本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從動(dòng)物組織得到的蛋白以及在生物制藥中的用途。

背景技術(shù)：
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糖尿病是多遺傳基因和環(huán)境因素引起的以糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂，而導(dǎo)致多系統(tǒng)，多臟器功能損害的一種多發(fā)的內(nèi)分泌、代謝性疾病。統(tǒng)計(jì)顯示，我國80年代糖尿病患病率僅為0.67％，但2010年國家疾病監(jiān)測(cè)地區(qū)數(shù)據(jù)顯示，全國18周歲以上居民糖尿病患病率為9.7％，并且有1.5億人處于糖尿病前期。糖尿病本身不可怕，可怕的是并發(fā)癥，糖尿病并發(fā)癥包括癌、睡眠呼吸暫停、抑郁、心肌梗死、外周血管病、高血壓。中國Ⅱ型糖尿病的發(fā)病率在過去的30年里猛增(Int J Med Sci.,2014,11(11):1185-200)。Ⅱ型糖尿病又稱“非胰島素依賴型糖尿病”，主要病理表現(xiàn)為胰島素抵抗和由胰島細(xì)胞功能失調(diào)所致的胰島素分泌相對(duì)不足，形成持久的高血糖，并可產(chǎn)生多種致命性并發(fā)癥。其臨床表現(xiàn)癥狀大多與機(jī)體產(chǎn)生胰島素抗性、自身分泌的胰島素少或滯后等有關(guān)。至今為止，該病尚無根治的辦法，它不僅會(huì)加重患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可使患者致殘、早亡。

目前，世界上治療Ⅱ型糖尿病以磺酰脲類藥物為主，輔以雙胍類、a-糖苷酶抑制劑等藥物。但是，由于磺酰脲類藥物的副作用大，長期使用會(huì)因?yàn)橐葝u素過度分泌而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞衰竭，服用此類藥物的糖尿病人中，每年有10％的病人會(huì)因治療失效而改用胰島素等其他類藥物(Int J Med Sci,2014,11(11):1185-200)。作為新藥發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)新的源泉，新結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和復(fù)雜化合物的高效制備一直是天然產(chǎn)物藥物研究的核心。來自脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的活性肽能夠利用腸促胰島素降低血糖水平(Am J Med,2010,123:S2-S10)。腸促胰島素是腸被收營養(yǎng)物質(zhì)刺激后在外周組織分泌產(chǎn)生以促進(jìn)胰島素分泌和葡萄糖的吸收。內(nèi)源性促胰島素釋放肽及其結(jié)構(gòu)類似物因能延緩胃排空，抑制胰高血糖素產(chǎn)生，增加胰島素的生物合成及β細(xì)胞數(shù)量等特點(diǎn)已成為治療Ⅱ型糖尿病的新亮點(diǎn)(Best Pract Res Clin Endocrinol Metab,2007,21:497-516)。人體內(nèi)最強(qiáng)的腸促胰島素GLP-1肽和其數(shù)種結(jié)構(gòu)類似物目前已經(jīng)被應(yīng)用于臨床上治療糖尿病(Drugs,2009,69:1985-2004)?；诖耍瑥淖匀唤缰袑ふ揖哂羞@些特點(diǎn)的多肽的研究已經(jīng)在全球被廣泛開展。從吉拉毒蜥(Heloderma suspectum)的毒液中發(fā)現(xiàn)的exendin-4是GLP-1受體的長效激動(dòng)劑，以其為基礎(chǔ)的商業(yè)化產(chǎn)品Byetta目前也被應(yīng)用于臨床上作治療糖尿病(Expert Opin Pharmacother,2007,8:2593-608)。

兩棲動(dòng)物一直以來都是傳統(tǒng)藥物的源泉。最近的研究表明許多蛙皮膚抗菌肽在對(duì)細(xì)胞沒有毒性的濃度下在體外能夠刺激大鼠BRIN-BD11β細(xì)胞釋放胰島素。這些促胰島素釋放肽已經(jīng)從Hylarana güntheri、Lithobates catesbeianus、Lithobates palustris、Lithobates pipiens、Lithobates septentrionalis、Pelophylax saharicus、Hylomantis lemur和Pseudis paradoxa的皮膚中被鑒定。并且其中的brevinin-2GUb、phylloseptin-L2、B2-RP及其相關(guān)類似物在體內(nèi)能夠增加胰島素濃度，能夠降低血漿血糖水平，改善小鼠的血糖耐受性Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。因此，這些化合物能夠用于治療糖尿病。

中國博大的多物種天然生物資源是結(jié)構(gòu)多樣性小分子有機(jī)化合物的重要來源，其中一些生物活性物質(zhì)早已被中醫(yī)記載和采用。很多兩棲類動(dòng)物在中國屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如，花姬蛙(Microhyla pulchra)是傳統(tǒng)中藥材，其成體被白酒內(nèi)浸泡或加酒搗敷后能用于治療骨折、腰痛、風(fēng)濕痹痛、體弱無力、跌打損傷、瘡癰潰后化膿和久不封口等多種病癥。但是由于花姬蛙個(gè)體小和捕捉困難，目前對(duì)其皮膚藥理活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究在世界范圍內(nèi)還未見報(bào)道，其作為中藥療效的物質(zhì)基礎(chǔ)仍不為人們所知。

進(jìn)入21世紀(jì)以來，基因組學(xué)的飛速發(fā)展及合成生物學(xué)的興起大大促進(jìn)了天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能研究；本發(fā)明利用基因組學(xué)方法和藥理學(xué)研究獲得花姬蛙胰島素釋放促進(jìn)肽編碼基因，發(fā)明人將本發(fā)明的花姬蛙胰島素釋放促進(jìn)肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。發(fā)明人將本發(fā)明的花姬蛙胰島素釋放促進(jìn)肽(Microhylain)全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索比較未發(fā)現(xiàn)有任何相同的多肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是基于上述技術(shù)背景，提供一種新的具有促進(jìn)胰島素釋放的花姬蛙促胰島素釋放肽及其基因在制藥中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種花姬蛙促胰島素釋放肽，其序列如SEQ ID No.1所示。

RLPCKGIFCKVGHGSPIGRHKNNNATLSPFSTV SEQ ID NO.1

一種花姬蛙促胰島素釋放肽，所述的花姬蛙促胰島素釋放肽是由33個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，分子量3535.14道爾頓，等電點(diǎn)10.3，其氨基酸序列為：Arg Leu Pro Cys Lys Gly Ile Phe Cys Lys Val Gly His Gly Ser Pro Ile Gly Arg His Lys Asn Asn Asn Ala Thr Leu Ser Pro Phe Ser Thr Val(RLPCKGIFCKVGHGSPIGRHKNNNATLSPFSTV)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的第四位半胱氨酸和第九位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。

所述花姬蛙促胰島素釋放肽的編碼基因由480個(gè)核苷酸組成，其序列為(SEQ ID NO.4)：

序列中第379-477位核苷酸編碼具有功能的成熟花姬蛙促胰島素釋放肽(SEQ ID NO.1)。所述的花姬蛙促胰島素釋放肽可作為制備治療糖尿病藥物應(yīng)用。

所述花姬蛙促胰島素釋放肽在促進(jìn)胰島素釋放中的應(yīng)用。

所述花姬蛙促胰島素釋放肽在制備治療血糖升高的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于:

由花姬蛙促胰島素釋放肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成的花姬蛙促胰島素釋放肽具有很好的促進(jìn)胰島素釋放作用，同時(shí)還具有細(xì)胞毒性、無血漿凝固活性等優(yōu)點(diǎn)，可作為制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明花姬蛙促胰島素釋放肽HPLC純化鑒定結(jié)果；

圖2為本發(fā)明花姬蛙促胰島素釋放肽質(zhì)譜鑒定結(jié)果；

圖3為本發(fā)明花姬蛙促胰島素釋放肽促進(jìn)INS-1細(xì)胞分泌胰島素的“量-效關(guān)系”結(jié)果；

圖4為本發(fā)明花姬蛙促胰島素釋放肽降低小鼠體內(nèi)血清血糖效果結(jié)果；

圖5為本發(fā)明花姬蛙促胰島素釋放肽降低小鼠體內(nèi)血糖AUC水平結(jié)果。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明：

本發(fā)明的花姬蛙促胰島素釋放肽由33個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，分子量3535.14道爾頓，等電點(diǎn)10.3，其氨基酸序列為：Arg Leu Pro Cys Lys Gly Ile Phe Cys Lys Val Gly His Gly Ser Pro Ile Gly Arg His Lys Asn Asn Asn Ala Thr Leu Ser Pro Phe Ser Thr Val (RLPCKGIFCKVGHGSPIGRHKNNNATLSPFSTV)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第四位半胱氨酸和第九位半胱氨酸相成分子內(nèi)二硫鍵。

所述花姬蛙促胰島素釋放肽的基因序列由SEQ ID NO.4序列組成，序列中第379-477位核苷酸編碼具有功能的成熟花姬蛙促胰島素釋放肽。本發(fā)明的花姬蛙促胰島素釋放肽及其基因的制備過程包括如下步驟：

實(shí)施例1，花姬蛙促胰島素釋放肽基因克隆

I、花姬蛙皮膚總RNA提取：活體花姬蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4h，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10m1總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于20m1玻璃勻漿器中勻漿30min。加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，棄除沉淀。向上清中加入等體積的異丙醇，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即為花姬蛙皮膚總RNA。

II、花姬蛙皮膚mRNA的純化：花姬蛙皮膚mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems試劑盒。具體如下：取花姬蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μl Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30S，棄上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30S，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30sec，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.L ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30sec，將上清移至新的試管，再加入0.15m1DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30S，移上清至上述試管，則上清中為純化的花姬蛙皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中得到花姬蛙皮膚mRNA。

III、花姬蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建：采用CLONTECH公司CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。

A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：在0.5ml無菌的離心管加入1μl花姬蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl?；靹螂x心管中的試劑并以12000rpm離心15sec，72℃保溫2min。將離心管在冰上孵育2min。在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶?；旌想x心管中試劑并以12000rpm離心15sec，在42℃保溫1h。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。

B.采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈：95℃預(yù)熱PCR儀。將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：95℃20sec，95℃5sec，68℃6min，22個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行抽提。

C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟上述步驟。12000rpm離心5min。將離心純化柱置于新的離心管中。加入30μl超純水，在室溫下靜置5min。以12000rpm離心30sec，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。

D.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl花姬蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。加入5μl的連接酶緩沖混合物。16℃反應(yīng)2h。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。42℃加熱90Sec后，再在冰中放置1分鐘。加入37℃孵育過的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60min。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16h，形成單菌落。每個(gè)LB平皿用5m1LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×10⁶個(gè)單獨(dú)克隆。

Ⅳ、花姬蛙促胰島素釋放肽基因克隆篩選：擴(kuò)增引物長度為27個(gè)核苷酸，其序列為5’ATGAAGGTCTGGCAGTGTGTGCTCTGG 3’(SEQ ID NO.2)，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMART^TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’(SEQ ID NO.3)。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行：94℃30sec，50℃50sec和72℃2.5min，35個(gè)循環(huán)。

首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μ1),37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。

Ⅴ、花姬蛙促胰島素釋放肽基因序列測(cè)定和結(jié)果：提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，使用儀器為美國Applied Biosystems 373A全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47，BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(SEQ ID NO.5)，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’(SEQ ID NO.6)。基因測(cè)序結(jié)果自5’端至3’端序列為(SEQ ID NO.4):

花姬蛙促胰島素釋放肽基因核苷酸的序列表為：序列長度為480個(gè)堿基；序列類型：核酸；鏈數(shù)：單鏈；拓?fù)鋵W(xué)：直鏈狀；序列種類：cDNA；來源：花姬蛙皮膚。

根據(jù)花姬蛙促胰島素釋放肽的基因推斷編碼由功能的成熟活胰島素釋放促進(jìn)肽為第379-477位核苷酸，氨基酸序列為SEQ ID NO.1。

實(shí)施例2，花姬蛙促胰島素釋放肽的制備

Ⅰ、花姬蛙促胰島素釋放肽的制備方法：根據(jù)花姬蛙促胰島素釋放肽的基因推斷編碼其有功能的成熟活性肽氨基酸序列后用自動(dòng)多肽合成儀合成多肽。二硫鍵的形成采用空氣氧化法，具體為在燒瓶中將多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氫氧化銨滴定成pH 7.8,然后室溫?cái)嚢柽^夜。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。純化時(shí)A液體為0.1％TFA+100％acetonitrile，B液為0.1％TFA+100％water，多肽出現(xiàn)在13.5分鐘，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長為220nm。

Ⅱ、分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，以甘油:間硝基芐醇:二甲亞砜(1:1:l，V:V:V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。

Ⅲ、純化的花姬蛙促胰島素釋放肽用高效液相色譜(HPLC)方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

花姬蛙促胰島素釋放肽是中國兩棲類動(dòng)物花姬蛙促胰島素釋放肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，3535.14道爾頓，等電點(diǎn)10.3，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為：其氨基酸序列為：Arg Leu Pro Cys Lys Gly Ile Phe Cys Lys Val Gly His Gly Ser Pro Ile Gly Arg His Lys Asn Asn Asn Ala Thr Leu Ser Pro Phe Ser Thr Val(RLPCKGIFCKVGHGSPIGRHKNNNATLSPFSTV)(SEQ ID NO.1)，上述多肽第四位半胱氨酸和第九位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵使多肽成環(huán)。

實(shí)施例3，花姬蛙促胰島素釋放肽的活性實(shí)驗(yàn)

Ⅰ、花姬蛙促胰島素釋放肽的體外促進(jìn)胰島素釋放作用

花姬蛙促胰島素釋放肽的促進(jìn)胰島素釋放活性采用葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放活性檢測(cè)方法(GSIS，Glucose-stimulated insulin secretion)測(cè)定。具體步驟如下：大鼠胰島細(xì)胞瘤INS-1細(xì)胞用含100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素、10％胎牛血清和11.1mM葡萄糖的RPMI-164037℃5％CO₂在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞形成單層后用pH 7.4，含5.6或16.8mM葡萄糖、0.1％牛血清白蛋白的Krebs–Ringer bicarbonate緩沖液中37℃預(yù)孵育40min，吸去上清，細(xì)胞同含樣品的同樣緩沖液37℃預(yù)孵育20min，吸去上清，1000rpm離心10min，上清液用于胰島素含量檢測(cè)，每個(gè)樣品4個(gè)重復(fù)。胰島素含量用上海酶研公司生產(chǎn)的胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒按照說明書檢測(cè)。結(jié)果見說明書附圖3。由說明書附圖3可見，花姬蛙促胰島素釋放肽具有顯著的促進(jìn)胰島素釋放的作用，INS-1細(xì)胞釋放出的胰島素隨著花姬蛙促胰島素釋放肽濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

Ⅱ、花姬蛙促胰島素釋放肽的體內(nèi)促胰島素釋放作用

初始血糖差異不顯著的30只8周齡C57BL/6J雄性小鼠按照單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)分為3組：100nmol/kg的花姬蛙促胰島素釋放肽、25nmol/kg利拉魯肽陽性藥組和PBS陰性對(duì)照組?？诜咸烟悄土吭囼?yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)前小鼠適應(yīng)1周，試驗(yàn)前空腹14h，并在葡萄糖(1.5g/kg)灌胃前30min腹腔給藥處理。灌胃后的0、10、20、30、60、90min取小鼠尾尖血測(cè)血糖，并觀察期間小鼠的狀態(tài)。血糖濃度測(cè)定采用酶聯(lián)公司的葡萄糖氧化酶活性測(cè)定試劑盒按照說明測(cè)定。結(jié)果見說明書附圖4和5。由說明書附圖4和5可見對(duì)C57BL/6J小鼠進(jìn)行OGTT后，花姬蛙促胰島素釋放肽同陽性藥利拉魯肽一樣均顯示出顯著的降血糖作用，花姬蛙促胰島素釋放肽和陽性藥利拉魯肽在120min的OGTT過程中的血糖曲線下面積均顯著小于PBS組，因此，花姬蛙促胰島素釋放肽具有降低血糖的生物活性，可作為制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。