本發(fā)明涉及新發(fā)現的源自于腫瘤抗原SAGE1的短肽，該短肽與MHC分子形成的復合物以及所述短肽與復合物的用途。同時，本發(fā)明還涉及與上述短肽或復合物結合的分子，以及這些分子的用途。
背景技術：
：眾所周知，在許多病理條件下，如感染、癌癥、自身免疫疾病等，都會有一些特定分子的不適宜表達。因此，這些分子就成了病理或異常狀態(tài)的“標記”。這些分子不但可以作為疾病診斷的標記物，還可用于產生診斷試劑和/或治療劑。例如，用癌癥的標記物來產生特定的抗體。另外，這些分子還可以有效地激發(fā)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的特異性免疫應答，發(fā)揮抗腫瘤效能，同時，還可以通過激活的CTL來獲得能夠與該“標記”結合的T細胞受體(TCR)作為治療劑。因此，這些分子，在相關疾病的診斷和治療中發(fā)揮著非常重要的作用。對于腫瘤而言，已有很多文獻發(fā)表過不同的內源性的腫瘤抗原分子。但這并不是相關疾病真正的靶點，因為引起CTL免疫應答反應的并非完整的腫瘤抗原分子，而是來自于抗原的特異性CTL表位(Epitope)。一般情況下，腫瘤抗原在細胞內通過蛋白水解作用將其加工成為8-16個氨基酸長度的多肽片段，即CTL表位，進而與內質網腔中的主要組織相容性復合體(MHC，人類的MHC通常稱為HLA基因或HLA復合體)分子結合形成多肽-MHC復合物(peptide-MHCcomplex,pMHC),并最終將pMHC遞呈到細胞表面供CD8+T細胞表面的TCR識別。雖然相關的內源性腫瘤抗原分子早已有發(fā)表，但我們并不知曉被呈遞出的具體多肽片段。因此，無論是作為疫苗還是用于產生相關疾病的診斷試劑或是治療試劑，鑒定出這些被呈遞到細胞表面的8-16個氨基酸長度的多肽片段，即CTL表位，是至關重要的。本領域技術人員致力于發(fā)現并確定這些被呈遞到靶細胞表面的多肽片段。這種被遞呈的多肽片段的發(fā)現與確定是一個復雜的過程，因為多肽被HLA遞呈是抗原蛋白的酶解以及多肽片段與HLA的相互作用的共同結果。這說明，完整的腫瘤抗原分子并不能為多肽片段的發(fā)現與鑒定提供任何信息。很多文獻發(fā)表了利用電腦模擬的方法，如公開數據庫SYFPEITHI(Rammensee,etal.,Immunogenetics.1999(50):213-219)和BIMAS(Parker,etal.,J.Immunol.1994.152:163)，提供預測算法來鑒定哪個多肽片段可能會被遞呈。但這只是一種預測，具有很大的不確定性，因為它并不是真正的胞內處理以及翻譯后的修飾過程。腫瘤組織經過處理后，可以利用質譜儀直接鑒定出腫瘤細胞表面被遞呈出的多肽片段，雖然這是一個復雜的過程，但這樣得到的結果是非?？煽康?。同時，質譜儀的靈敏度也足以能夠鑒別低濃度的多肽片段以及翻譯后的修飾，因此它是發(fā)現及確定腫瘤表面多肽片段的理想工具。研究發(fā)現，SAGE1抗原在黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、表皮樣癌、非小細胞肺癌和鱗狀細胞癌等腫瘤組織中均有表達，而在除睪丸外的多數正常組織中不表達(MartelangeV1,DeSmetC,DePlaenE,LurquinC,BoonT.CancerRes.2000；60(14):3848-55；AtanackovicD,etal.,CancerBiolTher.2006；5(9):1218-25)。因此，源自于SAGE1抗原的肽，作為上述多種癌癥的靶點，不但可以作為上述疾病診斷的標記物，還可用于產生上述疾病的預防試劑和/或治療劑，如抗體或T細胞受體。本發(fā)明利用質譜儀分析并鑒定出了腫瘤細胞表面被呈遞的源自于腫瘤抗原SAGE1的新的多肽片段。技術實現要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種新發(fā)現的源自于腫瘤抗原SAGE1的短肽，該短肽與MHC分子形成的復合物以及所述短肽與復合物的用途。本發(fā)明的第一方面，提供了一種肽，所述肽包含：(ⅰ)氨基酸序列VLSTAPPQL(SEQIDNO:1)；或(ⅱ)在SEQIDNO:1中具有1個、2個或3個氨基酸取代，和/或1個、2個或3個氨基酸插入，和/或1個、2個或3個氨基酸缺失的氨基酸序列；其中，所述肽能夠與MHC分子形成復合物。在另一優(yōu)選例中，所述肽由7-25個氨基酸組成。在另一優(yōu)選例中，所述肽由8-16個氨基酸組成。在另一優(yōu)選例中，所述肽的氨基酸序列為SEQIDNO:1。本發(fā)明的第二方面，提供了一種pMHC復合物，所述復合物包含本發(fā)明第一方面所述的肽。在另一優(yōu)選例中，所述pMHC復合物中的肽的氨基酸序列為SEQIDNO:1。在另一優(yōu)選例中，MHC分子的類型是HLA-A*02。在另一優(yōu)選例中，MHC分子的類型是HLA-A*0201。在另一優(yōu)選例中，所述pMHC復合物為多聚體。在另一優(yōu)選例中，所述pMHC復合物是可溶的。在另一優(yōu)選例中，所述pMHC復合物是生物素化的。本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的細胞，所述細胞表面呈遞本發(fā)明第二方面所述pMHC復合物。本發(fā)明的第四方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發(fā)明第一方面所述肽的核酸序列或其互補序列。本發(fā)明的第五方面，提供了一種載體，所述載體含有本發(fā)明第四方面所述的核酸分子。本發(fā)明的第六方面，提供了一種宿主細胞，所述細胞中含有本發(fā)明第五方面所述的載體。本發(fā)明的第七方面，提供了一種分子，所述分子能夠結合本發(fā)明第一方面所述的肽和/或本發(fā)明第二方面所述的pMHC復合物。在另一優(yōu)選例中，所述分子能夠特異性結合本發(fā)明第一方面所述的肽和/或本發(fā)明第二方面所述的pMHC復合物。在另一優(yōu)選例中，所述分子為T細胞受體。在另一優(yōu)選例中，所述T細胞受體是可溶的。在另一優(yōu)選例中，所述分子為抗體或其結合片段。在另一優(yōu)選例中，所述抗體為單克隆抗體。本發(fā)明的第八方面，提供了一種分離的單克隆T細胞，所述T細胞結合本發(fā)明第二方面所述pMHC復合物。在另一優(yōu)選例中，所述T細胞特異性結合本發(fā)明第二方面所述pMHC復合物。本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明第一方面所述肽、本發(fā)明第二方面所述pMHC復合物或本發(fā)明第三方面所述細胞的用途，用于激活和/或分離T細胞。本發(fā)明的第十方面，提供了本發(fā)明第一方面所述肽、本發(fā)明第二方面所述pMHC復合物的用途，用于篩選T細胞受體或抗體文庫。本發(fā)明的第十一方面，提供了本發(fā)明第一方面所述肽、本發(fā)明第二方面所述pMHC復合物、本發(fā)明第三方面所述細胞、本發(fā)明第四方面所述的核酸分子、本發(fā)明第七方面所述分子或本發(fā)明第八方面所述T細胞的用途，用于制備預防或治療癌癥的藥物。本發(fā)明的第十二方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學上可接受的載體以及本發(fā)明第一方面所述肽、本發(fā)明第二方面所述pMHC復合物、本發(fā)明第三方面所述細胞、本發(fā)明第七方面所述分子或本發(fā)明第八方面所述T細胞。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物為疫苗。本發(fā)明的第十三方面，提供了一種預防或治療疾病的方法，包括給需要的對象施用適量的本發(fā)明第一方面所述肽、本發(fā)明第二方面所述pMHC復合物、本發(fā)明第三方面所述細胞、本發(fā)明第七方面所述分子或本發(fā)明第八方面所述T細胞。本發(fā)明的第十四方面，提供了一種獲得與權利本發(fā)明第二方面所述pMHC復合物結合的分子的方法，包括：(ⅰ)將備選分子與本發(fā)明第二方面所述pMHC復合物接觸；(ⅱ)篩選出與(ⅰ)中pMHC復合物結合的分子。應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1為鑒定本發(fā)明短肽的具有代表性的質譜圖。圖2為本發(fā)明可溶性pMHC復合物的SDS-PAGE膠圖。左側條帶為分子量標記，右側條帶分別為MHC分子的輕鏈和重鏈。圖3為單克隆細胞的CD8+及四聚體-PE雙陽性染色結果。圖4為單克隆細胞的ELISPOT實驗結果圖。圖5為可溶性TCR與本發(fā)明pMHC復合物結合的BIAcore圖譜。具體實施方式本發(fā)明通過廣泛而深入的研究，獲得了源自于抗原SAGE1的肽，該肽由MHC分子呈遞到腫瘤細胞表面，作為腫瘤標記物。因此，本發(fā)明提供了源自于抗原SAGE1的肽，該肽與MHC分子形成的復合物以及所述肽與復合物的用途。同時，本發(fā)明還涉及與上述肽或復合物結合的分子。應理解，在本發(fā)明中，本發(fā)明的肽與本發(fā)明多肽或本發(fā)明短肽可互換使用，都指本發(fā)明提供的源自于抗原SAGE1的肽。具體地，本發(fā)明的第一方面提供了一種肽，所述肽包含：(ⅰ)氨基酸序列VLSTAPPQL(SEQIDNO:1)；或(ⅱ)在SEQIDNO:1中具有1個、2個或3個氨基酸取代，和/或1個、2個或3個氨基酸插入，和/或1個、2個或3個氨基酸缺失的氨基酸序列；其中，述肽能夠與MHC分子形成復合物。氨基酸取代意味著在相同位置，某個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基替代。插入的氨基酸殘基可以在任何位置插入，插入的氨基酸殘基也可以全部或部分彼此相鄰，或插入的氨基酸之間都不彼此相鄰。可以從SEQIDNO：1的序列中刪除1、2或3個氨基酸。本領域技術人員已知，本發(fā)明所述的肽可以在氨基酸序列之間的一個或多個位置進行翻譯后修飾。翻譯后修飾的例子可以在Engelhard等CurrOpinImmunol.2006年2月；18(1)：92-7中找到，并且包括磷酸化作用、乙?；饔煤兔擋０被饔?。較佳地，本發(fā)明所述的肽與MHC結合于MHC分子的肽結合位點。通常，上述描述的修飾的氨基酸不會破壞所述肽與MHC的結合能力。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述的氨基酸修飾提高了肽與MHC結合的能力。例如，突變可能發(fā)生在肽與MHC的結合位點。這些結合位點和結合位點上優(yōu)選的殘基為本領域已知的，尤其是對哪些結合HLA-A*02的肽來說(參見，比如Parkhurst等，J.Immunol.157:2539-2548(1996))。更具體地，本發(fā)明的肽的氨基酸的長度可以是7-25個，優(yōu)選8-16個，較佳地，9、10、或11個。本發(fā)明所述的肽可以由VLSTAPPQL(SEQIDNO：1)組成，或主要由VLSTAPPQL(SEQIDNO：1)組成，其對應于SAGE1蛋白全長的127-135殘基的位置。發(fā)明還提供SEQIDNO：1所示的蛋白或肽的類似物。這些類似物與天然的肽差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的肽并不限于上述例舉的代表性的肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括：體內或體外的肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的肽。這種修飾可以通過將肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的肽。在本發(fā)明中，“SEQIDNO：1所示的蛋白保守性變異肽”指與SEQIDNO：1的氨基酸序列相比，有至多3個，更佳地至多2個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成肽。這些保守性變異肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。表1最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu本發(fā)明所述的肽可以用Merrifield合成方法(又被稱為多肽固相合成法)簡單合成。GMP級別的肽可以用多肽系統(tǒng)(MultiplePeptideSystems，SanDiego，CA)的固相合成技術予以合成。或者，所述肽可以重組合成，如果需要，可以用本領域已知的方法予以合成。典型的此類方法涉及載體的使用，所述載體包括編碼多肽的核酸序列，在體內表達多肽；例如，在細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞中表達?；蛘撸€可以使用體外無細胞體系進行表達。此類系統(tǒng)為本領域已知的，并且可以從商業(yè)途徑獲得。所述肽可以是分離的和/或以基本上純的形式提供。例如，它們可以以一種基本上沒有其他肽或蛋白的形式提供。腫瘤抗原在細胞內通過蛋白水解作用將其加工成為8-16個氨基酸長度的多肽片段，即CTL表位，進而與內質網腔中的MHC分子結合形成多肽-MHC復合物(peptide-MHCcomplex,pMHC),一起遞呈到細胞表面。因此，本發(fā)明的第二方面提供了一種pMHC復合物，所述復合物中包含本發(fā)明第一方面所述的肽。較佳地，所述多肽結合于MHC分子的肽結合槽上。所述MHC分子可以是MHCI類分子或MHCⅡ類分子，優(yōu)選地，所述MHC分子是MHCI類分子。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述MHC分子是HLA-A*02，更優(yōu)選地，所述MHC分子是HLA-A*0201。本發(fā)明所述的pMHC復合物可以以多聚體形式存在，例如，二聚體、或四聚體、或五聚體、或六聚體、或八聚體、或更大。產生pMHC多聚體的適當方法可以參考相關文獻，如(Gretenetal.，Clin.DiagnosticLab.Immunol.2002：216-220)。通常，可以用帶有生物素殘基的pMHC復合物與通過熒光標記鏈霉親和素復合產生pMHC多聚體。或者，所述pMHC多聚體也可以通過免疫球蛋白作為分子支架來形成。在這個系統(tǒng)中，MHC分子的胞外區(qū)與免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)通過一個短的連接序列(linker)結合在一起。另外，形成pMHC多聚體也可以利用載體分子，如右旋糖酐(WO02072631)。pMHC多聚體有助于提高與其結合部分的檢測，如T細胞受體?；蛘撸岣遬MHC復合物在相關應用中的效應，如激活T細胞。本發(fā)明所述的pMHC復合物可以以可溶形式提供。為獲得可溶形式的pMHC復合物，優(yōu)選地，所述pMHC復合物中MHC分子不含跨膜區(qū)。具體地，在pMHC復合物中，MHCⅠ類分子可以由其輕鏈及全部或部分重鏈的胞外結構域組成。或者，MHC分子是僅包含其功能結構域的片段。產生本發(fā)明可溶性pMHC復合物的方法是本領域技術人員已知的，包括，但不限于，本發(fā)明實施例2中所述的方法。本發(fā)明可溶性pMHC復合物中的MHC分子也可以利用合成方法產生，然后與本發(fā)明的肽重折疊。通過確定肽與MHC分子是否能夠重折疊，可以確定本發(fā)明肽能夠與哪類MHC分子形成復合物。本發(fā)明的可溶性pMHC復合物可以用于篩選或檢測與其結合的分子，如TCR或抗體。所述方法包括將所述pMHC復合物與待測結合部分接觸，和測定待測結合部分是否與復合物結合。pMHC復合物的結合的測定方法是本領域熟知的。優(yōu)選的方法包括但不限于，表面等離子體共振，或任何其他的生物傳感技術，ELISA、流式細胞術、色譜法、顯微鏡檢查。或者，此外，所述結合可以通過對結合產生的生物響應進行功能測定來檢測，如細胞因子釋放或細胞凋亡。同樣地，本發(fā)明的可溶性pMHC復合物還可以用于篩選TCR或抗體文庫。利用噬菌體展示技術來構建抗體文庫是本領域熟知的，如參考文獻Aitken,Antibodyphagedisplay:MethodsandProtocols(2009,Humana,NewYork)中所述。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的pMHC復合物被用于篩選展示于噬菌體顆粒表面的多樣性TCR文庫。所述文庫展示的TCR可能含有非天然的突變。因此，本發(fā)明的可溶性pMHC復合物可以通過連接物固定到適當的固相載體上。固相載體的例子包括，但不限于，珠子、膜、瓊脂糖凝膠、磁珠、基板、管子、柱。pMHC復合物可以固定在ELISA反應板、磁珠、或表面等離子體共振生物傳感器芯片上。將pMHC復合物固定到固相載體的方法為本領域技術人員已知的，并且包括，例如，使用親和結合對，比如生物素和鏈霉親和素，或抗體和抗原。在一個優(yōu)選的實施方式中，pMHC復合物用生物素標記，并且固定在鏈霉親和素包被的表面。本發(fā)明所述的肽可以與MHC復合物一起遞呈到細胞表面。因此，本發(fā)明還提供了一種細胞，所述細胞能夠遞呈本發(fā)明的pMHC復合物到其表面。此類細胞可以是哺乳動物細胞，較佳地，免疫系統(tǒng)細胞，并且優(yōu)選為專門的抗原呈遞細胞，比如樹突細胞或B細胞。其他優(yōu)選的細胞包括T2細胞(Hosken,etal.,Science.1990.248:367-70)。呈遞本發(fā)明所述的肽或pMHC復合物的細胞可以是分離的，較佳地，以細胞群體的形式，或以基本上純的形式提供。所述細胞可以不是天然遞呈本發(fā)明所述的復合物的，或所述細胞遞呈復合物的水平比天然狀態(tài)下的高。此類細胞可以用本發(fā)明所述的肽進行脈沖處理而獲得。脈沖處理涉及用所述肽孵育細胞幾小時，優(yōu)選地，所用肽的濃度為10-5-10-12M。此外，所述細胞還可以用HLA-A*02分子進行轉導，進一步誘導肽的遞呈。遞呈本發(fā)明所述pMHC復合物的細胞可以被用于分離T細胞和T細胞受體，所述T細胞由所述細胞激活并進一步被分選出來，進而也能夠獲得表達在所述T細胞表面的T細胞受體。在一個優(yōu)選的實施方式中，獲得上述T細胞的方法包括利用上述遞呈本發(fā)明pMHC復合物的細胞刺激從健康志愿者處獲得的新鮮血液?？梢越涍^幾輪的刺激，如3-4輪。激活的T細胞的鑒定可以通過在本發(fā)明的肽脈沖的T2細胞的存在下，來測定細胞因子的釋放(比如，IFN-γELISpot實驗)。利用標記抗體，激活細胞可以通過流式細胞儀(FACS)進行分選，分選的細胞可以擴大培養(yǎng)和進一步驗證，例如，通過ELISpot檢測和/或針對靶細胞的細胞毒性和/或pMHC多聚體染色進行驗證。來自經驗證的T細胞克隆的TCR鏈可以通過cDNA末端快速擴增(RACE)被放大，并進行測序。本發(fā)明還提供了一種核酸分子，所述核酸分子包括編碼本發(fā)明的肽的核酸序列。所述核酸可以是cDNA。所述核酸分子可以主要由編碼本發(fā)明所述肽的核酸序列組成，或可以僅編碼本發(fā)明所述的肽。此類核酸分子可以用本領域已知的方法合成。由于遺傳密碼的簡并性，本領域技術人員應理解，不同核酸序列的核酸分子可以編碼相同的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種載體，所述載體中包括本發(fā)明所述的核酸序列。合適的載體是載體構建領域已知的，包括啟動子的選擇和其他調控元件，比如增強子元件。本發(fā)明所述的載體包括適合引入細胞的序列。比如，所述載體可以是表達載體，在該載體中，所述多肽的編碼序列受到它自身順式作用調控元件的控制，載體的設計便于宿主細胞的基因整合或基因替換等。本領域普通技術人員應理解，在本發(fā)明中，術語“載體”包括DNA分子，比如質粒、噬菌體、病毒或其他載體，它含有一個或多個異源的或重組的核酸序列。合適的噬菌體和病毒載體包括，但不限于：λ-噬菌體，EMBL噬菌體、猿猴病毒、牛疣病毒、Epstein-Barr病毒、腺病毒、皰疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠類乳癌病毒、慢病毒等。本發(fā)明還提供了一種結合分子，所述分子可以用來作為免疫治療劑或診斷試劑。該結合分子可以僅和肽結合，或與肽和MHC分子形成的復合物結合。在后一種情況，所述結合分子可以部分結合到MHC分子上，同時，它還與本發(fā)明的肽結合。本發(fā)明的結合部分可以是分離的和/或可溶的，和/或非天然存在的，即大自然中沒有等效物，和/或純的，和/或人工合成的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述結合分子是T細胞受體(TCR)?？梢圆捎脟H免疫遺傳學信息系統(tǒng)(IMGT)來描述TCR。天然αβ異源二聚TCR具有α鏈和β鏈。廣義上講，各鏈包含可變區(qū)、連接區(qū)和恒定區(qū)，β鏈通常還在可變區(qū)和連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，但該多變區(qū)常視作連接區(qū)的一部分。本發(fā)明的TCR可以是本領域已知的任何形式。例如，所述TCR可以是異二聚體，或以單鏈的形式存在。所述TCR可以是可溶形式(即無跨膜或胞漿區(qū))，具體地，所述TCR可以包含全部或部分TCR胞外結構域。所述TCR也可以是包含其跨膜區(qū)的全長鏈。所述TCR可以被提供到細胞表面，比如T細胞?？梢越Y合本領域中的現有技術來獲得可溶性的TCR，例如，在αβTCR的α與β鏈的恒定域之間引入人工二硫鍵，或者在αβTCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間引入人工二硫鍵。本發(fā)明的TCR可用于將細胞毒性劑或免疫刺激劑遞送到靶細胞，或被轉化入T細胞，使表達該TCR的T細胞能夠破壞腫瘤細胞，以便在被稱為過繼免疫治療的治療過程中給予患者。另外，本發(fā)明的TCR中也可以含有突變，優(yōu)選地，突變后的TCR對本發(fā)明pMHC復合物的親和力有所提高。本發(fā)明的TCR可以單獨使用，也可與偶聯物以共價或其他方式結合，優(yōu)選以共價方式結合。所述偶聯物包括可檢測標記物(為診斷目的，其中所述TCR用于檢測呈遞本發(fā)明pMHC復合物的細胞的存在)、治療劑、PK(蛋白激酶)修飾部分或任何以上這些物質的組合結合或偶聯。本發(fā)明的TCR還可以與抗-CD3的抗體結合，優(yōu)選以共價方式結合，以重定向T細胞，從而殺傷靶細胞。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明的結合分子是抗體。如本文所用，術語“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異性結合位點的分子，其可以全天然、或部分人工合成、或全部人工合成。術語“抗體”包括抗體片段、其衍生物、功能性等效物以及同源抗體、人源化抗體，所述抗體片段包括免疫球蛋白結合區(qū)，所述結合區(qū)是抗體結合區(qū)或與抗體結合區(qū)同源。其可以全天然、或部分人工合成、或全部人工合成。人源化抗體可以是修飾的抗體，其含有非人抗體的可變區(qū)(例如，小鼠)以及人抗體的恒定區(qū)?？贵w的例子可以是同型免疫球蛋白(例如IgG、IgE、IgM、IgD以及IgA)以及它們同型的亞類；片段包括抗原結合區(qū)，比如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；以及雙鏈抗體?？贵w可以是多抗或單抗，優(yōu)選為單克隆抗體。上述TCR與抗體的制備方法是本領域技術人員已知的，包括但不限于，從大腸桿菌細胞或昆蟲細胞中表達，并純化出來。在另一方面，本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明的肽、pMHC復合物、核酸分子、載體、細胞以及結合分子在制藥方面的用途。所述肽、pMHC復合物、核酸、載體、細胞或結合分子可以被用于治療或預防癌癥，優(yōu)選黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、表皮樣癌、非小細胞肺癌和鱗狀細胞癌等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的肽、pMHC復合物、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的細胞或本發(fā)明的結合分子，以及藥學上可接受的載體。所述藥物組合物可以是任何合適的形式，(取決于患者需要的給藥方法)。其可以以單位劑型的形式提供，通常置于密封容器中，并且可以作為試劑盒的一部分提供。此類試劑盒通常(但不是必須)包含使用說明。其可以包含多個所述的單位劑型。所述藥物組合物適用于任何適當的給藥途徑，如注射(包括皮下，肌肉，腹腔或靜脈注射)、吸入或口服、或經鼻、或經肛門等途徑。所述組合物可以通過藥學領域已知的任何方法制備，例如在無菌條件下，通過將活性成分與載體或賦形劑混合。根據用于治療的疾病或病癥(例如癌癥、病毒性感染或自身免疫疾病)、患者的個體年齡和狀況等，本發(fā)明制劑的給藥劑量可以在較寬的范圍內變化。恰當的給藥劑量將由醫(yī)師最終決定。根據本領域的現有技術，與MHC分子一起被呈遞到細胞表面的肽、pMHC復合物或遞呈pMHC復合物的細胞，可以激活T細胞或B細胞，使其發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的肽、pMHC復合物或遞呈pMHC復合物的細胞可以以疫苗組合物的形式提供。所述疫苗組合物可以用于治療或預防癌癥。所有的這類組合物都包括在本發(fā)明中。應理解，所述疫苗可以為多種形式(SchlomJ.JNatlCancerInst.2012104(8)：599-613)。例如，本發(fā)明的肽可以直接用于免疫患者(SalgallerML.CancerRes.1996.56(20)：4749-57andMarchandM.IntJCancer.1999.80(2)：219-230)。所述疫苗組合物可以包含額外的肽，使得本發(fā)明的肽是肽混合物中的一個。所述疫苗組合物可以加入佐劑，以增強免疫反應。或者，所述疫苗組合物可以是呈遞本發(fā)明肽和MHC復合物的抗原遞呈細胞的形式。優(yōu)選地，所述抗原呈遞細胞為免疫細胞，更優(yōu)選地為樹突細胞。所述肽也可以脈沖到細胞的表面(ThurnerBI.etal.,J.Exp.Med.1999.190:1669)，或者可以將本發(fā)明肽的編碼核酸引入到樹突細胞中，例如，利用電穿孔法(VanTendeloo,VF.etal.,Blood2001.98:49)。下面的具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?MolecularCloning-ALaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。實施例1通過質譜鑒定源自于SAGE1抗原的多肽將購自ATCC的腫瘤細胞系HCCC9810(人膽管細胞型肝癌細胞)，在標準條件下培養(yǎng)。使用商業(yè)化抗-HLA-A*02抗體BB7.2來純化HLA-A*02復合物。具體地，用含有非離子型表面活性劑TritonX-100(1％v/v)的緩沖液裂解細胞，按2*10^7細胞加入1ml裂解液，在4℃滾動孵育1h。離心去除細胞碎片，上清先與抗體孵育，再加入rProteinA-Sepharose捕獲“抗體-HLA-A*02復合物”。過柱，收集“rProteinA-Sepharose-抗體-HLA-A*02復合物”。用低鹽和高鹽緩沖液洗滌柱子，最后用10％的乙酸洗脫掛于免疫親和柱上HLA復合物，再經過95℃加熱，以及10KDa(AmiconRUltrCentrifugalFilters,MILLIPORE)超濾膜過濾掉大分子，最終得到多肽混合物。多肽混合物經Agilent1260高效液相色譜分餾：ZORBAX300SB-C18；1.0*150mm,3.5um；流動相A為98％水，2％乙腈，0.1％三氟乙酸，流動相B為98％乙腈，2％水，0.1％三氟乙酸，流動相梯度為10分鐘內流動相B由5％升到70％。每一分鐘收集一餾份。總運行時間為30分鐘。多肽的HPLC餾份經濃縮后，進樣nanoLC-MSMS系統(tǒng)分析：EksigentnanoLC-ABSciexTripleTOF5600系統(tǒng)：質譜采用IDA分析方法。液相色譜采用：預柱：(Eksigent)NanoLCTrapcolumn.5μmC18.100μm*2.5cm，910-00050，分析柱：(Eksigent)C18-CL-120,3μm,0.075×150mm，805-00120。DionexUltimate3000-ThermoQEPlus系統(tǒng)：質譜采用ddms2分析方法.液相色譜采用：預柱：(Thermo)Acclaim100um×2cm,nanoViper，C18,5um,100A，164564，分析柱：(Thermo)Acclaim75um×15cm,nanoViper，C18,3um,100A，164568。上述兩個系統(tǒng)的納流色譜的流動相A為98％水，2％乙腈，0.1％甲酸，流動相B為98％乙腈，2％水，0.1％甲酸，流動相梯度為74分鐘內流動相B由5％升到50％?？傔\行時間為90分鐘。質譜分析結果，借助搜庫軟件ProteinPilot和Peaks，搜索人類蛋白的Uniprot數據庫。根據軟件給出的結果，如圖1所示，最終得出本發(fā)明的抗原短肽序列。實施例2可溶性pMHC復合物的制備Ⅰ型HLA-A*0201分子的重鏈和輕鏈(β2m)分別以包涵體的形式在大腸桿菌中(E.coli)表達。應注意，為獲得可溶性的pMHC復合物，本實施例中所用的HLA-A*0201分子的重鏈不包含其跨膜區(qū)和胞質區(qū)。另外，為方便后續(xù)對可溶性的pMHC復合物進行生物素化，可以在重鏈的C末端加入生物素化標簽。制備本發(fā)明可溶性pMHC復合物的具體過程如下：a.純化收集100ml誘導表達重鏈或輕鏈的E.coli菌液，于4℃8000g離心10min后用10mlPBS洗滌菌體一次，之后用5mlBugBusterMasterMixExtractionReagents(Merck)劇烈震蕩重懸菌體，并于室溫旋轉孵育20min，之后于4℃，6000g離心15min，棄去上清，收集包涵體。將上述包涵體重懸于5mlBugBusterMasterMix中，室溫旋轉孵育5min；加30ml稀釋10倍的BugBuster，混勻，4℃6000g離心15min；棄去上清，加30ml稀釋10倍的BugBuster重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，重復兩次，加30ml20mMTris-HClpH8.0重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，最后用20mMTris-HCl8M尿素溶解包涵體，SDS-PAGE檢測包涵體純度，BCA試劑盒測濃度。b.復性將本發(fā)明的肽VLSTAPPQL(北京賽百盛基因技術有限公司合成)溶解于DMSO至20mg/ml的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8M尿素、20mMTrispH8.0、10mMDTT來溶解，復性前加入3M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mMEDTA進一步變性。將VLSTAPPQL肽以25mg/L(終濃度)加入復性緩沖液(0.4ML-精氨酸、100mMTrispH8.3、2mMEDTA、0.5mM氧化性谷胱甘肽、5mM還原型谷胱甘肽、0.2mMPMSF，冷卻至4℃)，然后依次加入20mg/L的輕鏈和90mg/L的重鏈(終濃度，重鏈分三次加入，8h/次)，復性在4℃進行至少3天至完成，SDS-PAGE檢測能否復性成功。c.復性后純化用10體積的20mMTrispH8.0作透析來更換復性緩沖液，至少更換緩沖液兩次來充分降低溶液的離子強度。透析后用0.45μm醋酸纖維素濾膜過濾蛋白質溶液，然后加載到HiTrapQHP(GE通用電氣公司)陰離子交換柱上(5ml床體積)。利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，20mMTrispH8.0配制的0-400mMNaCl線性梯度液洗脫蛋白，pMHC約在250mMNaCl處洗脫，收集諸峰組分，SDS-PAGE檢測純度。得到的本發(fā)明可溶性pMHC復合物的膠圖如圖2所示。d.生物素化用Millipore超濾管將純化的pMHC分子濃縮，同時將緩沖液置換為20mMTrispH8.0，然后加入生物素化試劑0.05MBicinepH8.3、10mMATP、10mMMgOAc、50μMD-Biotin、100μg/mlBirA酶(GST-BirA)，室溫孵育混合物過夜，SDS-PAGE檢測生物素化是否完全。e.純化生物素化后的復合物用Millipore超濾管將生物素化標記后的pMHC分子濃縮至1ml，采用凝膠過濾層析純化生物素化的pMHC，利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，用過濾過的PBS預平衡HiPrepTM16/60S200HR柱(GE通用電氣公司)，加載1ml濃縮過的生物素化pMHC分子，然后用PBS以1ml/min流速洗脫。實施例3結合本發(fā)明pMHC復合物的TCR本實施例提供了利用本發(fā)明pMHC復合物來獲得單克隆T細胞及TCR的例證。本領域技術人員熟知獲得TCR的多種方法，包括但不限于，從T細胞克隆中將TCRα與β鏈的序列分離出來，所述T細胞克隆是被遞呈本發(fā)明pMHC復合物的細胞刺激的。獲得的TCR序列可以被克隆到適合的載體上面，然后在大腸桿菌如E.coli中表達，或表達在噬菌體的表面。利用本發(fā)明的短肽獲得的T細胞克隆如圖3所示。通過ELISPOT實驗進一步檢測該T細胞克隆的功能及特異性。本領域技術人員熟知利用ELISPOT實驗檢測細胞功能的方法。本實施例IFN-γELISPOT實驗中所用的效應細胞為本發(fā)明中獲得的T細胞克隆，靶細胞為負載了本發(fā)明短肽的T2細胞，對照組為負載了其他短肽的T2細胞及未負載任何短肽的T2細胞。首先準備ELISPOT平板，ELISPOT實驗步驟如下：按以下順序將試驗的各個組分加入ELISPOT平板：40μlT2細胞5×105個細胞/毫升(即20,000個T2細胞/孔)、40μl效應細胞(2000個T細胞克隆/孔)后，實驗組加入20μl特異性短肽，對照組加入20μl非特異性短肽，空白組加入20μl培養(yǎng)基(試驗培養(yǎng)基)，并設置2復孔。然后溫育過夜(37℃，5％CO2)。隨后洗滌平板并進行二級檢測和顯色，干燥平板1小時，再利用免疫斑點平板讀數計(ELISPOTREADERsystem；AID公司)計數膜上形成的斑點。實驗結果如圖4所示，得到的特定抗原特異性T細胞克隆對負載本發(fā)明短肽的T2細胞有特異性反應。用Quick-RNATMMiniPrep(ZYMOresearch)抽提上述T細胞克隆的總RNA，并獲得TCR序列。為進一步驗證獲得的TCR能夠結合本發(fā)明的pMHC復合物，本實施例在E.coli中表達出了可溶的TCR蛋白，并通過BIAcore檢測其與pMHC復合物的結合。應注意，可以根據現有技術來獲得可溶性的TCR，包括但不限于，專利文獻PCT/CN2015/093806中所述。使用BIAcoreT200實時分析系統(tǒng)檢測可溶性TCR蛋白與pMHC復合物的結合活性。將抗鏈霉親和素的抗體(GenScript)加入偶聯緩沖液(10mM醋酸鈉緩沖液，pH4.77)，然后將抗體流過預先用EDC和NHS活化過的CM5芯片，使抗體固定在芯片表面，最后用乙醇胺的鹽酸溶液封閉未反應的活化表面，完成偶聯過程，偶聯水平約為15,000RU。使低濃度的鏈霉親和素流過已包被抗體的芯片表面，然后將按實施例2中所述方式制得的pMHC物流過檢測通道，另一通道作為參比通道，再將0.05mM的生物素以10μL/min的流速流過芯片2min，封閉鏈霉親和素剩余的結合位點。利用BIAcoreEvaluation軟件計算動力學參數，得到本發(fā)明可溶性的TCR分子與本發(fā)明pMHC復合物結合的動力學圖譜如圖5所示，圖譜顯示出了二者的結合。同時，還利用上述方法檢測了本發(fā)明可溶性的TCR分子與其他幾種無關抗原短肽與HLA復合物的結合活性，結果顯示本發(fā)明TCR分子與其他無關抗原均無結合。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3