頓州西雅圖)(AmnisCorp. , Seattle, WA)分析Prxl和TLR4的共定位和NF- κ B的核轉位。在姆種試驗條件下，至少獲得5000次事件,用IDEAS 軟件包分析相應的圖片。采用層級門控(hierarchicalgating)策略，使用基于圖像的物體對比度(梯度RMS)特征和面積對長寬比篩選在焦點中的單個細胞。分別使用Prxl和TLR4圖像或NF κ B和DRAQ5圖像的IDEAS*相似性特征測定各單獨細胞中的共定位和核易位，該相似性特征是對全細胞中空間相關像素強度的對數(shù)轉換的皮爾森相關系數(shù)。相似性得分是兩張圖像線性相關的程度的量度。電泳遷移率變動分析(EMSA)使用傳統(tǒng)技術進行EMSA。簡而言之,將10 μ g的核蛋白與Y-32P標記的雙鏈NF κ B寡核苷酸共孵育于 20 μ L含 IOmM HEPES (pH 7. 9)、80mM NaCl、10%甘油、ImM DTTUmM EDTA、100yg/mL聚(脫氧肌核酸一脫氧胞苷酸)的結合溶液中。DNA-蛋白質復合物在200V，4° C，非變性條件下在6%聚丙烯酰胺凝膠中解析2小吋。凝膠干燥后進行放射自顯影。統(tǒng)計學分析
為比較各實驗組，采用帶,爾奇校正(Welch’s correction)的標準化T測試進行統(tǒng)計分析，其中不假設方差相等。P值小于等于O. 05時認為差異有顯著性。實施例2本實施例提供對由實施例I中所描述的材料與方法所得結果的描述。Prxl激發(fā)DC和TG-巨噬細胞分泌細胞因子以及Prxl激發(fā)DC的成熟依賴于TLR4硫代こ醇酸鹽(TG)誘出的小鼠巨噬細胞用于評估Prxl激發(fā)細胞因子分泌的能力。通過分析腹腔滲出液細胞群的⑶llb、Grl和F4/80的表達鑒定巨噬細胞的表型。分離的細胞群中大于99%為^11ビ，在這些^11ド細胞群中大多數(shù)為61*1_、？4/80+(

圖1A)。用Prxl激發(fā)TG誘出的巨噬細胞導致該細胞劑量依賴地分泌TNF- α和IL-6，其分泌顯著高于所有濃度未激發(fā)細胞的分泌(P <0.01;圖IB)。Prxl與內毒素的滅活劑多粘菌素B—起預孵育對Prxl激發(fā)細胞因子的分泌沒有顯著影響(圖1C);相反，Prxl的變性顯著降低其激發(fā)細胞因子分泌的能力(Ρ〈0·01)。在無血清的條件下，與Prxl共孵育后對TG誘出的巨噬細胞分泌細胞因子的激發(fā)顯著降低(P彡0.01;圖1D);然而，即使在無血清的條件下，將Prxl與TG誘出的巨噬細胞共孵育也能顯著增高IL-6的分泌(P ^ O. 005，與在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞的分泌相比)。Prxl同樣能夠激發(fā)培養(yǎng)的樹突狀細胞系DCl. 2和鼠巨噬細胞系RAW264. 7分泌細胞因子(數(shù)據(jù)未顯示)。外源性的Prxl可以誘導未成熟的骨髓來源的樹突狀細胞(iBMDC)的成熟與活化。將iBMDC與濃度遞增的Prxl共培養(yǎng)24小時，檢測細胞表面共刺激分子的表達和TNF-α的分泌。在所有測試劑量下，添加Prxl導致細胞表面共刺激分子CD86的表達(圖2Α)和TNF-α的分泌(圖2Β)呈顯著的劑量依賴性增加(與對照相比P彡O. 01)。添加外源重組Prxl增強iBMDC和TG誘出的巨噬細胞分泌細胞因子可能是重組蛋白的現(xiàn)象，而無生理相關性。為了開始檢測Prxl是否能在生理條件下促進細胞因子的分泌，將TG誘出的巨噬細胞與收集自分泌Prxl的腫瘤細胞上清液或收集自表達Prxl特異性shRNA的基因工程化腫瘤細胞上清液共培養(yǎng)24小時。shRNA的表達導致Prxl而非Prx2的表達降低(圖8B)。將TG誘出的巨噬細胞與表達非特異性shRNA的基因工程化腫瘤細胞的上清液共培養(yǎng)將導致TNF-α表達的增強(Sc，圖2C;P彡O. 0001，與培養(yǎng)基組相比)。相反，將TG誘出的巨噬細胞與收集自Prxl表達水平降低的腫瘤細胞的上清液共培養(yǎng)使得分泌的TNF-α水平顯著降低(P彡O. 0001，與收獲自表達對照shRNA的細胞的上清液組相比；圖2C);向這些上清液中添加外源性的Prxl恢復TG誘出的巨噬細胞的TNF-α分泌(shPrxl+Prxl;P ( O. 003，與收獲自表達Prxl特異性shRNA的細胞的上清液組相比)。為了檢測Prxl激活iBMDC和TG誘出的巨噬細胞是否依賴于TLR4，從C57BL/6NCr (TLR4+/+)和 C57BL/10ScNJ(TLR4+)小鼠中分離得到 iBMDC 和 TG 誘出的巨噬細胞，用Prxl、LPS或Pam3Cys ( ー種TLR2激動劑)激發(fā)。結果提示Prxl、LPS和Pam3Cys激發(fā)從C57BL/6NCr小鼠中分離得到的iBMDC(圖3A)和巨噬細胞(圖3B)分泌細胞因子，但只有Pam3Cys激發(fā)從C57BL/10ScNJ小鼠中分離得到的iBMDC和巨噬細胞分泌細胞因子(P彡O. 01，與從C57BL/NCr小鼠中分離得到的細胞所分泌的細胞因子相比)。通過向C57BL/6NCr (TLR4+/+)或 C57BL/10ScNJ (TLR4+)小鼠腹腔注射重組 Prxl 來檢測Prxl誘導體內TLR4依賴性炎癥的能力。注射后2小時采集血樣，通過檢測全身IL-6的水平評估全身性炎癥的程度(圖3C)。注射Prxl導致C57BL/6NCr(TLR4+/+)小鼠的全身性IL-6水平顯著升高(P彡O. 0002)，但對C57BL/10ScNJ (TLR4+)小鼠的全身性IL-6水平 并沒有顯著影響。在無血清條件下，TG誘出的巨噬細胞與Prxl共培養(yǎng)后細胞因子表達減少(圖1D)，這提示血清蛋白可能有助于Prxl/TLR4的最優(yōu)化相互作用。很多的TLR4配體與TLR4相互作用時是作為ー個更大的復合物的一部分，其可包括⑶14和/或MD2。為了測定Prxl增強TG誘出的巨噬細胞分泌細胞因子是否涉及⑶14或MD2，在針對MD2、⑶14或對照IgG的封閉抗體存在的情況下，將細胞與Prxl或LPS共培養(yǎng)(圖4A)。與存在對照IgG時Prxl所誘導的相比，添加針對Prxl、⑶14或MD2的封閉抗體顯著抑制Prxl激發(fā)TG誘出的巨噬細胞分泌IL-6的能力(P彡O. 01)。針對⑶14和MD2的封閉抗體也阻斷LPS激發(fā)的細胞分泌細胞因子(圖8C)。為了進一步證實Prxl和TLR4/MD2/⑶14之間的相互作用，將TG誘出的巨噬細胞的裂解物與同種型的對照抗體或者TLR4或TLR2特異的抗體共培養(yǎng)(圖4B)。分離抗體復合物，用Prxl抗體進行免疫印跡；僅在用TLR4免疫沉淀的裂解物中發(fā)現(xiàn)Prxl (圖4B)。Prxl處理過的細胞中分離得到的TLR4/Prxl復合物也包含CD14和MD2 (圖4C)，確證了 Prxl與包含⑶14和MD2的復合物中的TLR4相互作用的這ー發(fā)現(xiàn)。使用成像流分析(imagestream analysis,安尼斯(Amnis))確定 Prxl 與 TLR4 相互作用的動力學，檢測這兩種分子的共定位。將TG誘出的巨噬細胞與FITC標記的Prxl和PE連接的抗TLR4抗體共培養(yǎng)。代表性的細胞的合并圖像表明Prxl和TLR4在5分鐘內共定位到巨噬細胞的膜上，30分鐘時TLR4和部分Prxl分子已內化(圖5A)。合并圖像右邊的柱狀圖是在逐像素基礎上，在5000例細胞上得到的FITC-Prxl和PE-抗-TLR4的相似性的統(tǒng)計分析。該分布右移說明有更大程度的相似性。每個時間點平均的相似系數(shù)顯示于圖5B中。在每個時間點上，Prxl和TLR4的染色都有高度的相似性(相似系數(shù)>1)，表明Prxl和TLR4共定位。這些結果證實Prxl和TLR4在細胞表面相互作用，并且至少部分Prxl隨TLR4內化。激發(fā)細胞因子的分泌以及與TLR4結合依賴于Prxl的結構Prxl既是過氧化物酶，也是蛋白質伴侶蛋白(Wood等(2003) Trends Biochem.Sci. 28:32-40)。為檢驗Prxl激發(fā)TG誘出的巨噬細胞分泌細胞因子的能力是否與其過氧化物酶的活性和/或伴侶蛋白的活性有夫，檢測兩種Prxl突變體。PrxlC52S突變體缺乏過氧化物酶的活性，但保留伴侶蛋白活性所需的十聚體結構；PrxlC83S主要以ニ聚體的形式存在，其伴侶蛋白的活性降低但保留完整的過氧化物酶活性。PrxlC52S激發(fā)TG誘出的巨噬細胞后的細胞因子分泌與用Prxl激發(fā)后觀察到的結果沒有顯著差異(圖6A);然而，PrxlC83S激發(fā)的TG誘出的巨噬細胞的細胞因子分泌顯著降低(P ( O. 01)。Prxl結合TG誘出的巨噬細胞依賴于TLR4的存在，因為在TLR4不存在的情況下，Prxl和無酶活性突變體(PrxlC52S)的結合顯著降低(圖6B)。PrxlC83S的結合無論在TLR4表達還是不表達的巨噬細胞上都是最小的，確證Prxl與TLR4的相互作用是非過氧化物酶依賴性的，但卻是結構依賴性的。采用飽和結合實驗(圖6C)和競爭分析(圖6D)測定Prxl結合到TG誘出的巨噬細胞表面的Kd與Ki值。Prxl結合到TG誘出的巨噬細胞的Kd值為1.6禮，1值為4. ImM (表I)。
Prxl激發(fā)細胞因子的分泌依賴于MyD88，并導致TLR4依賴的NF κ B的核易位配體介導的TLR4活化的后續(xù)下游信號傳導事件可能是MyD88依賴性或非MyD88依賴性的。用Prxl激發(fā)RAW264. 7細胞表達細胞因子，該細胞表達顯性陰性突變(DN)的MyD88蛋白。Prxl激發(fā)后的IL-6分泌依賴于MyD88的功能(圖7A)，表明Prxl激活了 MyD88信號傳導級聯(lián)，該級聯(lián)導致NF κ B的激活。為測定PrXI /TLR4的相互作用是否導致了 NF κ B的激活，分析從C3H/HeNCr和C3H/HeNJ小鼠中分離得到的巨噬細胞中Prxl激發(fā)后的NF κ B核易位。C3H/HeNJ小鼠的TLR4配體結合域中存在阻止配體結合的突變。將從C3H/HeNCr和C3H/HeNJ小鼠中得到的TG誘出的巨噬細胞在37 ° C下與200nM的PrxI共孵育指定的時間，轉移至冰上，與抗NF κ Bρ65的抗體共孵育；在用圖像流分析前15分鐘加入核染劑DRAQ5。Prxl在與從C3H/HeNCr小鼠中分離得到的巨噬細胞共培養(yǎng)的5分鐘內即可觸發(fā)NF κ B的易位，并且核定位直至60分鐘依然顯著(圖7B)。相反，Prxl與從C3H/HeNJ小鼠中分離得到的巨噬細胞共培養(yǎng)并不觸發(fā)NF κ B的易位(圖7B)。合并圖像右邊的柱狀圖顯示以逐像素為基礎的NF κ B與核染劑的相似性。Prxl激發(fā)導致NF κ B以TLR4依賴性方式易位至核，這已通過用Prxl激發(fā)C3H/H3NCr的TG誘出的巨噬細胞后所觀察到的正相似系數(shù)所證實，而用Prxl激發(fā)C3H/HeNJ的TG誘出的巨噬細胞后該相似系數(shù)降低(圖7C)。用EMSA法確證Prxl激活NF- κ B的能力，該法表明將巨噬細胞與Prxl共孵育導致NF κ B DNA結合活性呈現(xiàn)劑量依賴式的升高(圖7D)。本領域的技術人員會認識到前述的結果強有力地證明Prxl激發(fā)TG誘出的巨噬細胞和DC的TLR4依賴性TNF- α和IL-6分泌。細胞因子的分泌是TLR4激發(fā)MyD88依賴性信號傳導級聯(lián)的結果，并導致NF κ B的激活和易位。Prxl是ー種由腫瘤細胞和活化的T細胞所分泌的胞內蛋白。Prxl和TLR4相互作用并激發(fā)促炎細胞因子釋放的能力提示它還可能作為內源性的損傷相關分子模式分子(DAMP)。HSP72和HMGBl都被歸入內源性DAMP，這兩者均被顯示與TLR4相互作用。飽和與競爭性研究表明Prxl的Kd大約為I. SmMjKi大約為4. ImM ;由Binder等(Binder等，2000.J. Immunol. 165:2582-2587)提供的數(shù)據(jù)外推提示HSP72的Kd值介于2. 1-4. 4禮，1值介于10-21.8mM，這表明與HSP72相比，Prxl與TLR4有更強的相互作用。HMGBl的結合親和力尚不可得。TLR4鑒定為重組蛋白受體可能因重組蛋白制品中可能存在的LPS而變得復雜。為解釋在此呈現(xiàn)的結果中的這種可能性，在所有進行過的實驗中都包括兩組對照。在第一組對照中，在加至免疫細胞之前，重組蛋白先與多粘菌素B混合。多粘菌素B是ー種強效的LPS的滅活劑；重組的Prxl與多粘菌素B的預孵育對Prxl激發(fā)細胞因子表達的能力沒有影響(圖I)。然而，將LPS與相同濃度的多粘菌素B預孵育后顯著抑制LPS激發(fā)細胞因子釋放的能力。作為第二組對照，在加至免疫細胞之前，將Prxl和LPS煮沸，變性的Prxl顯著抑制其激發(fā)細胞因子釋放的能力，但煮沸對LPS激發(fā)細胞因子釋放的能力沒有影響。最后，本研究中用到的所有重組蛋白均以同樣制備方式得到，并且純化后都發(fā)現(xiàn)包含相同水平的內毒素(大約為14EU/ml)，盡管如此，PrxlC83S激發(fā)所分泌的細胞因子量顯著要低，且看來不與表達TLR4的細胞結合。因此，結果似乎證明Prxl與TLR4的相互作用與LPS污染的存在無關。Prxl、HSP72和HMGBl沒有顯示顯著的結構相似性，這些分子與LPS也并沒有顯示出同源性。Prxl、HSP72和HMGBl都是分子伴侶蛋白，并且HSP72/HMGB1和其它TLR4配 體之間不存在結構同源性，使得有人推測TLR4識別的不是伴侶蛋白本身而是伴侶蛋白運載物(cargo)。支持該假設的有最近的研究表明HMGBl結合至TLR9是TLR9識別HMGBl/DNA復合物的結果。胞外Prxl以十聚體的形式存在，該十聚體與Prxl的伴侶蛋白活性相關(Wood等，2002. Biochemistry 41:5493-5504，其內容通過引用納入本文)，而我們的研究表明Prxl與TLR4的結合依賴于它形成十聚體的能力(圖3和圖4B)。因此，Prxl與TLR4的結合可能是由于對運載物而不是Prxl本身的識別。盡管如此，預期本發(fā)明所述干擾Prxl結合TLR4的試劑會抑制血管發(fā)生。PrxlC83S突變體缺乏伴侶蛋白的活性，且主要以ニ聚體的形式存在(Wood等，2002. Biochemistry 41:5493-5504)，看來不結合TLR4 (圖4B);然而，這種純化的突變蛋白能激發(fā)巨噬細胞分泌細胞因子(圖4A)。慣例上，生物功能的檢測要比結合測試更敏感，因此ニ聚體形式的Prxl和TLR4的相互作用可能低于這些研究中所用的結合測試所能檢測到的水平。一小部分的PrxlC83S以四聚體的形式存在，這種四聚體也可能可以和TLR4相互作用，其水平低于可檢測到的水平，但足以激發(fā)細胞因子的分泌。Prxl激發(fā)細胞因子的分泌依賴于TLR4和MyD88(圖3、圖4和圖5);然而，F(xiàn)ITC標記的Prxl確實有結合到從TLR4+(B10SCNJ)小鼠中分離到的巨噬細胞上(圖4B)，盡管結合水平低于結合到從TLR4+/+(B6)小鼠中分離到的巨噬細胞上的水平。對Prxl和TLR4在細胞水平上的相互作用的檢測顯示盡管大多數(shù)的TLR4在Prxl結合后均被內化，至少有部分Prxl依然留在細胞表面上(圖3B/C)。這些發(fā)現(xiàn)可能是由于Prxl過量所致或者Prxl結合其它受體的結果。其它與TLR4結合的DAMP已顯示與多種危險受體相結合，并且在一些情況下，DAMP與TLR4的結合需要輔助受體。PbA是Prxl的瘧疾同源物，其需要MD2來與TLR4相結合；我們的研究表明，Prxl在有血清存在的情況下能最好地激發(fā)細胞因子的分泌，并且⑶14和MD2的抗體能阻斷受Prxl激發(fā)細胞分泌細胞因子。另外，TLR4和Prxl的免疫沉淀復合物中包含有MD2與⑶14，提示這些蛋白質有助于Prxl結合TLR4。實施例3我們測試了使用Prxl作為抗腫瘤疫苗的佐劑的效力。結果顯示于圖9中，證明Prxl增強抗腫瘤疫苗的效力。為得到圖9所示數(shù)據(jù)，對無處理小鼠用全細胞腫瘤裂解物進行單獨接種或者用全細胞腫瘤裂解物與20nM重組Prxl的混合物進行接種。休息一周后,通過注射活的腫瘤細胞攻擊小鼠。監(jiān)測腫瘤生長60天；姆組10只小鼠。如圖9所示，Prxl激發(fā)抗腫瘤疫苗抵御結腸26(Colon 26)腫瘤的效 力，該腫瘤是在小鼠中使用結腸26鼠結腸癌細胞誘發(fā)的。
權利要求
1.一種組合物，其包含抗原和分離的過氧化物氧化還原酶I(Prxl)蛋白。
2.如權利要求I所述的組合物，其特征在于，所述抗原是腫瘤抗原。
3.如權利要求I所述的組合物，其特征在于，所述Prxl蛋白和所述抗原以復合物的形式存在。
4.如權利要求I所述的組合物，其還包含抗原呈遞細胞。
5.如權利要求I所述的組合物，其特征在于，所述抗原呈遞細胞是樹突狀細胞、巨噬細胞或其組合。
6.如權利要求I所述的組合物，其特征在于，所述分離的Prxl蛋白以Prxl十聚體的形 式存在。
7.一種在個體中激發(fā)對抗原的免疫反應的方法，其包括給予所述個體包含所述抗原和分離的Prxl蛋白的組合物。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗原是腫瘤抗原。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述個體被診斷為患有癌癥或者疑似患有癌癥，其中所述癌癥的細胞表達所述抗原。
10.如權利要求7所述的方法,其特征在于,所述分離的Prxl蛋白以Prxl十聚體的形式存在。
11.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含抗原呈遞細胞。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述抗原呈遞細胞是樹突狀細胞、巨噬細胞或其組合。
全文摘要
本發(fā)明提供用于激發(fā)針對抗原的免疫反應的組合物和方法。該組合物包括抗原和分離的Prx1蛋白，該抗原激發(fā)所需要的免疫反應。Prx1蛋白作為佐劑起作用以使這種包含抗原與Prx1的組合物激發(fā)的對該抗原的免疫反應強于僅用該抗原激發(fā)的免疫反應。
文檔編號A61K38/44GK102834110SQ201080060971
公開日2012年12月19日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權日2009年12月8日
發(fā)明者S·O·戈爾尼克, J·里德爾 申請人:健康研究股份有限公司