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RT?qPCR檢測Wistar大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的方法與流程

文檔序號:12109124閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種RT-qPCR檢測Wistar大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的方法,其特征在于包括下列步驟:

(1)設計下列引物:

大鼠XDH/XO基因表達水平的特異性上、下游引物組合及對應的核苷酸序列為:

XDH/XO F:5'-ATGCGGACCCTGAAACAACA-3'

XDH/XO R:5'-TGTTCTGAAGACGGTCATACTTGGA-3';

作為內(nèi)參基因的大鼠GAPDH基因的特異性上、下游引物組合及對應的核苷酸序列為:

GAPDH F:5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'

GAPDH R:5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3';

(2)以大鼠新鮮肝臟組織提取的總RNA為模板,按常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄合成得大鼠肝臟組織cDNA第一鏈;

(3)建立大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因標準曲線:以Esidilution梯度稀釋步驟(2)大鼠肝臟組織cDNA第一鏈,分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4倍濃度,以原始cDNA第一鏈及稀釋后的cDNA為模板,進行實時熒光定量檢測,以步驟(1)中的XDH/XO F和XDH/XO R以及GAPDH F和GAPDH R為特異性引物,分別在下列PCR擴增體系下:25μL體系,SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 12.5μL,正向、反向引物各1μL,cDNA模板1μL,去離子水9.5μL,進行下列實時熒光定量PCR擴增:94℃預變性30s,94℃變性5s、59℃退火30s、40個循環(huán),59℃到94℃每5s采集一次熒光,得到大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因的溶解曲線和標準曲線;

(4)大鼠肝臟提取的總RNA經(jīng)實時熒光定量PCR檢測收集熒光與步驟(3)所得溶解峰標準曲線比較,即得到Wistar大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平。

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