本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從動(dòng)物組織得到的蛋白。

背景技術(shù)：

絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor,serpin)的最基本功能是防止蛋白質(zhì)水解，調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的水解平衡。通過(guò)對(duì)絲氨酸蛋白酶的調(diào)節(jié)，絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)生物體內(nèi)的生理生化功能都有重要的影響。如，它們?cè)谘耗?、補(bǔ)體形成、纖溶、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞基質(zhì)重建、激素形成及轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解、血壓調(diào)節(jié)、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成等方面都有重要作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)如此眾多的生理過(guò)程導(dǎo)致它們有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值，如，抑酶肽aprotinin除在臨床上廣泛用于胃炎、胰腺炎等疾病的治療外，也在胸外科手術(shù)中用于抗纖溶、抑制接觸性激活、抗炎癥等(Br J Anaesth.2013,110(5):675-8)。絲氨酸蛋白酶類似物如Kallikrein、tryptase在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及鼻炎、結(jié)膜炎、哮喘、胃腸炎、心血管系統(tǒng)炎癥等炎癥發(fā)生中起著重要的作用(Biol Chem.2004,385(11):989-96)。因此，絲氨酸蛋白酶抑制劑已成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)，其研究與開發(fā)則蘊(yùn)含著巨大的臨床治療藥物的制備價(jià)值。

兩棲動(dòng)物一直以來(lái)都是傳統(tǒng)藥物的源泉。中華蟾蜍(Bufo gargarizans)、大蹼鈴蟾(Bombina maxima)、黑斑蛙(pelophylax nigromaculata)、沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctis limnocharis)等兩棲類動(dòng)物被作為中國(guó)的傳統(tǒng)中藥材而被廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)代研究表明：這些兩棲動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性，如，廣譜抗菌作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、對(duì)心血管系統(tǒng)的作用等(Dongwuxue Yanjiu,2015,36(4):183-222)。傳統(tǒng)中藥藥物成分的復(fù)雜性及其炮制方法的局限性造成藥物活性成分不能更好發(fā)揮作用，從這些傳統(tǒng)藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容之一。在國(guó)外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已經(jīng)成為新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。目前有許多分子量小于10kDa的蛋白酶抑制劑多肽已經(jīng)從兩棲動(dòng)物皮膚中被鑒定。這些兩棲動(dòng)物皮膚的蛋白酶抑制劑除在前體蛋白的加工和降解過(guò)程中有作用外，還在抗微生物感染中有功能，因此許多來(lái)自兩棲動(dòng)物的蛋白酶抑制劑同時(shí)具有抗菌和蛋白酶抑制劑活性，這些多肽包括ranacyclin-B、KPHTI、HV-BBI、HJTI、hylaserpin S2、OGTI、PYR、PSKP-1、PSKP-2、BOTI、BVTI、BMTI、BPTI、pLR和BSTI等(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。

生物分子的氧化是一個(gè)自由基介導(dǎo)的過(guò)程，它對(duì)食品和生物系統(tǒng)會(huì)造成許多不利的影響。在好氧器官內(nèi)，與動(dòng)脈硬化、癌癥等多種疾病相關(guān)的游離自由基不可避免的隨著氧代謝的過(guò)程而產(chǎn)生。另外，氧化應(yīng)激被認(rèn)為與多種疾病例如老年癡呆癥、帕金森氏癥，這此病理系引發(fā)于糖尿病、由糖尿病引起的并發(fā)癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥引發(fā)的神經(jīng)退行性變有關(guān)(Food Chemistry,2008,107,1485–1493)。在食品中，營(yíng)養(yǎng)成分的氧化會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化物，其不僅會(huì)影響食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，造成食品品質(zhì)的下降，嚴(yán)重的甚至還會(huì)導(dǎo)致攝入者的身體疾病(Journal of Food Science,1999,64,1000–1004)。因此尋找安全的抗氧化劑以抑制過(guò)氧化物產(chǎn)生一直是生化營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。由于BHT、BHA和沒食子酸丙酯等化學(xué)合成抗氧化劑比天然抗氧化劑具有更好的效果和更便宜的價(jià)格，因此被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中，但是，目前有研究發(fā)現(xiàn)合成抗氧化劑對(duì)人體肝、脾、肺等器官有積蓄性致癌左右，從而引起了人們對(duì)其安全性的擔(dān)憂，并且開始慢慢限制起在食品中的使用，于是讓人們把目光轉(zhuǎn)向天然的抗氧化劑(Food Processing,1993,12,54–56)。α-生育酚是一種普遍適用的天然抗氧化劑，它能有效保持食品中油脂的穩(wěn)定性，但卻不利于食品保存。因此有必要尋找其他來(lái)源的天然抗氧化劑。由于兩棲動(dòng)物居住環(huán)境的特殊性，他們有時(shí)會(huì)受到自由氧等損害，這些活性自由氧能通過(guò)氧化脂肪、變性蛋白、破壞核酸，導(dǎo)致對(duì)代謝的嚴(yán)重后果和對(duì)組織和細(xì)胞的大量破壞。為了抵消這種氧化損害生存下來(lái)，兩棲動(dòng)物已經(jīng)進(jìn)化形成了抗氧化防御系統(tǒng)，抗氧化多肽是其中的一類重要組分。目前，從R.pleuraden、R.catesbeiana、O.livida等物種中鑒定了十幾種具有抗氧化活性的多肽(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。因此，兩棲動(dòng)物皮膚是天然抗氧化多肽的重要來(lái)源。

我國(guó)對(duì)兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對(duì)其皮膚活性肽類物質(zhì)研究不多?；⒓y蛙(Hoplobatrachus_rugulosus)是被人工飼養(yǎng)重要的經(jīng)濟(jì)蛙類之一，國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。目前對(duì)其皮膚藥理活性物質(zhì)的研究很少。

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，基因組學(xué)的飛速發(fā)展及合成生物學(xué)的興起大大促進(jìn)了天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能研究；本發(fā)明利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法和藥理學(xué)研究獲得虎紋蛙蛋白酶抑制肽的全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。發(fā)明人將本發(fā)明的虎紋蛙蛋白酶抑制肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是基于上述技術(shù)背景，提供一種具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽(yáng)性細(xì)菌、真菌和病毒)、抗氧化和胰酶抑制劑活性的虎紋蛙蛋白酶抑制肽及其基因和它作為制備病原微生物感染性疾病的治療藥物和美容護(hù)膚藥物的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明一個(gè)方面提供了一種虎紋蛙蛋白酶抑制肽，所述多肽的序列如SEQ ID No.1所示。

KECKDYYCRLLMKVGSTSHIDSLDLGLSHEAQQ SEQ ID NO.1

本發(fā)明另一個(gè)方面提供了一種虎紋蛙蛋白酶抑制肽，其特征在于，所述的虎紋蛙蛋白酶抑制肽是由33個(gè)氨基酸組成，分子量3768.33道爾頓，等電點(diǎn)6.303，其氨基酸序列為：Lys Glu Cys Lys Asp Tyr Tyr Cys Arg Leu Leu Met Lys Val Gly Ser Thr Ser His Ile Asp Ser Leu Asp Leu Gly Leu Ser His Glu Ala Gln Gln(KECKDYYCRLLMKVGSTSHIDSLDLGLSHEAQQ)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三半胱氨酸和第八位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供了虎紋蛙蛋白酶抑制肽基因的核苷酸序列，其特征在于：cDNA由480個(gè)核苷酸組成，其自5’端至3’端序列如SEQ ID NO.4所示。

序列中第379-477位核苷酸編碼具有功能的成熟虎紋蛙蛋白酶抑制肽。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供了一種編碼權(quán)利要求1所述的虎紋蛙蛋白酶抑制肽的核苷酸。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供了前述的虎紋蛙蛋白酶抑制肽在制備病原微生物感染疾病的治療藥物和美容護(hù)膚藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供了前述的虎紋蛙蛋白酶抑制肽在制備清除自由基藥物或美容用品中的用途。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供了前述的虎紋蛙蛋白酶抑制肽在制備抗氧化藥物或美容用品中的用途。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供了前述的虎紋蛙蛋白酶抑制肽在制備預(yù)防或治療與胃炎或胰腺炎的藥物中的用途，優(yōu)選，所述胃炎或胰腺炎為炎癥相關(guān)的胃炎或炎癥相關(guān)的胰腺炎。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供了前述的虎紋蛙蛋白酶抑制肽在非診斷或治療目的的抑制細(xì)菌中的用途，優(yōu)選所述細(xì)菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、綠膿桿菌和白色念球菌。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供了前述的虎紋蛙蛋白酶抑制肽在制備抑制細(xì)菌的藥物或美容用品中的用途，優(yōu)選所述細(xì)菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、綠膿桿菌和白色念球菌。

本發(fā)明的有益效果在于:

由虎紋蛙蛋白酶抑制肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成的虎紋蛙蛋白酶抑制肽具有顯著的抑制細(xì)菌、真菌生長(zhǎng)、抑制胰酶活性和抗氧化作用。該虎紋蛙蛋白酶抑制肽具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便、抗菌譜系廣和活性強(qiáng)的有益特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明虎紋蛙蛋白酶抑制肽HPLC純化鑒定結(jié)果；

圖2為本發(fā)明虎紋蛙蛋白酶抑制肽質(zhì)譜鑒定結(jié)果；

圖3為本發(fā)明虎紋蛙蛋白酶抑制肽絲氨酸蛋白酶抑制劑活性結(jié)果；

圖4為本發(fā)明虎紋蛙蛋白酶抑制肽清除DPPH和ABTS自由基“量-效”關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：

本發(fā)明的虎紋蛙蛋白酶抑制肽，所述的虎紋蛙蛋白酶抑制肽是由33個(gè)氨基酸組成多肽，分子量3768.33道爾頓，等電點(diǎn)6.303，其氨基酸序列為：Lys Glu Cys Lys Asp Tyr Tyr Cys Arg Leu Leu Met Lys Val Gly Ser Thr Ser His Ile Asp Ser Leu Asp Leu Gly Leu Ser His Glu Ala Gln Gln(KECKDYYCRLLMKVGSTSHIDSLDLGLSHEAQQ)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第八位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵從而成環(huán)。

所述虎紋蛙蛋白酶抑制肽的基因序列SEQ ID NO.4的第379-477位核苷酸編碼。本發(fā)明的虎紋蛙蛋白酶抑制肽及其基因的制備過(guò)程包括如下步驟：

實(shí)施例1，虎紋蛙蛋白酶抑制肽基因克隆：

I、虎紋蛙皮膚總RNA提?。夯铙w虎紋蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4h，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10m1總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國(guó)GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于20m1玻璃勻漿器中勻漿30min。加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，棄除沉淀。向上清中加入等體積的異丙醇，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即為虎紋蛙皮膚總RNA。

II、虎紋蛙皮膚mRNA的純化：虎紋蛙皮膚mRNA分離純化采用美國(guó)PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems試劑盒。具體如下：取虎紋蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μl Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30S，棄上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30S，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30sec，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.L ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30sec，將上清移至新的試管，再加入0.15m1DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30S，移上清至上述試管，則上清中為純化的虎紋蛙皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中得到虎紋蛙皮膚mRNA。

III、虎紋蛙皮膚cDNA文庫(kù)構(gòu)建：采用CLONTECH公司CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒。

A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：在0.5ml無(wú)菌的離心管加入1μl虎紋蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl?；靹螂x心管中的試劑并以12000rpm離心15sec，72℃保溫2min。將離心管在冰上孵育2min。在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶?；旌想x心管中試劑并以12000rpm離心15sec，在42℃保溫1h。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。

B.采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈：95℃預(yù)熱PCR儀。將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：95℃20sec，95℃5sec，68℃6min，22個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行抽提。

C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：將通過(guò)PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟上述步驟。12000rpm離心5min。將離心純化柱置于新的離心管中。加入30μl超純水，在室溫下靜置5min。以12000rpm離心30sec，管底溶液即為所純化過(guò)的cDNA雙鏈。

D.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl虎紋蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。加入5μl的連接酶緩沖混合物。16℃反應(yīng)2h。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。42℃加熱90Sec后，再在冰中放置1分鐘。加入37℃孵育過(guò)的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60min。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16h，形成單菌落。每個(gè)LB平皿用5m1LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×10⁶個(gè)單獨(dú)克隆。

Ⅳ、虎紋蛙蛋白酶抑制肽基因克隆篩選：擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸，其序列為5’ATGAAGGTCTGGCAGTGCGCGCTC 3’(SEQ ID NO.2)，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMART^TMcDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’(SEQ ID NO.3)。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行：94℃30sec，50℃45sec和72℃2.5min，35個(gè)循環(huán)。

首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫(kù)，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μ1),37℃過(guò)夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽(yáng)性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。

Ⅴ、虎紋蛙蛋白酶抑制肽基因序列測(cè)定和結(jié)果：提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，使用儀器為美國(guó)Applied Biosystems 373A全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47，BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(SEQ ID NO.5)，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’(SEQ ID NO.6)?；驕y(cè)序結(jié)果自5’端至3’端序列為(SEQ ID NO.4):

虎紋蛙蛋白酶抑制肽基因核苷酸的序列表為：序列長(zhǎng)度為480個(gè)堿基；序列類型：核酸；鏈數(shù)：?jiǎn)捂?；拓?fù)鋵W(xué)：直鏈狀；序列種類：cDNA；來(lái)源：虎紋蛙皮膚。

根據(jù)虎紋蛙蛋白酶抑制肽的基因推斷編碼由功能的成熟活多功能蛋白酶抑制肽為第379-477位核苷酸，氨基酸序列為：KECKDYYCRLLMKVGSTSHIDSLDLGLSHEAQQ(見序列SEQ ID NO.1)

實(shí)施例2，虎紋蛙蛋白酶抑制肽的制備：

Ⅰ、虎紋蛙蛋白酶抑制肽的制備方法：根據(jù)虎紋蛙蛋白酶抑制肽的基因推斷編碼有功能的成熟多功能蛋白酶抑制肽氨基酸序列后用自動(dòng)多肽合成儀合成多肽。通過(guò)HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。二硫鍵的形成采用空氣氧化法，具體為在燒瓶中將多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氫氧化銨滴定成pH 7.8,然后室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。通過(guò)HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。純化時(shí)A液體為0.05％TFA+2％CH3CN，B液為0.05％TFA+90％CH3CN，B液濃度梯度為15min內(nèi)25-40％，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，多肽出現(xiàn)在9.248分鐘。

Ⅱ、分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，以甘油:間硝基芐醇:二甲亞砜(1:1:l，V:V:V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。

Ⅲ、純化的虎紋蛙蛋白酶抑制肽用高效液相色譜(HPLC)方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

虎紋蛙蛋白酶抑制肽是中國(guó)兩棲類動(dòng)物虎紋蛙蛋白酶抑制肽基因編碼的一種多肽，分子量3768.33道爾頓，等電點(diǎn)6.303，其氨基酸序列為：Lys Glu Cys Lys Asp Tyr Tyr Cys Arg Leu Leu Met Lys Val Gly Ser Thr Ser His Ile Asp Ser Leu Asp Leu Gly Leu Ser His Glu Ala Gln Gln(KECKDYYCRLLMKVGSTSHIDSLDLGLSHEAQQ)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三半胱氨酸和第八位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。

實(shí)施例3，虎紋蛙蛋白酶抑制肽的活性實(shí)驗(yàn)

Ⅰ、抗菌能力測(cè)定

抗菌活性檢測(cè)采用杯碟法，細(xì)菌培養(yǎng)采用普通瓊脂培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)采用培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基。分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測(cè)樣品溶液0.l ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24h-48h后觀察抑菌圈大小。抑菌圈l0mm以上的作為最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)。所有測(cè)試菌株均來(lái)源于廣東微生物研究所，試驗(yàn)重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表1所示，虎紋蛙蛋白酶抑制肽對(duì)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、綠膿桿菌和白色念球菌都具有顯著的抑制作用，說(shuō)明虎紋蛙蛋白酶抑制具有良好的廣譜抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。

表1.虎紋蛙蛋白酶抑制肽的抗菌活性

Ⅱ、絲氨酸蛋白酶抑制劑活性測(cè)定

不同量的虎紋蛙蛋白酶抑制肽溶解于0.05M Tris-HCl緩沖液與一定量的胰蛋白酶(最終濃度為40μg/ml)于0.05M Tris-HCl緩沖液于室溫下保溫2min，最后加入發(fā)色底物S-2238(終濃度為40μg/ml)啟動(dòng)反應(yīng)，應(yīng)用PERKIN ELMER(美國(guó))公司生產(chǎn)的分光光度計(jì)于處監(jiān)測(cè)吸收值變化2min,加入同樣體積的0.05M Tris-HCl緩沖液與空白對(duì)照,抑制常數(shù)Ki＝[I]/(V0/VI+1)計(jì)算。[I]為虎紋蛙蛋白酶抑制肽的摩爾濃度，V0為空白對(duì)照是胰蛋白酶與發(fā)色底物的反應(yīng)速度，V1為加入虎紋蛙蛋白酶抑制肽后胰蛋白酶與發(fā)色底物的反應(yīng)速度。此試驗(yàn)重復(fù)六次，取平均值。

結(jié)果如圖3所示，虎紋蛙蛋白酶抑制肽能很有效地抑制胰蛋白酶的活性，在上述試驗(yàn)條件下抑制半數(shù)胰蛋白酶活性所需要的虎紋蛙蛋白酶抑制肽濃度為0.368μM，對(duì)胰蛋白酶的抑制常數(shù)Ki是3.2×10^-7M。

絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)生物體內(nèi)的生理生化功能都有重要的影響。如，它們?cè)谘耗?、補(bǔ)體形成、纖溶、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞基質(zhì)重建、激素形成及轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解、血壓調(diào)節(jié)、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成等方面都有重要作用。虎紋蛙蛋白酶抑制肽能很有效地抑制胰蛋白酶，證實(shí)其能在體內(nèi)調(diào)節(jié)眾多的生理過(guò)程和有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。胃炎、胰腺炎的發(fā)病過(guò)程涉及許多絲氨酸蛋白水解作用，因此抑制這些酶的水解能防止疾病的發(fā)生和減低隨后的炎癥因子對(duì)機(jī)體造成的損害。具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的虎紋蛙蛋白酶抑制肽能應(yīng)用與炎癥相關(guān)的胃炎、胰腺炎中。

Ⅲ、抗氧化能力測(cè)定

1)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

利用DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除率測(cè)定法研究抗氧化多肽。配制濃度為1×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。將2ml，0.1mM的DPPH無(wú)水乙醇溶液加入到含有2ml不同酶解樣品的潔凈試管中，混勻。室溫下放置30min后，于517nm處測(cè)定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越強(qiáng)。

清除率(％)＝【1-(A_i-A_j)/A₀】*100％

式中，A₀為2ml，0.1mM的DPPH無(wú)水乙醇溶液+2ml的樣品試劑，空白對(duì)照，A_i為2ml,0.1mM的DPPH無(wú)水乙醇溶液+2ml的樣品，A_j為2ml的無(wú)水乙醇+2ml的樣品。

2)ABTS自由基清除活性的測(cè)定

以去離子水將ABTS溶解，使ABTS濃度達(dá)到7mmol/L，加入過(guò)硫酸鉀，使過(guò)硫酸鉀的濃度為2.45nmol/L。之后將該溶液在室溫下置于暗處過(guò)夜12～16h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS，0.2mol/L，pH 7.4)稀釋，使其在734nm下的吸光值為0.70。取0.1ml酶解液與2.9ml ABTS自由基液混合，搖勻30秒鐘，暗處反應(yīng)10分鐘，然后在734nm下測(cè)定反應(yīng)液的吸光值。以蒸餾水代替水解液作空白。

清除率(％)＝(A_i-A_j)/A₀*100％

式中，A₀為2.9ml ABTS試劑與0.1ml蒸餾水混合液的吸光值，A_j為2.9ml ABTS+0.1ml的酶解液混合液的吸光值。

如圖4所示，虎紋蛙蛋白酶抑制肽能顯著清除DPPH和ABTS自由基。自由基氧化在老年癡呆癥、帕金森氏癥、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥引發(fā)的神經(jīng)退行性疾病中有重要作用?；⒓y蛙蛋白酶抑制肽能很好的清除自由基能說(shuō)明其能應(yīng)用于自由基氧化導(dǎo)致的相關(guān)疾病的治療。另外，為了防止自由基對(duì)皮膚造成的損害，在美容護(hù)膚品中添加自由基清除劑必不可少。因此，虎紋蛙蛋白酶抑制肽也可以應(yīng)用于美容護(hù)膚品中。