本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及菊花CmACO基因單克隆抗體的制備及鑒定方法。
背景技術(shù)：
：菊花是在植物分類學(xué)中是菊科、菊屬的多年生宿根草本植物。按栽培形式分為多頭菊、獨本菊、大立菊、懸崖菊、藝菊、案頭菊等栽培類型；有按花瓣的外觀形態(tài)分為園抱、退抱、反抱、亂抱、露心抱、飛午抱等栽培類型。不同類型里的菊花又命名各種各樣的品種名稱。菊花是中國十大名花第三，花中四君子(梅蘭竹菊)之一，也是世界四大切花(菊花、月季、康乃馨、唐菖蒲)之一，產(chǎn)量居首。因菊花具有清寒傲雪的品格，才有陶淵明的“采菊東籬下，悠然見南山”的名句。中國人有重陽節(jié)賞菊和飲菊花酒的習(xí)俗。唐·孟浩然《過故人莊》：“待到重陽日，還來就菊花?！痹诠派裨拏髡f中菊花還被賦予了吉祥、長壽的含義。菊花是經(jīng)長期人工選擇培育的名貴觀賞花卉，公元八世紀前后，作為觀賞的菊花由中國傳至日本。17世紀末葉荷蘭商人將中國菊花引入歐洲，18世紀傳入法國，19世紀中期引入北美。此后中國菊花遍及全球。菊花為多年生草本，高60-150厘米。莖直立，分枝或不分枝，被柔毛。葉互生，有短柄，葉片卵形至披針形，長5-15公分，羽狀淺裂或半裂，基部楔形，下面被白色短柔毛，邊緣有粗大鋸齒或深裂，基部楔形，有柄。頭狀花序單生或數(shù)個集生于莖枝頂端，直徑2.5-20厘米，大小不一，單個或數(shù)個集生於莖枝頂端；因品種不同，差別很大?？偘鄬?，外層綠色，條形，邊緣膜質(zhì)，外面被柔毛；舌狀花白色、紅色、紫色或黃色?；ㄉ珓t有紅、黃、白、橙、紫、粉紅、暗紅等各色，培育的品種極多，頭狀花序多變化，形色各異，形狀因品種而有單瓣、平瓣、匙瓣等多種類型，當中為管狀花，常全部特化成各式舌狀花；花期9-11月。雄蕊、雌蕊和果實多不發(fā)育。菊花為多年生宿根亞灌木。繁殖苗的莖，分為地上莖和地下莖兩部分。地上莖高0.2-2米，多分枝。幼莖色嫩綠或帶褐色，被灰色柔毛或絨毛?；ê笄o大都枯死。次年春季由地下莖發(fā)生孽芽。菊花葉系單葉互生，葉柄長1-2厘米，柄下兩側(cè)有托葉或退化，葉卵形至長圓形，邊緣有缺刻及鋸齒。葉的形態(tài)因品種而異，可分正葉、深刻正葉、長葉、深刻長葉、圓葉、葵葉、蓬葉和船葉等8類。菊花的花(頭狀花序)，生于枝頂，徑約2-30厘米，花序外由綠色范片構(gòu)成花苞?；ㄐ蛏现鴥煞N形式的花：一為簡狀花，俗稱"花心"，花冠連成簡狀，為兩性花，中心生一雌蕊，柱頭2裂，子房下位1室，圍繞花住主5孜聚藥雄蕊；另一為舌狀花，生于花序邊緣，俗稱"花瓣"，花內(nèi)雄蕊退化，雌蕊1枚。舌狀花多形大色艷，形狀分平、匙、管、桂、畸等5類。瘦果(一般稱為"種子")長1-3毫米，寬0.9-1.2毫米，上端稍尖，呈扁平楔形，表面有縱棱紋，褐色，果內(nèi)結(jié)一粒無胚乳的種子，果實翌年1-2月成熟，千粒重約1克。菊花品種具有極大多樣性，分類工作者們探討菊花的原祖。或認為野菊是菊花的原始祖先，或認為甘菊是原祖，或認為它的原祖是小紅菊，或者開出一系列的可能的原祖名單。中國科學(xué)工作者有的還進行過屬間雜交實驗，在探討菊花真源方面做了一些推測性和實驗性工作。無論推測和實驗，都是試圖把菊花的來源落實于該屬的某一個或某兩個種上，并且試圖指出，在這些浩瀚的品種中，哪一個品種最為原始，即是說，想找出最原始的菊花品種?？梢钥隙?，菊花的來源是多方面，是多元而不是單元起源。菊花是異花受粉植物。人們在長期的實踐過程中，運用種間，甚至屬間雜交的辦法，來獲取菊花的新性狀，并通過返交、互交等有性過程來獲得新性狀的分離。這樣如此返復(fù)的遺傳重組合和性狀的分離，新性狀就越來越多。在這個過程中，有意識的人工雜交和隨機的自然選擇都可以同時出現(xiàn)或交替發(fā)生。但是，去劣擇優(yōu)的人工選擇過程，卻永遠起著主導(dǎo)作用。菊花染色體極其有限。僅記錄到菊花是6倍體，2n＝54。菊花新品種產(chǎn)生的另一個可能的途徑是體細胞的突變(芽變)，用固定芽變的辦法來獲得新品種。菊花是世界四大切花之一，人們首先認識和利用菊花的藥用價值，然后逐步發(fā)展到對食用和觀賞價值的開發(fā)，隨著菊花在綠化工程、藥物工程的應(yīng)用越來越廣，對菊花的需求量也日益增多，因此急需加大菊花繁殖及創(chuàng)新工作的進度。乙烯(Ethylene，ETH)在特定濃度下對不定根的生成的影響具有雙重性，既有抑制，也有促進。乙烯能促進植物下胚軸形成較多的根源基，能抑制根的伸長，同時又使下胚軸變粗。研究表明，當下胚軸基部的乙烯增多，IAA水平高時，則促進生根，但如果持續(xù)增高達到一定程度時，則會抑制IAA向下運輸，抑制生根，因此乙烯在植物扦插生根中起著至關(guān)重要的作用。ACO是乙烯生物合成的一個重要限速酶，研究菊花ACO基因的單克隆抗體制備及鑒定對難生根植物繁殖提供理論參考，為生產(chǎn)上加快植物扦插生根提高其成活率提供技術(shù)支持。目前對乙烯在菊花生根過程中的作用研究還是鮮有報道，其合成途徑中關(guān)鍵酶的抗體制備及功能研究還是空白。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了菊花CmACO基因單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：步驟一，制備菊花CmACO基因并測序；步驟二，從所述菊花CmACO基因的氨基酸序列中找出抗原片段，并合成菊花CmACO抗原蛋白；步驟三，用所述菊花CmACO抗原蛋白免疫實驗動物，并取動物細胞與骨髓瘤細胞融合并用抗原包被，得到雜交瘤細胞株。步驟四，將所述雜交瘤細胞株進行增殖、純化和篩選，得菊花CmACO基因單克隆抗體。進一步的，所述菊花CmACO基因的氨基酸序列為：METFPIVNMEKLNGEERAATLNLINDACENWGFFEIVNHGISTELLDTVEKMTKGHYKKCMEDRFKEMVASKGLEAVQSEIEDLDWESTFYLRHLPVSNISEVPDLEDEYRKVMKLFAEELEKLAENLLDIFCENLGLEKGYLKKAFYGAGAKGPTFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTDAGGVILLFQDDKVSGLQLLKDDKWVDVPPMHHSIVINLGDQLEVITNGRYKSVMHRVIAQTDGTRMSIASFYNPGSDAVIYPAPELVNKEAEKSSMYPKFVFEDYMKLYAEVKFQAKEPRFEAFKTMQEAVSVSPIATA。進一步的，所述步驟一中，制備所述菊花CmACO基因包括如下步驟：步驟一，根據(jù)菊花EST數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物；步驟二，將所述引物通過RT-PCR得到菊花CmACO基因。進一步的，所述引物包括GAACCTGAGAACAATGGAAACCTT和CAAGACACCAGACCGATAAT。進一步的，所述實驗動物為Balb/c小鼠；所述動物細胞為所述Balb/c小鼠脾細胞；所述骨髓瘤細胞為Sp2/0骨髓瘤細胞。進一步的，所述步驟三的所述免疫試驗動物包括如下步驟：步驟一，將所述菊花CmACO抗原蛋白與弗氏完全或不完全佐劑混合，得混合液，對實驗動物給藥，為第一次免疫；步驟二，第二次免疫給藥的所述混合液用量減半，對實驗動物給藥；步驟三，第三次免疫起，免疫后檢測效價；步驟四，最后一次加強免疫，3天后取脾細胞，待用。進一步的，所述步驟四中的所述增殖包括如下步驟：步驟一，用所述弗氏不完全佐劑致敏所述實驗動物；步驟二，對所述實驗動物給藥所述雜交瘤細胞株，得實驗動物體液；步驟三，取所述實驗動物體液上清液。進一步的，所述實驗動物體液為腹水；取所述實驗體液上清液的方法為離心。進一步的，所述步驟四中的所述純化方法為采用ProteinG柱方法進行純化。提供一種菊花CmACO基因單克隆抗體的鑒定方法，包括如下步驟：步驟一，用苯酚法提取菊花可溶性蛋白；步驟二，對所述菊花可溶性蛋白進行定量并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；步驟三，通過免疫印跡試驗檢驗菊花可溶性蛋白，驗證菊花CmACO基因單克隆抗體。本申請中，制備了高特異性的菊花CmACO單克隆抗體(1A10)，研究了扦插生根過程中ACO的表達特性。從切花菊‘神馬’中分離獲得了菊花CmACO基因，其ORF全長960bp，編碼320個氨基酸，對其氨基酸序列進行分析，根據(jù)抗原挑選原則，找到15個抗原片段，將化學(xué)合成的肽段與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑混合免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞，用PEG4000進行細胞融合。用相應(yīng)抗原包被，進行間接Elisa篩選得到陽性雜交瘤細胞，并進行超表達Westernblot驗證，獲得5株分泌菊花CMACO單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經(jīng)小鼠腹水制備大量單克隆抗體，采用ProteinG柱純化腹水。進一步通過免疫印跡分析篩選出1株高特異性的菊花CmACO單克隆抗體(1A10)。用菊花莖基部蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示，1A10單克隆抗體特異性識別菊花中的ACO蛋白，是研究扦插生根過程中乙烯作用的最佳抗體。菊花是世界四大切花之一，人們首先認識和利用菊花的藥用價值，然后逐步發(fā)展到對食用和觀賞價值的開發(fā)，隨著菊花在綠化工程、藥物工程的應(yīng)用越來越廣，對菊花的需求量也日益增多，因此急需加大菊花繁殖及創(chuàng)新工作的進度。菊花CmACO基因的克隆及CmACO單克隆抗體的制備為菊花繁殖提供了全新的思路和途徑。乙烯(Ethylene，ETH)在特定濃度下對不定根的生成的影響具有雙重性，既有抑制，也有促進。乙烯能促進植物下胚軸形成較多的根源基，能抑制根的伸長，同時又使下胚軸變粗。研究表明，當下胚軸基部的乙烯增多，IAA水平高時，則促進生根，但如果持續(xù)增高達到一定程度時，則會抑制IAA向下運輸，抑制生根，因此ETH在植物扦插生根中起著至關(guān)重要的作用。ACO是ETH生物合成的一個重要限速酶，研究菊花ACO基因的克隆及單克隆抗體制備及鑒定對難生根植物繁殖提供理論參考，為生產(chǎn)上加快植物扦插生根提高其成活率提供技術(shù)支持。最近通過分析矮牽牛轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)乙烯和生長素的刺激是扦插不定根形成的調(diào)節(jié)器。1975年Kohler和Milstein首次建立了B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，該技術(shù)使人們通過細胞工程可以在體外定向地制備各種單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)。McAb最大的優(yōu)點在于其特異性強、靈敏度高,能大量制備,且不含其他交叉反應(yīng)性的污染抗體。目前對乙烯在菊花生根過程中的作用研究還是鮮有報道，其合成途徑中關(guān)鍵酶的抗體制備及功能研究還是空白，因此CmACO單克隆抗體的研究及制備意義十分重大。附圖說明應(yīng)當理解的是，以下附圖僅示出了本申請的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本申請中菊花CmACO基因蛋白表位指標分析圖；圖2為本申請中菊花CmACO基因的PCR產(chǎn)物凝膠電泳；圖3為本申請中菊花CmACO基因與其他物種ACO同源物氨基酸比對及進化聚類分析；圖4為本申請中菊花CmACO基因抗體過表達初篩；圖5為本申請中菊花莖基部總蛋白單向電泳圖譜；圖6為本申請中菊花生根過程中莖基部ACO的檢測；具體實施方式提供了菊花CmACO基因單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：步驟一，制備菊花CmACO基因并測序；步驟二，從所述菊花CmACO基因的氨基酸序列中找出抗原片段，并合成菊花CmACO抗原蛋白；步驟三，用所述菊花CmACO抗原蛋白免疫實驗動物，并取動物細胞與骨髓瘤細胞融合并用抗原包被，得到雜交瘤細胞株。步驟四，將所述雜交瘤細胞株進行增殖、純化和篩選，得菊花CmACO基因單克隆抗體。需要理解的是，基因(遺傳因子)是具有遺傳效應(yīng)的DNA片段(部分病毒如煙草花葉病毒、HIV的遺傳物質(zhì)是RNA)?；蛑С种幕緲?gòu)造和性能。儲存著生命的種族、血型、孕育、生長、凋亡等過程的全部信息。環(huán)境和遺傳的互相依賴，演繹著生命的繁衍、細胞分裂和蛋白質(zhì)合成等重要生理過程。生物體的生、長、衰、病、老、死等一切生命現(xiàn)象都與基因有關(guān)。它也是決定生命健康的內(nèi)在因素。因此，基因具有雙重屬性：物質(zhì)性(存在方式)和信息性(根本屬性)。帶有遺傳訊息的DNA片段稱為基因，其他的DNA序列，有些直接以自身構(gòu)造發(fā)揮作用，有些則參與調(diào)控遺傳訊息的表現(xiàn)。組成簡單生命最少要265到350個基因。上述，本申請中實驗材料分別為：1、切菊花品種“神馬”，栽植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)“中國菊花種質(zhì)資源保存中心”。取插穗莖基部約0.8cm，液氮速凍后于-80℃超低溫冰箱保存，以備提取RNA或蛋白質(zhì)。2、Sp2/0骨髓瘤細胞3、Balb/c小鼠購自艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司。進一步的，所述菊花CmACO基因的氨基酸序列為：METFPIVNMEKLNGEERAATLNLINDACENWGFFEIVNHGISTELLDTVEKMTKGHYKKCMEDRFKEMVASKGLEAVQSEIEDLDWESTFYLRHLPVSNISEVPDLEDEYRKVMKLFAEELEKLAENLLDIFCENLGLEKGYLKKAFYGAGAKGPTFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTDAGGVILLFQDDKVSGLQLLKDDKWVDVPPMHHSIVINLGDQLEVITNGRYKSVMHRVIAQTDGTRMSIASFYNPGSDAVIYPAPELVNKEAEKSSMYPKFVFEDYMKLYAEVKFQAKEPRFEAFKTMQEAVSVSPIATA。上述，為菊花CmACO基因的氨基酸序列；而菊花CmACO基因序列為：GAACCTGAGAACAATGGAAACCTTCCCAATTGTGAACATGGAGAAGCTTAACGGCGAGGAAAGAGCTGCAACGTTGAACTTGATCAACGATGCTTGTGAAAACTGGGGGTTCTTCGAGATTGTGAACCATGGCATATCGACTGAGCTTTTGGACACTGTGGAAAAGATGACAAAAGGGCATTACAAGAAGTGTATGGAAGATAGGTTCAAAGAAATGGTCGCCAGCAAAGGGTTAGAAGCGGTTCAAAGTGAAATCGAAGATTTGGACTGGGAGAGCACTTTCTATCTTCGTCATCTACCCGTATCCAACATCTCTGAGGTCCCAGATCTTGAAGATGAGTACAGGAAGGTGATGAAGTTGTTTGCTGAAGAGCTTGAGAAACTAGCTGAGAATCTTTTAGACATATTCTGTGAGAATCTAGGACTAGAGAAAGGTTACCTCAAGAAAGCTTTCTATGGTGCTGGAGCCAAGGGTCCCACCTTCGGGACCAAAGTGAGCAACTATCCCCCATGTCCTAAGCCTGATCTTATCAAGGGTCTCCGGGCCCACACCGATGCTGGCGGCGTTATCTTACTCTTCCAGGACGATAAGGTCAGCGGGCTCCAGCTCCTTAAGGACGACAAATGGGTTGATGTTCCACCGATGCACCATTCCATTGTGATTAACCTGGGTGATCAGCTTGAGGTAATCACTAACGGAAGGTACAAAAGTGTGATGCATAGAGTGATTGCTCAAACTGATGGAACCCGAATGTCGATAGCCTCATTTTACAACCCAGGAAGTGATGCTGTGATCTATCCTGCACCAGAACTAGTAAACAAGGAAGCAGAAAAAAGCAGTATGTACCCGAAGTTTGTGTTTGAGGACTACATGAAGCTCTATGCTGAAGTGAAGTTTCAGGCAAAGGAGCCTAGATTTGAAGCTTTTAAGACCATGCAGGAGGCAGTCAGCGTCAGCCCCATTGCGACGGCTTGAGTGAAGAAATCAACAGTGATGGTGTTTGTGTGTGTTCATTTAGTTAAATAAGATTATAAAGGATTACACCAAAAAAAAAATGAGATGTGTTTGAGTATATTCTAAGGTATTATCGGTCTGGTGTCTTG。進一步的，所述步驟一中，制備所述菊花CmACO基因包括如下步驟：步驟一，根據(jù)菊花EST數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物；步驟二，將所述引物通過RT-PCR得到菊花CmACO基因。進一步的，所述引物包括GAACCTGAGAACAATGGAAACCTT和CAAGACACCAGACCGATAAT。需要理解的是，EST數(shù)據(jù)庫中序列的獲得方法為：登錄NCBI網(wǎng)站HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov/，選擇EST數(shù)據(jù)庫，以切菊花或栽培菊花拉丁名比如Chrysanthemummorifolium或Dendranthemamorifolium為關(guān)鍵詞，進行菊花EST數(shù)據(jù)檢索，將獲取到的數(shù)據(jù)以fasta格式保存并下載，以便進一步處理；將下載的數(shù)據(jù)使用SeqVerterTM軟件進行序列格式轉(zhuǎn)化為DNAStar進行處理，去除序列中污染的克隆載體序列。上述，根據(jù)根據(jù)菊花EST數(shù)據(jù)庫信息，設(shè)計一對引物分別為：CmACOF：GAACCTGAGAACAATGGAAACCTT，CmACOR：CAAGACACCAGACCGATAAT，通過RT-PCR得到目的片段、并進行測序。需要理解的是，RT-PCR為逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR)或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補DNA。RT-PCR的指數(shù)擴增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測某種RNA的含量。檢測基因表達的方法，參見NorthernBlot法。RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即鳥類成髓細胞性白細胞病毒(avianmyeloblastosisvirus，AMV)反轉(zhuǎn)錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus，MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶。在完成逆轉(zhuǎn)錄過程之后,通過PCR進行定量分析的時候，隨著技術(shù)的發(fā)展，real-timePCR(實時熒光PCR)或ddPCR(數(shù)字PCR)技術(shù)也被用來做定量分析，它們比普通PCR進行定量分析時靈敏度更高，定量更精確。上述，以CmACOF和CmACOR翻譯的氨基酸序列為材料，應(yīng)用DNAStar中的多種方法預(yù)測抗原細胞表位。最后從中挑選15條10肽抗原片段進行合成。將合成的15條多肽進行串聯(lián)，連接到H載體上，進行原核表達并純化，即為CmACO抗原蛋白。上述，通過RT-PCR擴增獲取目的基因中間片段，并進行測序。根據(jù)引物CmACOF和CmACOR，以切花菊品種‘神馬’cDNA為模板，擴增到與預(yù)期大小吻合的1104bp的中間片段(如圖2)，割膠純化回收目的片段后，連接T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)，挑選陽性克隆，搖菌并測序。對測序結(jié)果進行分析，確定得到了CmACO基因cDNA完整序列，開放閱讀框(ORF)為960bp，編碼320個氨基酸。預(yù)測分析，蛋白大小為77.94kD，等電點是4.9。將克隆所得的CmACO基因編碼得到的氨基酸序列與NCBI上的已登錄的其它作物的ACO基因編碼的氨基酸進行比對?？梢园l(fā)現(xiàn)克隆所得菊花CmACO基因與其它作物中的ACO非常類似，它們都具有高度的ACO保守區(qū)(圖3)。比對結(jié)果顯示，菊花CmACO基因編碼得到的氨基酸序列與萵苣氨ACO基因編碼的氨基酸序列的相似性最高。進一步的，所述實驗動物為Balb/c小鼠；所述動物細胞為所述Balb/c小鼠脾細胞；所述骨髓瘤細胞為Sp2/0骨髓瘤細胞。進一步的，所述步驟三的所述免疫試驗動物包括如下步驟：步驟一，將所述菊花CmACO抗原蛋白與弗氏完全或不完全佐劑混合，得混合液，對實驗動物給藥，為第一次免疫；步驟二，第二次免疫給藥的所述混合液用量減半，對實驗動物給藥；步驟三，第三次免疫起，免疫后檢測效價；步驟四，最后一次加強免疫，3天后取脾細胞，待用。上述，用菊花CmACO抗原蛋白免疫鼠齡為10周的雌性Balb/c健康小鼠3只。流程如下：將CmACO抗原蛋白與弗氏完全或不完全佐劑1:1混合(抗原蛋白含量為100μg)充分乳化后，采用多點皮下注射的方法，免疫Balb/c小鼠。兩周后，第二次免疫，采用弗氏不完全佐劑，用量減半(抗原蛋白含量與50μg)，用腹腔注射的方法免疫小鼠。兩周后，第三次免疫，用量和方法與第二次免疫相同。從第三次免疫起，免疫后隔周采用Elisa的方法檢測小鼠血清效價，效價達到1:40000以上后準備融合。最后一次加強免疫，免疫劑量在400μg，采用靜脈注射的方法。3d后，取脾細胞融合。進一步的，所述步驟四中的所述增殖包括如下步驟：步驟一，用所述弗氏不完全佐劑致敏所述實驗動物；步驟二，對所述實驗動物給藥所述雜交瘤細胞株，得實驗動物體液；步驟三，取所述實驗動物體液上清液。進一步的，所述實驗動物體液為腹水；取所述實驗體液上清液的方法為離心。進一步的，所述步驟四中的所述純化方法為采用ProteinG柱方法進行純化。上述，將免疫鼠脾細胞和骨髓瘤細胞進行細胞融合，采用間接ELISA方法檢測雜交瘤細胞上清，鑒定其可以產(chǎn)生目標抗體后，立即進行克隆化，確保能分離出單個細胞并能重新進行克隆，用非競爭酶免疫試驗測定抗原抗體的親和力優(yōu)選的，取7周齡的Balb/c小鼠，用弗氏不完全佐劑致敏Balb/c小鼠，500μL/只。致敏一周后腹腔注射雜交瘤細胞懸液，8d后采集小鼠腹水，設(shè)定離心機轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心5min后收集上清液。將從小鼠腹水中提取的大量單克隆抗體采用ProteinG柱方法進行純化。優(yōu)選的，細胞株采用小鼠腹腔接種法制備腹水，10-14d收集腹水，ELISA檢測腹水是否制備成功?？偣驳玫?株細胞株，用合成的多肽去偶聯(lián)BSA及ELISA檢測后發(fā)現(xiàn)其中的7株針對的表位是PKPDLIKGLR，1株針對的表位是VSNISEVPDL，還有1株沒有檢測到表位信息(X表位是指在表位鑒定實驗中，由于該細胞組上清的ELISA信號在陽性閾值附近，因此表位信息判斷模糊)。親和力數(shù)據(jù)及ELISA檢測的效價見表1。表1親和力信息及ELISA檢測數(shù)據(jù)克隆號表位編號表位序列親和力ELISA效價1G12X5.53E-09128K2J165VSNISEVPDL3.81E-09256K1I22PKPDLIKGLR5.67E-09128K1D192PKPDLIKGLR5.59E-09256K1M192PKPDLIKGLR5.76E-09128K1P152PKPDLIKGLR5.53E-09128K1G122PKPDLIKGLR6.27E-09128K1A102PKPDLIKGLR6.42E-09512K提供一種菊花CmACO基因單克隆抗體的鑒定方法，包括如下步驟：步驟一，用苯酚法提取菊花可溶性蛋白；步驟二，對所述菊花可溶性蛋白進行定量并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；步驟三，通過免疫印跡試驗檢驗菊花可溶性蛋白，驗證菊花CmACO基因單克隆抗體。構(gòu)建真核質(zhì)粒SalI和KpnI雙酶切后連接到PEGFP載體上，帶有Myc標簽。用構(gòu)建的真核質(zhì)粒去轉(zhuǎn)染293T細胞后，進行細胞裂解得到的蛋白去做WB實驗。CmACO蛋白大小為36.18KD，Myc標簽為8KD，加起來是在44KD左右。泳道2-7分別對應(yīng)著5株細胞株和Myc標簽，用Western-blot的方法進行特異性檢測。一抗：1D19，IM19，IP15,1G12，1A10，1A10稀釋度為1:200，Myc抗體稀釋度為1:1000。二抗：anti-mouse二抗，稀釋度為1:5000。第2-6泳道(圖4)分別對應(yīng)1D19，IM19，IP15,1G12，1A10，1A10這5株菊花ACO抗體，第7泳道對應(yīng)Myc抗體，這6個泳道所對應(yīng)的蛋白大小和預(yù)期蛋白的大小吻合，說明克隆特異性狀態(tài)良好。過表達發(fā)現(xiàn)1A10特異性好，并且從ELISA的檢測結(jié)果也可以看到1A10效價最高，所以我們選擇1A10做大量抗體制備。間接競爭ELISA法檢測抗體和圖4中的5株ACO抗體與菊花可溶性蛋白進行交叉反應(yīng)性。結(jié)果如表2所示，菊花ACO蛋白只與IA10抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，而與其它抗體交叉反應(yīng)性均小于1，說明IA10效果不錯，進行大量制備。先用石蠟注入小鼠14d后，然后將1A10細胞株注入小鼠腹腔內(nèi)，制備大量的腹水，進行ProteinG純化得到純化的抗體。用純化的1A10抗體和提取的菊花蛋白進行內(nèi)源WB驗證。提取菊花莖基部蛋白，檢測提蛋白效果(圖5)，之后用純化好的1A10檢測菊花中ACO蛋白。一抗：1A10株抗體，稀釋度為1:200二抗：anti-mouse二抗，稀釋度為1:5000用提取的不同濃度梯度的菊花莖基部蛋白和1A10株抗體進行WB實驗，發(fā)現(xiàn)在36KD處有條帶，可以證明是1A10株抗體可以識別菊花里的ACO蛋白。(圖6)表2抗體與菊花可溶性蛋白的交叉反應(yīng)性克隆號ID19IM19IP15IG12IA10Myc交叉反應(yīng)率(％)<1<1<1<1100<1下面結(jié)合具體實施例的方式對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細說明，在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。實施例1、依據(jù)菊花EST數(shù)據(jù)庫信息，設(shè)計一對引物：CmACOF：GAACCTGAGAACAATGGAAACCTTCmACOR：CAAGACACCAGACCGATAAT通過RT-PCR得到目的片段并測序。2、以CmACOORF翻譯的氨基酸序列為材料，應(yīng)用DNAStar中的多種方法預(yù)測抗原細胞表位。表位圖可綜合顯示目標蛋白中各區(qū)域的表位指標以及被選中的表位，X軸是目標蛋白中各10肽的起始位置。Y軸是表位指標得分。得分越高，該10肽成為成功表位的可能性越高。灰色曲線是每個10肽的得分曲線。藍色表示被選中的10肽片段。X軸上短柱表示目標蛋白中親水性的分布：綠色代表親水，紅色代表疏水。如果目標蛋白中存在信號肽和跨膜區(qū)，該區(qū)域在X軸下方將用粗橫線標識。最后從中挑選15條10肽抗原片段(AVSVSPIATA；PKPDLIKGLR；NKEAEKSSMY；QSEIEDLDWE；VSNISEVPDL；EVKFQAKEPR；SKGLEAVQSE；EKLNGEERAA；KAFYGAGAKG；AFKTMQEAVS；KDDKWVDVPP；RFKEMVASKG；STELLDTVEK；GLEKGYLKKA；NGRYKSVMHR)，由上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司合成。將合成的15條多肽進行串聯(lián)，連接到H載體上，進行原核表達并純化，即為CmACO抗原蛋白。3、用CmACO抗原蛋白免疫鼠齡為10周的雌性BALB/c健康小鼠3只。流程如下：將CmACO抗原蛋白與弗氏完全或不完全佐劑1：1混合(抗原蛋白含量為100μg)充分乳化后，采用多點皮下注射的方法，免疫Balb/c小鼠。兩周后，第二次免疫，采用弗氏不完全佐劑，用量減半(抗原蛋白含量與50μg)，用腹腔注射的方法免疫小鼠。兩周后，第三次免疫，用量和方法與第二次免疫相同。從第三次免疫起，免疫后隔周采用Elisa的方法檢測小鼠血清效價，效價達到1:40000以上后準備融合。最后一次加強免疫，免疫劑量在400μg，采用靜脈注射的方法。3d后，取脾細胞融合。4、將免疫鼠脾細胞和骨髓瘤細胞進行細胞融合，采用間接ELISA方法檢測雜交瘤細胞上清，鑒定其可以產(chǎn)生目標抗體后，立即進行克隆化，確保能分離出單個細胞并能重新進行克隆，用非競爭酶免疫試驗測定抗原抗體的親和力5、構(gòu)建帶有Myc標簽的真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞后，裂解細胞提取蛋白進行過表達WB試驗。6、取7周齡的Balb/c小鼠，弗氏不完全佐劑致敏Balb/c小鼠，500μL/只。致敏一周后腹腔注射雜交瘤細胞懸液，8d后采集小鼠腹水，設(shè)定離心機轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心5min后收集上清液。將從小鼠腹水中提取的大量單克隆抗體采用ProteinG柱方法進行純化。7、用苯酚法抽提菊花莖基部的可溶性蛋白，并進行定量。定量后進行SDS-PAGE電泳檢測，然后通過Westernblot檢測菊花可溶性蛋白，驗證單克隆抗體。當前第1頁1 2 3