本發(fā)明涉及基因工程及免疫分析領(lǐng)域，具體的說是涉及一種生物素精準共價偶聯(lián)抗體Fc位點的標記技術(shù)，該發(fā)明提供的精準Fc位點的生物素化抗體可在包被親和素的載體表面實現(xiàn)牢固的定向固定，不影響抗體Fab段的抗原結(jié)合位點，且不受待測樣品中內(nèi)源性抗體的干擾。

背景技術(shù)：

生物素親合素系統(tǒng)(biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。親合素與生物素之間的親和力極強，二者結(jié)合的親和常數(shù)(Ka)為10¹⁵mol^-1，親合素與生物素一經(jīng)結(jié)合，不受pH、溫度、有機溶劑及變性劑的影響(使用變性劑且在>90℃的情況下才能解離)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標記技術(shù)有機地結(jié)合，使各種免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。生物素偶聯(lián)標記抗體即生物素化抗體是BAS體系的應(yīng)用前提，目前所采用的生物素化抗體制備技術(shù)是基于各種生物素衍生物(活化生物素)與抗體分子內(nèi)的氨基酸殘基(氨基、羰基)之間的共價偶聯(lián)技術(shù)，一個抗體分子可連接多個生物素分子，由于抗體分子內(nèi)活性氨基酸殘基的數(shù)量、位置的不唯一性，生物素分子不能特異性地偶聯(lián)在抗體的Fc段，當生物素分子隨機地偶聯(lián)于抗體Fab段，則會阻礙抗體的抗原結(jié)合而導(dǎo)致抗體結(jié)合抗原活性下降。

利用某些抗體親和蛋白可實現(xiàn)抗體Fc端的間接標記，如葡萄球菌蛋白A(SpA)及其衍生蛋白(ZZ親和肽)，能通過疏水作用結(jié)合多種動物IgG的Fc段，且這種結(jié)合不影響IgG的Fab段與抗原特異性結(jié)合的免疫活性。ZZ親和肽是源自葡萄球菌蛋白A的B結(jié)構(gòu)域的重復(fù)序列，每個ZZ親和肽分子可結(jié)合兩個IgG分子，而單個的Z序列(Z親和肽)可結(jié)合IgG分子的一條重鏈，因而一個IgG分子可結(jié)合兩個單個的Z序列。我們曾利用定點生物素化的ZZ親和肽實現(xiàn)了抗體Fc端的生物素親和偶聯(lián)(發(fā)明專利CN103694358B《位點特異性生物素標記重組及其在三維定向固定IgG抗體中的應(yīng)用》)。然而，親和肽與IgG之間的結(jié)合是一種可逆的生物結(jié)合，該抗體定向固定技術(shù)應(yīng)用于基于芯片技術(shù)的免疫分析中，在芯片的再生過程中親和肽-IgG的結(jié)合物會解離，需重復(fù)結(jié)合捕獲抗體；更為重要的是，在臨床樣品分析中如果含有與親和肽結(jié)合的IgG類物質(zhì)，則會嚴重干擾分析結(jié)果，繼而限制了這種由親和肽介導(dǎo)的抗體定向固定技術(shù)的應(yīng)用范圍。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明以基因工程技術(shù)表達帶有光敏基團(4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸，p-benzoylphenylalanine，簡稱Bpa)的Z親和肽-Avitag融合蛋白并以BirA酶催化完成其生物素共價定點偶聯(lián)，獲得一種精準Fc位點偶聯(lián)的生物試劑Z_Bpa-Biotin，由Z親和肽導(dǎo)向Fc位點親和偶聯(lián)后，繼而在365nm紫外光激發(fā)光敏基團與抗體生產(chǎn)共價鍵，實現(xiàn)Fc位點的生物素共價偶聯(lián)標記的生物素化抗體。因一個IgG分子可結(jié)合兩個單個的Z序列，本發(fā)明所提供的精準Fc位點的生物素化抗體，是每個IgG分子可定量結(jié)合兩個Biotin分子，且是一種不可逆的共價偶聯(lián)生物素抗體，不受pH、溫度、有機溶劑及變性劑的影響，可實現(xiàn)固相載體表面所固定的IgG抗體是均一、Fab段充分暴露及保持高抗原結(jié)合活性的三維定向IgG抗體，且在實際應(yīng)用中突破了被分析物中不能有結(jié)合Z親和肽物質(zhì)的限制。

本發(fā)明利用氨酰tRNA合成酶/抑制琥珀tRNA(aminoacyl-tRNA synthetase/amber suppressor tRNA，aaRS/suppressor tRNA)技術(shù)實現(xiàn)在蛋白質(zhì)的翻譯過程中即生物合成含光敏基團的目的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種精準導(dǎo)向Fc位點偶聯(lián)的生物試劑(簡稱Z_Bpa-Biotin)，該生物試劑包括一Z親和肽，其特點是：所述Z親和肽的α1結(jié)構(gòu)域處連接有4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸，所述Z親和肽的羧基末端殘基處依次連接Avi-tag標簽蛋白和多聚組氨酸純化標簽蛋白，其中所述Avi-tag標簽蛋白上的賴氨酸殘基上連接生物素或其衍生物。

優(yōu)選的，從光照后與IgG抗體偶聯(lián)效果來講，所述α1結(jié)構(gòu)域處連接有4-苯甲?；?L-苯丙氨酸的部位為氨基酸的第17位置。第17位置是指在Z親和肽的第16個氨基酸之后第17個氨基酸前的位置。

優(yōu)選的，所述多聚組氨酸純化標簽蛋白為為6聚組氨酸(6×His)。

本發(fā)明的第二個目的是提供上述精準Fc位點偶聯(lián)的生物試劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)首先構(gòu)建重組質(zhì)粒pZ_TAG–Avitag表達載體：其中，目的基因的合成為：首先根據(jù)Z親和肽基因序列，在Z親和肽基因序列的α1結(jié)構(gòu)域序列所需位點處插入琥珀密碼子(TAG)，然后在Z親和肽基因序列下游末端、多聚組氨酸純化標簽基因序列置入Avitag基因序列，最后在上述基因序列的5'端和3'端分別設(shè)置限制性內(nèi)切酶酶切位點，化學合成得到目的基因序列；

(2)然后利用原核微生物表達出重組蛋白Z_Bpa–Avitag；

(3)最后利用生物素連接酶(BirA酶)對重組蛋白Z_Bpa–Avitag生物素化，得到生物素化的重組蛋白Z_Bpa–Avitag，即為該生物試劑(Z_Bpa-Biotin)。

步驟(1)中，重組質(zhì)粒表達載體的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的常規(guī)技術(shù)手段?；静襟E是：化學合成目的基因序列后，將其克隆至質(zhì)粒中，即可獲得相應(yīng)的質(zhì)粒表達載體。在本發(fā)明優(yōu)選的一個具體實施例中，將目的基因序列亞克隆至pTBX1質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pZ_TAG–Avitag表達載體。

優(yōu)選的，所述多聚組氨酸純化標簽基因序列為6聚組氨酸基因序列。

所述限制性內(nèi)切酶并沒有特別限定，可以根據(jù)需求進行設(shè)定。在本發(fā)明優(yōu)選的一個具體實施例中，所述目的基因的5'端設(shè)置NdeI限制性內(nèi)切酶酶切位點，所述目的基因的3'端設(shè)置XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點；在本發(fā)明優(yōu)選的一個具體實施例中，所述目的基因的序列為：

5’-CATATGGTAGACAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAACGCGTTCTATGAGATCTAGCATTTACCTAACTTAAACGAAGAACAACGAAACGCCTTCATCCAAAGTTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAGGCGCCGAAAGGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAACATCATCATCATCATCATTAACTCGAG-3’，如SEQIDNO.1所示。其中，雙下劃線表示的堿基是琥珀密碼子，單下劃線表示的序列是限制性內(nèi)切酶酶切位點，粗體序列表示的是6聚組氨酸基因序列，斜體序列表示Avi-tag的氨基酸基因序列。

步驟(2)中，重組蛋白Z_Bpa–Avitag包括Z親和肽，所述Z親和肽的α1結(jié)構(gòu)域處連接有4-苯甲?；?L-苯丙氨酸，所述Z親和肽的羧基末端殘基處依次連接Avi-tag標簽蛋白和多聚組氨酸純化標簽蛋白。

為實現(xiàn)目的蛋白在蛋白質(zhì)的翻譯過程中即生物合成含光敏基團的目的蛋白質(zhì)，步驟(1)中的表達載體與含有氨酰tRNA合成酶編碼基因的pEVOL-pBpF共轉(zhuǎn)化至原核生物中，獲得基因工程菌。利用該基因工程即可順利表達出含有光敏基團的重組蛋白Z_Bpa–Avitag。為順利合成含光敏基團的目的蛋白質(zhì)，氨酰tRNA合成酶/抑制琥珀tRNA(aminoacyl-tRNA synthetase/amber suppressor tRNA，aaRS/suppressor tRNA)技術(shù)已經(jīng)是比較常規(guī)的技術(shù)。利用aaRS/suppressor tRNA技術(shù)在蛋白質(zhì)的翻譯過程中在琥珀密碼子(TAG)處翻譯不會終止且翻譯成非天然氨基酸(一般是含有特殊基團的非天然氨基酸，如Bpa含光敏基團)，肽鏈繼續(xù)翻譯至目的蛋白。

本發(fā)明中pEVOL-pBpF質(zhì)粒為本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)得到的，例如可通過商業(yè)途徑得到。

將上述基因工程菌30～37℃經(jīng)過12～18h培養(yǎng)、活化后，轉(zhuǎn)接到2×YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6–0.8；然后加入4-苯甲?；?L-苯丙氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)0.5～2h；再加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和阿拉伯糖，30～37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5～7h；經(jīng)過上述培養(yǎng)的工程菌離心收集菌體，采用緩沖液重懸，凍融裂解菌體；離心去除菌體碎片后，采用層析柱純化目的蛋白。

其中，所述2×YT培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)知曉的培養(yǎng)基。

步驟(3)中，利用BirA酶體外反應(yīng)體系對重組蛋白Z_Bpa–Avitag進行生物素化，再通過層析柱和超濾離心管獲得生物素化的重組蛋白，即Z_Bpa-Biotin。

所述BirA酶體外反應(yīng)體系如下：buffer A，buffer B，Z_Bpa–Avitag，生物素連接酶，25～35℃反應(yīng)5～7h；所述buffer A為0.5M的N-二(羥乙基)甘氨酸，pH 8.3；所述buffer B為pH 8.0的溶液中，含有100mM ATP,100mM乙酸鎂,200mM生物素。

優(yōu)選的，所述buffer A，buffer B和Z_Bpa–Avitag的體積比為1：1：4，所述BirA酶添加量為40～50U/μL。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種精準導(dǎo)向Fc位點偶聯(lián)的生物素化抗體，該抗體是由所述生物試劑中Z親和肽導(dǎo)向的4-苯甲?；?L-苯丙氨酸通過共價鍵與IgG抗體Fc段相連接。

本發(fā)明的第四個目的是所述精準導(dǎo)向Fc位點偶聯(lián)的生物素化抗體的制備方法，包括以下步驟：將IgG抗體與所述生物試劑混合，先導(dǎo)向Fc位點的生物親和偶聯(lián)，繼而在365nm紫外光照射下激發(fā)光敏基團與IgG抗體的Fc段的氨基產(chǎn)生共價鍵，即可得到精準導(dǎo)向Fc位點偶聯(lián)的生物素化抗體。

本發(fā)明的第五個目的是提供上述生物試劑在三維定向固定IgG抗體中的應(yīng)用。該應(yīng)用方法是：所述生物試劑中的4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸通過共價鍵與IgG抗體Fc段相連接，通過生物素-親和素作用，從而實現(xiàn)三維定向固定IgG抗體。

具體步驟如下：

IgG抗體與所述生物試劑按照1:4～6分子數(shù)比例混合，室溫振蕩20～40min后，將上述反應(yīng)體系置于冰上，365nm紫外照射2～4h，照射后產(chǎn)物用超濾離心管除去多余的Z_Bpa–Biotin分子，即可得到精準導(dǎo)向Fc位點偶聯(lián)的生物素化抗體。

所述室溫是指18～37℃。

本發(fā)明的第六個目的是提供一種免疫傳感芯片，該免疫芯片包括一基底片，所述基底片上固定有親和素，親和素與所述生物素化抗體中的生物素相結(jié)合。

其中，基底片上固定有親和素為本領(lǐng)域的公知常識，在此不再贅述。所述基底片并沒有特別限定，本發(fā)明中的一個具體實施方式為CM5芯片，該芯片可常規(guī)得到。在本發(fā)明中的一個具體實施方式中，所述親和素為鏈霉親和素(SA)。

該芯片可用于生物樣本的分析測定，主要是指檢測相關(guān)抗原，所述相關(guān)抗原是指能夠與IgG抗體特異性結(jié)合的物質(zhì)，比如：癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)等疾病標記物。

由背景技術(shù)可知，基于各種生物素衍生物(活化生物素)與抗體分子內(nèi)的氨基酸殘基(氨基、羰基)之間的共價偶聯(lián)技術(shù)，一個抗體分子可連接多個生物素分子，但生物素與抗體分子內(nèi)的活性基團是一種隨機結(jié)合方式，當反應(yīng)基團的氨基酸殘基位于抗體Fab或附近時，導(dǎo)致固相化的生物素化抗體的Fc端向外而掩蓋Fab段，仍不能保證所吸附的抗體是定向固定的抗體。

本發(fā)明以基因工程技術(shù)表達帶有光敏基團的Z親和肽-Avitag融合蛋白并BirA酶催化完成Z_Bpa-Avitag融合蛋白自身的生物素共價定點偶聯(lián)，獲得一種可精準導(dǎo)向Fc位點偶聯(lián)的Z_Bpa-Biotin，繼而在365nm紫外光激發(fā)下實現(xiàn)Fc位點的生物素共價標記的抗體。本發(fā)明所提供的精準Fc位點的生物素化抗體，是一種Fc位點不可逆的共價偶聯(lián)，不受pH、溫度、有機溶劑及變性劑的影響，可實現(xiàn)在親和素包被的載體表面所固定的IgG抗體是均一、Fab段充分暴露及保持高抗原結(jié)合活性的三維定向IgG抗體，且在實際應(yīng)用中突破了被分析物中不能有結(jié)合Z親和肽物質(zhì)的限制。

附圖說明

圖1 Z_Bpa–Biotin介導(dǎo)的精準Fc位點生物素化抗體示意圖。

圖2 Z_Bpa–Biotin精準偶聯(lián)抗體Fc位點電泳及Western分析。

圖3 photo-biotinylated IgG的三維定向固定及應(yīng)用示意圖。

圖4 NHS-biotinylated IgG的三維定向固定及應(yīng)用示意圖。

圖5固相化的photo-biotinylated IgG及NHS-biotinylated IgG分析效能比較。

具體實施方式

若無特別說明，所涉及的試劑、試驗方法均為常規(guī)法試劑、常規(guī)方法。

本發(fā)明中的術(shù)語解釋：

Fab段：抗原結(jié)合片段(fragment of antigen binding，F(xiàn)ab)，相當于抗體分子的兩個臂，由一個完整的輕鏈和重鏈的V_H和C_H1結(jié)構(gòu)域組成。

Fc段/Fc：可結(jié)晶段(fragment crystallizable，F(xiàn)c)相當于Ig的C_H2和C_H3結(jié)構(gòu)域，是Ig與效應(yīng)分子或者細胞相互作用的部位。

ZZ親和肽：是源于葡萄球菌蛋白A的人工合成的兩個重復(fù)序列，能結(jié)合IgG抗體Fc段。

Z親和肽：是源于葡萄球菌蛋白A的人工合成的單序列，能結(jié)合IgG抗體Fc段。

Z親和肽的α1結(jié)構(gòu)域是指：Z親和肽氨基酸序列的第4–18位。

Avi-tag是一個由15個氨基酸殘基組成的短肽標簽，在體內(nèi)或體外都能被生物素連接酶在賴氨酸殘基連接上一個生物素，從而實現(xiàn)蛋白的生物素化。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明。

如圖1所示，一種精準導(dǎo)向Fc位點偶聯(lián)的生物試劑(簡稱Z_Bpa-Biotin)，該生物試劑包括一Z親和肽，其特點是：所述Z親和肽的α1結(jié)構(gòu)域處連接有4-苯甲?；?L-苯丙氨酸，所述Z親和肽的羧基末端殘基處依次連接Avi-tag標簽蛋白和多聚組氨酸純化標簽蛋白，其中所述Avi-tag標簽蛋白上的賴氨酸殘基上連接生物素或其衍生物(其衍生物也指活化生物素)。

實施例1重組質(zhì)粒pZ_TAG–Avitag表達載體的構(gòu)建

為實現(xiàn)利用aaRS/suppressor tRNA技術(shù)實現(xiàn)在蛋白質(zhì)的翻譯過程中即生物合成含光敏基團的目的蛋白質(zhì)，及利用BirA/Avitag技術(shù)實現(xiàn)生物素在目的蛋白特定位點的共價偶聯(lián)：

首先根據(jù)Z親和肽基因序列，通過分析優(yōu)化設(shè)計，在Z親和肽的α1結(jié)構(gòu)域序列適宜位點置換插入琥珀密碼子(TAG)。

本發(fā)明利用BirA/Avitag技術(shù)實現(xiàn)生物素在目的蛋白特定位點的共價偶聯(lián)，在Z親和肽基因序列下游、6×His純化標簽上游置入Avitag基因序列。

上述目的基因序列的5'端設(shè)置NdeI限制性內(nèi)切酶酶切位點，3'端設(shè)置XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點，化學合成法合成含有6×His純化標簽的Z_TAG-Avitag基因序列(如SEQIDNO.1所示)，目的基因序列亞克隆至pTBX1質(zhì)粒的NdeI/XhoI位置中，獲得重組pZ_TAG-Avitag質(zhì)粒表達載體。

實施例2重組蛋白Z_Bpa–Avitag的表達與純化

(1)重組表達質(zhì)粒pZ_TAG–Avitag和質(zhì)粒pEVOL-pBpF氯化鈣法共轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌E.coli BL21(DE3)，涂布于含氨芐(100μg/mL)和氯霉素(50μg/mL)的LB固體培養(yǎng)平板，37℃過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆，獲得基因工程菌；

(2)挑取單克隆菌落至10mL液體LB培養(yǎng)基(氨芐100μg/mL，氯霉素50μg/mL)，37℃過夜培養(yǎng)、活化；

(3)活化的細胞轉(zhuǎn)接到50mL 2×YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6–0.8；加入終濃度為300μM的Bpa，繼續(xù)培養(yǎng)1h；再加入終濃度分別為0.5mM的IPTG和0.2％的阿拉伯糖，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6h；

(4)上述培養(yǎng)的基因工程菌經(jīng)4℃，6000rpm離心15min后，收集菌體，以5mL 20mM PBS(含20mM咪唑，150mM NaCl，pH 8.0)緩沖液重懸，-70℃冰箱反復(fù)凍融5次以裂解細胞；8000rpm離心15min去除菌體碎片；0.45μm濾膜過濾上清后，以HisTrap層析柱純化目的蛋白。20mM PBS(含250mM咪唑，150mM NaCl，pH 8.0)緩沖液洗脫并收集洗脫組分。

(5)Millipore超濾離心管(截留分子量為10kDa)8000rpm離心脫鹽濃縮至合適體積，冷凍干燥，稱重，可從1L菌體發(fā)酵液純化得到約10mg目的蛋白。

實施例3重組蛋白Z_Bpa–Avitag體外生物素化的制備

本實施例中利用BirA酶體外反應(yīng)體系對重組蛋白Z_Bpa–Avitag進行生物素化，再通過HisTrap層析柱和Millipore超濾離心管獲得生物素化的重組蛋白Z_Bpa–Avitag。

步驟如下：

(1)采用BirA酶反應(yīng)體系如下：25μL buffer A，25μL buffer B，100μL Z_Bpa–Avitag，45U/μL BirA，250μL反應(yīng)體積30℃反應(yīng)6h；

(2)將上述反應(yīng)后的混合液依據(jù)實施例2步驟(4)和(5)，利用HisTrap層析柱和Ultra-4(NMWL:10kDa)超濾離心管即可獲得生物素化的重組蛋白Z_Bpa–Avitag即Z_Bpa–Biotin，并且去除了多余的生物素和BirA酶；

(3)生物素化產(chǎn)物Z_Bpa–Biotin經(jīng)15％SDS-PAGE分離后，移至NC膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，經(jīng)5％BSA溶液封閉30min，TBST(含0.1M Tris pH 7.5，0.05％Tween20)洗滌后，膜浸入SA-HRP(辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素，1:1000)溶液中，37℃溫育結(jié)合30min，TBST洗滌3次，每次5min，加入顯色底物TMB(TMB為常規(guī)顯色液)顯色。

(4)重組蛋白Z_Bpa–Avitag的生物素化效率測定：利用HABA法檢測生物素標記效果，檢測結(jié)果顯示通過BirA酶在體外進行生物素化后，有98％的蛋白Z_Bpa–Avitag結(jié)合了生物素，即Z_Bpa–Biotin。

所述buffer A為0.5M的N-二(羥乙基)甘氨酸(pH 8.3)；所述buffer B為pH 8.0的溶液中，含有100mM ATP,100mM乙酸鎂,200mM biotin。

實施例4Z_Bpa–Biotin介導(dǎo)的精準Fc位點生物素化抗體

本實施例基于Z_Bpa–Biotin通過生物親和性的特性可以與IgG定向結(jié)合，由于Bpa是光敏基團，在365nm紫外照射條件下，促使活化的Bpa與鄰近的IgG的氨基形成共價鍵，可實現(xiàn)生物素精準共價偶聯(lián)抗體的Fc位點(圖1所示)。

步驟如下：

(1)IgG抗體與Z_Bpa–Biotin按照1:5分子數(shù)比例混合于石英比色皿，室溫輕輕振蕩30min。

(2)將上述石英皿置于冰上，365nm紫外照射3h，照射后產(chǎn)物用Ultra-0.5(NMWL:100kDa)超濾離心管除去多余的Z_Bpa–Biotin分子，將最終產(chǎn)物即生物素化抗體命名為photo-biotinylated IgG。

(3)photo-biotinylated IgG首先12％非變性SDS-PAGE和變性SDS-PAGE分析，然后進行Fc位點偶聯(lián)確證：胃蛋白酶溶解于水解(50mM醋酸鈉,10mM EDTA,pH 3.3)緩沖液中，使其終濃度為100μg/mL；100μL胃蛋白酶溶液與100μL photo-biotinylated IgG混合，37℃反應(yīng)2h；15％SDS-PAGE分離后移至NC膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，經(jīng)5％BSA溶液封閉30min，TBST(含0.1M Tris pH 7.5，0.05％Tween20)洗滌后，膜浸入SA-HRP(1:1000)溶液中，37℃溫育結(jié)合30min，TBST洗滌3次，每次5min，加入顯色底物TMB顯色。實驗結(jié)果表明，photo-biotinylated IgG水后的12KD條帶明顯著色，表明Z_Bpa–Biotin不與重鏈的V_H,C_H1和鉸鏈區(qū)結(jié)合，而與IgG的Fc段結(jié)合，且90％的IgG分子共價偶聯(lián)了Z_Bpa–Biotin(圖2所示)。

實施例6Z_Bpa–Biotin介導(dǎo)的精準Fc位點生物素化抗體的應(yīng)用

本實施例是基于CEA(癌胚抗原)作為臨床多種癌癥診斷的生物標記物，通過對CEA的檢測來間接評估定向固定photo-biotinylated IgG在生物傳感方面的應(yīng)用，并以隨機偶聯(lián)生物素化的抗體為對照(NHS-biotinylated-兔抗CEA IgG)。

步驟如下：

(1)兔抗CEA IgG與過量的Z_Bpa–Biotin室溫孵育30min，紫外照射3h，得到產(chǎn)物photo-biotinylated-兔抗CEA IgG，Ultra-0.5超濾離心管離心，醋酸緩(10mM，pH 3.2)沖液作為離心時的洗滌液，分離除去多余的Z_Bpa–Biotin和非共價結(jié)合的兔抗CEA IgG。

(2)5μM of photo-biotinylated-兔抗CEA IgG以30μL/min流速，PBS(10mM,pH 8.0)緩沖液作為流動相，通過鏈霉親和素(SA)-生物素相互作用結(jié)合到固定有SA的CM5芯片，產(chǎn)生定向固定的photo-biotinylated IgG免疫傳感芯片，如圖3所示。

(3)以化學共價偶聯(lián)法的NHS-biotinylated IgG為對照，即5μM of NHS-biotinylated-兔抗CEA IgG以30μL/min流速，PBS(10mM,pH 8.0)緩沖液作為流動相，通過鏈霉親和素(SA)-生物素相互作用結(jié)合到固定有SA的CM5芯片，產(chǎn)生定向固定的NHS-biotinylated IgG免疫傳感芯片，如圖4所示。

(5)稀釋0至200ng/mL不同系列濃度的鼠抗CEA做為測試樣品，以PBS(10mM,pH8.0)緩沖液作分流動相，醋酸緩(10mM,pH 3.2)沖液用于重生芯片表面。結(jié)果顯示photo-biotinylated IgG免疫傳感芯片的線性檢測范圍為2–100ng/mL，LOD值2ng/mL；NHS-biotinylated IgG免疫傳感芯片的線性檢測范圍為10–80ng/mL，LOD值為10ng/mL，如圖5所示。

(6)以PBS(10mM,0.05％Tween20，pH 8.0)稀釋人血清100倍，加入不同量的CEA，使其終濃度分別為10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL，photo-biotinylated IgG免疫傳感芯片分析上述樣品，回收率為103.40％–109.53％，RSD為4.51％–13.50％，結(jié)果顯示血清內(nèi)的內(nèi)源性抗體不干擾photo-biotinylated IgG免疫傳感芯片對CEA測定，表明該免疫傳感芯片可以用于生物樣本的分析測定。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。