一種用于驗(yàn)證氨基酸誘導(dǎo)多肽形成β-sheet二級結(jié)構(gòu)能力的化合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物工程領(lǐng)域，具體地指一種用于驗(yàn)證氨基酸誘導(dǎo)多肽形成0-sheet二級結(jié)構(gòu)能力的化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)作為構(gòu)成生命體系的三大物質(zhì)基礎(chǔ)之一，幾乎參與著生命活動的每一個(gè)環(huán) 節(jié)，在生命的誕生、成長和繁衍過程中起著決定性的作用。許多疾病的發(fā)生也與多肽、蛋白 質(zhì)在體內(nèi)發(fā)生變異有著密切的關(guān)系。因此選擇與重大疾病密切相關(guān)的蛋白質(zhì)、多肽以及氨 基酸殘基作為靶標(biāo)，發(fā)展具有高選擇性，高靈敏度的檢測方法，對生命奧秘的揭示，疾病的 早期診斷與藥物的篩選有著重大的意義。
[0003]熒光檢測法是目前診斷多肽及蛋白質(zhì)的重要檢測方法之一，因其具有靈敏度高、 選擇性好，動態(tài)響應(yīng)范圍寬，能在活體內(nèi)檢測等優(yōu)點(diǎn)在蛋白質(zhì)檢測中得以廣泛應(yīng)用。焚光檢 測法需要根據(jù)靶向蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)設(shè)計(jì)多肽熒光探針，方法之一為先合成熒光氨基酸 (通過在側(cè)鏈上導(dǎo)入熒光基團(tuán)），然后將其作為一個(gè)結(jié)構(gòu)單元直接用于多肽合成。
[0004]蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有0-turn，0-sheet和α-helix三種，主要依靠肽鏈中-NH-上的 氫原子與羰基上的氧原子形成氫鍵而實(shí)現(xiàn)。通過合成β-turn模擬物并將其引入到一個(gè)多肽 序列中，從而誘導(dǎo)β-sheet結(jié)構(gòu)的形成，這類工作已多有報(bào)道。當(dāng)將β-turn模擬物與熒光氨 基酸結(jié)構(gòu)結(jié)合，合成了特定的β-turn模擬物的熒光氨基酸后，其能否成功誘導(dǎo)連接的多肽 形成β-sheet二級結(jié)構(gòu)，對于該能力的驗(yàn)證現(xiàn)有技術(shù)中還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是要解決上述【背景技術(shù)】的不足，提供一種用于驗(yàn)證氨基酸誘導(dǎo)多 肽形成β-sheet二級結(jié)構(gòu)能力的化合物及其制備方法，確定被驗(yàn)證的特定氨基酸能否誘導(dǎo) 連接的多肽形成穩(wěn)定的β-sheet二級結(jié)構(gòu)，是否能應(yīng)用于焚光試劑盒開發(fā)、藥物研發(fā)等領(lǐng) 域。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007]一種用于驗(yàn)證氨基酸誘導(dǎo)多肽形成β-sheet二級結(jié)構(gòu)能力的化合物，其特征在于， 結(jié)構(gòu)如下式所示。
[0009]本發(fā)明還提供上述化合物的合成方法，其特征在于，合成步驟為：
[0011]優(yōu)選的，步驟為：
[0012] (1)將化合物I-3、N-乙?；腚装贰⑷野芳尤胍译嬷蟹磻?yīng)，室溫?cái)嚢鑜-3h，經(jīng)后 處理得到固體中間體I-8;
[0013] ⑵將中間體I-8、N-甲基-β-丙氨酰胺加入乙腈中反應(yīng)，室溫?cái)嚢?2-16h，經(jīng)后處 理得到固體化合物2;
[0014] 上述各步驟中投料比為以下摩爾比：
[0015] (1)化合物I-3:N-乙酰基半胱胺:三乙胺= 1:4.8-6:1-1.5;
[0016] (2)中間體1-8:^甲基-0-丙氨酰胺=1:1.5-2。
[0017]進(jìn)一步的，步驟為：
[0018] (1)將三乙胺加入溶有化合物1-3的乙腈溶液中，再將溶有N-乙?；腚装返囊译?溶液緩慢加入，室溫?cái)嚢鑜_3h，經(jīng)萃取、干燥、過濾、濃縮、硅膠柱層析分離提純得到固體中 間體1-8;
[0019] (2)將溶有中間體1-8的乙腈溶液中加入N-甲基-β-丙氨酰胺，室溫?cái)嚢?2-16h，加 水經(jīng)、干燥、過濾、濃縮、硅膠柱層析分離提純得到固體化合物2。
[0020]進(jìn)一步的，各步驟中投料比為以下摩爾比：
[0021] (1)化合物I-3:N-乙?；腚装?三乙胺=1:4.8:1;
[0022] (2)中間體1-84-甲基-0-丙氨酰胺=1:1.5。
[0023]本發(fā)明中化合物2是為了驗(yàn)證如下所示化合物1的誘導(dǎo)多肽形成β-sheet二級結(jié)構(gòu)能力。
[0025]化合物1是特定合成β-turn模擬物的熒光氨基酸，合成路線如下：
[0027]化合物1的具體合成步驟為：
[0028] a.中間體1-1的制備：
[0029] 氮?dú)鈿夥障?，吡咯、苯甲醛、三氟乙酸TFA混合室溫下攪拌l_2h，經(jīng)后處理得到固體 中間體1-1;
[0030] b.中間體1-2的制備：
[0031]氮?dú)鈿夥障?，_78°C下將溶有氯代丁二酰亞胺NCS的四氫呋喃THF溶液加入溶有中 間體1-1的四氫呋喃THF溶液中，保持-78°c攪拌2-3h，室溫繼續(xù)攪拌3-4h，經(jīng)后處理得到產(chǎn) 物;將得到產(chǎn)物溶于二氯甲烷，加入2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌DDQ，室溫?cái)嚢鑜-2h，經(jīng) 后處理得到固體中間體I-2;
[0032]c.中間體1-3的制備：
[0033]氮?dú)鈿夥障?，中間體1-2、三乙胺溶于無水二氯甲烷中，加入三氟化硼乙醚溶液，室 溫?cái)嚢?2-16h，經(jīng)后處理得到固體中間體1-3;
[0034] d.中間體1-4的制備：
[0035]中間體I-3、Fmoc保護(hù)的氨基乙硫醇、三乙胺在乙腈中室溫反應(yīng)l-3h，經(jīng)后處理得 到固體中間體1-4;
[0036]e.中間體1-5的制備：
[0037]中間體Ι-4、β_丙氨酸叔丁醇酯在乙腈中室溫反應(yīng)12_16h，經(jīng)后處理得到固體中間 體 1-5;
[0038]f中間體1-6的制備：
[0039] 中間體I-5、Fmoc_0su、三乙胺在二氧六環(huán)中室溫反應(yīng)3_5h，經(jīng)后處理得到固體中 間體1-6;
[0040] g.化合物1的制備：
[0041 ] 將中間體1-6溶于二氯甲烷中，冰浴下加入三氟乙酸，室溫反應(yīng)2-4h，經(jīng)后處理得 到化合物1;
[0042] 上述各步驟中投料比為以下摩爾比：
[0043]a·吡咯：苯甲醛：三氟乙酸TFA= 20-25:1:0 · 1-0 · 2;
[0044]b.中間體 1-1:氯代丁二酰亞胺NCS: 2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌DDQ= 1:2.2-3:1.2-2；
[0045]c.中間體1-2:三乙胺:三氟化硼乙醚= 1:2.2-3:4.2-5;
[0046]d.中間體1-3 :Fmoc保護(hù)的氨基乙硫醇:三乙胺=1:1.2-2:1.2-2.4;
[0047]e.中間體Ι-4:β-丙氨酸叔丁醇酯=1:5-7;
[0048]f·中間體1-5 :Fmoc-〇su:三乙胺=1:1 · 2-2:7 · 2-8;
[0049]g.中間體 1-6:三氟乙酸= 1:90-100。
[0050] 化合物1合成過程中的中間體1-3即為合成化合物2步驟a中的原料，1-3為現(xiàn)有技 術(shù)中的已知化合物。
[00511本發(fā)明的有益效果為:針對特定的β-turn模擬物的熒光氨基酸化合物1，合成化合 物2,通過測試化合物2中氨基氫和羰基氧能否形成分子內(nèi)的氫鍵，來確定化合物1能否誘導(dǎo) 連接的多肽形成穩(wěn)定的β-sheet二級結(jié)構(gòu)，這對合成的焚光氨基酸能否應(yīng)用于焚光試劑盒 開發(fā)、藥物研發(fā)等領(lǐng)域具有重要的指導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0052]圖1為化合物2的二氯甲烷溶液的紅外光譜圖 [0053]圖2為不同溫度下對化合物2氨基氫的核磁位移值圖
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0055]化合物1的制備
[0056]a.中間體1-1的制備：
[0057] 取干燥的500ml的兩口瓶，瓶內(nèi)置換成氮?dú)?，加入吡咯?04ml，1.5mol)，苯甲醛 (6mL，60mmol)和三氟乙酸(0.67mL，6mmol)，室溫?cái)嚢鑜h，加入濃度為1M的NaOH溶液（100mL) 淬滅，乙酸乙酯萃?。?00mLX3)，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，乙醇重結(jié)晶得褐色固體 l〇.5g，收率 80.7%。
[0058]b.中間體1-2的制備：
[0059]將中間體I_l(5g，22mmol)溶于200mL無水四氫咲喃中，置換成氮?dú)怏w系，-78°C下 加入氯代丁二酰亞胺(6.5g，48.4mmol)的四氫呋喃溶液(60mL)，保持-78°C攪拌2h，然后室 溫?cái)嚢?h，反應(yīng)結(jié)束后，加水(300mL)，二氯甲燒萃取(200mLX3)，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃 縮，將得到的產(chǎn)物溶于二氯甲烷（250mL)中，加入2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（6g， 26.4mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后，水洗（100mLX3)，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮， 硅膠柱層析分離提純(體積比石油醚:乙酸乙酯=50:1)得黃色固體5g，收率為79%。
[0060]c.中間體1-3的制備：
[00611 將中間體I-2(5g，17mmol)溶于無水二氯甲烷（150mL)，置換成氮?dú)怏w系，加入三乙 胺(5.2mL，37.4mmo1)，然后緩慢加入三氟化硼乙醚溶液(8.9mL，71.4mmo1)，室溫?cái)嚢?2h，水洗(1OOmLX3)，二氯甲烷萃取(200mLX3)，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，硅膠柱層析分離 提純(體積比石油醚:乙酸乙酯=1 0: 1)得深紅色固體5.1g，收率89 %。
[0062]d.中間體1-4的制備：
[0063] 將中間體I-3(2g，6mmol)溶于100mL乙腈中，加入催化劑三乙胺（lmL，7.2mmol)，將Fmoc保護(hù)的氨基乙硫醇Fmoc-NHCH2CH2SH(2.2g，7.2mmo1)溶于80mL乙腈中，將此溶液緩慢滴 加入中間體1-3、三乙胺的乙腈溶液中，室溫反應(yīng)lh，加水(200mL)，二氯甲烷萃取(200mLX 3)，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，硅膠柱層析分離提純(體積比石油醚：乙酸乙酯:二氯甲烷 =4:1:0 · 5)的深紅色固體2 · 5g，收率為70% 肩·p· 103 · 8-104 · 2°C。
[0064] 咕NMR(400MHz，CDCl3)S7.75((1,J= 7.5Hz，2H) ,7.54-7.51 (m，4H) ,7.46-7 ·36(ι?， 7H) ,7.29-7.27(m,2H),6.87(d,J= 4.0Hz,lH) ,6.72(d,J= 4.0Hz, 1H) ,6.67(d,J= 4.0Hz, 1H) ,6.35(d,J= 4.0Hz,lH) ,5.40(br,lH) ,4.36(d,J= 8.0Hz, 2H) ,4.16(t,J= 8.0Hz, 1H), 3.57-3.53(m，2H)，3.29-3.26(m，2H).13CNMR(100MHz，CDC13)S156.4，143.7，141.3，140.4， 136.6.133.2.133.0. 132.4.130.4.130.4.130.3.128.4.128.3.127.7.127.1.125.1， 119 · 9，118 · 9，116 · 9，66 · 9，47 · 2，40 · 8，32 · 8 ·MS(ESI)calcdforC23H25BClF2N3Na〇2S+(M+Na )+622found622.
[0065]e.中間體1-5的制備：
[0066] 將中間體1-4( 1.Og，1.7mmol)溶于80mL乙腈中，然后加入β-丙氨酸叔丁醇酯 (1.2mL，8.5mmol)，室溫反應(yīng)12h，加水（100mL)，二氯甲烷萃?。?00mLX3)，無水硫酸鎂干 燥，過濾，濃縮，硅膠柱層析分離提純(體積比二氯甲烷：甲醇=50 :1 )，得紅色固體0.6g，收 率為 73%。1114.101.5-103.2。(3。
[0067] 咕匪R(400MHz，CDCl3)S7· 48-7 ·43(ι?，5H)，6.88((1,J= 8.0Hz，1H)，6.40((1,J= 4·0Ηζ，1Η)，6.35((1,J= 4.0Hz，lH)，6.24(d，J= 8.0Hz，lH) ,3.69-3.66(m，2H) ,3.09-3.06 (m，2H)，2.99-2.94(m，2H)，2.63-2.60(m，2H)，1.47(s，9H).13CNMR(100MHz，CDC13)S169.9， 161.4,137.6,135.4,134.4,134.2,133.3,131.6,130.3,129.1,128.1,120.8,117.9， 110 · 2，82 · 0，40 · 7，40 · 6，39 · 4，35 · 9，28 · 0 ;MS(ESI)calcdforC24H3〇BF2N4〇2S+(M+H)+487 found487.
[0068]f.中間體1-6的制備：
[0069] 將中間體1-5(0 · 60g，1 · 2mmol)溶于50mL二氧六環(huán)中，加入Fmoc-〇Su9-荷甲基琥 珀酰亞氨基碳酸酯(〇.50g，1.4mmol)，三乙胺（1.2mL，8.6mmol)，室溫反應(yīng)3h，加入濃度為1M 的稀鹽酸50mL，乙酸乙酯萃取(50mLX3)，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，硅膠柱層析分離提 純(體積比石油醚：乙酸乙酯=4:1)得紅色固體0.52g，收率為96 %;m.p.86.1 -87.1°C。
[0070] 4^^(40011^,0)(:13)37.76-7.74(111,210,7.6^7.60(111,310,7.47-7.30(111,810, 7.28-7.27(m,2H),6.87(d,J= 4.0Hz,1H),6.63(s,1H),6.41 (m,2H),6.25(d,J= 4.0Hz, 1H),5.76(s,lH),4.31-4.29(m,2H),4.21-4.18(m,lH),3.68-3.61(m,2H),3.45-3.44(m, 2H)，3.09(m