專利名稱：雜合干擾素組合物及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有來自干擾素τ的一個或幾個區(qū)域以及來自其他干擾素的一個或幾個區(qū)域的雜合干擾素蛋白。
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背景技術：
各種哺乳動物的孕體膜或滋養(yǎng)外胚層產(chǎn)生生化信號以使妊娠得以建立和保持(Bazer等，1983)。此類蛋白的一種，羊滋養(yǎng)層蛋白-1(oTP-1)，曾被確定為懷孕10至12天的綿羊孕體分泌的一種低分子量蛋白(Wilson等，1979；Bazer等，1986),oTP-1蛋白顯示出可以抑制前列腺素F2-α的子宮分泌，導致卵巢的黃體化而使得未懷孕的山羊受到生理和內分泌損傷(Bazer等，1986)。因而，oPT-1蛋白具有抗黃體溶解的生物學活性。oTP-1的主要功能據(jù)推測與妊娠的建立相關。
oTP-1隨后被發(fā)現(xiàn)(ⅰ)呈現(xiàn)出與不同種的干擾素α(IFNα)具有一定的同源性(50％-70％)(Imakawa等，1987)，以及(ⅱ)與I型干擾素受體結合(Stewart等，1987)。除了有這些與IFNα相似之處，oPT-1還具有與IFN α相區(qū)別的特性，包括oTP-1在生殖生物化學上的功能(其他的干擾素還不知道在生殖周期的生物化學調控中具有任何的功能)，oTP-1的細胞來源-滋養(yǎng)外胚層細胞(IFNα則來自淋巴細胞)，oTP-1的大小-172個氨基酸(IFNα則一般為165-166個氨基酸)，以及oTP-1不易被病毒誘導(病毒對IFNα具有高的可誘導性)。國際干擾素學會把oTP-1編作一個完全的干擾素新類，稱作干擾素-τ(IFNτ)。這里的希臘字母τ代表滋養(yǎng)外胚層(trophoblast)。
干擾素被分為兩個明顯的組別Ⅰ型干擾素，包括IFNα,IFNβ和IFNω(也稱IFNαⅡ)；和Ⅱ型干擾素，其代表是IFNγ(DeMaeyer等綜述，1988)。人體中據(jù)估計有至少17個IFNα的非等位基因，至少2或3個的IFNβ的非等位基因，以及一個單個的IFNγ基因。
IFNα尤其可用于抗血液惡性腫瘤如毛狀細胞白血病(Quesada等，1984)。而且這些蛋白還表現(xiàn)出抗多骨髓瘤、慢性淋巴白血病、低級骨髓瘤、Kaposi腫瘤、慢性骨髓瘤白血病、腎細胞癌、泌尿膀胱腫瘤和卵巢癌(Bonnem等，1984；Oldham,1985)。干擾素以及干擾素受體在某些自身免疫和炎癥疾病的病理發(fā)生中的作用也有所研究(Benoit等，1993)。
IFNα還用于抗各種類型的病毒感染(Finter等，1991)。干擾素α在抗人乳頭瘤病毒、乙型肝炎、和丙型肝炎中表現(xiàn)出活性(Finter等，1991；Kashima等，1988；Dusheiko等，1986；Davis等，1989)。
但是顯然，IFNα的用途由于其毒性而具有局限性在治療癌癥和病毒性疾病中使用干擾素會導致嚴重的副作用，如發(fā)燒、發(fā)冷、厭食、體重下降和疲勞(Pontzer等，1991；Oldham,1985)。這些副作用常常導致(ⅱ)降低干擾素的劑量直到影響療效的程度，或者(ⅱ)停止對患者的治療。這些毒性減少了這類有效抗病毒和抗增殖的蛋白質在對衰弱的患者和動物治療上的應用。
本發(fā)明概述一方面，本發(fā)明包括編碼雜合干擾素融合多肽的核酸分子。每種這樣的分子是由編碼一個干擾素-τN末端氨基酸序列的5’端片段，和編碼一個非τ的Ⅰ型干擾素多肽的C末端氨基酸序列的3’端片段所構成。這兩個片段剪接的區(qū)域相當于成熟干擾素多肽的約第8至第37個殘基的部分。非τ-Ⅰ型干擾素多肽的例子包括干擾素α和干擾素β。在一個實施方案中，5’端還包括一個前導序列。
5’端片段編碼序列的例子包括那些選自下列一組的一個序列中所含有的序列SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:35,SEQ IDNO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52，和SEQ IDNO:53。尤其是SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:15，或SEQ ID NO:35。5’端片段也可以是編碼一個來自上述任何一個的共有序列，或者是一個內在的保守序列。優(yōu)選的實施方案為其序列來自人源的，如SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:35。
在不同的實施方案中，3’端片段可以編碼一個來自α1-干擾素、α2-干擾素、干擾素β或者ω-干擾素的氨基酸序列。3’端片段也可以編碼一個來自上述任何一個的共有序列，或者是一個內在的保守序列。優(yōu)選的實施方案為其序列來自人源的，如人的IFNα或者是人的IFNβ。
在一個一般性的實施方案中，這兩個片段接合的區(qū)域相當于成熟干擾素多肽的約第8至第28個殘基的部分。在另一個實施方案中，這兩個片段接合的區(qū)域相當于成熟干擾素多肽的約第8至第22個殘基的部分。而在又一個實施方案中，這兩個片段接合的區(qū)域相當于成熟干擾素多肽的約第8至第16個殘基的部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，這兩個片段接合于相當于成熟干擾素多肽的約第22個殘基的位置。
在其他的實施方案中，干擾素-τ多肽可以是人的或者是反芻動物的(如羊的)干擾素-τ多肽。而非干擾素-τⅠ型多肽也同樣可以是人的或非人源的Ⅰ型干擾素多肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，干擾素-τ多肽為一個羊干擾素-τ多肽，而非干擾素-τⅠ型多肽是一個人Ⅰ型干擾素多肽。
本發(fā)明的一個典型的嵌合核酸分子是SEQ ID NO:54，它具有編碼人干擾素-τ的第1-28位氨基酸(SEQ ID NO:3)的5’端片段，和編碼人IFNα的第29-167位氨基酸的3’端片段(克隆pIFN105；Genbank HUMIFNN Acc.M28585)。
上述的任何一個嵌合分子可以進一步包括一個前導序列。
在一個相關方面，本發(fā)明包括一個雜合干擾素融合多肽，它由含有干擾素τ的N-末端氨基酸序列的第一個片段，和含有一個非τ的干擾素Ⅰ型多肽的C-末端氨基酸序列的第二個片段所構成。兩個片段連接于成熟干擾素多肽的約第8至第37個殘基的區(qū)域。上面所述的為該嵌合分子的特別實施方案。干擾素α和干擾素β為此類非τ-Ⅰ型干擾素的例子。在將干擾素用于藥物成分或治療應用時，這類雜合融合蛋白可以降低非τⅠ型干擾素的毒性。
在不同的實施方案中，此第一個片段可以具有選自下列一組的序列中所含的氨基酸序列SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:15,SEQ IDNO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52，和SEQ IDNO:53。優(yōu)選的實施方案中其序列來自人的干擾素-τ序列，如SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:35。
在一個一般性的實施方案中，這兩個片段接合于成熟干擾素多肽的約第8至第28個殘基的區(qū)域。在另一個實施方案中，它們接合于成熟干擾素多肽的約第8至第22個殘基的區(qū)域。而在又一個實施方案中，它們接合于成熟干擾素多肽的約第8至第16個殘基的區(qū)域。
另一方面，本發(fā)明包括一個表達載體，其具有的核酸序列含有一個編碼雜合干擾素融合多肽的開放閱讀框(ORF)，包括上述的核酸和多肽序列。該載體還包括調控序列，以有效地在一個宿主細胞中表達此開放閱讀框此序列可以是內源性的(如通常存在的IFN前導序列)，或者是異源性的(如在酵母，哺乳動物細胞，昆蟲細胞，組織培養(yǎng)物或細菌表達系統(tǒng)中被識別的分泌信號)。在此表達載體上，調控序列還可包括，在所說的核酸序列的5’端的一個啟動子區(qū)域和一個與雜合干擾素融合多肽的編碼序列(嵌合核酸分子)同閱讀框的一個ATG起始密碼子，在所說編碼序列的3’端，有一個翻譯終止信號及其后的一個轉錄終止信號。進而，本發(fā)明還包括利用本發(fā)明的表達載體重組產(chǎn)生雜合干擾素融合多肽的方法。該表達載體引入合適的宿主細胞，此宿主細胞然后在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)，從而表達該ORF序列。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明包括一種重組產(chǎn)生雜合干擾素融合多肽的方法。在該方法中，含有編碼雜合干擾素融合多肽開放閱讀框(ORF)的序列的表達載體被引入合適的宿主細胞中，在該宿主細胞中載體可以如期表達此ORF。然后，將轉化的宿主細胞在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)，從而表達該ORF序列。大量的載體和與其相應的宿主可以用于本發(fā)明的這個方法的實驗中，包括，λgtll噬菌體載體和大腸桿菌細胞。其他的宿主包括，酵母，哺乳動物細胞，昆蟲細胞，組織培養(yǎng)物，植物細胞培養(yǎng)物，轉基因植物或細菌表達系統(tǒng)。
本發(fā)明進而包括抑制腫瘤細胞生長的方法。在此方法中，腫瘤細胞與雜合干擾素融合多肽以可有效抑制腫瘤細胞生長的濃度相接觸。該雜合干擾素融合多肽可以是任何可行的藥物制劑中的一部分?？梢员浑s合干擾素融合多肽抑制生長的腫瘤細胞包括，但并不限于，癌細胞，造血癌細胞，白血病細胞，淋巴瘤細胞，和黑色素瘤細胞。在一個實施方案中，腫瘤細胞為類固醇敏感的腫瘤細胞，例如，乳房瘤細胞。
在本發(fā)明的另一個方面，雜合干擾素融合多肽用于抑制病毒復制的方法中。在此方法中，感染病毒的細胞與雜合干擾素融合多肽以可有效抑制其中病毒的復制的濃度相接觸。該雜合干擾素融合多肽可以是任何可行的藥物制劑中的一部分。RNA和DNA病毒的復制都可以被雜合干擾素融合多肽所抑制，典型的RNA病毒包括貓白血病病毒，羊進行性肺炎病毒，羊慢病毒，馬感染性貧血癥，牛免疫缺損病毒，維斯納-梅迪病毒，山羊關節(jié)炎腦炎病毒，人免疫缺損病毒(HIV)或者丙型肝炎病毒(HCV)。典型的DNA病毒為乙型肝炎病毒。
在另一方面，本發(fā)明包括一種在需要此類治療的患者中治療自身免疫疾病的方法。在一個實施方案中，自身免疫疾病為多樣硬化癥。該方法包括對患者施用藥物有效量的雜合干擾素融合多肽。該雜合干擾素(hybIFN)可以通過例如口服或者通過靜脈或肌肉注射而施用?？诜┯胔ybIFN為優(yōu)選的患者攝入方法。
本發(fā)明的其他實施方案包括在需要此類治療的患者中治療紅斑狼瘡，Ⅰ型糖尿病，和風濕性關節(jié)炎的方法。該方法包括對患者施用藥物有效量的本發(fā)明的雜合干擾素融合多肽。
結合所附附圖閱讀下面的本發(fā)明的詳細描述，將能夠更為全面地對本發(fā)明的這些以及其它的目的和特征加以理解。
附圖的簡要描述

圖1A,1B,1C,1D和1E表示了OvIFNτ的合成基因的核苷酸編碼序列，其設計包括19個平均分布于編碼序列的單一限制酶位點。
圖2表示產(chǎn)生編碼OvIFNτ的合成基因的克隆策略。
圖3示出人干擾素τ基因與羊干擾素τ基因的預測蛋白序列的比較。通過核酸序列下面列出的變化的氨基酸對趨異進化的氨基酸進行了標記。
圖4提供的數(shù)據(jù)顯示OvIFNτ和IFNα都能夠降低HL-60細胞的生長。
圖5提供的數(shù)據(jù)顯示rHu IFNα具有細胞毒性，而OvIFNτ沒有。圖中三次重復實驗的一次結果以平均％存活±SD表示。
圖6表示衍生自IFNτ序列的多肽序列。
圖7提供了一個OvIFNτ序列的完整的核苷酸和氨基酸序列。
圖8提供的數(shù)據(jù)體現(xiàn)了當將IFNτ用于處理外周血單核細胞時，相對于IFNα，其不具有細胞毒性。
圖9表示了用IFNτ處理人皮膚T細胞淋巴瘤細胞系HUT的結果。
圖10表示用IFNτ處理人T細胞淋巴瘤細胞系H9的結果。
圖11A提供的數(shù)據(jù)為衍生自OvIFNτ的多肽參照與全OvIFNτ對FIV(貓免疫缺損病毒)復制的肽抑制。圖11B提供的數(shù)據(jù)為衍生自OvIFNτ的多肽參照與全OvIFNτ對HIV(人免疫缺損病毒)復制的肽抑制。
圖12提供的數(shù)據(jù)顯示IFNτ衍生肽對IFNτ抗病毒活性的抑制作用。
圖13提供的數(shù)據(jù)顯示IENτ-衍生肽對OvIFN抗病毒活性的抑制作用。
圖14提供的數(shù)據(jù)顯示IFNτ-衍生肽對牛IFNα的抗病毒活性的抑制作用。
圖15提供的數(shù)據(jù)顯示IFNτ-衍生肽對人IFNα抗病毒活性的抑制作用。
圖16提供的數(shù)據(jù)顯示了IFNτ-衍生肽對牛IFNγ抗病毒活性缺乏抑制作用。
圖17提供的數(shù)據(jù)顯示了抗-IFNτ-衍生肽的抗血清對IFNτ抗病毒活性抑制作用。
圖18提供的數(shù)據(jù)顯示了抗-IFNτ-衍生肽的抗血清對放射性標記的IFNτ與細胞的結合的抑制作用。
圖19A和19B提供了編碼IFNτ多肽的核酸序列的對比。
圖20A和20B提供了IFNτ多肽的氨基酸序列的對比。
圖21提供的數(shù)據(jù)比較了IFNτ和IFNβ的細胞毒性。
圖22A和22B表示IFNαA(圖22A)和IFNτ(圖22B)對MDBK細胞的細胞毒性情況。
圖23A和23B表示IFNτ對IFNαA在MDBK細胞中細胞毒性的影響。
圖24A和243表示125I-IFNτ(圖24A)和125I-IFNαA(圖24B)與MDBK細胞的結合，以及結合數(shù)據(jù)的Scatchard圖。
圖25A和25B表示IFNτ(圖25A)和IFNαA(圖25B)與MDBK細胞的競爭結合。
圖26表示由針對IFNτ的N末端(實心柱)和C末端(斜紋柱)產(chǎn)生的抗血清相對于免疫前處理的對照(空心柱)對IFNτ和IFNαA與MDBK細胞結合的抑制。
圖27A和27B表示IFNτ(圖27A)和IFNαA(圖27B)在MDBK細胞中最大抗病毒活性百分比(○)，細胞毒性(□)，和結合(◇)的劑量-應答/占據(jù)曲線。
圖28示出雜合干擾素融合多肽的示意圖。
序列的簡要描述SEQ ID NO:1為一個編碼羊干擾素τ(OvIFNτ)的合成基因的核苷酸序列。也表示了編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2為一個成熟的OvIFNτ蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3為一個編碼人干擾素τ(HuIFNτ)的合成基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4為一個成熟的HuIFNτ蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5為SEQ ID NO:2的1-37片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6為SEQ ID NO:2的34-64片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7為SEQ ID NO:2的62-92片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8為SEQ ID NO:2的90-122片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9為SEQ ID NO:2的119-150片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10為SEQ ID NO:2的139-172片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11為一個帶有一個前導序列的成熟的HuIFNτ1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12為SEQ ID NO:11預測的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:13為一個根據(jù)本發(fā)明而設計的25mer的合成的寡核苷酸。
SEQ ID NO:14為一個根據(jù)本發(fā)明而設計的25mer的合成的寡核苷酸。
SEQ ID NO:15為SEQ ID NO:4的1-37片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16為SEQ ID NO:4的34-64片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17為SEQ ID NO:4的62-92片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18為SEQ ID NO:4的90-122片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19為SEQ ID NO:4的119-150片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20為SEQ ID NO:4的139-172片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21為cDNAHuIFNτ6的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22為由SEQ ID NO:21所表示序列而預測的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:23為cDNA HuIFNτ7的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24為由SEQ ID NO:23所表示序列而預測的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:25為cDNAHuIFNτ4的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26為由SEQ ID NO:25所表示序列而預測的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:27為cDNA HuIFNτ5的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28為由SEQ ID NO:27所表示序列而預測的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:29為基因組DNA克隆HuIFNτ2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30為由SEQ ID NO:29所表示序列而預測的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:31為包括前導序列的基因組DNA克隆HuIFNτ3(一個天然的HuIFNτ基因)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:32為由SEQ ID NO:31所表示序列而預測的氨基酸編碼序列(包括前導序列)。
SEQ ID NO:33為不包括前導序列的基因組DNA克隆HuIFNτ3(一個天然的HuIFNτ基因)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:34為由成熟的HuIFNτ3所編碼的，SEQ ID NO:33所表示序列所編碼的成熟人IFNτ蛋白的預測的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35為SEQ ID NO:33的1-37片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36為SEQ ID NO:33的34-64片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37為SEQ ID NO:33的62-92片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38為SEQ ID NO:33的90-122片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39為SEQ ID NO:33的119-150片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40為SEQ ID NO:33的139-172片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41為SEQ ID NO:32的1-23片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42為SEQ ID NO:11的1-23片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43為不包括前導序列的DNA克隆HuIFNτ1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:44為由HuIFNτ1所編碼的，SEQ ID NO:43所表示序列所編碼的，成熟人IFNτ蛋白的預測的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45為來自序列A4068(Bin 12,Accession #gi108955)1-37片段(成熟序列)的預測的氨基酸序列，它編碼牛TP-1(克隆bTP509)。
SEQ ID NO:46為來自序列BovTPH1Bcdsl(Bin 13,Accession#gi 163767)1-37片段(成熟序列)的預測的氨基酸序列，它編碼牛TP-1。
SEQ ID NO:47為來自序列BovTPH1Ccdsl(Bin 14,Accession#gi 163769)1-37片段(成熟序列)的預測的氨基酸序列，它編碼牛TP-1。
SEQ ID NO:48為來自序列A39505(Bin 15,Accession #gi163769)1-37片段(成熟序列)的預測的氨基酸序列，它編碼牛TP-1(克隆bTP4)。
SEQ ID NO:49為來自序列OATP5cdsl(Bin 16,Accession #gi1412)1-37片段(成熟序列)的預測的氨基酸序列，它編碼羊TPp5。
SEQ ID NO:50為來自序列OATP3cdsl(Bin 17,Accession #gi1410)1-37片段(成熟序列)的預測的氨基酸序列，它編碼羊TPp3。
SEQ ID NO:51為來自序列SHP010TPcdsl(Bin 18,Accession #gi165821)1-37片段(成熟序列)的預測的氨基酸序列，它編碼羊TP-1。
SEQ ID NO:52為來自序列SHP02TPcdsl(Bin 19,Accession #gi165823)1-37片段(成熟序列)的預測的氨基酸序列，它編碼羊TP-1。
SEQ ID NO:53為來自序列GOTCTPcdsl(Bin 21,Accession #gi164117)1-37片段(成熟序列)的預測的氨基酸序列，它編碼Caprahircus的IFNτ。
SEQ ID NO:54為衍生自人DNA的嵌合核酸序列，它帶有編碼人IFNτ(來自SEQ ID NO:3)1-28位氨基酸的5’端片段，和編碼人IFNα(克隆pIFN105；Genbank HUMIFNN Acc.M28585)29-167位氨基酸的3’端片段。
SEQ ID NO:55為由SEQ ID NO:54所示序列所編碼的預測的氨基酸序列。
本發(fā)明的詳細描述Ⅰ．定義干擾素τ(IFNτ)是指任何一個與(a)SEQ ID NO:2或(b)SEQID NO:34序列之一具有大于70％，或者優(yōu)選地大于80％，或者更為優(yōu)選地大于90％的氨基酸同源性的蛋白家族成員。氨基酸同源性的測定可以使用，例如，省缺參數(shù)LALIGN程序。該程序可在FASTA1.7版的序列比較程序套件(Pearson和Lipman 1988；Pearson,1990；程序可從William R.Pearson,Department of Biological Chemistry,Box440,Jordan Hall,Charlottesville,VA處獲得)中找到。典型地，IFNτ具有下列一組特征中的至少一個特征(a)在胚胎/嬰兒期由滋養(yǎng)外胚層表達，(b)抗黃體屬性，(c)抗病毒屬性，和(d)抗細胞增殖屬性。IFNτ可以從許多來源包括牛，綿羊，和人中獲得。
干擾素τ多肽是一種具有衍生自干擾素τ氨基酸編碼序列的約15至172個氨基酸的多肽，其中所說的15至172個氨基酸在天然的干擾素τ中是連續(xù)的。這15-172個氨基酸區(qū)域也可以裝配于這樣的多肽中，其中兩個或多個的干擾素τ區(qū)域相連接而它們在天然的蛋白中是不連續(xù)的。
一個多肽序列或片段“衍生自”另一個多肽序列或片段是指，它含有和存在于所衍生自的序列或片段中相同的的氨基酸序列。例如，如果一個細菌質粒中的插入片段的多肽序列與特定的人基因的多肽序列相同，那么該質粒含有一個“衍生自”特定的人基因的插入片段。
同樣，當一個多肽序列或片段含有和存在于它所衍生的序列或片段相同的氨基酸序列時，其“衍生自”另一個的多肽序列或片段。
用于兩個氨基酸序列間的相同性百分比(％)是指，在對兩個序列進行優(yōu)化比較且無罰分賦值到“缺口”處時，兩個序列之間相同殘基的百分比。就是說，如果需要在第一個序列中插入一個缺口而將其與第二個序列進行優(yōu)化比較，那么相同性百分比則只通過對那些和相應氨基酸殘基配對的殘基進行計算(即計算不考慮第二個人序列上處在第一個序列的“缺口”處的殘基。)優(yōu)化比較的定義是該比較可給出最高的相同性百分比數(shù)值。這種比較可以通過“GENEWORKS”程序進行。也可以利用局部比較程序LALIGN，以ktupl，缺省參數(shù)和缺省PAM來進行比較。
治療一種疾病是指施用一種治療性物質以有效減輕該病的癥狀和/或降低該病的嚴重程度。
Ⅱ．干擾素τ的分離與鑒定A．羊和牛的干擾素τ1．干擾素τ的編碼序列羊干擾素τ(OvIFNτ)是在綿羊母體識別的關鍵時期，由胚胎滋養(yǎng)外胚層產(chǎn)生的一種主要的孕體分泌蛋白。一個成熟的OvIFNτ分離物長172個氨基酸(SEQ ID NO:2)。其cDNA編碼序列包括在成熟蛋白的氨基端有額外的23個氨基酸(Imakawa,1987)，該OvIFNτ分離物的編碼序列如圖7中所示。
相對于其他的干擾素而言，OvIFNτ與干擾素α具有45％至68％的氨基酸同源性，并且與ω-干擾素(IFNωs)具有最大的相似性，約為68％。
為了分離OvIFNτ蛋白，從懷孕綿羊中搜集孕體，并在前面所述的修正的最低基本培養(yǎng)基(Godkin等，1982)中體外培養(yǎng)。收集懷孕天數(shù)不同的孕體，交配的第一天記作第0天?；景凑誚allet等(1987)和Godkin(1982)的方法從孕體培養(yǎng)物培養(yǎng)基中純化OvIFNτ。
OvIFNτ的均質性通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE；Maniatis等，1982；Ausubel等，1988)來檢測。純化的OvIFNτ的蛋白濃度通過二金雞寧試驗(BCA)(Pierce ChemicalCo.Rockford,IL；Smith,P.K.，等，1985)來確定。
與OvIFNτ同源的蛋白從牛中得到了分離(BoIFNτ；Helmer等，1987；Imakawa,1989)。OvIFNτ和BoIFNτ(ⅰ)在妊娠的母體識別中具有相同的功能，且(ⅱ)在成熟蛋白中的氨基酸序列上具有高度的同源性。OvIFNτ和BoIFNτ的核酸序列同源性在5’非編碼區(qū)為76.3％，在編碼區(qū)為89.7％，在3’非編碼區(qū)為91.9％。氨基酸的同源性為80.4％。
實施例1描述了OvIFNτ的生殖功能。OvIFNτ和重組人干擾素α2(rHuIFNα)以不同的濃度注入到母羊的子宮內腔中。通過測試發(fā)情間隔，孕酮分泌的保持和前列腺素分泌的抑制來檢測黃體的生命周期，對這些測試結果數(shù)據(jù)的比較表明，當以100μg/天施用OvIFNτ時發(fā)情間隔明顯延長，而施用rHuIFNα則無有意義的效果。這些數(shù)據(jù)支持OvIFNτ顯著影響性欲周期中的生化事件的結論。
對在生殖周期的不同階段干擾素τ的抗病毒特性也進行了測試(實施例2)。以16天發(fā)情周期的第12天的綿羊中得到的孕體建立孕體培養(yǎng)物。測試了每個孕體培養(yǎng)物上清中的抗病毒活性。培養(yǎng)物上清中具有的抗病毒活性，隨著孕體的進一步發(fā)育不斷增高，一直到第16天的后發(fā)情期。
2．IFNτ的重組產(chǎn)生重組OvIFNτ利用細菌和酵母細胞產(chǎn)生。從OvIFNτ的氨基酸編碼序列中得出相應的DNA編碼序列，為在E.coli中表達(實施例3)而使用偏愛的密碼子。該DNA編碼序列通過相繼添加寡核苷酸而合成構建。克隆的寡核苷酸如圖2中所列，利用限制消化和連接而融合進入一個多核苷酸中。該多核苷酸編碼序列具有如SEQ IDNO:1所示的序列。
為了表達重組干擾素多肽，例如合成的OvIFNτ或者本發(fā)明的雜合干擾素融合多肽，可將嵌合編碼序列置于各種細菌表達載體中例如，λgtll(Promega,Madison WI)；pGEX(Smith,D.B.等，1988)；pGEMEX(Promega)；和pBS(Strategene,La Jolla CA)載體。也可以使用其他的含有合適的啟動子，如T7RNA聚合酶啟動子或者tac啟動子的細菌表達載體。實施例3描述了將合成的OvIFNτ多核苷酸克隆入一個經(jīng)修改的pIN Ⅲ omp-A表達載體中。通過加入IPTG誘導產(chǎn)生OvIFNτ蛋白。可溶性的重組IFNτ通過超聲波或滲透分餾而從細胞中釋放出來。
該蛋白可通過標準方法進一步純化，包括大小分級分離(柱層析或預凝膠電泳)或者使用例如抗干擾素抗體(固相載體可從Pharmacia,Piscataway NJ獲得)的親和層析。蛋白制備物可以通過例如超濾(Amicon,Danvers,Mass)進行濃縮。
合成的OvIFNτ基因也可以克隆到酵母克隆載體pBS24Ub中(實施例4；Sabin等，1989；Ecker等，1989)。構建合成的接頭子以使OvIFNτ的編碼序列與載體上的蛋白質編碼序列處于同一閱讀框。形成的連接可使得遍在蛋白質序列與OvIFNτ序列能夠在體內剪切開。
重組質粒pBS24Ub-IFNτ轉化入啤酒酵母中。轉化的酵母細胞經(jīng)培養(yǎng)，裂解并將重組IFNτ(r-IFNτ)蛋白從細胞裂解物中分離。
r-IFNτ的量通過放射性免疫試劑定量。進行純化的r-IFNτ的微量測序，結果顯示與天然的OvIFNτ的前15個氨基酸相同。結果也證實遍在蛋白/IFNτ融合蛋白在體內經(jīng)過了正確的加工。
通過此方法獲得的重組IFNτ所表現(xiàn)的抗病毒活性與從孕體條件培養(yǎng)物培養(yǎng)基中純化的IFNτ的抗病毒活性相似。
其他的酵母載體也可以用于本發(fā)明的實踐中。它們包括2微米質粒載體(Ludwig等，1993)，酵母整合質粒(如Yips；Shaw等，1988)，YEP載體(Shen等，1986)，酵母著絲粒質粒(如Ycps Ernst,1986)，等等。優(yōu)選地，載體包括一個表達盒，它含有有效的酵母啟動子，如MFα1啟動子(Emst,1986；Bayne等，1988),GADPH啟動子(甘油醛-3-磷酸脫氫酶；Wu等，1991)，半乳糖-誘導型GAL10啟動子(Ludwig等，1993；Feher等，1989；Shen等，1986)，或者甲醇調控的乙醇氧化酶(AOX)動子。AOX啟動子在巴斯德畢赤氏酵母宿主細胞中尤為有用(例如，AOX啟動子用于可從Invitrogen,SanDiego,CA獲得的畢赤氏酵母表達試劑盒內的pHIL和pPIC載體中)。
該表達盒中也可以包括其他的元件，以助于重組蛋白的表達和純化，并/或助于將該表達盒插入酵母的染色體上。例如，元件盒中可包括一個信號序列以指導蛋白的分泌。一個適用于各種酵母表達載體的典型的信號序列為MFα1前原信號序列(Bayne等，1988；Ludwig等，1993；Shaw等，1988)。其他的信號序列也可以使用，例如，Phol信號序列(Elliot等，1986) 在巴斯德畢赤氏酵母和粟酒裂殖糖酵母宿主細胞中尤為有效。
典型的表達盒包括(ⅰ)一個含有(5’到3’)AOX啟動子，Phol信號序列，和編碼OvIFNτ的DNA序列的元件盒，和(ⅱ)用于在啤酒糖酵母宿主細胞中表達的一個含有(5’到3’)MFα1啟動子，MFα1前原信號序列，和編碼本發(fā)明的干擾素組合物的DNA序列的元件盒。
另外的可適用于本發(fā)明的酵母載體包括，但不局限于，其他的可調控表達的載體(Hitzeman等，1988；Rutter等，1988；Oeda等，1988)。典型的酵母轉化宿主為啤酒裂殖糖酵母，但是，如上所述，其他的可適用于本發(fā)明的酵母也可使用(如，粟酒裂殖糖酵母，巴斯德畢赤氏酵母等等)。
編碼這種干擾素多肽的DNA序列可以克隆到任何一種商業(yè)可得的載體上，而在適當?shù)乃拗飨到y(tǒng)中得到該多肽的表達。這些系統(tǒng)包括上述的細菌和酵母表達系統(tǒng)，同樣也包括下列桿狀病毒表達(Reilly等，1992；Beames等，1991；Clontech,Palo Alto CA)，植物細胞表達，轉基因植物表達(如，S.B.Gelvin和R.A.Schilperoot,PlantMolecular Biology,1988)，和哺乳動物細胞中的表達(Clontech,PaloAlto CA；Gibco-BRL,Gaithersburg MD)。這些重組多肽可以作為融合蛋白或作為天然蛋白表達。一些特性可以被引入載體中，例如能促使表達序列分泌到培養(yǎng)基中的前導序列。重組產(chǎn)生的多肽典型地可以從裂解的細胞或培養(yǎng)基中分離。純化可按照本領域所熟知的方法進行，包括分子篩，離子交換層析，和親和層析?？砂凑杖缟纤?，利用基于IFN多肽產(chǎn)生的抗體應用免疫親和層析。
B．人干擾素τ1．編碼干擾素τ蛋白的人基因組序列的鑒定和克隆。
對人基因組DNA掃描與干擾素τ的同源序列(實施例5)。確定出幾個與OvIFNτ cDNA探針雜交的序列。然后分離出含有部分人干擾素τ序列的克隆(實施例6)。合成了兩個相應于OvIFNτ的cDNA序列(Imakawa等，1987；Whaley等，1994)的25-mer寡核苷酸。這些引物用于擴增反應，其中所用的DNA來自下列兩個cDNA文庫從足期胚胎分離的人胎盤和細胞滋養(yǎng)層細胞。所得到的擴增的DNA片段經(jīng)電泳分離，并分離出來含有人IFNτ擴增產(chǎn)物的條帶。擴增產(chǎn)物進行亞克隆，插入的擴增產(chǎn)物通過雙脫氧終止法測序。
對來自五個這樣的克隆的序列的比較表明，雖然這些分離物間存在高度的序列同源，但是序列并不完全一致。該結果提示人干擾素τ基因多重變異的存在。對這些核苷酸和蛋白質序列的分析提示，根據(jù)序列同源性人干擾素τ基因可至少分成三個組。這些組如下面所示。
實施例7描述了幾種全長人IFNτ基因的分離。高分子量DNA經(jīng)分子篩分離自人外周血單核細胞(PBMCs)。通過聚合酶鏈反應檢測分離組份中IFNτ的存在檢測出擴增陽性的組份中得到DNA分子用作制備一個λgtll的亞基因組文庫。
該亞基因組文庫鋪板并與OvIFNτ的cDNA探針雜交(實施例7A)。檢出大約20個與該探針雜交上的克隆。相應于陽性克隆的噬斑進行了傳代，通過利用OvIFNτ引物的擴增反應分離并分析DNA。這二十個噬斑中，有六個產(chǎn)生出陽性信號。這六個克隆的噬菌體被純化，插入子被測序。來自這六個克隆的一個插入子用作下面掃描的雜交探針。
利用剛才所述的雜交探針對來自該λgtll亞克隆的重組噬菌體進行掃描(實施例7B)。分離到五個顯示出陽性雜交信號的克隆，對插入子測序。這些克隆的三個序列相重疊，得到的共有核酸序列(HuIFNτ1)如SEQ ID NO:11所示，其預測的蛋白質編碼序列如SEQ ID NO:12所示。預測的成熟蛋白編碼序列如SEQ ID NO:4所示。來自另外兩個克隆的序列如SEQ ID NO:29(HuIFNτ2)和SEQ ID NO:31(HuIFNτ3)所示。預測的來自HuIFNτ3的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，而成熟的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
對一個人干擾素τ基因(SEQ ID NO:4)與羊干擾素τ基因的預測蛋白序列的比較(圖3)顯示出在氨基酸水平上的序列同源性。
本文描述的(實施例6和7)7個人干擾素τ核酸序列與羊干擾素τ的核酸序列的排列比較如圖19A和19B所示。OvIFNτ(oIFNτ),HuIFNτ1,HuIFNτ2和HuIFNτ3的序列從圖19A的左上角開始，以ATG密碼子為起始，一直到該圖的第二頁。HuIFNτ4,HuIFNτ5,HuIFNτ6和HuIFNτ7的序列在圖19A約中途部分，于氨基酸位置40的CAG(嘆號的右側)開始，直到該圖的第二頁。HuIFNτ4,HuIFNτ5,HuIFNτ6和HuIFNτ7每個克隆的3’和5’末端以嘆號標記。
完整的OvIFNτ編碼序列列于每組排列比較的頂行。其他序列的核苷酸只有在與OvIFNτ的核苷酸不相同的位置上才標出。小寫字母代表不會導致氨基酸變化的核苷酸，大寫字母代表導致氨基酸替換的核苷酸。
按照與上述基本相同的方法構建的這7個相應的氨基酸序列的一個排列比較如圖20A和20B所示。同上，完整的OvIFNτ編碼序列列于每組排列比較的頂行。其他序列的氨基酸只有在與OvIFNτ的不相同的位置上才標出。
對排列比較的檢測揭示這7個序列可分成至少三個組別。組Ⅰ含有HuIFNτ1和HuIFNτ2，組Ⅱ含有HuIFNτ3,HuIFNτ4和HuIFNτ5，而組Ⅲ含有HuIFNτ6和HuIFNτ7。這些組代表了具有不同細胞功能的干擾素τ基因家族。
分組的建立基于下列標準。在成熟的蛋白中，組Ⅰ的HuIFNτ的第95位氨基酸(編號參考圖20A至20B)為天冬酰銨(ASN)，第104位氨基酸為甲硫氨酸(MET)及第120位氨基酸為亮氨酸(LEU)。組Ⅱ的HuIFNτ的第95位氨基酸為天冬氨酸(ASP)，第104位氨基酸為蘇氨酸(THR)及第120位氨基酸為甲硫氨酸(MET)。組Ⅲ的HuIFNτ的第72位氨基酸為精氨酸(ARG)，第120位氨基酸為纈氨酸(VAL)及第122位氨基酸為絲氨酸(SER)。
人IFNτ核酸序列和多肽序列如下所示SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:12,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34。它們可以作為特異引物和探針的來源，用于以后的人IFNτ編碼序列和/或假基因分離物的檢測。而且，如上所述，每個物種中可能有一個以上的IFNτ蛋白的異構型和一個以上的編碼序列。本發(fā)明實踐中所用的特異核酸探針以及與多肽反應的抗體，可按照本發(fā)明在此公開的方法，用于分離哺乳動物中尚未鑒定的干擾素τ變異體。
2．人組織中干擾素τ表達的鑒定人胎盤cDNA文庫和羊cDNA文庫通過與OvIFNτcDNA探針(實施例8)雜交進行分析。該DNA雜交分析提示，來自人cDNA文庫的IFNτ信號約為來自羊cDNA文庫的信號的1/100。OvIFNτcDNA占羊cDNA文庫的約0.4％。所以，人cDNA對OvIFNτ探針的豐度顯得很低，至少對于產(chǎn)生該cDNA文庫的胎盤來說。
還分析了人胎盤和羊膜中HuIFNτmRNA的存在。結果提示在胎兒胎盤附件中存在HuIFNτmRNA。羊膜細胞也表達與OvIFNτ引物和人探針相關的信息，說明HuIFNτmRNA的表達并不限于胎盤。
通過原位雜交檢測了人組織中干擾素τ的表達(實施例9)。檢測了4個健康的，不同足月的和頭三月的人胎盤的分泌。分析中使用了一個衍生自OvIFNτcDNA序列的cDNA探針(實施例9B)。用一個反義RNA探針進行雜交。在三個獨立的實驗中，所有足月的和頭三月的胎盤組織都呈現(xiàn)出特異雜交。
頭三月胎盤絨毛(由外層的合胞滋養(yǎng)層，底層的細胞滋養(yǎng)層，以及含有各種間充質的中央基質區(qū)組成)在其細胞滋養(yǎng)層和基質細胞中都表現(xiàn)出最高的表達水平。相類似的轉錄表達類型也顯現(xiàn)在足月組織的胚胎絨毛中，但是檢測到的信號水平很低。頭三月的外絨毛滋養(yǎng)層顯現(xiàn)出最強的信號和染色陽性，當存在于蛻膜中母血空間時。
Howatson等，(1988)紀錄了頭三月和足月組織中的絨膜絨毛的合胞滋養(yǎng)層都有IFNτ產(chǎn)物。另外，Paulesu等(1991)發(fā)現(xiàn)在合胞滋養(yǎng)層和外絨毛滋養(yǎng)層都有IFNτ，與足月的比較，在頭三月胚胎有更強烈更豐富的反應性。這些調查中使用對人IFNα亞型的增強抗體，在絨毛細胞滋養(yǎng)層未發(fā)現(xiàn)任何IFNα。
這些結果表明人IFNτ基因在早期胚胎組織中由遷移的外絨毛滋養(yǎng)層高表達，但也在合胞滋養(yǎng)層、細胞滋養(yǎng)層和各種基質細胞中表達。這些結果表明檢測出了在人妊娠組織中的IFNτ轉錄本，以及頭三月期胚胎的絨毛細胞滋養(yǎng)層和外絨毛滋養(yǎng)層中IFNτ的表達。
C．干擾素τ的抗病毒特性OvIFNτ的抗病毒活性在抗一些病毒方面，包括RNA和DNA病毒，已有證實。均一純化的OvIFNτ的相對特異活性已經(jīng)用于抗病毒分析(實施例10)。無論比rBoIFNα或rBoIFNγ,OvIFNτ都具有較高的抗病毒活性(實施例10，表3) 。
本發(fā)明的一個優(yōu)點在于，OvIFNτ具有有效的抗病毒活性而只有有限的細胞毒效應。對暴露于貓AIDS和人AIDS逆轉錄病毒的外周血淋巴細胞，用高度純化的OvIFNτ檢測其抗逆轉錄病毒活性和其細胞毒效應(Bazer等，1989)。貓AIDS慢病毒在貓中產(chǎn)生慢性的類似AIDS的綜合癥，可作為人AIDS的一個模型(Pederson等，1987)。兩種病毒在外周血淋巴細胞(PBL)中的復制通過一定時間內培養(yǎng)上清中的逆轉錄酶(RT)來監(jiān)測。
為了確定IFNτ對FIV和HIV的抗病毒活性，在經(jīng)OvIFNτ處理的FIV-和HIV-感染的貓和人的PBL培養(yǎng)物中測定RNA依賴的DNA聚合酶RT的活性(實施例11)。當細胞在OvIFNτ存在下培養(yǎng)時，F(xiàn)IV的復制被降低至對照值的約三分之一。OvIFNτ的加入導致逆轉錄酶(RT)活性的迅速的、劑量依賴性的降低(實施例11，表4)。低至0.62ng/ml濃度的IFNτ可抑制病毒復制，而更高的濃度(40ng/ml)具有更高的抑制RT活性的作用，但沒有對細胞的毒性效應。該結果提示，當細胞在OvIFNτ存在下培養(yǎng)時，與對照值比較，猴免疫缺損病毒的復制被顯著降低。
IFNτ表現(xiàn)出對于逆轉錄病毒的宿主細胞不顯現(xiàn)細胞毒性效應。在IFNτ在培養(yǎng)基中存在濃度達到40ng/ml也是如此。這一濃度相當于干擾素α的約8000抗病毒單位-在對OvIFNτ和HuIFNα分別進行的測試其保護Madin-Darby牛腎細胞防止被皰疹口炎病毒裂解的能力的試驗中證明了這一點(裂解試驗如Pontzer等1988所述)。
還測試了IFNτ在人細胞中抗HIV復制的活性。已感染HIV的人外周血淋巴細胞用不同濃度的IFNτ處理(實施例12)。通過不同時間內逆轉錄酶活性來對外周血淋巴細胞中HIV的復制進行監(jiān)測。在一系列的IFNτ濃度下產(chǎn)生了顯著的抗HIV作用。僅6天中10ng/ml的濃度就導致RT活性50％以上的降低。10天中500ng/ml的濃度導致RT活性90％的降低。而且，IFNτ的施用沒有任何的細胞毒性效應(實施例12，表5)。
而且，通過在以HIV感染的同時，以不同劑量的其他的重組IFNτ或者重組人IFNα處理人PBMC細胞，對IFNτ的抗HIV效果進行了評估(實施例19)。這些實驗的數(shù)據(jù)(實施例19，表11)支持這樣的結論以相似的濃度，IFNα和IFNτ可有效地降低人淋巴細胞中HIV的復制。但是，以IFNα處理細胞會產(chǎn)生細胞毒性，而用IFNτ處理卻未發(fā)現(xiàn)這種細胞毒性，即使是用高得多的IFNτ濃度。使用IFNτ未發(fā)現(xiàn)細胞毒性，即使當IFNτ以相當于αⅡ-干擾素的200倍的劑量使用時也是如此。
FIV和HIV的逆轉錄酶本身都不受PBL中IFNτ存在的影響。因此，抗病毒活性不是因為對病毒RT的直接作用。
干擾素τ還表現(xiàn)出對肝細胞中乙型肝炎病毒DNA復制的抑制(實施例19)。通過一個來自轉染了乙型肝炎病毒(HBV)的肝細胞的人細胞系測試IFNτ的抗病毒效果。以一系列濃度的IFNα和IFNτ處理細胞。與無干擾素的對照相比，IFNα和IFNτ都兩倍地降低了DNA的產(chǎn)生。
為了表明干擾素特異地作用于感染病毒而不導致對普通肝細胞代謝的影響，檢測了該肝細胞中IFNα和IFNτ對肝細胞特異的mRNA產(chǎn)物的作用(實施例19)。用雜交分析檢測了兩個肝細胞特異的蛋白，Apo E和Apo Al。高達40000單位/ml的IFNα或IFNτ濃度下，兩個肝細胞特異的mRNA產(chǎn)物都沒有明顯的降低。而且，該試驗中沒有看到表明IFNτ的肝細胞毒性的證據(jù)。
還評價了重組羊干擾素IFNτ(roIFNτ)對羊慢病毒(OvLV)復制的作用。通過以連續(xù)稀釋的OvLV感染山羊滑液膜細胞試驗體外作用。受感染的細胞每天用roIFNτ處理(0-2500抗病毒單位/ml(AVU/ml))6至12天，檢測病毒的復制和致細胞病變效應(CPE；如實施例2)。
評價方法包括病毒生長曲線、細胞增殖試驗(例如實施例13,14或15所述)、多核構成試驗(例如，如Nagy等1983；Dalgleish等1964所述)、以及通過PCR和逆轉錄酶試驗(Mullis,1987；Mullis等，1987)對原病毒DNA的定量。在經(jīng)roIFNτ處理的培養(yǎng)物中出現(xiàn)OvLV滴度的降低(p＜0.00)和CPE(80-99％)。
通過對24只新生羊羔接種5×106TCID的OvLV毒株84/85試驗roIFNτ的體內活性。11只這樣的羊羔每天以105-106AVU/Kg的roIFNτ處理進行30天后接種(PI)，以后每周兩次。13只羊羔作為對照。通過端點稀釋法確定病毒滴度，兩組的最高值都出現(xiàn)在PI的4-6周。相對于對照動物，經(jīng)roIFNτ處理的羊羔的OvLV滴度降低了。相對于對照動物，在4周PI中經(jīng)處理的動物中OvLV滴度最大降低了90％(p＜0.01)。
上述的OvLV的研究表明重組ovIFNτ能夠顯著地降低OvLV復制，并提示IFNτ可用于控制由慢病毒感染導致的臨床疾病。結合其他的抗病毒數(shù)據(jù)，這些結果提示IFNτ是一種有效的抗病毒劑，可對付廣泛的各種病毒，包括RNA病毒和DNA病毒。
本發(fā)明的干擾素組合物可用于獸醫(yī)應用，包括但不限于對下列病毒疾病的治療猴白血病病毒，羊進行性肺炎，羊慢病毒，馬感染性貧血病病毒，牛免疫缺損病毒，維斯納-梅迪病毒，以及山羊關節(jié)炎腦炎病毒。
人來源的干擾素組合物可用于，例如，下列病毒疾病的治療人免疫缺損病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
D．IFNτ的抗增殖特性還對IFNτ在細胞生長中的作用進行了檢測。在一個分析中，通過集落抑制試驗(實施例13)檢測了抗細胞生長活性。人羊膜(WISH)或MDBK細胞以低細胞密度鋪板以產(chǎn)生來自單細胞的集落。稀釋的干擾素被加入到培養(yǎng)孔中，孵育培養(yǎng)板使集落形成。IFNτ在這些試驗中抑制集落的大小與數(shù)量。在抑制人細胞系(WISH)的細胞增殖上IFNτ比IFNα更為有效。IFNτ的抗細胞增殖活性是劑量依賴性的。高濃度的IFNτ使增殖停止，但細胞的存活性并未受損。
根據(jù)流式細胞計數(shù)進行的細胞周期分析，IFNτ表現(xiàn)為抑制細胞通過S期的進程。這些結果表明了IFNτ的抗增殖效應，并突出了它的低細胞毒性。
IFNτ的抗增殖效應也在大鼠和牛的細胞系中進行了研究(實施例14)。利用3H-胸腺嘧啶的摻入率來確定細胞增殖的比率。獲得的數(shù)據(jù)表明IFNτ對每種測試的細胞系都強烈地降低了細胞增殖的比率(實施例14，表7)。
利用一系列的人腫瘤細胞系進一步對IFNτ的抗增殖活性和低細胞毒性作了檢測(實施例15)。利用NIH掃描抗腫瘤劑程序(Pontzer等，1991)從標準細胞系中選出了不同的人腫瘤細胞系。每個腫瘤類別中至少選出一個細胞系進行檢測。
下列細胞系得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301,Parklawn Dr.,Rockville MD 20852)NCI-H460人肺大細胞癌DLD-1 人結腸腺癌SK-MEL-28 人惡性黑色素瘤ACHN 人腎腺癌HL-60 人早幼粒細胞白血病H9 人T細胞淋巴瘤HUT78 人皮膚T細胞淋巴瘤；和MCF7 人胸腺癌同上，通過對經(jīng)IFNτ處理的細胞中3H-胸腺嘧啶的摻入率的測量來確定抗增殖活性。按照Scheffe的F-測驗進行的差異分析得出各處理間存在顯著的差異。通過流式細胞計數(shù)進行細胞周期分析。
IFNτ對MCF7(人胸腺癌)的抑制的測試表明IFNτ以劑量依賴方式降低了MCF7的增殖。10000單位/ml的IFNτ導致3H-胸腺嘧啶50％的降低(實施例15，表8)。該細胞系以前曾發(fā)現(xiàn)對抗雌激素的處理無反應。
利用HL-60(人早幼粒細胞白血病)細胞獲得了對IFNτ和IFNα抗增殖效應的比較。人早幼粒細胞白血病HL-60細胞中對IFNτ和IFNα的比較的結果是典型的(實施例15)。兩種IFN濃度低至100單位/ml時都產(chǎn)生了顯著的生長下降(＞60％)，IFN量的增加進一步降低腫瘤細胞的增殖(圖4)。高劑量的HuIFNα具有細胞毒性，而OvIFNτ則沒有(圖5)。IFNα導致細胞存活性下降了約80％。相反，當應用10000單位/ml的IFNτ時，近100％的IFNτ處理的細胞保持存活。沒有毒性對IFNτ用于體內治療提供了一個優(yōu)勢。
當用IFNτ處理時，人皮膚T細胞淋巴瘤HUT78的反應與HL-60相似(實施例5，表9)。OvIFNτ和rHuIFNα都降低了HUT78的細胞生長，但是IFNα對細胞存活有副作用。
人T細胞淋巴瘤H9比上述的其他腫瘤細胞系對IFNα的抗增殖效應的敏感性低。雖然IFNα對H9細胞沒有毒性，但它在任何的測試濃度下都無法顯著地抑制細胞分裂(實施例15，表10)。相反，發(fā)現(xiàn)IFNτ可降低H9生長的約60％。因此，只有OvIFNτ是一種對該T細胞淋巴瘤的有效的生長抑制劑。
在其他的三種細胞系中(NCI-H460,DLD-1和SK-MEL-28),IFNτ和IFNα是同樣有效的抗腫瘤劑。在黑色素瘤SK-MEL-28中IFNα的抑制附帶著13％的存活性下降，而IFNτ則沒有毒性。在測試的大部分腫瘤中，IFNτ在作為抗人腫瘤的抗腫瘤劑上等同于或者優(yōu)于IFNα。
IFNτ表現(xiàn)出對人腫瘤細胞的無毒性抗增殖效應，它與人IFNα相比同樣有效或者更為有效。IFNα2的臨床試驗表明它們是有效的抗瘤劑(Dianzani,1992；Krown,1987)。作為一種治療劑，IFNτ的一個優(yōu)勢在于它消除了高劑量IFNα所帶出的毒性效應。
IFNτ的另一個應用是抗Kaposi肉瘤類腫瘤(與HIV感染相關)，此時IFNτ的抗腫瘤效應與IFNτ的抑制逆轉錄病毒生長的能力相偶聯(lián)。
在一個小鼠系統(tǒng)中測試了干擾素τ治療的體內效力(實施例16)。B16-F10是一種性細胞遺傳的小鼠可移植性腫瘤，它具有肺轉移的高發(fā)生率(Poste等，1981)。植入腫瘤細胞后3天開始干擾素處理。IFNτ的體內施用強烈地減少了B16-F10肺腫瘤。因此，IFNτ在體內和在體外一樣表現(xiàn)為一種有效的抗腫瘤劑。
這些結果提示本發(fā)明的干擾素組合物可用于抑制或者降低腫瘤細胞生長的方法中，包括但不局限于下列類型的腫瘤細胞人癌細胞、造血癌細胞、人白血病細胞、人淋巴瘤細胞、人黑色素瘤細胞和類固醇敏感性腫瘤細胞(例如乳房瘤細胞)。
E．Ⅰ型IFN對自身免疫紊亂的治療本發(fā)明的組合物和方法可用于治療，從而減輕各種由于“超強”或者“衰退”的免疫系統(tǒng)功能而導致的免疫系統(tǒng)紊亂。這種紊亂包括超變態(tài)反應和自身免疫紊亂，例如多重硬化癥、Ⅰ型(胰島素依賴型)糖尿病、紅斑狼瘡、肌肉萎縮性側生硬化癥、Crohn氏病、風濕性關節(jié)炎、口炎、哮喘、過敏反應、牛皮癬等等。
F．口服IFNτ的效果在用于疾病的治療或者用IFNτ改善疾病狀況方面，例如對自身免疫疾病(如多重硬化癥)，本發(fā)明進行的支持實驗表明口服IFNτ多肽組合物的效力可以比得上注射IFNτ組合物。
在對能因IFNτ處理而改善的疾病的治療中，口服施用IFNτ不僅有效，而且，口服施用相對于注射IFNτ組合物的治療，還具有意外的優(yōu)點。例如，口服施用IFNτ在受治療個體的血清中產(chǎn)生明顯低水平的抗IFNτ抗體。這點很有益處，因為口服施用的IFNτ就幾乎不可能被宿主免疫系統(tǒng)無效呈遞(就是說，對治療不敏感和/或劑量水平顯著的低)，而接受治療的個體就可能不用忍受這類免疫應答導致的副作用。
G．干擾素的細胞毒性相對于其他干擾素例如IFNα來說，IFNτ的一個優(yōu)點在于，以治療劑量的IFNτ對一個個體的處理并不產(chǎn)生相關的毒性。尤其是，在一個IFNβ可產(chǎn)生毒性的濃度下，IFNτ表現(xiàn)出無毒性。通過以不同的濃度，范圍從6000U/ml至200000U/ml，的oIFNτ或MuIFN-β(Lee Biomolecular,San Diego,CA)處理L929細胞的實驗可以證明這點(實施例19E)。
oIFNτ,MuIFN-β或培養(yǎng)基(對照)在時間為零時加入，細胞孵育72小時。該實驗的結果列于圖21?；罴毎陌俜直?相對于對照)沿y軸表示(帶標準差)。100％相當于只用培養(yǎng)基處理的L929細胞的存活性。結果顯示oIFNτ在濃度高至100000U/ml時基本無毒性，而且在該化合物整個的治療范圍內顯著低于MuIFN-β的毒性。
先前有證據(jù)表明兩種Ⅰ型IFN,IFNβ和IFNα在人和動物的體內治療中會產(chǎn)生毒性，這些各種副作用的證據(jù)包括發(fā)燒、嗜睡、心動過速、體重下降和白細胞減少(Degr,1974；Fent and Zbinden,1987)。在體內IFNτ,IFNβ和IFNα(105U/每次注射)的處理對NZW小鼠總白細胞(WBC)、總淋巴細胞數(shù)和體重(表13)的影響如實施例19所述進行了測試。在WBC，淋巴細胞數(shù)和體重變化上，IFNτ處理的與未處理的小鼠間沒有明顯的差別。
相比之下，IFNβ處理的小鼠的白細胞數(shù)在注射12小時后下降了31.7％。而且，IFNβ注射后白細胞數(shù)持續(xù)下降了24小時。IFNα處理的小鼠在注射12小時后顯現(xiàn)出55.8％的白細胞下降和顯著的體重下降。其他的支持本發(fā)明的實驗表明IFNτ在高劑量時不抑制骨髓。因此，在外周血和體重測量的研究所提供的證據(jù)中，IFNτ不同于IFNβ和IFNα，它無毒性。如下面所述，進行的支持本發(fā)明的實驗提示，相對于IFNβ和IFNα來說IFNτ的低毒性，如前面所小結的，可能是因為N末端IFNτ的37個氨基酸序列的存在，而以這些序列替換了相應的非τ-Ⅰ型干擾素，如，IFNβ和/或IFNα，可能導致在所得到的雜合干擾素多肽中具有減低的細胞毒性。
Ⅲ．干擾素τ多肽片段和Ⅰ型干擾素受體被IFNτ與IFNα的差異識別A．IFNτ多肽片段正如本文所教導的IFNτ的各種活性、其效力和無細胞毒性提示出對這種新型干擾素結構/功能分析的重要性。利用對應于整個OvIFNτ序列的6個合成的重疊肽對OvIFNτ功能的結構基礎進行了測試(圖6)。衍生自羊IFNτ序列的相應多肽如SEQ ID NO:5和SEQID NO:10所示。三個相應于氨基酸1-37,62-92和139-172的多肽表現(xiàn)出對IFNτ抗病毒活性的抑制(實施例17)。這些多肽在300μM以上的濃度時是有效的競爭物。
對應于ovIFNτ的C末端區(qū)域的合成肽，OvIFNτ(139-172)和內部肽(62-92)，在相同的范圍內抑制IFNτ和rBoIFNτ的抗病毒活性，而N末端的OvIFNτ(1-37)對抑制OvIFNτ抗病毒活性更為有效。劑量依賴性數(shù)據(jù)表明IFNτ(62-92)和IFNτ(139-172)在相同的范圍中抑制IFNτ的抗病毒活性程度相似。阻斷IFNτ抗病毒活性的相同肽同樣也阻斷重組牛IFNα(rBoIFNα)的抗病毒活性；重組IFNγ不受這些肽的影響。這兩個IFNτ肽可能代表著IFNτ和各種IFNα的通用受體結合區(qū)域。
兩個合成肽OvIFNτ(1-37)和OvIFNτ(139-172)也阻斷OvIFNτ抗FIV和抗HIV的活性(實施例17；圖11A和11B)。雖然這兩個肽都阻斷FIV RT活性，但是只有C末端肽OvIFNτ(139-172)表現(xiàn)出在馬細胞系Fc9中是皰疹口炎病毒活性的有效抑制物。
多克隆抗肽抗血清對IFNτ肽的作用結果與上述的多肽抑制研究的結果相似。對同樣的這三個區(qū)域(OvIFNτ(1-37),IFNτ(62-92)和IFNτ(139-172))的抗體阻斷了OvIFNτ的功能，這證實了這三個功能區(qū)在抗病毒活性中的重要性(實施例17)。這些肽雖然表現(xiàn)出與干擾素受體的結合，但是它們本身并不對細胞產(chǎn)生類似干擾素的效應。
IFNτ的抗增殖活性(實施例17，表11)涉及該分子的另一個區(qū)域，因為IFNτ(119-150)是對OvIFNτ導致細胞增殖降低最有效的抑制物。此結果提示該分子中主要負責對細胞生長抑制的區(qū)域是IFNτ(119-150)區(qū)域。IFNτ分子的這個區(qū)域可單獨或者與其它蛋白(如血清白蛋白，抗體或者干擾素α)相融合作為一個抗腫瘤藥劑應用。來自人干擾素的N末端肽和血清白蛋白之間的偶聯(lián)蛋白顯現(xiàn)出具有抗細胞增殖的活性(Ruegg等，1990)。
最后，125I-OvIFNτ與MDBK細胞中其受體的結合可以被這6個肽中的4個的抗血清所阻斷；這4個肽相應于OvIFNτ的1-37,62-92,119-150和139-172位的氨基酸。這反映出了多個結合功能區(qū)以及這些區(qū)域在功能上的重要性。由于IFNτ不同的區(qū)域涉及不同功能的產(chǎn)生，因此對有選擇的氨基酸的修飾可能得到帶有選定的生物功能的IFNτ類干擾素。
根據(jù)上述所提供的關于OvIFNτ多肽片段的數(shù)據(jù)，結合本文在此公開的HuIFNτ序列信息，可提示具有上述的OvIFNτ多肽相似的特性的人IFNτ蛋白的多肽片段。這些人序列衍生的多肽包括，但不限于SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:20，以及SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:40。
B．IFNτ和IFNα對Ⅰ型干擾素受體的作用與相互作用與上述的和實施例17所述的肽拮抗劑研究相一致，實施例18中所述的實驗表明，高濃度(高至10倍過量)的OvIFNτ在MDBK細胞中與人IFNαA無法競爭受體和阻斷其毒性效應。從對OvIFNτ和人IFNαA相應的抗病毒，細胞毒性，受體結合以及受體競爭反應等特性的比較中得到了在配體-受體相互作用水平上的認識。IFNτ和IFNαA具有相似的特異抗病毒活性，如先前所示(Pontzer等，1988)。但是，如實施例18所示，IFNαA比IFNτ的Kd低約10倍，且因此與受體具有較高的結合親和力。而且在用125I-IFNτ或者125I-IFNαA進行的結合競爭試驗中IFNαA比IFNτ的效力高數(shù)倍(圖24A,24B)。由于每個細胞中對IFNτ和IFNαA的結合位點的數(shù)量很相似，而IFNτ與IFNαA競爭結合，所以似乎IFNαA和IFNτ識別相同的受體復合物。
對細胞毒性和抗病毒活性的劑量反應/占據(jù)曲線的比較(圖27A和27B)表明細胞毒性與最大受體占據(jù)量，進而與結合親和力相關；IFNαA具有較大的親和力因而具有實際上較大的毒性。相反，抗病毒活性只有在導致很少的受體占據(jù)量的濃度時最大，而并不為飽和結合數(shù)據(jù)所反應。
支持本發(fā)明的實驗還表明羊IFNτ，同IFNαA一樣，可以誘導Ⅰ型受體相關激酶Tyk2和轉錄因子Statlα和Stat2的迅速磷酸化。一定時間內的IFNαA和IFNτ的刺激，只有少部分的受體需要被占據(jù)以誘導Tyk2,Statlα和Stat2的磷酸化。和起來，這些數(shù)據(jù)提示這些信號轉導蛋白可能不足以誘導與“其他”的Ⅰ型IFN(即除IFNτ的Ⅰ型IFN)相關的細胞毒性。
IFNαA對受體較高的親和力以及IFNτ和IFNαA不同的競爭特性還提示兩種IFN識別不同的受體。利用合成的肽拮抗物進行的支持本發(fā)明的實驗，包括如實施例17所述的實驗，表明C末端肽IFNτ(139-172)(SEQ ID NO:10)與IFNαA和IFNτ活性都具有競爭性，而N末端肽IFNτ(1-37)(SEQ ID NO:5)在5至10倍的高濃度下只對IFNτ活性有效。使用抗IFNτ(139-172)和IFNτ(1-37)的抗血清的實驗表明IFNτ(1-37)的抗血清只阻斷IFNτ的結合，而IFNτ(139-172)的抗血清對IFNαA和IFNτ的結合都阻斷。這些數(shù)據(jù)提示IFNαA和IFNτ的N末端部分代表著重要的高親和力結合的決定蔟，且IFNαA和IFNτ之間高親和飽和結合的差異是由于受體與這些分子的N末端相互作用的差異。因此，這些分子的N末端也表現(xiàn)為IFN細胞毒性效應重要的決定蔟。
C．雜合干擾素融合蛋白上述數(shù)據(jù)和起來提示Ⅰ型干擾素的C末端區(qū)域結合于Ⅰ型干擾素受體的一個通用位點(即一個對IFNαA和IFNτ的受體激活特性都有影響的位點)，而N末端區(qū)域可能關系到特定功能的行使(即結合于一個僅對IFNτ的受體激活特性都有影響的位點)，數(shù)據(jù)尤其提示N末端區(qū)域決定了相對于其他Ⅰ型干擾素如IFNα來說IFNτ細胞毒性的下降。
本發(fā)明使用的發(fā)現(xiàn)涉及IFNτ的N末端區(qū)域提供的減低的毒性，利用嵌合DNA結構產(chǎn)生雜合干擾素融合蛋白，該蛋白擁有一個衍生自IFNτ的N末端部分和一個衍生自非τⅠ型干擾素多肽的C末端部分。后者作為治療劑的效力因其相對高的毒性而減小。這種非τⅠ型干擾素多肽包括IFNβ和的IFNα各種異構形式。
參考圖28，這樣的一個雜合干擾素融合蛋白或多肽40，由一個嵌合核酸分子編碼，擁有一個N-末端42和一個C-末端44。該融合蛋白由第一個(N端)片段46和第二個(C端)片段48組成。N末端片段含有一個干擾素τ多肽的N末端氨基酸序列，它由該嵌合核酸分子的5’端片段編碼。C末端片段含有一個非τ-Ⅰ型干擾素多肽的C末端氨基酸序列和一個干擾素τ多肽的氨基酸序列，它由該嵌合核酸分子的3’端片段編碼。這兩個片段接合或剪切于一個接合位點50，其所處的這個區(qū)域(接合區(qū)域)相應于成熟干擾素多肽約第8和第37位殘基間的部分。注意成熟的IFNτ多肽典型地起始于完整序列(包括前導序列和甲硫氨酸起始點)的第24位氨基酸的半胱氨酸。
該接合區(qū)域包含在上述實驗中所用的37個氨基酸的N末端肽(SEQ ID NO:5)之內。對幾種IFNτ,IFNα和IFNβ克隆的成熟氨基酸序列中第1至第37位間的氨基酸的排列比較表明，接近N末端的這些序列之間有著很大程度的差異。尤其是，序列之間最大程度的差異發(fā)生于第1位和第6位氨基酸間。第29位和第37位氨基酸之間的區(qū)域在不同的Ⅰ型干擾素中相對的保守，它被認為與Ⅰ型干擾素受體結合相互作用相關(Fish,1992)。
可以通過例如本文所描述的方法，利用相應于IFNτ(1-37)中或長或短的多肽序列或者編碼多肽的DNA序列，結合本文所述的功能試驗(例如，抗病毒，抗增殖和細胞毒性試驗)鑒定出最佳的接合處(即上游(朝向N-末端或5’端)氨基酸序列為干擾素τ，而其下游(朝向C-末端或3’端)為另一種干擾素如IFNα或IFNβ的氨基酸位置)。應理解的是，例如，本發(fā)明的含有干擾素-τ的第1-28位氨基酸和其余的來自其他非τ-Ⅰ型干擾紊的氨基酸的雜合或嵌合干擾素，具有與干擾素-τ相關的低毒性，同時也具有來自該Ⅰ型干擾素的生物活性。例如，一個IFNτ/IFNα雜合蛋白可以，例如，降低IFNα的毒性但不影響IFNα的抗病毒特性。
如上所述，本發(fā)明的干擾素融合蛋白的氨基酸序列中，成熟序列的前面約8至37個氨基酸為IFNτ分子的序列，而其余的氨基酸為一個非τ-Ⅰ型干擾素多肽的序列。樣板序列中干擾素融合蛋白的前面8至37個氨基酸可從本文所提供的下列序列中選出SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ IDNO:51,SEQ ID NO:52，和SEQ ID NO:53。
其余的序列(即“第二個”氨基酸序列，C端片段，它由嵌合核酸分子的3’端片段編碼)可以選自人和適當?shù)姆铅?Ⅰ型干擾素多肽。如干擾素α(例如，α-1或α-2)、干擾素β、干擾素ω、雜合干擾素或共有干擾素。τ-Ⅰ型干擾素的序列為本領域所熟知。例如，Gunther等，1990,Leibowitz等，1990,Goeddel,1983,1984,1987和Creasey等，1986,1988所提供的雜合干擾素的樣板序列。Stabinsky,1990提供了共有干擾素的樣板序列。Capon,1983,Dworkin-Rastl,1989,Sato,1988和Sloma,1988提供了干擾素α的樣板序列。Fish,1992提供了其他的干擾素α和干擾素β的序列。也可以從GenBank或其他的公共序列庫中獲得適當?shù)男蛄小?br> 對非τ-Ⅰ型干擾素氨基酸殘基中3’端或C末端片段的起始位置的確定，是通過對母本序列進行優(yōu)化對比并構建一個接合區(qū)，從而得到的嵌合干擾素分子的序列與(ⅰ)在5’端或N端片段的母本干擾素-τ序列以及(ⅱ)在3’端或C端片段的母本非τ-Ⅰ型干擾素序列完美排列對比。這里的母本序列當然是指5’端或N端片段和3’端或C端片段所來自的干擾素序列。
非τ-Ⅰ型干擾素氨基酸殘基中3’端或C末端片段的起始位置典型地為緊接于5’端或N端干擾素-τ序列片段的最后一個氨基酸殘基。例如，在一個雜合干擾素中，其前10個氨基酸序列為SEQ ID NO:5的前10個氨基酸，其余的氨基酸序列是成熟的干擾素α(例如，IFN-αCon，如Fish,1992所述)減去干擾素α的前10個氨基酸。
本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案是N端和C端片段都來自人干擾素序列的融合蛋白。例如，構建產(chǎn)物中的前面，例如，28個氨基酸為SEQID NO:15或SEQ ID NO:35的前28個氨基酸，而其余序列為人α或干擾素β的部分。人干擾素-τ序列如Bazer等，1994所述。人干擾素α或干擾素β的序列可從GenBank中獲得。
應當理解，雖然所描述的干擾素融合蛋白是“成熟”蛋白，即，它們開始于完整干擾素序列的第24個殘基，但是本發(fā)明也包括含有前導肽(即，開始于起始甲硫氨酸)的融合蛋白和編碼融合蛋白的嵌合核酸分子。在此干擾素融合蛋白中的前導序列可來自一個τ或非τ-Ⅰ型干擾素。
進而，應當理解第一個和第二個片段的序列可以是“共有”序列。就是說，5’片段的序列可以不是一個“天然的”IFNτ，而是一個通過對幾種不同的IFNτ排列比較而獲得的共有序列。類似地，3’片段的序列可以不是一個“天然的”非τ-Ⅰ型IFN，而是一個通過對幾種不同的非τ-Ⅰ型IFN排列比較而獲得的共有序列。
另外，每個片段的序列可以是一種“內在一致的”序列，即，一個序列中的各個位點所含有的殘基至少可以在一個IFNτ(對于N端片段而言)或者非τ-Ⅰ型IFN(對于C端片段而言)的天然存在的異構型中找到。例如，如果兩個異構型，每個長3個氨基酸，含有序列“CRS’和“CKG”，那么一個內在一致的序列是“CRG”。
而且應當理解，本發(fā)明還包括更為復雜的嵌合體，例如，含有一個以上的來自IFNτ的不連續(xù)區(qū)域和/或一個以上的來自其他干擾素的區(qū)域。這種嵌合體可以在如下情況下獲得，例如，當非τ-Ⅰ型IFN的第二個(C端)片段本身是一個雜合干擾素，由例如干擾素α和干擾素β(Creasey等，1986,188),α1和α2干擾素(Leibowitz等，1990)或干擾素α或和(ω-干擾素(Gunther等，1990)構成。
如上面所指出的，本發(fā)明的雜合干擾素融合蛋白組合物的一個明顯優(yōu)勢是降低了組合物的毒性，相對來說，天然的非τ-Ⅰ型IFN，例如已被證實了在作為治療劑時具有毒性。該雜合組合物可具有與非τ-Ⅰ型IFN相同的生物學活性及IFNτ的低細胞毒性。
嵌合核酸分子可以通過合成或以標準的分子實驗操作產(chǎn)生(Ausubel等，1988；Sambrook等，1989)，如本文所例舉的。編碼母本多肽(構成雜合蛋白的兩個片段所來自的兩個多肽序列)的DNA序列以標準的重組方法(例如，通過對DNA序列進行限制酶切位點的操作而不改變翻譯的氨基酸序列，質粒的消化，以及將適當?shù)钠慰寺∪脒x好的表達載體中)，克隆連接于一個表達載體中。
然后，重組雜合干擾素融合多肽從上述的表達載體中產(chǎn)生，經(jīng)純化，用于疾病的治療和/或用于因IFNτ處理而得到改善的病情中。
Ⅳ．蛋白建模和蛋白改造上節(jié)中的數(shù)據(jù)表明，鑒定了具有與和受體作用及生物活性相關的OvIFNτ蛋白中的4個不連續(xù)的位點的合成肽。為了闡明這些區(qū)域的結構關系，進行了IFNτ三維結構的模型構建。三維結構模型對于已有的數(shù)據(jù)闡明和進一步的結構/功能研究很有益處。
A．分子蛋白模型的構建結合OvIFNτ和IFNβ(其三維結構已知(Senda等，1992))兩者的園二色性(CD)構建了OvIFNτ的模型。該模型最為吃驚的一點是IFNτ被分到4-螺旋束基序的一類蛋白中。OvIFNτ園二色性光譜在AVIV 60 S光譜偏振儀上測量。使用了兩種方法對二級結構進行估算，Perczel等(1991)的運算法則和W.C.Johnson,Jr.(1992)的變量選擇。
光譜的二級結構估算顯示出70-75％的α-螺旋(最低222和208nm，最高190nm的鑒定)。變量選擇算法估算出剩余的分子為20％的β-折疊和10％的轉折。Chang的方法估算出剩余為30％的隨機螺旋。IFNτ和IFNβ序列的排列比較揭示出兩個分子間的同源性，尤其在IFNβ已知的螺旋結構區(qū)域。IFNτ的序列分析也顯示出已知的螺旋區(qū)域擁有一個意味著4-螺旋束基序的一個極性周期。
最后的建模步驟為對IFNτ序列應用IFNβ的X射線晶體圖像和IFNβ的碳骨架。如前面所述的IFNτ的具有功能性的區(qū)域被定位于該分子的一側，而且發(fā)現(xiàn)在空間上接近。這與IFNτ同時和Ⅰ型IFN受體作用的多重結合位點相一致。
三維模型的數(shù)據(jù)結合上述的功能數(shù)據(jù)，提供了必要的信息，可用于在IFNτ特定的區(qū)域中引入序列突變，以增強特定的功能(例如，抗病毒或抗細胞增殖)或者將特定的功能置換到其他干擾素分子中去(例如抗病毒、抗神經(jīng)炎或降低細胞毒性)。
B．重組和合成操作
OvIFNτ的合成基因的構建如實施例3所述。簡要地，從一個OvIFNτ的cDNA(Imakawa等，1987)用E.coli.偏愛的密碼子反翻譯出OvIFNτ的核酸序列，該序列編輯成含20個單一的限制位點，遍布于整個序列。將該540個堿基對的合成基因分割成11個寡核苷酸片段，合成每個片段并以單鏈或雙鏈克隆到pTZ19R,pTZ18R或pBluescript上，擴增，融合。合成的OvIFNτ構建物然后被克隆到經(jīng)修改過的pIN-Ⅲ-ompA表達載體上，在細菌中表達，還被克隆到一個酵母表達質粒上。還設計構建了一個人IFNτ合成基因(SEQ IDNO:3)類似的構建物，并在酵母細胞中表達。
OvIFNτ合成基因在酵母中的表達(實施例4)在S.cerevisiae中能夠得到高效IFNτ的重組產(chǎn)物隨后應用離子交換和分子篩層析，從可溶性酵母抽提物中純化出大量的重組IFNτ(5-20mg/l)。以此方式純化的IFNτ表現(xiàn)出與天然的OvIFNτ類似的有效的抗病毒活性(2至3×105單位/mg)。
該合成基因構建物有利于引入突變而可增強抗腫瘤(抗細胞增殖)和抗病毒活性。而且，該分子上負責不同功能的區(qū)域可以單獨進行修飾以產(chǎn)生帶有所預期功能的分子。例如，構建了兩個缺失突變，OvIFNτ(1-162)和OvIFNτ(1-166)，用以檢測IFNτ分子C端序列的作用。
還構建了其他的突變IFNτ分子用以確定對抗增殖活性重要的殘基。例如，已證明在IFNα的抗細胞增殖活性中有一個特別的殘基TYR123(McInnes等，1989)。IFNτ中TYR123等價物包含在肽OvIFNτ(119-150)中該肽抑制OvIFNτ和人IFNα的抗增殖活性。構建了將TYR123轉變成保守的(TRP)和非保守的(ASP)的取代突變，以及該殘基缺失的突變序列。TYR123的密碼子位于SspⅠ位點中；用該位點的消失與否來檢測。這些突變的IFNτ抗增殖活性的測試如本文所描述。
可以產(chǎn)生相應于本發(fā)明的IFNτ多肽的合成肽。合成肽可以商業(yè)合成或用本領域的標準方法和儀器(Applied Biosystems,Foster CityCA)制備。
另外，編碼肽的寡核苷酸序列可以按標準的寡核苷酸合成方法直接合成，或者，當是大量的編碼序列情況時，通過一系列克隆步驟合成，步驟包括相應于編碼序列的多個寡核苷酸片段的串聯(lián)(Crea,1989；Yoshio等，1989；Easton等，1988)。寡核苷酸編碼序列可通過標準的重組程序被表達(Maniatis等，1982；Ausubel等，1988)。
上述的干擾素τ多肽的生物學活性的應用可以通過單獨地使用干擾素τ也可以結合或融合如上面和下面所述的其他的蛋白而實現(xiàn)。
Ⅴ．融合蛋白的產(chǎn)生另一方面，本發(fā)明包括干擾素τ、干擾素τ的衍生多肽，或者與第二個多肽共價結合而形成一個融合或雜合蛋白的雜合干擾素。構成這樣的融合蛋白的干擾素τ序列可重組產(chǎn)生干擾素τ或其生物活性部分，如上所述。
例如當干擾素τ用于抑制病毒的表達時，衍生自具有抗病毒活性的IFNτ的多肽，可以優(yōu)勢地融合一個可溶性肽，如血清白蛋白或一個抗體(例如特異針對一個病毒特異表面抗原的)，或融合一個干擾素α多肽。在一個實施方案中，如上所述的雜合干擾素融合多肽，IFNτ多肽提供了一個降低其他干擾素分子(如IFNβ或IFNα)毒性的方法，即，以相應的IFNτ低毒性的區(qū)域置換這些干擾素中的毒性相關區(qū)域。這些區(qū)域可從例如本文所公開的人干擾素τ序列中得到。
本發(fā)明中的融合蛋白可通過化學偶聯(lián)或重組技術獲得。前一種方法中，干擾素和第二個所選的多肽用常規(guī)的偶聯(lián)劑做共價結合的修飾。在一個將可溶性血清白蛋白與干擾素多肽偶聯(lián)的樣板方法中，血清白蛋白用N-琥珀酰亞胺-S-乙酰-硫代醋酸酯處理(Duncan等，1983)，產(chǎn)生硫醇血清白蛋白。然后該激活了的血清白蛋白與經(jīng)N-琥珀酰亞胺-3(2-二硫吡啶)丙酸酯處理的干擾素(Cumber等，1985)反應，形成通過二硫鍵連接的融合蛋白。
作為另一種方法，重組蛋白的制備可利用一個半胱氨酸殘基，使得該干擾素與一個激活的配體形成二硫鍵，從而簡化偶聯(lián)反應。用于產(chǎn)生重組干擾素的干擾素τ表達載體可以按照標準的定點誘變的方法修飾，插入一個中間的或末端的半胱氨酸密碼子(Ausubel等，1988)。
在一個方法中，利用一個表達載體重組制備融合蛋白，該載體上第二個所選多肽的編碼序列與干擾素τ編碼序列相連接。例如，可將人血清白蛋白編碼序列與干擾素τ多肽的編碼序列，如SEQ IDNO:9,SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:39同閱讀框融合。然后在一個適當?shù)乃拗骷毎斜磉_該融合蛋白。該融合蛋白可通過分子篩和離子交換層析方法純化，如有需要，還可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和/或HPLC層析進行其他的純化。
從以上所述中可以理解如何制備含有干擾素τ的融合蛋白。上述的融合的一個變化是，在該融合蛋白中改變干擾素τ-和所選的第二個蛋白的位置(如，氨基端變?yōu)轸然?。此外，天然干擾素τ多肽的內部部分(例如15-172位氨基酸的區(qū)域)可以組裝到多肽中去，從而兩個或多個這種干擾素τ部分在此多肽中是相鄰的，而在天然蛋白中它們是不連續(xù)的。
Ⅵ．與干擾素τ反應的抗體與谷胱甘肽-S-轉移酶(Sj26)融合的含有本發(fā)明的多肽抗原的融合蛋白，可以利用pGEX-GLI載體系統(tǒng)在大腸桿菌JM101細胞中表達。該融合Sj26蛋白可方便地利用谷胱甘肽底物親和層析(Smith,D.B.等，1988)而分離。IFN蛋白的表達和部分純化如實施例21所述，其適用于由本發(fā)明描述的任何序列所編碼的可溶性的誘導的多肽。
不溶性的GST(sj26)融合蛋白可通過制備型凝膠電泳純化。
另外，IFNτ-β-半乳糖苷酶融合蛋白可按照實施例20中所述進行純化。
本發(fā)明還包括一個表達載體，如上述的λgtll或pGEX載體，它含有IFNτ編碼序列和可使編碼區(qū)在一個適當?shù)乃拗髦斜磉_的表達調控元件。調控元件一般包括啟動子、翻譯起始密碼和翻譯和轉錄終止序列、和一個可在載體中引入插入片段的插入位點。
編碼所要多肽的DNA可克隆到任何一種載體中(如上所討論的)從而在適當?shù)乃拗飨到y(tǒng)中獲得該多肽的表達。這些重組多肽可以融合蛋白或者天然蛋白形式表達。許多特征可以引入到表達載體中，如可促使表達序列分泌到培養(yǎng)集中去的前導序列。重組生產(chǎn)的IFN和由它衍生的多肽通?？梢詮牧呀獾募毎蚺囵B(yǎng)基中分離。純化可以按照本領域所熟知的方法如鹽分餾、離子交換層析和親和層析進行。也可利用抗所要IFNτ或雜合干擾素抗原的抗體而使用免疫親和層析方法。
另一方面，本發(fā)明包括針對本發(fā)明所提供的多肽的特異抗體。典型地，為制備抗體，用純化的抗原或融合蛋白抗原免疫一個宿主動物，如兔。利用許多衍生自其他蛋白的序列，如β-半乳糖苷酶或谷胱甘肽-S-轉移酶，可以產(chǎn)生雜合或融合蛋白。經(jīng)適當?shù)臅r間間隔后收集宿主血清或血漿，測試該血清對抗原的特異抗體。實施例21描述了兔血清抗體的產(chǎn)生，該抗體特異地抗、Sj26/hybIFN雜合蛋白中的hybIFN抗原。這些技術可以應用于所有的hybIFN分子和由其衍生的多肽。
可以通過，例如用飽和硫酸銨或DEAE Sephadex，或其他本領域熟練技術人員所知道的生產(chǎn)多克隆抗體的方法，獲得免疫動物的γ球蛋白或IgG抗體。
另外，純化的蛋白或融合蛋白可用于產(chǎn)生單克隆抗體。將以所需的抗原免疫的動物的脾或淋巴細胞取出或體外增殖，或通過本領域熟練技術人員所熟知的方法用于制備雜交瘤(Harlow等，1988)。可從外周血樣品中分離淋巴細胞。Epstein-Barr病毒(EBV)。可用于體外無限增殖人淋巴細胞或者使用一個融合配對物來產(chǎn)生雜交瘤。
通過例如ELISA或Western blot的方法(Ausubel等，1988)，對體外增殖細胞所分泌的抗體掃描，以確定分泌所需的特異抗體的克隆。支持本發(fā)明所進行的實驗產(chǎn)生了4個雜交瘤，它們可產(chǎn)生對分離的羊IFNτ特異的單克隆抗體。
多肽的抗原性區(qū)域通常比較小，典型長度為7至10個氨基酸。已有小片段被確定為抗原性區(qū)域。干擾素τ多肽抗原按如上所述鑒定。得到的DNA編碼區(qū)域可以融合蛋白或分離的多肽形式重組表達。
此外，一些氨基酸序列可以方便地化學合成(Applied Biosystems,Foster City CA)。以上述方法之一獲得的抗原可直接用于抗體的產(chǎn)生或者將其結合于適當?shù)妮d體分子。許多這類載體分子為本領域所熟知或者可以商業(yè)購買(如，Pierce,RockfordIL)。
與IFNτ或者雜合干擾素反應的抗體可用于例如分析結構/功能關系。
Ⅶ．應用A．繁殖雖然IFNτ在結構上和在其有效的抗病毒特性上與IFNα家族相似，但是IFNα不具備IFNτ所有的繁殖特性。例如，重組IFNα與IFNτ相比，即使施用兩倍的劑量對發(fā)情間隔也無作用(Davis等，1992)。
因此，雖然IFNτ與其他干擾素具有一些結構相似性，但是它具有其鮮明的特性例如，能夠顯著地影響發(fā)情周期的生物學事件。
本發(fā)明的人IFNτ可用于增強生育能力和延長雌性動物黃體的生命期的方法中，通常例如Hansen等1991所述，附此可參考。而且，本發(fā)明的IFNτ可用于調控子宮和/或胚胎組織的生長發(fā)育。人IFNτ尤其可用在對人的治療中，因為潛在的抗原反應在使用同種蛋白時較小。
B．抗病毒特性Ⅰ型干擾素顯示出有效的抗病毒特性。IFNτ的抗病毒活性具有廣泛的無毒效治療應用，而IFNα則通常帶有這些毒效。雖然在培養(yǎng)基中存在的IFNτ抑制貓的免疫缺損病毒反轉錄酶活性(實施例11)，但這并不是由于IFNτ對反轉錄酶的直接作用。而是IFNτ誘導宿主細胞產(chǎn)生了對病毒反轉錄酶的抑制因子。
IFNτ被發(fā)現(xiàn)執(zhí)行其抗病毒活性而不對細胞具有副作用未發(fā)現(xiàn)由于施用IFNτ而導致細胞毒性效應的證據(jù)。IFNτ沒有細胞毒性使得其在作為體內治療藥劑上極為有價值。無細胞毒性將IFNτ與大多數(shù)其他的抗病毒藥劑和所有其它干擾素區(qū)分開來。
包括本發(fā)明的含IFNτ雜合干擾素融合化合物的配制物可用于抑制病毒復制。
本發(fā)明的雜合干擾素融合蛋白可用于影響胎兒和母親間的免疫關系，例如防止母體病毒(如HIV)轉移至發(fā)育中的胎兒。人干擾素組合物尤其可用在對人的治療中，因為潛在的抗原反應在使用同源蛋白時較小。
C．抗細胞增殖特性Ⅰ型干擾素顯示出有效的抗細胞增殖特性。本文所述的這種雜合干擾素也可用于抑制細胞生長，而沒有其他現(xiàn)在已知的干擾素所帶的副作用。含有本發(fā)明的雜合干擾素化合物的配制物可用于抑制、防止或減緩腫瘤的生長。
某些腫瘤的發(fā)育受雌激素的介導。支持本發(fā)明所進行的實驗表明IFNτ可以降低雌激素受體數(shù)量。因此，含有IFNτ的組合物可用于治療或防止雌激素依賴型腫瘤。
D．免疫系統(tǒng)紊亂可用本發(fā)明的方法治療的疾病包括自身免疫，炎癥，增殖性或高增殖性疾病，以及皮膚表現(xiàn)形式的免疫介導疾病。本發(fā)明的方法在涉及免疫系統(tǒng)超敏性時的治療條件下尤其優(yōu)越。有4種類型的免疫系統(tǒng)超敏性(Clayman)。類型Ⅰ，或直接型/過敏性超敏性是由于對過敏原(如花粉)反應而肥大細胞脫粒，包括哮喘、過敏性鼻炎(干草熱)、風疹(蕁麻疹)、過敏性休克和其他的變態(tài)性疾病。類型Ⅱ，或自身免疫超敏是由于直接針對所察覺的身體自身細胞上的“抗原”的抗體所致。類型Ⅲ超敏是由于寄存于各種組織中并激活進一步免疫應答的抗原/抗體復合物的構成，它相應的情形有血清疾病、過敏性肺泡炎和有時加強免疫后的大發(fā)脹。類型Ⅳ超敏是由于致敏T-細胞淋巴因子的釋放，它導致炎癥反應。例子包括接觸性皮炎、麻疹和對某些藥物的“過敏性”反應。
雖然在一些個體中某種條件導致超敏的機制一般無法被完全了解，但它可能涉及遺傳和外在的因素。例如，對于一個已經(jīng)帶有自身免疫紊亂的遺傳因素的個體，細菌、病毒或藥物可能在啟動自身免疫應答上起一定的作用。據(jù)推測，某種類型超敏的發(fā)病可與其他類型相關聯(lián)。例如有報道帶有某種常見的變態(tài)性的個體對自身免疫紊亂有更高的易感性。
自身免疫紊亂可大概分為主要限于特異器官和組織的一類和影響整個身體的一類。器官特異的紊亂(其涉及器官)的例子包括多重硬化癥(包被神經(jīng)過程的髓鞘質)、Ⅰ型糖尿病(胰腺)、Hashimotos甲狀腺炎(甲狀腺)、惡性貧血癥(胃)、Addison疾病(腎上腺)、重癥肌無力(神經(jīng)肌肉接合處的乙酰膽堿受體)、風濕性關節(jié)炎(關節(jié)襯)、葡萄膜炎(眼睛)、牛皮癬(皮膚)、Guillain-Barre綜合癥(神經(jīng)細胞)和Grave疾病(甲狀腺)。系統(tǒng)自身免疫疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和皮膚肌炎。
其他的超敏紊亂包括哮喘、濕疹、遺傳過敏性皮炎、接觸性皮炎、其他濕疹性皮炎、皮脂溢性皮炎、Pemplugus、天皰瘡、Epidermolysis皰、uriccaris、血管水腫、visculitides、紅斑、皮膚性嗜曙紅細胞增多、Alopecia areata、動脈硬化癥、初級膽硬化和腎病綜合癥。相關疾病包括、腸道炎癥如Coeliac疾病、直腸炎、嗜曙紅細胞增多腸胃炎、肥大細胞病、發(fā)炎腸疾病、Chrohn疾病和潰瘍性結腸炎，以及食物相關的過敏。
自身免疫疾病尤其適合于本發(fā)明的方法治療，包括多重硬化癥、Ⅰ型(胰島素依賴型)糖尿病、紅斑狼瘡、肌肉萎縮性側相硬化癥、Crohn疾病、風濕性關節(jié)炎、口炎、哮喘、葡萄膜炎(眼睛)、變態(tài)和牛皮癬。
含有hybIFN的藥劑可用于治療處理并減輕上面所述的自身免疫紊亂癥狀。
E．干擾干擾素與受體的結合IFNτ能夠通過分子上的幾個表位與Ⅰ型IFN受體反應，這些區(qū)域可以或單獨或聯(lián)合地影響IFNτ的獨特功能。
本發(fā)明的肽可用于選擇性地抑制干擾素與干擾素受體的結合。特別是如本文所述，某些所公開的肽選擇性地抑制IFNτ的抗病毒活性，而另外的肽抑制抗增殖活性。這些肽聯(lián)合起來可用于抑制兩種活性。有利的是，盡管結合干擾素受體并阻斷IFNτ活性，這些肽本身并不表現(xiàn)抗病毒或抗增殖活性。
因此，這些肽可以用作免疫調節(jié)分子，用于防止干擾素分子激發(fā)的免疫應答。這些肽可用作免疫抑制劑，防止例如對組織移植的干擾素介導的免疫應答。其他類型的干擾素介導的應答也可被阻斷，如干擾素α的細胞毒效應。
F．藥物組合物本發(fā)明的雜合干擾素融合多肽可按照已知的方法配制藥物用途的組合物。先前已描述(例如，Martin等，1976)包含干擾素或干擾素類化合物的配制物。通常，本發(fā)明的組合物可以有效量的雜合干擾素結合適當?shù)妮d體配制，以有效地促進該組合物的施用。
用于治療的組合物可以是不同的形式。包括，例如，固體的，半固體的和液體的形式，如，片劑、丸劑、液態(tài)溶液或懸液、脂質體、栓劑、注射型或不溶性溶液。其優(yōu)選形式基于所需的施用方式和治療應用。組合物還優(yōu)選地包括本領域熟練技術人員所熟知的常規(guī)的藥物學可接受的載體和賦型劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物以一個單位劑量的形式構成，并通常能夠對患者一天施用一次或多次。
雜合干擾素融合多肽或相關多肽可對患者以藥物學可接受的劑量形式施用，這些形式包括口服、吸入、鼻腔噴霧、腹膜內、靜脈、肌肉、內壁或皮下注射。特別地，用于其他干擾素化合物的組合物和方法可用于這些化合物的輸入。
本發(fā)明的化合物的一個重要優(yōu)點是IFNτ蛋白極低的細胞毒性。由于其低細胞毒性，該雜合干擾素組合物可以以高于其他干擾素(如IFNα)化合物應用時的濃度來施用。因此，本發(fā)明的雜合干擾素組合物可以考慮以大約5×104至20×106單位/天甚至500×106單位/天或更多的劑量來施用。對于系統(tǒng)施用優(yōu)選的是高劑量。當然應當理解本發(fā)明的組合物和方法可與其他的治療相結合。
當患者的病狀有所改善時，如需要可施用保持劑量。然后，施用的劑量或頻率或兩者一起隨癥狀而定降低至一個能夠保持改善病癥的水平。當癥狀減輕至所需水平時，可以停止治療。但患者可能需要在一個長時期內根據(jù)疾病癥狀的復發(fā)情況進行間歇治療。
本發(fā)明的組合物可通過標準的程序施用，以治療各種癌癥和病毒性疾病，包括那些其他干擾素已經(jīng)顯示出效果的病癥。可參見例如Fintre等，1991；Dianzani,1992；Francis等，1992和U.S.專利4,885,166和4,975,276。然而如上面所討論的，本發(fā)明的組合物具有獨特的特點和優(yōu)點，包括它們可以無毒性地治療那些病癥。
G．對皮膚紊亂的治療皮膚紊亂癥可以使用本發(fā)明的雜合干擾素治療，其配方和劑量可根據(jù)施用的方法和損傷的大小和嚴重程度確定。優(yōu)選的方法包括真皮和皮下注射。對于大的損傷可以多次注射，而單個患者皮膚上的幾塊損傷可以一次處理。施用的時間計劃可以由本領域熟練人員確定。設計的可持續(xù)釋放的配方能夠降低施用頻率。
H．系統(tǒng)治療系統(tǒng)治療在各項應用上基本相同?？捎枚啻戊o脈、皮下和/或肌肉劑量，而對于植入方法的治療，設計的持續(xù)釋放配方尤為有用。患者也可通過植入皮下門、儲存池、或泵來治療。
I．區(qū)域治療利用本發(fā)明的雜合干擾素融合多肽的區(qū)域治療可用于特定組織的癌癥治療。治療可通過動脈灌輸完成。可利用外科或血管造影方法植入導管直接地對所影響的器官治療。一個與導管相連的皮下門可用于持續(xù)治療，或者也可使用一個植入的再裝泵。
下列的實施例是對本發(fā)明的解釋而非限制。
材料和方法限制性內切酶，T4連接酶，T4多核苷酸激酶，Taq DNA聚合酶，和小牛腸磷酸酶購自New England Biolabs(Beverly,MA)或PromegaBiotech(Madison,WI)，這些試劑按照制造商的說明書使用。對于測序反應，使用了“SEQUENASE DNA IFNα”測序試劑盒(UnitedStates Biochemical Corporation,Cleveland OH)。免疫雜交和其他試劑來自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)或Fisher Scientific(Needham,MA)。醋酸纖維素膜購自Schleicher and Schuell(Keene,NH)。
合成的寡核苷酸連接子和引物通過商業(yè)購買的自動核苷酸合成儀制備(如，ABI 380B-02型DNA合成儀(Applied Biosystems,FosterCity,CA))?；蛘撸Ｓ迷O計的合成寡核苷酸可購自例如，SyntheticGenetics(San Diego,CA)。cDNA合成試劑盒和隨機引物標記試劑盒購子Boehringer-Mannheim Biochemical(BMB,Indianapolis,IN)。
編碼多肽的寡核苷酸序列的合成可通過標準的寡核苷酸合成方法，或者，對于大的編碼序列，通過一系列的克隆步驟，利用相應于該編碼序列的一組多個寡核苷酸串聯(lián)片段(Crea,1989；Yoshio等，1989；Eaton等，1988)而完成。寡核苷酸編碼序列通過標準的重組程序(Maniatis等，1982；Ausubel等，1988)而表達?；蛘?，通過標準體外技術(Applied Biosystems,Foster City CA)直接合成肽。
重組人IFNα(rHuIFNα)和rBIFNγ購自Genentech Inc.(SouthSan Francisco,CA)。參照的重組人IFNα(rHuIFNα)制備物得自Natonal Institutes of Health:rHuIFNα商購自Lee Biomolecular(SanDiego,CA)。純化的人IFNαA(2×104單位/mg)得自BiosourceInternational(Camarillo,CA)。除非另有說明，通過二金雞寧酸試驗試劑盒(Pierce,Rockford IL)按照制造商的說明書確定蛋白濃度。
涉及多克隆和單克隆抗體工作的一般的操作，包括抗體的純化，按照標準的程序進行(Harlow等，1988)。Pierce(Rockford,IL)為許多抗體試劑的來源。
親和純化的對Tyk2,Statlα，和Stat2特異的兔抗肽抗體購自SantaCruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。單克隆抗磷酸酪氨酸抗體(4G10)購自Upstate Biotechnology(Lake Placid,NY)。Western blots以增強的化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒(Amersham Corp.ArlingtonHeights,IL)顯色。
牛腎細胞系MDBK和人Burkitt淋巴瘤細胞系Daudi得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Rockville,MD)。Daudi細胞生長于RPMI1640培養(yǎng)基，其中加有20％胎牛血清和抗生素(Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)。MDBK細胞生長于Eagle最小基本培養(yǎng)基(EMEM)，其中加有10％馬血清和抗生素(Gibco/BRL)。
本研究中使用的所有組織培養(yǎng)基，血漿和IFN為內毒素陰性，這是由Limulus變型細胞溶胞產(chǎn)物(Associates of Cape Cod,WoodsHole,MA)試驗，以0.07ng/ml的靈敏度水平確定。
抗體檢測的一般ELISA實驗程序聚苯乙烯96孔板ImmulonⅡ(PGC)用5μg/mL(100μl/每孔)抗原，0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH9.5包被。平板用石蠟膜封住，置于4℃過夜。
平板抽氣并用300μl 10％NGS封閉，于37℃孵育1小時。
用PBS0.5％TWEEN-20洗板5次。
抗血清稀釋于0.1M PBS,pH7.2。將所需的抗血清(0.1mL)加入每孔中，平板于37℃孵育1小時。然后用PBS 0.5％TWEEN-20洗滌5次。
辣根過氧化物酶(HRP)綴合的羊抗人抗血清(Cappel)1/5000稀釋于PBS。在每孔中加入0.1mL的此溶液。平板于37℃孵育30分鐘，然后用PBS洗滌5次。
Sigma ABTS(底物)在加入到平板中之前備好。
試劑中含有50mL 0.05M檸檬酸，pH4.2,0.078mL 30％過氧化氫溶液和15mg ABTS。在每孔中加入0.1mL的底物，然后于室溫孵育30分鐘，加入0.050mL5％SDS(w/v)終止反應。在410nm處測量相對吸收值。
實施例1IFNτ的生殖功能測試了干擾素τ對黃體壽命的作用。
將IFNτ按照表1的濃度輸入母羊的子宮腔內。重組人IFN(α(rHuIFNα)以相似的濃度輸入。此外，還使用了接受對照蛋白的對照動物。黃體的壽命通過檢測發(fā)情間隔、孕酮分泌的保持、和前列腺分泌的抑制(Davis等，1992)來測試。
表1干擾素對生殖生理學的作用
當IFNτ以100μg/天施用時，對照動物與接受OvIFNτ的動物發(fā)情間隔的比較顯示出明顯的間隔增加。另一方面，對照動物和接受人重組干擾素α的動物發(fā)情間隔的比較顯示rHuINFα沒有有意義的效果。
結果表明干擾素τ具有顯著影響生殖周期生化事件的能力。
實施例2在生殖周期的不同時期干擾素τ的抗病毒特性從處于16天發(fā)情周期的第12天的綿羊上獲得孕體建立孕體培養(yǎng)物。通過致細胞病變效應試驗(Familetti等，1981)檢測每個孕體培養(yǎng)物上清中抗病毒活性。簡要地，IFNτ或其他IFN的稀釋液與Madin-Darby牛腎(MDBK)細胞一起于37℃孵育16-18小時。孵育后，在致細胞病變效應試驗中用皰狀口炎病毒(VSV)作為感染病毒，檢測對病毒復制的抑制(Armstrong,1989)。相對于受VSV感染而沒經(jīng)處理的MDBK細胞(對照板)，一個抗病毒單位可導致單層細胞破壞率下降50％。利用正常的羊成纖維細胞(Shnf)通過斑抑制試驗(Langford等，1981)進一步評測了特異活性。每個時間點至少測試了3個樣品，每個樣品試驗3次。結果以平均單位/ml列于表2中。
表2孕體培養(yǎng)物和尿囊液和羊膜液中的IFNτ的抗病毒活性
培養(yǎng)物上清中的抗病毒活性隨著孕體的進一步發(fā)育而增加(表2)。
實施例3IFNτ在細菌中的表達以編碼OvIFNτ的氨基酸序列(Imakawa等，1987)，使用為E.coli.表達而優(yōu)化的密碼子，產(chǎn)生一個相應的DNA編碼序列。在5’和3’端加入接頭序列以方便在細菌表達載體中的克隆。核苷酸序列的設計包括19個單限制酶位點，它們均勻地遍布于編碼序列上(圖1A和1B)。
核苷酸序列分成11個大小范圍在33至75個堿基的寡核苷酸片段。這11個寡核苷酸都在380-B 2-柱DNA合成儀(AppliedBiosystems)上合成，并以單鏈或者雙鏈形式克隆到下列之一的載體中“pBLUESCRIPT+(KS)”(Stratagen,LaJolla,CA),pTZl8R(Pharmacia,Piscataway,NJ)，或pTZ19R(Pharmacia,Piscataway,NJ)克隆載體。
載體轉化進E.coli.菌株”XLl-BLUE”(recA1 end A1 gyrA96 thihsdR17(r-s,ms+)supE44 relA1λ-(lac),{F’,proAB,lacqZΔM15,Tn10(tetR)})，它可從Stratagen(LaJolla,CA)商業(yè)購買。轉化細胞在加入了氨芐青霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中生長。寡核苷酸的克隆和融合按照標準的重組DNA技術進行。
克隆載體用適當?shù)南拗泼盖懈?，插入合成的寡核苷酸。載體用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)處理以去除末端磷酸基團。寡核苷酸進行磷酸化，并以單鏈或者雙鏈分子，使用T4連接酶克隆入適當?shù)妮d體中。當引入克隆載體的是單鏈時，第二條鏈由轉染后的細菌宿主完成。
對于雙鏈克隆，寡核苷酸先與合成的互補鏈退火，然后連接入載體中。然后以連接產(chǎn)物轉化E.coli K12菌株SB221或NM522。當涉及到甲基化敏感的StuⅠ和ClaⅠ限制位點時，使用E.coli GM119菌株。在每一步的克隆程序中對分離的DNA進行限制酶切分析。將克隆的寡核苷酸按照圖2所示，經(jīng)限制酶切和連接形成一個多核苷酸。含有DNA片段的寡核苷酸一般通過低熔點瓊脂糖上的電泳而進行分離(Maniatis等，1982；Sambrook等，1989；Ausubel等，1988)。得到的IFNτ多肽編碼序列的跨度為第16位至531位，它編碼172個氨基酸。
最終所得多核苷酸的核苷酸序列通過雙脫氧鏈終止法的DNA測序加以確定。
將全長的StuⅠ/SstⅠ片段(540bp；圖2)克隆到一個修改過的pINⅢompA表達載體上，并轉化入E.coli SB221菌株感受態(tài)細胞。為了表達IFNτ蛋白，含有表達載體的細胞在含氨芐青霉素的L-肉湯中生長至0.1-1的OD(550nm)值時，用IPTG誘導3個小時，離心收集。可溶性重組IFNτ經(jīng)超聲波或滲透壓破碎從細胞中釋放出來。
實施例4IFNτ在酵母中的表達如實施例3所合成的合成IFNτ基因，5’端加有StuⅠ限制酶位點3’端加有SacⅠ限制位點。
A．合成的IFNτ基因的分離用兩個寡核苷酸引物(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)將接頭通過聚合酶鏈反應連接到合成的IFNτ基因上。在5’端的接頭使得該合成的IFNτ基因以正確的讀框置于酵母表達載體pBS24Ub(Chiron Corp,Emeryville,CA)上的遍在蛋白編碼序列。此接頭還構建出一個遍在蛋白-IFNτ連接區(qū)域，可使得遍在蛋白序列在體內與IFNτ序列切離開來。5’寡核苷酸還編碼一個SacⅡ限制內切酶切點。3’寡核苷酸含有一個StuⅠ切點。
帶有合成的IFNτ基因的載體(實施例3)通過堿裂解法從E.coli“XLI-BLUE”菌株中分離。分離的載體用10mM Tris,pH8.0/1mMEDTA/10mM NaCl稀釋500倍。在100μl的體積里用Taq DNA聚合酶和引物SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:14進行PCR反應。擴增片段用SacⅡ和StuⅠ消化。消化后的片段連接到“pBLUESCRIT+(KS)”的SacⅡ和StuⅠ位點上。
得到的質粒命名為pBSY-IFNτ。用雙鏈DNA作為模板鑒定該DNA序列。
B．表達質粒的構建用SacⅡ和EcoRⅤ消化質粒pBSY-IFNτ，分離含有合成的IFNτ基因的片段。酵母表達載體pBS24Ub(Sabin等，1989；Ecker等，1989)用SalⅠ消化。用T4 DNA聚合酶產(chǎn)生平末端。載體DNA用酚抽提并用乙醇沉淀(Sambrook等，1989)?；厥盏木€性化質粒用SacⅡ消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，與從pBSY-IFNτ分離的SacⅡ-EcoRⅤ片段相連接。得到的重組質粒命名為pBS24Ub-IFNτ。
將重組質粒pBS24Ub-IFNτ轉化進E.coli。分離出含有IFNτ插入片段的重組克隆并用限制酶分析鑒定。從含有IFN-τ編碼序列的克隆中獲得的質粒DNA用于轉化S.cerevisiae(Rothstein,1986)。轉化混合物鋪于尿嘧啶缺乏培養(yǎng)基，于30℃孵育3-5天。然后將克隆在尿嘧啶和亮氨酸缺乏的培養(yǎng)基上劃線并保存(Rothstein,1986)。
C．表達實驗為了小量表達，從尿嘧啶和亮氨酸缺乏的培養(yǎng)基上挑取含有pBS24Ub-IFNτ的S.cerevisiae單菌落，在YEP培養(yǎng)基(1％酵母抽提物，2％的蛋白胨)上，誘導條件下含有1％葡萄糖而在非誘導條件下含有8％的葡萄糖，于30℃生長?；厥占毎呀馕锊⒁?5％的丙烯酰胺，0.4％甲叉丙烯酰胺進行SDS-PAGE(Sambrook等，1989)。分離的蛋白通過考馬斯亮蘭染色顯示。
將分離的細胞抽提物電轉移至NYTRAN紙上，利用單克隆抗體或對羊IFNτ的多克隆抗血清，通過免疫雜交特異顯示重組IFNτ。
為了大量表達，pBS24Ub-IFNτ在含有8％葡萄糖的5×尿嘧啶和亮氨酸缺乏的培養(yǎng)基中于30℃生長24小時。然后將培養(yǎng)物于含有1％葡萄糖的YEP培養(yǎng)基中稀釋20倍，進一步孵育24-36小時。
離心收集細胞，由50mM Tris,pH7.6,/1mM EDTA洗滌，重懸于含有1mM PMSF的洗滌緩沖液中。用Bead-beater儀(BiospecProducts,Bartlesville,OK)裂解細胞。裂解物以43000g離心20分鐘?；厥丈锨?，用于下面所述的純化步驟。
D．酵母細胞裂解物中roIFNτ的純化將上清上樣于1×10cm DEAE柱，并用10mM Tris,pH8.0洗滌。保留蛋白用300ml，在10mM Tris,pH8.0中的0-0.5M NaCl梯度洗脫。每次3毫升部分收集。含有重組子(roIFNτ)的第17-26管中的10微升樣品在15％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。凝膠用考馬斯亮蘭染色。
第18,19和20管部分含有最高量的roIFNτ。這些部分分別在1.5×90cm Sephadex S-200柱上樣，蛋白分成兩個峰。每個蛋白峰的液體(25μl)在15％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，蛋白用考馬斯亮蘭染色顯示。
合并純化的含有roIFNτ的部分，通過放射免疫試驗(Vallet等，1988)確定roIFNτ的量?？偟鞍诐舛韧ㄟ^Lowry蛋白試驗(Lowry等，1951)確定。
roIFNτ的微量測序顯示它與天然的IFNτ前15個氨基酸一致，確證了遍在蛋白/roIFNτ融合蛋白在體內得到正確加工。
純化的roIFNτ每毫克蛋白(n=3重復板)顯示出2至3×105單位的抗病毒活性，這與孕體條件培養(yǎng)物培養(yǎng)基中獲得的抗病毒活性(2×105/U/mg)相似。
實施例5人高分子量DNA的Southern Blot分析在加有肝素的管中收集來自健康供體的人靜脈血樣品，通過Ficoll-Isopaque梯度(1.077g/ml)(Sigrna Chemical Co.)的密度梯度離心分離外周血淋巴細胞。從這些細胞中分離出高分子量(HMW)DNA(Sambrook等，1989)。
兩個10μg的HMW DNA樣品用限制內切酶HindⅢ或PstⅠ(promega)于37℃消化2小時，DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠(Bio-Rad,Richmond,CA)上于75伏電泳分離8小時，將DNA片段轉移到尼龍膜上(IBI-International Biotechnoligies,Inc.,New Haven,CT)。將膜于80℃烘烤2小時，并在如下的預雜交溶液中于42℃孵育4小時5×SSC(1×0.15M NaCl,0.15M檸檬酸鈉)，50％v/v甲酰胺，0.6％(wt/vol)SDS,0.5％(wt/vol)脫脂奶粉，20mM Tris-HCl(pH7.5),4mMEDTA，和0.5mg/ml魚精DNA(Promega)。
放射性自顯影在PstⅠ消化的DNA中檢測到一個大約3.4kb的雜交信號帶，而在HindⅢ消化的DNA中檢測到較小的片段(3.0kb)。這些結果表明存在與OvIFNτcDNA探針互補的人DNA序列。
實施例6通過PCR分離人IFNτcDNA部分序列合成了兩個合成寡核苷酸(每個25mer)，它們是對應于OvIFNτcDNA序列上第231至255位(SEQ ID NO:13)和第566至590位(SEQ ID NO:14)的寡核苷酸(編號是相對于帽位點的，Imakawa等，1987)，這兩個引物分別包含限制內切酶PstⅠ和EcoRⅠ的切割位點。SEQ ID NO:13經(jīng)修改而從第569位起含有EcoRⅠ位點。
從下面的兩個cDNA文庫中的大約1×105個噬斑形成單位分離出DNA人足月胎盤(Clontech,inc.,Palo Alto,CA)和人足月細胞滋養(yǎng)層(Dr.J.F.Strauss,University of Pennsylvania,Philadelphia PA)。此DNA用于聚合酶鏈反應(PCR)擴增(Mullis,1987；Mullis等，1987；Perkin Elmer Cetus Corp.Norwalk CT)。擴增反應使用引物SEQID NO:13/SEQ ID NO:14，進行30個循環(huán)(45℃,1m；72℃,2m；94℃,1m)(溫度循環(huán)儀和試劑，Perkin Elmer Cetus)。
擴增產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳分離(100伏，Bio-Rad)并轉移到尼龍膜上(IBI)。膜在80℃烘烤2小時，按如上所述與32P標記的OvIFNτcDNA預雜交和雜交。濾膜用5×SSC/0.1％(wt/vol)SDS于42℃洗滌5分鐘，再用2×S8C/0.1％(wt/vol)SDS于42℃洗滌2分鐘。然后在增感屏中于-80℃暴露于X光膠片(XAR,EastmanKodak,Rochester,NY)24小時。檢測到一個與標記引物雜交的擴增產(chǎn)物。
再次按如上所述進行PCR。擴增產(chǎn)物用限制內切酶EcoRⅠ和PstⅠ(Promega)于37℃消化90分鐘。所得的DNA片段如上所述電泳分離，從凝膠上切下含有IFNτ擴增產(chǎn)物的條帶。通過電洗脫回收DNA片段，將其亞克隆到經(jīng)EcoRⅠ和/PstⅠ消化并去磷酸化的質粒pUC19上，并通過氯化鈣法(Sambrook等，1989)轉化入E.coli.菌株JM101(Promega)。分離質粒并通過雙脫氧終止法(Sanger等，1977；“SEQUENASE”反應，United States Biochemical,Cleveland,OH)對插入的擴增產(chǎn)物測序。確定這些核苷酸序列，并用“DNA STARSOFTWARE”(Madison,WI)程序將它們和由其推導出的氨基酸序列與其他IFNτ序列進行比較。
對這些克隆的序列的比較顯示出有4種不同的克隆來自人胎盤文庫的HuIFNτ6(299bp),HuIFNτ7(288bp)和HuIFNτ4(307bp)，它們的核苷酸序列顯示出95％的同一性；來自細胞滋養(yǎng)層文庫的克隆CTB35(HuIFNτ5；294bp)，它與HuIFNτ6和HuIFNτ4分別具有95％和98％的同一性。
實施例7全長人IFNτ基因的分離10毫克的PBMC HMW DNA用限制內切酶EcoRⅠ消化，在O.8％的瓊脂糖凝膠上電泳分析。從凝膠上切下大小范圍1.5至10kb(如，1.5-2.5kb,2.5-3kb)的一系列DNA樣品。DNA經(jīng)電洗脫并純化。用OvIFNτ引物如上對每個DNA樣品擴增。將每個產(chǎn)生陽性PCR信號的樣品DNA分子克隆到λgtll上(亞基因組λgtll文庫)。
A．含有與OvIFNτ互補序列的克隆的PCR鑒定然后將λgtll噬菌體鋪板，用32p標記的OvIFNτcDNA探針進行噬菌斑雜交和去除噬菌斑的雜交。鑒定出大約20個與探針雜交的克隆。
與探針雜交的噬菌斑進一步用上述的OvIFNτ引物進行PCR分析。將6個產(chǎn)生PCR陽性信號的噬菌斑純化。分離出這些克隆的噬菌體DNA，并用EcoRⅠ限制內切酶消化。DNA插入片段亞克隆到pUC19載體上，并通過雙脫氧核苷酸測序確定其核苷酸序列。
B．含有與PCR陽性噬菌體互補序列的克隆的雜交鑒定來自λgtll亞基因組文庫的重組噬菌體在E.coli.Y1080中繁殖，并與E.coli.Y1080一起以大約20000個噬菌體/150mm平板的密度鋪板。將其與來自上面分離的6個人IFNτcDNA克隆之一的32p標記探針雜交。用雙層醋酸纖維濾膜覆蓋這些平板。
對顯示出陽性雜交信號的克隆進一步掃描和純化。分離出雜交陽性克隆的噬菌體DNA，用EcoRⅠ消化，將其亞克隆入pUC19載體并測序。然后對序列信息進行分析。
1．HuIFNτ1三個克隆得到了位于距離mRNA帽位點800多個堿基的重疊的序列信息(對克隆進行雙向測序)。合并的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，其預測的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。對由該基因預測的成熟蛋白序列(SEQ ID NO:12)與OvIFNτ預測的序列的比較見圖3。
2．HuIFNτ2,HuIFNτ3對另外兩個顯示出陽性雜交信號的克隆(HuIFNτ2,HuIFNτ3)也進行了掃描、純化，噬菌體DNA也如上進行了亞克隆和測序。這兩個克隆的序列如圖19A和19B所示。正如可從圖19A和19B中看出的，兩個克隆的核苷酸序列(HuIFNτ2,HuIFNτ3)都與HuIFNτ1和OvIFNτ同源。
HuIFNτ2(SEQ ID NO:29)可能是個假基因，因為它在第115-117位含有一個終止密碼子。該序列，SEQ ID NO:29，未提供前導序列。前導序列如圖20A所示。從圖20A所示的HuIFNτ2的序列可以看出，在成熟的HuIFNτ1中存在的第一個氨基酸(CYS殘基)并不存在于HuIFNτ2序列中。因此，如SEQ ID NO:29所示預測的氨基酸序列相當于一個不帶有第一個CYS殘基和原有終止密碼子的成熟的IFNτ蛋白。
核酸編碼序列中原有的終止密碼子可通過標準方法用一個氨基酸密碼子，例如編碼GLN的密碼子，替換掉這個終止密碼子。氨基酸GLN在其他的人IFNτ(HuIFNτ)分離產(chǎn)物的這個位置上存在。如果愿意，標準的重組操作可以引入這個起始的CYS殘基。
HuIFNτ3(SEQ ID NO:31)編碼人IFNτ蛋白。其翻譯的全部蛋白的氨基酸序列，包括前導序列，如SEQ ID NO:32所示。其翻譯的成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
實施例8通過RT-PCR分析HuIFNτmRNA的存在對人胎盤cDNA文庫和構建自第15-16天的孕體的羊cDNA文庫通過如上所述與OvIFNτcDNA探針雜交進行了分析。在瓊脂糖凝膠上大小分離cDNA并轉移到濾膜上(Maniatis等，1982；Sambrook等，1989)。用OvIFNτ探針的Southern blot分析顯示來自人cDNA文庫的放射性自顯影信號約為從OvIFNτcDNA文庫中獲得的信號的1/100。
用逆轉錄酶-PCR(RT-PCR)方法(Clontech Laboratories,Palo AltoCA)分析人足月胎盤和羊膜細胞中HuIFNτmRNA的存在。
從人胎盤、羊膜細胞和羊孕體中分離出的總細胞RNA(tcRNA)用引物SEQ ID NO:14進行逆轉錄。然后在反應中加入引物SEQ IDNO:13進行40個循環(huán)的聚合酶鏈反應。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上大小分離并轉移到濾膜上。濾膜上的DNA與32P標記的OvIFNτ和HuIFNτcDNA雜交。分析結果表明在胎盤附屬物中存在人IFNτmRNA。羊膜細胞也表達相應于OvIFτ引物和人探針的信息。
此外，還對從成年人淋巴細胞分離的tcRNA中HuIFNτ的存在進行了RT-PCR分析。密度計數(shù)分析表明HuIFNτmRNA存在于淋巴細胞中。
實施例9原位雜交A．組織對來自4個健康的、不同的足月的和頭三月期的人胎盤的半連續(xù)5-μ石蠟包埋切片進行了實驗。
B．cDNA探針的制備從來自OvIFNτ擴增文庫的cDNA克隆中，將一個相應于OvIFNτcDNA的#77-736位堿基(#1位堿基為帽位點，OvIFNτcDNA的開放閱讀框為#81-665位堿基，圖7)的片段亞克隆到轉錄載體pBS上(New England Biolabs)。分離、亞克隆了幾個pBS克隆，并對其核苷酸進行了測序。從該克隆中將一個3’端片段(#425-736位堿基)用限制內切酶NlaⅣ和EcoRⅠ切下，并克隆到轉錄載體pBS上。該載體命名為pBS/OvIFNτ。
線性化此pBS/OvIFNτ質粒后，利用T7RNA聚合酶(Stratagene)通過體外轉錄(Sambrook等，1989)合成了一個反義cRNA探針。在轉錄反應中使用了痕量的3H-CTP(NEN-DuPont,Cambridge,MA)。地高辛標記的dUTP結合到cRNA上，通過TCA沉淀和閃爍計數(shù)估算產(chǎn)率。
C．雜交使用該反義RNA探針，按照Lawrence等(1985)所述及如下的修改進行原位雜交。去石蠟并水合的切片在室溫下于含有5mM MgCl2的磷酸緩沖鹽(PBS)中預雜交10分鐘。切片上的核酸于65℃在50％的甲酰胺/2×SSC中變性。切片在含有0.3μg/ml地高辛標記的cRNA探針的雜交混合液中于37℃孵育過夜，然后于37℃在50％的甲酰胺/1×SSC中洗滌30分鐘。最后于室溫下在1×SSC中和O.1×SSC中各洗滌30分鐘。切片用0.5％Triton X-100(Sigma)和O.5％脫脂奶粉封閉30分鐘。
用純化的綴合堿性磷酸酶的綿羊地高辛Fab片段(Boehringer-Mannheim)檢測雜交信號。除去未結合抗體后，加入氮藍四唑/5-溴-4氯-3-吲哚-磷酸底物(Promega)和左旋四咪唑(Bector Laboratories,Burlingame,CA)，產(chǎn)生比色底物來做信號檢測。組織用甲基綠染色，脫水，并制成標本。
作為對照，一些組織用100μg/ml的胰RNaseA(Sigma)于37℃預處理30分鐘。RNase在切片上用400單位的RNase抑制劑(Promega)滅活。然后切片用250ml的PBS/5mM MgCl2洗滌兩次。在其他的對照實驗中，用tRNA(Sigma)替換地高辛探針。
在三次用不同的OvIFNτcRNA探針濃度和封閉試劑的獨立實驗中，在所有的足月的和頭三月期的胎盤組織中均觀察到了特異雜交。
頭三月期胎盤絨毛由一個外層的合胞滋養(yǎng)層、一個底層的細胞滋養(yǎng)層、以及一個含有各種間充質細胞的中央基質區(qū)組成，在其細胞滋養(yǎng)層細胞中表現(xiàn)出最高的IFNτ轉錄水平。而在合胞滋養(yǎng)層和基質細胞中都表現(xiàn)出低強度但可檢測到的水平。相類似的轉錄表達類型也顯現(xiàn)在足月組織的胚胎絨毛中，但是檢測到的信號水平很低。頭三月期存在于母血空間中的外絨毛滋養(yǎng)層顯現(xiàn)出最強的信號和染色陽性。
實施例10IFNτ的抗病毒活性在抗病毒試驗中對純化至同質性的OvIFNτ的相對比活性進行了評估。抗病毒試驗基本上按照上面實施例2所述進行。通過用Madin-Darby牛腎(MDBK)細胞或者綿羊正常成纖維細胞(Shnf)進行的抗病毒試驗所獲得的比活性以抗病毒單位/mg蛋白表示。所有樣品同時試驗以消除試驗內差異。如表3所示，結果為4次測定的平均值，其標準偏差小于平均值的10％。
表3 IFNτ和已知的IFN的抗病毒活性
無論比rBoIFNα還是比rBoIFNγ,IFNτ都具有更高的比活性(表3)。rHuIFNα的NIH標準制備物具有相似的比活性，而商業(yè)購買的rHuIFNα顯示出較低的抗病毒比活性。比較的相對抗病毒活性用?；蜓蚣毎C實。
實施例11IFNτ的抗逆轉錄病毒活性和細胞毒性作用在暴露于貓免疫缺損逆轉錄病毒的貓外周血淋巴細胞中，對高度純化的OvIFNτ測試其抗逆轉錄病毒活性和細胞毒性作用。該慢病毒在貓中導致慢性的類似AIDS的綜合癥，是一個人AIDS的模型(Pederson等，1987)。該病毒在外周血淋巴細胞中的復制通過隨時間變化的培養(yǎng)上清中逆轉錄酶的活性來監(jiān)測。試驗的數(shù)據(jù)如表4所示。
表4 OvIFNτ對FⅣ復制的作用
OvIFNτ的加入導致逆轉錄酶(RT)活性快速的，劑量依賴的降低(表4)。當濃度低至0.62ng/ml時IFNτ就可抑制病毒的復制，而更高的濃度(40ng/ml)對RT活性具有更大的作用，但卻對細胞沒有毒性效應。該結果提示當細胞在OvIFNτ存在下培養(yǎng)時，貓免疫缺損病毒的復制與對照值相比較顯著降低了。
即使培養(yǎng)基中IFNτ存在濃度達到40ng/ml時，IFNτ對逆轉錄病毒宿主細胞也不產(chǎn)生細胞毒性效應。
實施例12IFNτ對HIV感染的人外周血淋巴細胞的作用還測試了IFNτ抗HIV對人細胞感染的活性。已經(jīng)感染了HIV的人外周血淋巴細胞(Crowe等，1987)用不同濃度的OvIFNτ處理。HIV在外周血淋巴細胞中的復制通過隨時間變化的培養(yǎng)上清中逆轉錄酶的活性來監(jiān)測。逆轉錄酶的活性基本上按照Hoffman等(1985)的方法測定。試驗的數(shù)據(jù)如表5所示。
表5 OvIFNτ對人外周血淋巴細胞中HIV復制的作用
如表5所示，OvIFNτ的濃度產(chǎn)生了顯著的抗病毒效應。只有10ng/ml的濃度在6天后就導致RT活性50％的降低。而500ng/ml的濃度在10天中導致了RT活性90％的降低。
經(jīng)IFNτ以一定的濃度范圍處理3-13天后，人外周血淋巴細胞的存活性通過錐蟲藍排除法測定。存活性分析的結果如表6所示。
表6 OvIFNτ對HIV感染的人外周血淋巴細胞存活性的作用
<p>表6的數(shù)據(jù)表明沒有證據(jù)顯示出由于IFNτ施用而產(chǎn)生的細胞毒性效應。
實施例13細胞生長的抑制還測試了IFNτ對細胞生長的作用。通過集落抑制試驗來測試抗細胞生長活性。人羊膜(WISH)或MDBK細胞以低細胞密度鋪板，形成源于單細胞的集落。細胞在24孔板上以200或400個細胞/孔，于加有2％胎牛血清(FBS)和基本與非基本氨基酸的HMEM中培養(yǎng)。將不同稀釋度的干擾素加到三個平行孔內，將板孵育8天以形成集落。集落用晶紫染色并計數(shù)。用含有5％的“耗盡”培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天作細胞周期分析。WISH細胞無需同步即可使用。
為了測試IFNτ活性，細胞以2.5×105細胞/孔轉鋪于含有10％FBS的HMEM的6孔板上。單獨或與肽聯(lián)合加入不同稀釋度的OvIFNτ至終體積1ml。培養(yǎng)板在5％CO2于37℃孵育12,15,18,24，或48小時。細胞用胰蛋白酶處理，低速離心收集并洗滌。吸干細胞沉淀，每管中加入250μl核染色溶液(5mg碘化丙錠,0.3ml NP40和0.1gm檸檬酸鈉，溶于100ml蒸餾水中)。管子在室溫下孵育。10分鐘后，每管中加入250μl的RNase(500單位/ml于1.12％檸檬酸鈉中)繼續(xù)孵育20分鐘。核用44μm網(wǎng)過濾，在FACstar(Becton Dickinson,Mountain View,CA)上用DNA Star2.0軟件分析。
在細胞生長試驗中使用了牛上皮細胞系MDBK，還使用了人羊膜細胞系WISH,OvIFNτ對集落的大小和數(shù)量都抑制。羊IFNτ比人IFNα對人細胞系更為有效；故它具有有效的種間活性。其活性是劑量依賴性的，在濃度低至1單位/ml時也可觀察到對增殖的抑制。濃度高達50000單位/ml(抗病毒活性/ml)時使增殖停止，但細胞存活性卻沒有削弱。
利用碘化丙錠染色的WISH細胞用流式細胞器進行的細胞周期分析表明，經(jīng)48小時的OvIFNτ處理后處于G2/M期的細胞比例增加了。因此，IFNτ抑制細胞通過S期。OvIFNτ的抗增殖效應早在培養(yǎng)物抑制12小時后就可觀察到并保持6天。
上述結果都顯示出IFNτ的抗增殖效應而又具有低細胞毒性。
實施例14IFNτ進一步的抗增殖效應對一個大鼠細胞系和一個牛細胞系研究了OvIFNτ的抗增殖效應。用3H-胸腺嘧啶的摻入率來評測細胞增殖比率。
在加有3％的右旋糖苷包被的活性炭脫色的控制加工血清替代物2(charcoal stripped Controlled Process Serum Replacement2,CPSR2,Sigma)和5％的右旋糖苷包被的活性炭脫色的胎牛血清(FBS)的無酚紅DME-F12培養(yǎng)基中接種大鼠細胞(MtBr7.c5)或牛腎(MDBK)細胞。附著約15-18個小時后，用無血清的DME-F12培養(yǎng)基洗滌細胞一次。將培養(yǎng)基換成無酚紅的DME-F12培養(yǎng)基，其中加有3％脫色的CPSR 2,1％脫色的FBS(“3/1”培養(yǎng)基)或含有不同單位的抗病毒活性(經(jīng)干擾素的皰狀口炎病毒激發(fā)試驗確定(實施例2))的OvIFNτ的3/1培養(yǎng)基。用溶有OvIFNτ的同樣稀釋度的緩沖液(未稀釋緩沖液=10mM Tris,330mM NaCl,[TS])作對照。
細胞用3H-胸腺嘧啶脈沖標記2小時，再有約48小時的后處理。通過閃爍計數(shù)確定三氯乙酸(TCA)沉淀的摻入計數(shù)。每次處理包括三次重復實驗。OvIFNτ的平均值與含有可比稀釋度的載體TS緩沖液樣品相比較。實驗結果如表7所示。
表73H-胸腺嘧啶的摻入
如表7所示，OvIFNτ對每個測試的細胞系都強烈地降低了細胞增殖比率(根據(jù)胸腺嘧啶的摻入)。
實施例15IFNτ對人腫瘤細胞系的抗增殖效應通過經(jīng)OvIFNτ處理的細胞中3H-胸腺嘧啶的摻入比率來測定OvIFNτ對人腫瘤細胞系的抗增殖活性。
在生長于懸浮液中的腫瘤細胞系的實驗中，將1ml的細胞按2.5-5×105細胞/孔鋪于24孔板。在三個重復的孔內加入適當?shù)脑噭?00,1000或10000單位/ml的OvIFNτ，或相當?shù)目共《緷舛鹊膔HuIFNα2A(Lee Biomolecular)。孵育48小時后，通過錐蟲藍排除法對細胞計數(shù)測定生存率。
貼壁腫瘤細胞系按2.5×105細胞/孔鋪于6孔板上。如上所述用干擾素處理，但在計數(shù)前先胰酶消化。
通過Scheffe‘s F測驗的差異分析評測，不同的處理間呈現(xiàn)出顯著的區(qū)別。利用碘化丙錠通過流式細胞計數(shù)器進行細胞周期分析。
A．乳腺癌細胞從加有3％的右旋糖苷包被的活性炭脫色的CPSR2和5％的右旋糖苷包被的FBS的無酚紅DME-F12培養(yǎng)基中處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)物，轉種人MCF7乳腺癌細胞。附著大約15-18小時后，用無血清的DME-F12培養(yǎng)基洗滌細胞一次。將培養(yǎng)基換成無酚紅的DME-F12培養(yǎng)基，其中加有3％脫色的CPSR2,1％脫色的FBS(“3/1”培養(yǎng)基)或含有一定單位的抗病毒活性(經(jīng)干擾素的皰狀口炎病毒激發(fā)試驗確定)的OvIFNτ的3/1培養(yǎng)基。用溶有OvIFNτ的同樣稀釋度的緩沖液(未稀釋緩沖液=10mM Tris,330mM NaCl,[TS])作對照。細胞用3H-胸腺嘧啶脈沖標記2小時，再有約48小時的后處理。
通過閃爍計數(shù)確定三氯乙酸(TCA)沉淀的摻入數(shù)。每次處理包括三次重復實驗。OvIFNτ的平均值與含有可比稀釋度的載體TS緩沖液樣品相比較。實驗結果如表8所示。
表8 3H-胸腺嘧啶的摻入
可從表7所示的結果看出，OvIFNτ能夠實際地降低人癌細胞系中3H-胸腺嘧啶的摻入。這顯示了OvIFNτ在抑制腫瘤細胞增殖，尤其是乳腺腫瘤細胞增殖上的效應。
B．人早幼粒細胞白血病基本上如上面對MDBK細胞那樣，用HL-60(人白血病)細胞(Foa等，1982；Todd等，1981)對OvIFNτ和IFNα抗病毒效應進行了比較。OvIFNτ和IFNα都抑制HL-60細胞的增殖。三次重復實驗的每一次結果以平均的％生長降低±SD的形式在圖4中表示。圖4表明OvIFNτ和IFNα都可以強烈地降低HL-60細胞的生長。在測試的各個濃度下兩個干擾素對生長的降低都超過了60％。在10000單位/ml時，OvIFNτ導致了大約80％的生長降低，而IFNα導致了100％的生長降低。
然而圖4的數(shù)據(jù)還表明，IFNα降低生長能力的一個實際因素是它對細胞的毒性效應。在10000單位/ml時，IFNα的毒性導致25％以下單細胞還保持有存活性。相反，在使用10000單位/ml的OvIFNτ時，近100％的細胞保持著存活性。
圖5中的數(shù)據(jù)顯示rHuIFNα具有細胞毒性。圖中，三次重復實驗的每一次結果以平均％存活性±SD的形式表示。
C．人皮膚T細胞淋巴瘤皮膚T細胞淋巴瘤HUT78對IFNτ處理的反應與HL-60一樣。OvIFNτ和IFNα都能夠降低HUT78細胞的生長，但是10000單位/ml的rHuIFNα使細胞數(shù)下降到低于原鋪板的數(shù)量(5×105)。這表明細胞存活性降低至大約60％。
通過流式細胞計數(shù)器進行的細胞周期分析表明，經(jīng)兩種干擾素處理48小時后處于細胞周期的G2/M相的細胞比率增加了(表9)。在表9中，三次重復實驗的每一次結果以處于各個細胞周期時相中細胞的百分比表示。每個樣品分析了10000個細胞。
該結果可能是因為通過細胞周期的細胞進程減慢。在以10000單位/ml rHuIFNα處理的樣品中，存在有大部分細胞，很少向前發(fā)展多為兩側發(fā)散的，可視為死細胞。這點與增殖實驗中獲得的數(shù)據(jù)一致，只有OvIFNτ抑制HUT78的增殖而不具有毒性。
表9 HUT78細胞周期分析
D．人T細胞淋巴瘤T細胞淋巴瘤細胞系H9比上面所述的腫瘤細胞系對IFN的抗增殖效應的敏感性略低。三次重復實驗的每一次結果以平均的％生長降低±SD的形式在圖10中表示。盡管rHuIFNα對H9細胞沒有毒性，但它在任何測試的濃度下都不能顯著地抑制細胞分裂。相反，OvIFNτ發(fā)現(xiàn)可以降低H9的生長約60％(圖10)。因此，OvIFNτ是該T細胞淋巴瘤有效的生長抑制劑。
上述結果既顯示出了IFNτ的抗增殖效應也顯示除了它的低毒性。
實施例16用OvIFNτ的初步的體內治療三組4只C57B1/6小鼠，每組從尾靜脈給入2.5×104的B16-F10細胞B16-F10是一種同系鼠移植性腫瘤，選用它是因為它的高發(fā)性肺轉移(Poste等，1981)。引入腫瘤細胞的第3天開始干擾素處理。每只小鼠，連續(xù)3天，每天接受100μl的空白的PBS，或者含有1×105單位OvIFNτ的PBS，或者含有1×105單位的重組鼠IFNα(MuIFNα)的PBS。
第21天處死小鼠，其肺保存于10％的緩沖福爾馬林。在對照小鼠(PBS)、經(jīng)OvIFNτ處理的小鼠(OvIFNτ)、和經(jīng)MuIFNα處理的小鼠之間比較肺轉移率。該體內施甩的結果顯示OvIFNτ強烈地降低肺腫瘤。此結果支持可將IFNτ在體內用作為一種有效的抗腫瘤藥劑。
實施例17IFNτ肽片段的競爭結合A．基于IFNτ的肽對IFNτ和IFNα抗病毒活性的阻斷能力相應于全部的IFNτ序列合成若干重疊肽(圖6)。各個序列通過將每個氨基酸親水值之和除以氨基酸總數(shù)計算出平均親水值。氨基酸親水值取自Kyte等(1982)。
這些肽在分子量上大體相同而在整體的親水性上略有差異。雖然有這些差異，但所有的肽在滴度大于1∶3000的兔抗血清產(chǎn)物的ELISA(Harlow等，1988)試驗中都顯示出抗原性。
用這些肽抑制OvIFNτ和rBoIFNα的抗病毒活性(實施力2)。分析結果如圖12所示1mM N-和C-肽都有效地阻斷MDBK細胞中OvIFNτ的抗病毒活性。第三個肽，對應于第62-92位氨基酸，也降低了IFNτ的抗病毒活性(70％的抑制)。肽OvIFNτ(119-50)表現(xiàn)的抑制活性最小。OvIFNτ(34-64)和(90-22)肽沒有顯示出抑制活性。
按如下所述還測試了肽對OvIFNτ抗病毒活性的抑制。在OvIFNτ肽以不同濃度存在或不存在的情況下，將單層的Madin Darby牛腎細胞與40單位/ml的OvIFNτ一起孵育(見圖13)。圖13中的結果以對照的(即，不存在任何的競爭肽)抗病毒活性的百分比來表示。數(shù)據(jù)為6次重復實驗的平均值。數(shù)據(jù)顯示出在10-3M和3×103M時OvIFNτ(1-37),(62-92,(119-150)，和(139-172)的抑制顯著地不同于OvIFNτ(34-64)和(90-122)。在103M時OvIFNτ(139-172)與其它的肽有顯著的差異。通過Scheffe F測驗p＜0.05的差異分析來評測出顯著性。因此，OvIFNτ(1-37),(62-92,(119-150)，和(139-172)，尤其是(139-172)，可能為IFNτ受體的結合區(qū)域。
如下所述測試了OvIFNτ肽對牛IFNα(BoIFNα)抗病毒活性的抑制能力。在OvIFNτ肽以不同濃度存在或不存在的情況下，將單層的Madin Darby牛腎細胞與40單位/ml的牛IFNα一起孵育。結果如圖14所示，以不存在OvIFNτ肽的對照抗病毒活性的百分比來表示。數(shù)據(jù)為4次重復實驗的平均值。結果顯示出在10-3M時OvIFNτ(62-92,(119-150)，和(139-172)的抑制顯著地不同于OvIFNτ(1-37),(34-64)和(90-122)。通過Scheffe F測驗p＜0.05的差異分析來評測顯著性。因此，OvIFNτ(62-92,(119-150)，和(139-172)，尤其是(139-172)，可能為IFNτ和牛IFNα共同的受體結合區(qū)域。
如下所述還測試了OvIFNτ肽對人IFNα抗病毒活性的抑制能力。在OvIFNτ肽以不同濃度存在或不存在的情況下，將單層的MadinDarby牛腎細胞與40單位/ml的人IFNα一起孵育。結果以不存在OvIFNτ肽的對照抗病毒活性的百分比來表示。數(shù)據(jù)如圖15所示，為3次重復實驗的平均值。在10-3M時OvIFNτ(139-172)與其它的肽有顯著的差異。通過Scheffe F測驗p＜0.05的差異分析來評測出顯著性。因此，OvIFNτ(139-172)可能為IFNτ和各種IFNα共同的受體結合區(qū)域。
上述的OvIFNτ肽對IFNγ抗病毒活性沒有表現(xiàn)出作用。如下所述評測了肽對牛IFNγ抗病毒活性的抑制能力。在OvIFNτ肽以不同濃度存在或不存在的情況下，將單層的Madin Darby牛腎細胞與40單位/ml的人牛IFNγ一起孵育。結果以不存在OvIFNτ肽的對照抗病毒活性的百分比來表示。數(shù)據(jù)如圖16所示，為3次重復實驗的平均值。通過Scheffe F測驗p＜0.05的差異分析評測，各個肽沒有顯著差異。
兩個合成肽OvIFNτ(1-37)和(139-172)也阻斷OvIFNτ的抗FIV和抗HIV的活性。在14天的時間內對FIV感染的FET-1細胞(1×106/ml)和HIV感染的HPBL細胞(1×106/ml)監(jiān)測逆轉錄酶(RT)的活性(實施例12和13)。使用100ng/ml的OvIFNτ和200μM的肽。從一個典型的實驗中所得的數(shù)據(jù)以cpm/ml培養(yǎng)物上清來表示，圖11A所示的為FIV感染的細胞，圖11B為HIV感染的細胞。OvIFNτ的N-端和C-端都與其抗逆轉錄病毒的活性相關。兩個肽都阻斷FIT RT活性，但是只有C-端肽OvIFNτ(139-172)在貓細胞系Fc9中是泡狀口炎病毒活性的有效抑制劑。因此Ⅰ型IFN的C-端區(qū)域可能結合受體的共同位點，而N-端區(qū)域可能與特定功能的產(chǎn)生有關。
B．抗肽血清還檢測了抗肽的抗血清對OvIFNτ抗病毒活性的抑制能力。按如下所述評測抗肽的抗血清對OvIFNτ抗病毒活性的抑制能力。在1∶30稀釋的免疫前血清或者上述每種OvIFNτ肽的抗血清存在下，將單層的MDBK細胞與20單位/mlOvIFNτ一起孵育。圖17中的數(shù)據(jù)來自兩次重復實驗，以相對于適當?shù)拿庖咔把?，抗肽抗血清產(chǎn)生的對OvIFNτ抗病毒活性的抑制的百分比±標準差表示。通過Scheffe F測驗p＜0.05的差異分析評測。與肽對抗病毒活性的抑制一致，含有與OvIFNτ(1-37),OvIFNτ(62-92)和OvIFNτ(139-172)免疫反應的抗體的血清，也是OvIFNτ抗病毒活性的最有效的抑制劑，他們所含的直接針對N-端和C-端肽的抗體是最為有效的。
同樣的血清也用于檢測對IFNτ與其受體結合的作用。
IFNτ結合試驗如下進行。在25μ10.5M磷酸鉀緩沖液，pH7.4，和10μl氯胺-T(5mg/ml)中，將5μl的IFNτ用500μCi的Na125I(15mCi/μg；Amersham Corporation,Arlingto Heights,IL)碘化2分鐘(Griggs等1992)。碘化蛋白的特異活性為137μCi/μg。結合試驗中，將單層的MDBK細胞與低聚甲醛混合，并用5％的脫脂奶粉封閉。在1∶30稀釋的含有抗IFNτ肽抗體的血清或者適當?shù)拿庖咔把宕嬖谙?，將細胞與2nM125I IFNτ一起在加有1％BSA的磷酸緩沖液中于4℃孵育2小時。通過與100倍摩爾數(shù)過量的非標記IFNτ一起孵育來評測特異結合。例如，總結合計數(shù)是6850±133，而100倍摩爾數(shù)過量的OvIFNτ產(chǎn)生4398±158次計數(shù)/分鐘。孵育后，單層細胞洗滌三次，用1％的十二烷基磺酸鈉固定，作放射性計數(shù)。來自3次重復實驗的數(shù)據(jù)如圖18所示，以相對于適當?shù)拿庖咔把?，抗肽抗血清產(chǎn)生的對OvIFNτ抗病毒活性的抑制的百分比平均值±標準偏差表示。通過Scheffe F測驗的差異分析來評測出顯著性。
同樣的血清(含有與OvIFNτ(1-37),OvIFNτ(62-92)和OvIFNτ(139-172)免疫反應的抗體)也是MDBK細胞上125I-IFNτ與其受體結合的最有效的抑制劑。血清與其它IFNτ-衍生肽免疫反應能力的缺乏，不隨抗OvIFNτ滴度的變化而改變。因為，每種血清相對于這三種抑制血清，對其相應的肽具有相同的或更高的滴度在用ELISA評測每種血清抗全長OvIFNτ分子反應能力的試驗中得到了同樣的結果。
這些肽雖然表面上能結合干擾素受體，但是他們本身在細胞中并不能夠產(chǎn)生類似干擾素的效應。
C．抗增殖活性利用合成肽也測試了IFNτ的抗增殖活性中功能上重要的位點(表10)。利用MDBK細胞同上所述檢測細胞增殖。在實驗1和2中以5×105細胞/孔，實驗3中以1O×5細胞/孔的濃度培養(yǎng)細胞，并以空白培養(yǎng)基為對照，加入濃度為300單位/ml的IFNτ和1M肽，培養(yǎng)48小時。每次計數(shù)2個重復孔，共進行3次重復實驗。在統(tǒng)計分析中，以空白培養(yǎng)基的數(shù)據(jù)為基準，通過最小顯著性差異多重比較測驗(p＜0.05)的差異分析對數(shù)據(jù)進行評測。
表10 肽對IFNτ抗病毒活性抑制
在兩天的時間內對MDBK細胞增殖的監(jiān)測中，細胞數(shù)增加大約兩倍，具有95％以上的存活性。加入300單位/ml的OvIFNτ，則完全抑制了細胞的增殖而細胞存活性沒有下降。OvIFNτ(119-150)是IFNτ抗病毒活性的最為有效的抑制劑。
可抑制OvIFNτ與受體結合的IFNτ(119-150)的抗血清，也對OvIFNτ的抗增殖效應起負作用。幾種其他的肽，特別是IFNτ(139-172)，雖然也OvIFNτ的對抗增殖效應起負作用，但程度較小。
實施例18
IFNτ和IFNα的干擾素受體的差異識別A．在MDBK細胞上試驗OvIFNτ和人IFNαA的相對毒性以生長于96孔板上的MDBK細胞進行細胞毒性試驗。測試細胞用不同濃度的(如圖中所示)IFNτ處理，IFNτ溶于加有2％新生小牛血清的100μl的EMEM中，對照細胞只用空白的溶液處理，試驗重復三次。將OvIFNτDNA編碼序列克隆到pHIL-S1 Pichia表達質粒(Invitrogen,San Diego,CA)上，質粒以BglⅡ酶切，按供應商的說明用線性質粒轉化Pichia pastoris(菌株GS115；Invitrogen)原生質體。重組的OvIFNτ蛋白通過轉化的His+Mut-酵母細胞而表達，并通過離子交換和羥磷灰石層析純化至同質水平(0.8×105單位/mg)。純化的重組人IFNαA得自Biosource International(Camarillo,CA)。
細胞溫育于37℃直到顯微鏡檢測到明顯的細胞死亡。細胞用結晶紫染色，洗滌平板并用2-甲氧基乙醇(甲基溶纖劑)浸取染料。在570nm測量洗脫染料的吸收值。
結果如圖22A和22B所示。IFNτ對MDBK細胞的毒性比IFNα至少低30倍。IFNα導致50％的細胞死亡的濃度為2500單位/ml，而相比之下IFNτ的濃度為85000單位/ml。這些結果進一步確定了IFNτ和IFNα在它們的細胞毒性效應上明顯地不同。
B．OvIFNτ不抑制IFNαA介導的細胞毒性按照剛才上面所述的細胞毒性試驗，檢測了作為IFNα細胞毒性效應的競爭性拮抗劑的IFNτ低毒性濃度的可能性。
第一個實驗如圖23A所示，在細胞中加入IFNτ(50000單位/ml)和/或IFNαA(50000單位/ml)，按照剛才上面所述的方法進行試驗。數(shù)據(jù)表明IFNτ的處理，以10倍高于IFNαA的濃度(但低毒性)，不阻斷IFNαA對MDBK細胞的毒性。
第二個實驗如圖23B所示，用IFNτ(25000單位/ml)于37℃處理細胞1小時，然后不去除IFNτ再加入IFNαA(5000單位/ml)。結果表明，在細胞中加入IFNαA之前1小時，加入5倍以上濃度的IFNτ不阻斷IFNαA的毒性。
和起來這些結果表明IFNτ對于IFNα細胞毒性效應只是一個弱的拮抗劑。考慮到這兩個Ⅰ型干擾素在結構和功能上的同源性(Jarpe等，1994)和他們在MDBK細胞上的特異抗病毒活性(Pontzer等，1988)，這是一個令人驚訝的發(fā)現(xiàn)。IFNτ不能阻斷IFNαA的細胞毒性，這表明這些IFN與Ⅰ型受體復合物結合的不同，可能啟動了不同的信號事件。
C．125I標記的IFNτ和IFNα與MDBK細胞的結合用Bolton-Flunter試劑(單[125I]碘衍生物～2000Ci/mmol,Amersham；1Ci=37GBq)，如Langer和Pestka(1986)所述標記IFNτ和IFNαA。標記蛋白的比活性為40-70μCi/μg。標記的IFN保持了完整的在MDBK細胞上的抗病毒活性，在4℃下至少4周內沒有變化。
按照對IFNαA所作的方法(Zoon等，1986)，進行了MDBK細胞上的結合試驗。將6孔板上鋪滿的MDBK單層細胞4℃預冷，加入適當濃度的溶于2ml完全生長培養(yǎng)基的標記或未標記的IFNs,4℃下對于125I-IFNαA溫育4小時，對于125I-IFNτ溫育過夜(＞17小時)，使得結合至飽和狀態(tài)。飽和度結合數(shù)據(jù)用“EBDA”程序(McPherson,1985)分析。
結果如圖24A(125I-IFNτ)和24B(125I-IFNαA)所示。在每個濃度下加入100倍過量的相應的未標記的IFN而確定非特異結合。減去這些非特異結合計算出特異結合。非特異結合對于IFNτ小于20％，對于IFNαA小于7％。數(shù)值以平均值±SE作圖。每個圖中的插圖為結合數(shù)據(jù)的Scatchard圖(B，結合；F，游離)。
數(shù)據(jù)表明，125I-IFNτ以高特異性與MDBK細胞結合(圖24A)。結合的Scatchard分析(圖24A的插圖)給出了一個近似的Kd值3.90×10-10M。該Kd值處于在不同的IFNα與不同的細胞類型的結合中的Kd值范圍內(10-11到10-9)(Rubinstein等，1986；Aguet等，1983)，并相似于重組牛IFNαD(3.5×10-10M)和重組牛IFNτ(3.7×10-10M)與牛子宮內膜結合的數(shù)值(Li和Roberts,1994)。但是，125I-IFNαA與MDBK細胞結合的Scatchard分析(圖24B的插圖)得出了一個近似的IFNαA Kd值4.45×10-11M。這與以前報道的(6.0×10-11M)相似(Zoon等，1986)。Scatchard作圖得到的125I-IFNαA總的受體濃度(4.62pM)與125I-IFNτ非常相似(4.22pM)。這些結果表明對MDBK細胞的IFN受體，IFNαA的Kd值比IFNτ的低10倍。而且，結果還提示，結合親和力的實質上的不同導致了IFNτ不能“競爭”受體而阻斷IFNαA毒性。
D．125I標記的IFNτ和IFNα與MDBK細胞的競爭結合進行競爭性結合實驗以確定IFNτ和IFNα結合于相同的受體。將6孔板上鋪滿的MDBK單層細胞以三份重復與所示濃度的未標記的IFNαA或IFNτ及0.2nM125I-IFNτ(圖25A)或0.02nM125I-IFNαA(圖25B)保溫。數(shù)值以相對于無競爭物存在的對照的百分比來表示。100％表示平均的特異結合對于125I-IFNτ是1673±51cpm(平均值±SE)，對于125I-IFNαA是1255.7±16.3cpm(平均值±SE)。對125I-IFNτ和125I-IFNαA，分別加入200nM未標記的IFNτ(11％的非特異結合)和20nM未標記的IFNαA(5％的非特異結合)以確定的其非特異結合，并從總的結合中減去。
IFNαA對125I-IFNτ結合MDBK細胞是一個有效的競爭劑(圖25A)。事實上，在以50％的水平抑制的結合上，IFNαA的效率是IFNτ本身的40倍。在用重組人IFNαD作為競爭劑時得到了相似的結果。另外使用125I-IFNαA進行的交叉競爭的研究表明，以50％的水平置換125I-IFNαA,IFNαA的效率比IFNτ高40倍以上。
這些結果表明，對于MDBK細胞上的IFN受體，IFNαA比IFNτ具有高的多的親和性，這與低10倍的Kd值相一致。而且，競爭實驗給出了一個解釋為什么過量的(5∶1)IFNτ不能阻斷IFNαA對MDBK細胞的毒性效應。IFNαA的高受體親和性提示IFNτ和IFNαA具有不同的受體識別，而解釋了為什么IFNτ不能阻斷IFNαA細胞的毒性效應。
E．針對IFNτ的N-端或C-端的抗血清對IFN與MDBK細胞結合的抑制對如實施例17中所描述的抗IFNτ肽IFNτ(1-37)(N-端；SEQID NO:5)和IFNτ(139-172)(C-端；SEQ ID NO:10)的兔抗血清檢測了它們對IFNα和IFNτ與MDBK細胞結合的阻斷能力。將96孔板上鋪滿的MDBK單層細胞，與0.3μM生物素?；腎FNα和IFNτ一起，在含有5％胎牛血清磷酸緩沖鹽溶液和1∶30稀釋的適當?shù)目寡逯惺覝叵聹赜?小時。用含有5％胎牛血清磷酸緩沖鹽溶液洗滌后，用對-硝基苯作為底物通過“EXTRAVIDIN”-堿性磷酸鹽結合使平板顯色(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)。按照供應商的說明用Immunopure NHS-LC-生物素?；噭┖?Pierce)進行IFNα和IFNτ的生物素酰化。按上面所述對125I標記的IFN的方法確定特異結合。
結果如圖26所示。實心柱代表抗N-末端的抗血清對IFNα和IFNτ與MDBK細胞結合的抑制，陰影柱代表抗C-末端的抗血清的抑制。數(shù)據(jù)以平均吸收值±SD表示。對照樣品用免疫前血清處理(空心柱)。
數(shù)據(jù)表明N-末端肽IFNτ(1-37)(SEQ ID NO:5)的抗血清特異阻斷IFNτ與MDBK細胞結合，但不阻斷IFNα。相反，C-末端肽IFNτ(139-172)(SEQ ID NO:10)的抗血清特異對IFNτ和IFNα與MDBK細胞結合都阻斷。這些發(fā)現(xiàn)與關于IFNτ(1-37)含有一個IFNτ特有的表位而有助于IFNτ在MDBK細胞上的結合與活性的假說相一致。此外，數(shù)據(jù)提示IFNα和IFNτN-末端不同的相互作用至少是部分地因為MDBK細胞受體的差異競爭。
F．在MDBK細胞中IFNτ和IFNα的劑量反應/占據(jù)曲線用上述的數(shù)據(jù)作為濃度的函數(shù)作圖，計算(ⅰ)最大抗病毒活性的百分比，(ⅱ)最大細胞毒性百分比，和(ⅲ)IFNα和IFNτ與MDBK細胞最大結合的百分比的劑量反應/占據(jù)曲線，或濃度效應曲線，如圖27A(IFNτ)和27B(IFNα)所示。利用泡狀口炎病毒通過致細胞病變效應抑制試驗(Armstrong,1981)對抗病毒活性定量，如實施例2所述，對IFNαA用2×108單位/mg的量為基準。來自細胞毒性劑量反應曲線和飽和結合曲線的數(shù)據(jù)再以最大值百分比作圖。通過MDBK細胞上2×108單位/mg的IFNα和0.8×108單位/mg的IFNτ的特異活性，從抗病毒單位來確定濃度。符號如下最大抗病毒活性的百分比(○)，最大細胞毒性百分比(□)，和最大結合的百分比(◇)。
結果表明細胞毒性與受體的飽和結合相關，而抗病毒活性涉及到受體的分部占據(jù)。就是說，毒性與Kd相關。IFNαA以比IFNτ高10倍的親和力結合于MDBK細胞，而在低得多的濃度下就具有毒性。這兩個IFN的特異抗病毒活性相似，IFNα為2×108單位/mg蛋白而IFNτ為0.8×108單位/mg蛋白，這與僅以較低的受體分部占據(jù)而得到最大抗病毒活性是一致的。
G．IFNτ和IFNαA對Tyk2,Stat1α和Stat2的磷酸化IFNs與受體的結合通過涉及到一系列磷酸化激活的酪氨酸激酶和轉錄因子的信號傳導機制在細胞中被解釋。因此進行了實驗以確定在激活Ⅰ型受體相關的酪氨酸激酶Tyk2和轉錄因子Stat1α和Stat2上，IFNτ和IFNαA的結合差異是否導致了明顯的變化。
在RPM1 1640培養(yǎng)基中的Dauli細胞(4-5×107個細胞/ml樣品)，用5000單位/ml的IFNτ或IFNαA刺激，或者37℃下不給與處理4分鐘(Tyk2)或10分鐘(Stat1α和Stat2)。然后將細胞在500μl冰冷的裂解緩沖液中4℃裂解20分鐘。裂解緩沖液含有50mM Tris HCl(pH7.4),150ml NaCl,2mM EDTA,2mM EGTA,50mM NaF,20mM B-磷酸甘油，2mM Na3VO4,0.05mM對-硝基苯酰-對-胍基苯甲酸(來自溶于二甲基甲酰胺的儲存液)，亮肽素(10μg/ml)，抑胃肽(10μg/ml)，抑肽酶(10μg/ml)，苯甲脒(5μg/ml),1mM苯甲基磺酰氟，10％(v/v)甘油，和1％(vol/vol)”NONIDET P-40”。
用1μg的抗-Tyk2抗體或者1μg抗Stat1α和1μg抗Stat2抗體的混合物對抽提物免疫沉淀，并進行免疫印跡后，用單克隆抗-磷酸酪氨酸(抗-PY)抗體(4G10)探測印跡，并用ECL(Amersham)檢測Tyk2,Stat1α和Stat2的酪氨酸磷酸化。然后印跡除去抗-py用Tyk2蛋白的抗體或Stat1和Stat2抗體的混合物再次探測。
結果表明在Tyk2磷酸化中IFNτ與IFNα同樣有效。未刺激的細胞中和用IFNs刺激的細胞中，在Tyk2的水平上沒有顯示出差異。IFNτ與IFNα對Stat1α和Stat2豆誘導出類似水平的磷酸化。而且，從未刺激和刺激的細胞中免疫沉淀的Stat1α和Stat2在蛋白水平上沒有顯示出差異。因此，IFNτ在其結構和功能上保持了IFNα相似性，而在激活這些涉及Ⅰ型受體的信號轉導蛋白上與IFNα相似。
實施例19對IFNτ的細胞效應和抗病毒效應進一步的分析A．抗HIV病毒的效應通過在感染HIV時用不同數(shù)量的重組羊IFNτ(OvIFNτ)或者重組人IFNαA處理人PBMC細胞，評測IFNτ抗HIV的抗病毒效應。在整個實驗中都加有IFNτ。在第7天和第14天測定p24產(chǎn)物(ELISA法(Wang等，1988,1989)，并與零藥物對照相比較)。分析結果如表11所示。
表11
這些實驗的數(shù)據(jù)得出的結論是，在相對低的濃度下，IFNα2a和IFNτ都能夠有效地降低HIV在人淋巴細胞中的復制。
B．在PBMC’s中的體外細胞毒性的測驗以5×105個細胞/ml接種人PBMC’s。細胞在第0天用3μg/mlPHA刺激。用重組人IFNα2A(濃度為10,100,1000和10000單位/ml)和IFNτ(濃度為2.6,26,260,2600,260000，和2600000單位/ml)處理細胞(用96孔平底板，每個濃度重復4次)。對照培養(yǎng)物中不加入干擾素。溫育4天后，用1μCi/孔的3H-胸腺嘧啶脈沖細胞9小時。收集細胞并測定標記的胸腺嘧啶在DNA中的摻入(圖8)。
在任何濃度的IFNτ下通過測量的胸腺嘧啶的摻入沒有發(fā)現(xiàn)細胞毒性。然而，rHuIFNα2在1000單位/ml下對細胞就具有毒性。
第二個實驗中，用IFNτ或人IFNα2A以100單位/ml或10000單位/ml的濃度處理相同的人PBMC’s。3天或8天的溫育后，存活的細胞通過流式細胞器計數(shù)。分析結果如表12所示。
表12
在用IFNτ處理的細胞中沒有發(fā)現(xiàn)細胞毒性。然而，用IFNα2a處理3天的細胞中有10％，處理8天的細胞中有49％的細胞死亡。
C．對肝細胞中乙肝病毒復制的抑制所用的細胞系，HepG2-T14，是一種人細胞，衍生自感染乙肝病毒(HBV)的肝細胞。該細胞系半穩(wěn)定地產(chǎn)生HBV病毒隨時間的延長，該細胞系產(chǎn)生的HBV細胞內DNA和分泌的病毒逐漸下降。為了獲得HBV DNA和病毒的最大產(chǎn)量，用deAZA-C(5-氮胞苷；Miyoshi等，1992)對該細胞預處理，以誘導病毒的產(chǎn)生。處理2-3天，誘導的數(shù)量是2的階數(shù)。
然后用IFNα或IFNτ以0,5000,10000,20000和40000單位/ml的水平處理細胞。
與無藥對照相比，所有水平的IFNα或IFNτ以2的階數(shù)降低了DNA產(chǎn)量。
D．對肝細胞中肝特異信使RNA的抑制用肝細胞系HepG2-T14(如上所述)測定IFNα或IFNτ對肝特異信使RNA的效應。將細胞與0,5000,10000,20000和40000單位/ml的IFNα或IFNτ一起溫育。利用對兩個mRNA特異的探針(Shoulders等，1982；Wallis等，1983)，通過雜交分析(Sambrook等，1989；Maniatis等，1982)檢測肝細胞特異的蛋白ApoE和ApoAl的信使RNA。
以高達40000單位的IFNα或IFNτ處理，都沒有發(fā)現(xiàn)ApoE和ApoAl的mRNA產(chǎn)量的降低。該結果提示，前面的實驗中病毒DNA復制的降低不是由于IFN對細胞看家活性的作用；降低更可能是由于對宿主中病毒復制的特異抑制。
E．IFNβ,IFNγ和IFNτ的體外毒性-L929細胞試驗利用鼠L929細胞系體外測定IFN處理的毒性。L929細胞用6000U/ml至200000U/ml的OvIFNτ或MuIFNβ處理。在時間為零時加入干擾素，細胞溫育72小時用結晶紫染色。通過測量405nm處的吸收值確定活細胞的百分比。
例舉的數(shù)據(jù)如圖21所示。數(shù)值以存活性百分比±標準差的形式表示，其中100％相當于只用空白溶液處理L929細胞的存活性。隨著IFNβ濃度的增加，L929細胞的存活性以劑量依賴的形式下降。相反，在測試的IFNτ的各個濃度下，細胞存活性都沒用表現(xiàn)出下降。這些數(shù)據(jù)表明不同于IFNβ,IFNτ在體外的高濃度下沒有毒性。
上述的結果綜合起來說明，無論在體內或在體外，IFNτ在IFNβ會導致毒性的濃度下基本上是無毒的。
F．IFNβ,IFNγ和IFNτ的體內毒性-細胞計數(shù)和重量的變化按如下所述測試了NZW小鼠中用IFNτ,IFNβ和IFNα(105U/注射)體內處理，對總白細胞(WBC)、總淋巴細胞的計數(shù)和體重的效應。以105U的濃度，總體積2mlPBS溶液，對幾組新西蘭白色(NZW)小鼠(Jackson laboratories,BarHarbor,ME)腹膜內注射(i.p.)干擾素(OvIFNτ,MuIFNβ和MuIFNα)。每組中包括3-4只動物。在注射前以及其后所選定的時間點(一般為12和24小時)，用血細胞計數(shù)器和標準的技術測定白細胞數(shù)(WBC)。在Wright-Giemsa染色的血涂片上進行差示W(wǎng)BC計數(shù)。注射前動物的體重范圍在20至23克。
結果總結在表13中。
表13通過白細胞計數(shù)和體重變化的百分比測定干擾素的體內毒性
在IFNτ處理的和未經(jīng)處理的小鼠之間，沒有發(fā)現(xiàn)WBC數(shù)，淋巴細胞數(shù)或體重變化的顯著差異。相反，IFNβ處理的小鼠在注射12小時后表現(xiàn)出31.7％的淋巴細胞脫阻抑，并至少在其后的12小時中繼續(xù)。IFNα處理的小鼠在注射12小時后表現(xiàn)出55.8％的淋巴細胞脫阻抑以及顯著的體重下降。這些數(shù)據(jù)表明，如外周血細胞計數(shù)和體重測量所證實的，不同于IFNβ和IFNα,IFNτ在上述的濃度下沒有體內毒性。
實施例20雜合干擾素融合蛋白的分離結合了抗-β半乳糖苷酶的Sepharose 4B樹脂購自Promega。將樹脂裝于2ml的柱子中，并用含有0.02％疊氮鈉的磷酸緩沖液溶液和10rmlTX緩沖液(10mM Tris緩沖液，pH7.4,1％抑肽酶)依次清洗。
將一個雜合干擾素的編碼序列克隆到λgtll的多克隆位點上。該嵌合的編碼序列在λgtll上同閱讀框地位于半乳糖苷酶編碼序列氨基端。將感染gtll/IFN的溶源性細菌接種于500ml NZYDT培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物于32℃通風培養(yǎng)至0.2至0.4個OD值，然后迅速升溫至43℃，于43℃水浴15分鐘以誘導gtll肽的合成，于37℃浴1小時。離心沉淀細胞，并用10ml裂解緩沖液(10mM Tris,pH7.4，含有2％”TRITON X-100和用前新鮮配制的1％抑肽酶)懸浮。
重新懸浮的細胞在液氮中速凍然后解凍，使得細胞基本上完全裂解。裂解物用DNaseⅠ消化細菌和噬菌體DNA，以裂解物粘度下降來確實。不溶性物質通過離心去除。
澄清的裂解液在Sepharose柱上上樣，將柱子的端口封閉，在室溫下置于旋轉器上振蕩2小時，在4℃下16小時。融合蛋白用0.1在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH10洗脫。通常，14ml的洗脫液穿過柱子，融合蛋白被洗脫于第4-6ml的洗脫液中。
含有融合蛋白的洗脫液在“CENTRICON-30”儀器(Amicon,Danvers,Mass.)中濃縮。最終的融合蛋白濃縮物重新懸浮于例如400μlPBS緩沖液。蛋白的純度用SDS-PAGE分析。
為了獲得單克隆抗體，將純化的融合蛋白和Freund佐劑一起皮下注射兔。在第0天和第21天注射大約1mg的融合蛋白，兔血清通常在第6和第8周收集。
實施例21抗hybIFN抗體的制備A．谷胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白的表達將一個雜合干擾素的編碼序列的嵌合核酸分子克隆到pGEX載體上(Boyer等，1992；Frangioni等，1993；Guan等，1991；Hakes等，1992；Smith,D.B.等，1988)。在pGEX載體(Smith,D.B.等，1988)中與谷胱甘肽-S-轉移酶蛋白(GST-sj編碼序列)同閱讀框地插入一個凝血酶切點序列。此修改的載體記作pGEXthr。雜合IFN(hybIFN)編碼序列同閱讀框地連接于sj26-凝血酶編碼序列(Guan等，。991；Hakes等，1992)。
將雜合干擾素編碼序列與線性化的載體相連接。連接混合物轉化入E.coli.中，選取氨芐青霉毒素抗性的菌落。從氨芐青霉素抗性的菌落中分離質粒，并用限制酶消化分析鑒定出含有IFN插入物的克隆(載體記作pGEXthr-hybIFN)。
將pGEXthr-hybIFN轉化E.coli.菌株XL-IBlue，并于37℃培養(yǎng)過夜。從隨機挑取的克隆中制備DNA。確定是否存在插入的編碼序列通常根據(jù)(ⅰ)限制酶切圖譜，(ⅱ)用標記的hybIFN探針進行雜交掃描(如，Southem分析)，或(ⅲ)直接的DNA序列分析。
B．融合蛋白的部分純化將pGEXthr-hybIFN克隆培養(yǎng)過夜。用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基1∶10地稀釋過夜培養(yǎng)物并繼續(xù)在37℃生長1小時。或者將過夜培養(yǎng)物1∶100稀釋并培養(yǎng)生長至0.5-1.0的OD值，然后加入IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖苷)。加入IPTG(GBICO-BRL,GaithersburgMD)至終濃度為0.2-0.5mM以誘導蛋白表達，溫育通常持續(xù)2-5小時，優(yōu)選地為3.5小時。
離心收集細菌細胞并用1/100培養(yǎng)物體積的MTPBS(150mMNaCl,16mM Na2HPO4,4mM NaH2PO4)重新懸浮。通過溶菌酶，超聲處理或Frech加壓使細胞裂解，并通過離心清除裂解物中的細胞碎片。
將一份經(jīng)IPTG誘導的含有細胞的pGEXthr-hybIFN培養(yǎng)物懸浮液，和一份IPTG誘導的只含有pGEXthr載體的培養(yǎng)物懸浮液，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后作Western blot分析，如下所述。
如果需要，抽提物可以用例如“CENTRICON 10”濾器進行超濾濃縮。
或者，通過谷胱甘肽瓊脂糖親和柱，按照Smith,D.B.等，1988所詳細描述的方法，部分純化融合蛋白。再此方法中，過夜培養(yǎng)100ml培養(yǎng)物。培養(yǎng)物稀釋到1升，并于37℃繼續(xù)培養(yǎng)1小時。用IPTG誘導融合蛋白的表達。誘導的培養(yǎng)物于37℃繼續(xù)培養(yǎng)3.5小時。收集細胞并用超聲波儀裂解細胞。沉淀細胞碎片，將澄清的裂解液上樣于一個谷胱甘肽“SEPHAROSE”柱。以幾個柱體積清洗柱子。帶有還原型谷胱甘肽的融合蛋白從柱子上洗脫下來，并進行透析。用凝血酶處理將IFN從結合的雜合蛋白上釋放出來。通過在層析柱上或在凝膠上的分子篩大小分部分離，將結合的雜合蛋白的sj26和hybIFN片段分離。
或者，通過凝血酶處理從層析柱上釋放出結合的雜合蛋白中的hybIFN部分。
C．抗融合蛋白的抗體將純化的Sj26/IFN融合蛋白，與Freund佐劑一起，對兔子進行皮下注射。在第0天和第21天注射大約1mg的融合蛋白，通常于第6周和第8周收集兔血清。第二只兔子類似地用從對照細菌裂解物中純化的Sj26蛋白免疫。
從下列細菌培養(yǎng)物中制備小量裂解物(1)以pGEXthr和含有hybIFN插入物的pGEXthr質粒感染的KM392細胞；和(2)以含有hybIFN插入物的λgtll感染的細胞。將小量裂解物和商業(yè)購買的β-半乳糖苷酶在SDS-PAGE上分部分離，并將條帶轉移至醋酸纖維膜上進行Western blot(Sambrook等，1989；Ausubel等，1988)。
總結預期的結果，來自對照(Sj26)兔的血清與各種Sj26和Sj26融合蛋白抗原發(fā)生免疫反應。來自用Sj26/hybIFN融合蛋白免疫的動物的血清，與所有的Sj26和含有hybIFN編碼序列的β-gal融合蛋白反應，這表明具有對抗原的特異免疫反應。沒有血清預期會對β-半乳糖苷酶起免疫反應。
通過親和層析(以固定的重組產(chǎn)物的hybIFN作為配基，基本上按實施例12中所述的關于抗β-半乳糖苷酶抗體的方法)對來自Sj26/hybIFN免疫的動物的血清中存在的抗hybIFN抗體進行純化。
雖然在本發(fā)明的描述中提及了特定的方法和實施方案，但是應當意識到可以不背離本發(fā)明而對其進行各種修改和變化。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人佛羅里達大學(ⅱ)發(fā)明名稱雜合干擾素組合物及其使用方法(ⅲ)序列數(shù)目55(ⅳ)聯(lián)系地址(A)地址Dehlinger &amp; Associates(B)街道350Cambridge Ave.,Suite 250(C)城市Palo Alto(D)州CA(E)國家美國(F)郵政編碼94306(ⅴ)計算機閱讀格式(A)介質類型軟盤(B)計算機類型IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatenIN Release#1.0,#1.25版(ⅵ)本申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日1997年4月11日(C)分類(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/631,328(B)申請日1996年4月12日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Sholtz,Charles K.
(B)注冊號38,615(C)文檔號5600-0201.41(ⅸ)電子通訊信息(A)電話415-324-0880(B)電傳415-324-0960(2)序列號1(SEQ ID NO:1)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度516個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲環(huán)狀(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(A)有機體Ovis aries(B)品系國內(C)發(fā)育階段囊胚(囊胚泡)(D)組織類型滋養(yǎng)外胚層(E)細胞類型單核滋養(yǎng)外胚層細胞(ⅶ)直接來源(B)克隆oTP-1a(ⅷ)基因組位置(C)單位bp(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置1..516(ⅹ)出版物信息(A)作者Ott,Troy LVan Heeke,GinoJohnson,Howard MBazer,Fuller W(B)題目Ⅰ型滋養(yǎng)層干擾素羊滋養(yǎng)層蛋白-1在啤酒糖酵母中的克隆和表達純化和抗病毒活性(C)期刊J.Interferon Res.
(D)卷11(F)頁357-364(G)日期1991(K)在SEQ ID NO:1中的相關殘基1-516(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1TGC TAC CTG TCG CGA AAA CTG ATG CTG GAC GCT CGA GAA AAT TTA AAA48Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1 5 10 15CTG CTG GAC CGT ATG AAT CGA TTG TCT CCG CAC AGC TGC CTG CAA GAC96Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30CGG AAA GAC TTC GGT CTG CCG CAG GAA ATG GTT GAA GGT GAC CAA CTG 144Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu35 40 45CAA AAA GAC CAA GCT TTC CCG GTA CTG TAT GAA ATG CTG CAG CAG TCT 192Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60TTC AAC CTC TTC TAC ACT GAA CAT TCT TCG GCC GCT TGG GAC ACT ACT 240Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80CTT CTA GAA CAA CTG TGC ACT GGT CTG CAA CAG CAA CTG GAC CAT CTG 288Lcu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu85 90 95GAC ACT TGC CGT GGC CAG GTT ATG GGT GAA GAA GAC TCT GAA CTG GGT 336Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly100 105 110AAC ATG GAT CCG ATC GTT ACT GTT AAA AAA TAT TTC CAG GGT ATC TAC 384Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr115 120 125GAC TAC CTG CAG GAA AAA GGT TAC TCT GAC TCC CCT TGG GAA ATC GTA 432Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140CGC GTT GAA ATG ATG CGG GCC CTG ACT GTG TCG ACT ACT CTG CAA AAA 480Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys145 150 155 160CGG TTA ACT AAA ATG GGT GGT GAC CTG AAT TCT CCG 516Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro165 170(2)序列號2(SEQ ID NO:2)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度172個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離一個成熟的OvIFNτ蛋白的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu35 40 45Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu85 90 95Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly100 105 110Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr115 120 125Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys145 150 155 160Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro165 170(2)序列號3(SEQ ID NO:3)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度516個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)原始來源(C)個體分離編碼一個成熟的人τ-干擾素蛋白，HuIFNτ1的合成的核苷酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3TGTGACTTGT CTCAAAACCA CGTTTTGGTT GGTAGAAAGA ACTTAAGACT ACTAGACGAA 60ATGAGACGTC TATCTCCACG CTTCTGTCTA CAAGACAGAA AGGACTTCGC TTTGCCTCAG 120GAAATGGTTG AAGGTGGCCA ACTACAAGAA GCTCAAGCGA TATCTGTTTT GCACGAAATG 180TTGCAACAAA GCTTCAACTT GTTCCACACC GAACACTCTT CGGCCGCTTG GGACACCACC 240TTGTTGGAAC AGCTCAGAAC CGGTTTGCAC CAACAATTGG ACAACTTGGA TGCATGTTTG 300GGTCAAGTTA TGGGTGAAGA AGACTCTGCT CTCGGGAGAA CCGGTCCAAC GCTAGCTTTG 360AAGAGATACT TCCAAGGTAT CCACGTTTAC TTGAAGGAAA AGGGTTACTC TGACTGTGCT 420TGGGAAACCG TGCGTCTAGA AATCATGCGT AGCTTCTCTT CTTTGATCAG CTTGCAAGAA 480AGATTACGTA TGATGGACGG TGACTTGTCG AGCCCA 516
(2)序列號4(SEQ ID NO:4)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度172個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離一個成熟的HuIFNτ蛋白，HuIFNτ1的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu35 40 45Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu85 90 95Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly100 105 110Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His115 120 125Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val130 135 140Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu145 150 155 160Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170
(2)序列號5(SEQ ID NO:5)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離SEQ ID NO:2的1-37片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號6(SEQ ID NO:6)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:2的34-64片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln5 10 15Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser20 25 30(2)序列號7(SEQ ID NO:7)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:2的62-92片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp5 10 15Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln20 25 30(2)序列號8(SEQ ID NO:8)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:2的92-122片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8Gln Gln Gln Leu Asp His Leu Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly5 10 15Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys20 25 30Lys(2)序列號9(SEQ ID NO:9)的信息D(ⅰ)序列特征(A)長度32個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:2的119-150片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp Tyr Leu Gln Glu Lys5 10 15Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg20 25 30(2)序列號10(SEQ ID NO:10)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:2的139-172片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val5 10 15Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn20 25 30(2)序列號11(SEQ ID NO:11)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度588個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物帶有一個前導序列的HuIFNτ1人T-干擾素的編碼序列(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置1..585(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11ATG GCC TTC GTG CTC TCT CTA CTC ATG GCC CTG GTG CTG GTC AGC TAC48Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15GGC CCA GGA TCC CTG GGT TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG96Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu20 25 30GTT GGC AGG AAG AAC CTC AGG CTC CTG GAC GAA ATG AGG AGA CTC TCC 144Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser35 40 45CCT CGC TTT TGT CTG CAG GAC AGA AAA GAC TTC GCT TTA CCC CAG GAA 192Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu50 55 60ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC 240Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC 288His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC 336Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu100 105 110CAT CAG CAG CTG GAC AAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ATG GGA 384His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly115 120 125GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG GCT CTG AAG 432Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys130 135 140AGG TAC TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAC AGC 480Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser145 150 155 160GAC TGC GCC TGG GAA ACC GTC AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT 528Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser165 170 175TCA TTA ATC AGC TTG CAA GAA AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG 576Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu180 185 190AGC TCA CCT TGA 588Ser Ser Pro195(2)序列號12(SEQ ID NO:12)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度139個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:11(HuIFNτ1)的預測的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu20 25 30Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser35 40 45Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu50 55 60Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu100 105 110His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly115 120 125Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys130 135 140Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser145 150 155 160Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser165 170 175Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu180 185 190Ser Ser Pro195(2)序列號13(SEQ ID NO:13)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)
(ⅵ)原始來源(C)個體分離物25-mer合成的寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13CCTGTCTGCA GGACAGAAAA GACTT25(2)序列號14(SEQ ID NO:14)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅵ)原始來源(C)個體分離物25-mer合成的寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14TCTGAATTCT GACGATTTCC CAGGC25(2)序列號15(SEQ ID NO:15)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:4的1-37片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Ala35(2)序列號16(SEQ ID NO:16)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:4的34-64片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln1 5 10 15Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser20 25 30(2)序列號17(SEQ ID NO:17)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說否(ⅵ)原始來源
(C)個體分離物SEQ ID NO:4的62-92片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp1 5 10 15Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln20 25 30(2)序列號18(SEQ ID NO:18)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:4的90-122片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly1 5 10 15Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys20 25 30Arg(2)序列號19(SEQ ID NO:19)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說否
(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:4的119-150片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys1 510 15Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg20 25 30(2)序列號20(SEQ ID NO:20)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:4的139-172片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser1 5 10 15Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser20 25 30Ser Pro(2)序列號21(SEQ ID NO:21)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度299個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈
(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物HuIFNτ6(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置2..298(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21C CAG GAG ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC46Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile1 5 10 15TCT GTG CTC CAC AAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA94Ser Val Leu His Lys Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr20 25 30GAG CGC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC 142Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg35 40 45ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG CAT GAC CTG GAC GCC TGC CTG GGG CAG 190Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln50 55 60GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG 238Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu65 70 75GCC GTG AAG AGC TAC TTC CAG GGC ATC CAT ATC TAC CTG CAA GAG AAG 286Ala Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Ile Tyr Leu Gln Glu Lys80 85 90 95GGA TAC AGC GAC T 299Gly Tyr Ser Asp
(2)序列號22(SEQ ID NO:22)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度99個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:21的預測的氨基酸序列(HuIFNτ6)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu His Lys Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu20 25 30Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr35 40 45Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val50 55 60Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala65 70 75 80Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Ile Tyr Leu Gln Glu Lys Gly85 90 95Tyr Ser Asp(2)序列號23(SEQ ID NO:23)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度288個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA
(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物HuIFNτ7(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置2..286(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23C CAG GAG ATG GTG GAG GTC AGC CAG TTC CAG GAG GCC CAG GCC ATT46Gln Glu Met Val Glu Val Ser Gln Phe Gln Glu Ala Gln Ala Ile1 5 10 15TCT GTG CTC CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC AAA94Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Lys20 25 30GAG CGC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACT ACC CTC CTG GAG CAG CTC CTC 142Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Leu35 40 45ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGT CTG GGG CAG 190Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln50 55 60TTG ACT GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG 238Leu Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu65 70 75GCC GTG AAG AGC TAC TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG CAA GAG AAG 286Ala Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Gln Glu Lys80 85 90 95GG288(2)序列號24(SEQ ID NO:24)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度95個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性
(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:23的預測的氨基酸序列(HuIFNτ7)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24Gln Glu Met Val Glu Val Ser Gln Phe Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Lys Glu20 25 30Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Leu Thr35 40 45Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln leu50 55 60Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala65 70 75 80Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Gln Glu Lys85 90 95(2)序列號25(SEQ ID NO:25)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度307個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物HuIFNτ4(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS
(B)位置2..307(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25C CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC46Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile1 5 10 15TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA94Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr20 25 30GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC142Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg35 40 45ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG190Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln50 55 60GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG238Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu65 70 75GCC ATG AAG ACG TAT TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG286Ala Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys80 85 90 95GGA TAT AGT GAC TGC GCC TGG307Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp100(2)序列號26(SEQ ID NO:26)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度102個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:25的預測的氨基酸序列(HuIFNτ4)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu20 25 30His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr35 40 45Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val50 55 60Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala65 70 75 80Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly85 90 95Tyr Ser Asp Cys Ala Trp100(2)序列號27(SEQ ID NO:27)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度294個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物HuIFNτ5(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置2..292(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27C CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC46Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile1 5 10 15TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA94Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr20 25 30GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC 142Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg35 40 45ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG 190Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln50 55 60GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG 330Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu65 70 75GCC ATG AAG ACG TAT TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG 286Ala Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys80 85 90 95GGA TAT AG294Gly Tyr(2)序列號28(SEQ ID NO:28)的信息(ⅱ)序列特征(A)長度97個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:27的預測的氨基酸序列(HuIFNτ5)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu20 25 30His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Glu Glu Gln Leu Arg Thr35 40 45Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val50 55 60Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala65 70 75 80Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly85 90 95(2)序列號29(SEQ ID NO:29)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度516個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物HuIFNτ2(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置1..516(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTT GGC AGG AAG AAC CTC AGG CTC48Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu1 5 10 15CTG GAC CAA ATG AGG AGA CTC TCC CCT CGC TTT TGT CTG CAG GAC AGA96Leu Asp Gln Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg20 25 30AAA GAC TTC GCT TTA CCC TAG GAA ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC CAG 144Lys Asp Phe Ala Leu Pro Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln35 40 45GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC 192Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe50 55 60AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC 240Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu65 70 75 80CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAC AAC CTG GAT 288Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp85 90 95GCC TGC CTG GGG CAG GTG ATG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG 336Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg100 105 110ACG GGC CCC ACC CTG GCT CTG AAG AGG TAC TTC CAG GGC ATC CAT GTC 384Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val115 120 125TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAC AGC GAC TGC GCC TGG GAA ACC GTC AGA 432Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg130 135 140GTG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TCA TTA ATC AGC TTG CAA GAA AGG 480Val Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg145 150 155 160TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TGA 516Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵修飾的位點(B)位置115-117(D)其它信息/注為使編碼的蛋白表達，這一位點可以被修飾以編碼一個氨基酸，例如，“Gln”(2)序列號30(SEQ ID NO:30)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度171個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性
(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離SEQ ID NO:29的預測的氨基酸序列(HuIFNτ2)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu1 5 10 15Leu Asp Gln Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg20 25 30Lys Asp Phe Ala Leu Pro Xaa Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln35 40 45Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe50 55 60Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu65 70 75 80Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp85 90 95Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg100 105 110Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg130 135 140Val Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg145 150 155 160Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵修飾位點(B)位置39(C)其他信息/注=“其中Xaa是一個選擇的氨基酸，如Gln”(2)序列號31(SEQ ID NO:31)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度588個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ⅰ)分子類型DNA(基因組)(ⅱ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物HuIFNτ3(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置1..588(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31ATG GCC TTC GTG CTC TCT CTA CTC ATG GCC GTG GTC AGC TAC48Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15GGC CCG GGA GGA TCC CTG CGG TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG96Gly Pro Gly Gly Ser Leu Arg Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu20 25 30GTT GGC AGC CAG AAC CTC AGG CTC CTG GGC CAA ATG AGG AGA CTC TCC 144Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser35 40 45CTT CGC TTC TGT CTG CAG GAC TTC GCT TTC CCC CAG GAG 192Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu50 55 60ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC 240Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC 288His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC GGC ACT GGA CTC 336Set Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu100 105 110CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ACG GGA 384His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu G1y Gln Val Thr Gly115 120 125GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGA ACG GGC CCC ACC CTG GCC ATG AAG 432Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys130 135 140AGG TAT TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAT AGT480Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser145 150 155 160GAC TGC GCC TGG GAA ATT GTC AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTG TCT528AsP Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser165 170 175TCA TCA ACC AGC TTG CAC AAA AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG576Ser Ser Thr Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu180 185 190AGC TCA CCT TGA588Ser Ser Pro195(2)序列號32(SEQ ID NO:32)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度195個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:31的預測的氨基酸序列(HuIFNτ3)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Ser Leu Arg Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu20 25 30Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser35 40 45Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu50 55 60Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu100 105 110His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly115 120 125Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys130 135 140Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser145 150 155 160Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser165 170 175Ser Ser Thr Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu180 185 190Ser Ser Pro195(2)序列號33(SEQ ID NO:33)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度518個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物HuIFNτ3，成熟的但不含有前導序列(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置1..518(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTT GGC AGC CAG AAC CTC AGG48Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg1 5 10 15CTC CTG GGC CAA ATG AGG AGA CTC TCC CTT CGC TTC TGT CTG CAG GAC96Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30AGA AAA GAC TTC GCT TTC CCC CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC144Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu35 40 45CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC192Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC240Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80CTC CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG288Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu85 90 95GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA336Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly100 105 110AGA ACG GGC CCC ACC CTG GCC ATG AAG AGG TAT TTC CAG GGC ATC CAT384Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His115 120 125GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAT AGT GAC TGC GCC TGG GAA ATT GTC432Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTG TCT TCA TCA ACC AGC TTG CAC AAA480Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu His Lys145 150 155 160AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TG 518Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(2)序列號34(SEQ ID NO:34)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度172個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu35 40 45Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu85 90 95Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly100 105 110Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His115 120 125Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu His Lys145 150 155 160Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(2)序列號35(SEQ ID NO:35)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:33的1-37片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Ala35(2)序列號36(SEQ ID NO:36)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:33的34-64片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln1 5 10 15Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser20 25 30(2)序列號37(SEQ ID NO:37)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:33的62-92片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp1 5 10 15Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln20 25 30(2)序列號38(SEQ ID NO:38)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:33的90-122片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly1 5 10 15Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys20 25 30(2)序列號39(SEQ ID NO:39)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:33的119-150片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys1 5 10 15Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg20 25 30(2)序列號40(SEQ ID NO:40)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:33的139-172片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser1 5 10 15Ser Thr Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser20 25 30Ser Pro(2)序列號41(SEQ ID NO:41)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:32的1-23片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Ser Leu Arg20
(2)序列號42(SEQ ID NO:42)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(C)個體分離物SEQ ID NO:11的1-23片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly20(2)序列號43(SEQ ID NO:43)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度519個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物基因組HuIFNτ1衍生的DNA編碼序列，無前導序列
(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置1..519(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTT GGC AGG AAG AAC CTC AGG48Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15CTC CTG GAC GAA ATG AGG AGA CTC TCC CCT CGC TTT TGT CTG CAG GAC96Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30AGA AAA GAC TTC GCT TTA CCC CAG GAA ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC144Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu35 40 45CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC192Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC240Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80CTC CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAC AAC CTG289Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu85 90 95GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ATG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA336Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly100 105 110AGG ACG GGC CCC ACC CTG GCT CTG AAG AGG TAC TTC CAG GGC ATC CAT384Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His115 120 125GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAC AGC GAC TGC GCC TGG GAA ACC GTC432Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val130 135 140AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TCA TTA ATC AGC TTG CAA GAA480Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu145 150 155 160AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TGA519Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(2)序列號44(SEQ ID NO:44)的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度172個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:44Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu35 40 45Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu85 90 95Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly100 105 110Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His115 120 125Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val130 135 140Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu145 150 155 160Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(2)序列號45(SEQ ID NO:45)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質
(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物Bin12,A40068,Acc.Gi108955，小牛TP-1(克隆bTP509)(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45Cys Tyr Leu Ser Glu Asp His Met Leu Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號46(SEQ ID NO:46)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物Bin13,,Acc.gi163767，小牛TP-1(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:46Cys Tyr Leu Ser Glu His His Ile Leu Gly Pro Arg Gln Asn Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35
(2)序列號47(SEQ ID NO:47)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物Bin14,BovTPH1Ccdsl,Acc.gi 163769，小牛TP-1(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:47Cys Tyr Leu Ser Glu His His Met Leu Gly Ala Arg Gln Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號48(SEQ ID NO:48)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅲ)假說否
(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物Bin15,A39505,Acc.，小牛TP-1(克隆bTP4)(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:48Cys Tyr Leu Ser Glu Asn His Met Leu Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號49(SEQ ID NO:49)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物Bin16,OATP1P5cdsl,Acc.gi1412，羊TPp5(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:49Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Lys Glu Asn Leu Lys1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35
(2)序列號50(SEQ ID NO:50)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物Bin17,OATP1P3cdsl,Acc.gi1410，羊TPp3(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:50Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號51(SEQ ID NO:51)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質
(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物Bin18,SHP010TPcdsl,Acc.gi165821，羊TPp-1(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:51Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys15 10 15Leu Leu Glu Pro Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號52(SEQ ID NO:52)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物Bin19,SHP02TPcdsl,Acc.gi165823，羊TPp-1(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:52Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35
(2)序列號53(SEQ ID NO:53)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ原始來源(C)個體分離物Bin21,GOTCTP1cdsl,Acc.gi164117,Capra hircusIFNτ(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:53Cys Tyr Leu Ser Arg Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Gln Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號54(SEQ ID NO:54)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度498個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)
(ⅲ)假說否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(C)個體分離物HuIFNτ/HuIFNalpha雜合，(1-28)/(29-167)(ⅸ)特征(A)名字/關鍵CDS(B)位置1..498(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:54TGT GAC TTG TCT CAA AAC CAC GTT TTG GTT GGT AGA AAG AAC TTA AGA48Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15CTA CTA GAC GAA ATG AGA CGT CTA TCT CCA CGC TTC TGC CTG AAG GAC96Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Lys Asp20 25 30AGA TAT GAT TTC GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAT GGC AAC CAG TTC144Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GCC TTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC192Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC240Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr65 70 75 80CTC CTA GAC AAA TTC TAC ATT GAA CTT TTC CAG CAA CTG AAT GAC CTA288Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95GAA GCC TGT GTG ACA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG ATT GCC CTG ATG336Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met100 105 110AAT GAG GAC TCC ATC CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTT CAA AGA ATC ACT384Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr115 120 125CTT TAT CTG ATG GGG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC432Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTT TCA ACA AAC TTG CAA AAA480Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145 150 155 160
(2)序列號55(SEQ ID NO:55)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度166個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:55Cys Asp Leu Ser GLn Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr65 70 75 80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met100 105 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr115 120 125Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145 150 155 160Gly Leu Arg Arg Lys Asp15權利要求
1．一種嵌合的核酸分子，其構成包括一個編碼干擾素-τ多肽N-末端氨基酸序列的5’端片段，和一個編碼非τ的Ⅰ型干擾素多肽C-末端氨基酸序列的3’端片段，其中兩個片段剪接于相當于成熟干擾素多肽的約第8和第37位殘基間的區(qū)域。
2．如權利要求1所述的嵌合的核酸分子，其中所說的5’端片段還包括一個前導序列。
3．如權利要求1所述的嵌合的核酸分子，其中所說的5’端片段編碼選自下列一組序列的一個序列所含有的氨基酸序列SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ IDNO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ IDNO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53，和SEQ ID NO:54和SEQID NO:55。
4．如權利要求3所述的嵌合的核酸分子，其中所說的5’端片段編碼SEQ ID NO:5所含有的氨基酸序列。
5．如權利要求3所述的嵌合的核酸分子，其中所說的5’端片段編碼SEQ ID NO:15所含有的氨基酸序列。
6．如權利要求3所述的嵌合的核酸分子，其中所說的5’端片段編碼SEQ ID NO:54所含有的氨基酸序列。
7．如權利要求1所述的嵌合的核酸分子，其中兩個片段剪接于相當于成熟干擾素多肽的約第8和第28位殘基間的區(qū)域。
8．如權利要求7所述的嵌合的核酸分子，其中兩個片段剪接于相當于成熟干擾素多肽的約第22位殘基的位置。
9．如權利要求1所述的嵌合的核酸分子，其中的干擾素-τ多肽是羊干擾素-τ多肽，而非τ的Ⅰ型干擾素多肽是人非τ的Ⅰ型干擾素多肽。
10．一種雜合干擾素融合多肽，其構成包括，含有干擾素-τ多肽N-端氨基酸序列的第一個片段，和含有非τ的Ⅰ型干擾素多肽C-端氨基酸序列的第二個片段，其中兩個片段結合于成熟干擾素多肽的約第8和第37位殘基間的區(qū)域。
11．如權利要求10所述的干擾素融合多肽，其中所說的第一個片段具有的氨基酸序列為選自下列一組序列的一個序列所含有的氨基酸序列SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:45,SEQ IDNO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ IDNO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52，和SEQ ID NO:53。
12．如權利要求10所述的干擾素融合多肽，其中所說的第一個片段具有SEQ ID NO:5所含有的氨基酸序列。
13．如權利要求10所述的干擾素融合多肽，其中所說的第一個片段具有SEQ ID NO:15所含有的氨基酸序列。
14．如權利要求10所述的干擾素融合多肽，其中所說的第一個片段具有SEQ ID NO:55所含有的氨基酸序列。
15．如權利要求10所述的干擾素融合多肽，其中兩個片段結合于成熟干擾素多肽的約第8和第28位殘基間的區(qū)域。
16．如權利要求15所述的干擾素融合多肽，其中兩個片段結合于成熟干擾素多肽的約第8和第22位殘基間的區(qū)域。
17．如權利要求16所述的干擾素融合多肽，其中兩個片段結合于成熟干擾素多肽的約第8和第16位殘基間的區(qū)域。
18．一種表達載體，包括(a)一個含有編碼如權利要求10所述的雜合干擾素融合多肽的開放閱讀框的核酸，和(b)可有效地在宿主細胞中表達所說的開放閱讀框的調控序列。
19．一種重組生產(chǎn)如權利要求10所述的雜合干擾素融合多肽的方法，包括將含有具有編碼如權利要求10所述的雜合干擾素融合多肽的多核苷酸序列的開放閱讀框(ORF)的重組表達系統(tǒng)引入適當?shù)乃拗骷毎?，其中的載體用于在所說的宿主中表達該ORF，以及在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)所說的宿主以使該ORF序列表達。
20．一種抑制腫瘤細胞生長的方法，包括使細胞與如權利要求10所述的雜合干擾素融合多肽以能有效地抑制腫瘤細胞生長的濃度相接觸。
21．一種抑制病毒復制的方法，包括使細胞與如權利要求10所述的雜合干擾素融合多肽以能有效地在所說的細胞中抑制病毒復制的濃度相接觸。
22．一種對需要治療的個體治療自身免疫疾病的方法，包括對所說的個體施用藥物學有效量的如權利要求10所述的雜合干擾素融合多肽。
全文摘要
本發(fā)明描述了一類由兩個片段構成的雜合干擾素融合多肽,所含的第一個片段為一個干擾素－τ多肽的N端氨基酸序列,第二個片段為非τ的Ⅰ型干擾素多肽的C端序列。兩個片段在成熟干擾素多肽約第8和第37位殘基間的區(qū)域連接。本發(fā)明還描述了編碼這類干擾素融合多肽的核酸序列、含有此序列的表達載體以及這類干擾素融合多肽在治療上的應用。在治療上的應用包括抗病毒和抗細胞增殖的應用。本發(fā)明的這類干擾素融合多肽的一個優(yōu)點在于它們用于對細胞進行處理時沒有細胞毒效應。
文檔編號C07K16/24GK1221452SQ97195391
公開日1999年6月30日 申請日期1997年4月11日 優(yōu)先權日1996年4月12日
發(fā)明者霍華德·M·約翰遜, 普雷姆·S·蘇布拉馬尼亞姆, 卡羅爾·H·彭澤爾 申請人:佛羅里達大學