專利名稱：：用于預(yù)防和/或治療癌癥的腫瘤抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及編碼多肽的核酸，和核酸或多肽在預(yù)防和/或治療癌癥中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于插入和表達(dá)編碼腫瘤抗原的外來基因的載體，所述的載體用于免疫治療性處理癌癥。
背景技術(shù)：
：近幾年來，由于在高密度微陣列、SEREX、免疫組織化學(xué)(IHC)、RT-PCR、原位雜交(ISH)和激光捕獲顯微術(shù)等數(shù)項(xiàng)技術(shù)的輔助下，基于原發(fā)腫瘤和正常細(xì)胞的表達(dá)譜分析的分子鑒定的巨大進(jìn)展，在用腫瘤相關(guān)抗原(TAA)開發(fā)癌癥疫苗方面取得了巨大進(jìn)步(Rosenberg，Immunity，1999；Sgroi等，1999，Schena等，1995，Offringa等，2000)。TAA是腫瘤細(xì)胞表達(dá)的或超量表達(dá)的抗原，且對一種或幾種腫瘤是特異性的，例如CEA抗原在結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌中表達(dá)。Sgroi等(1999)組合使用激光捕獲顯微解剖和cDNA微陣列，鑒定出了在侵入性和轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中差異表達(dá)的幾種基因?？梢允褂脦追N送遞系統(tǒng)(象DNA或病毒)來針對人癌癥治療性地接種疫苗(Bonnet等，2000)，且可以引起免疫應(yīng)答，也可以中斷針對TAA的免疫耐受。通過插入編碼尤其是T細(xì)胞共刺激分子(例如B7.1)或細(xì)胞因子(例如IFN-γ，IL2，或GM-CSF)的轉(zhuǎn)基因，可以為腫瘤細(xì)胞提供更多的免疫原性。已經(jīng)證實(shí)，TAA和細(xì)胞因子或共刺激分子的共表達(dá)可以用于開發(fā)有效的治療性疫苗(Hodge等，95，Bronte等，1995，Chamberlain等，1996)。本領(lǐng)域需要能用于刺激免疫應(yīng)答的試劑和方法來預(yù)防或治療癌癥。本發(fā)明提供了這樣的試劑和方法，這克服了其它人在嘗試治療癌癥時(shí)遇到的許多困難。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了用于施用給患者以預(yù)防和/或治療癌癥的免疫原性靶。更具體地，免疫原性靶是腫瘤抗原(″TA″)和/或血管發(fā)生相關(guān)抗原(″AA″)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性靶由SEQIDNO.29或SEQIDNO.31編碼，或具有SEQIDNO.30或SEQIDNO.32的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，將TA和/或AA作為包含在質(zhì)?；蚱渌瓦f載體(例如重組病毒)中的核酸施用給患者。也可以將TA和/或AA與免疫刺激物(例如共刺激分子或佐劑)組合施用。圖1.A.AAC2-1和AAC2-2的核苷酸序列。B.預(yù)測的AAC2-1和AAC2-2的氨基酸序列的比對。缺失的核苷酸或氨基酸標(biāo)記為″*″。序列之間的差異標(biāo)有下劃線。圖2.A.人淋巴細(xì)胞應(yīng)答于源自AAC2-2蛋白的肽而分化成能分泌IFN-γ的效應(yīng)細(xì)胞。用表III所示的肽組(組1-9)刺激了T細(xì)胞。刺激3輪后，通過ELISPOT分析了淋巴細(xì)胞的肽-特異性的IFN-γ生產(chǎn)。B.插入的圖表明，由肽組#6刺激的活化的細(xì)胞能抗原-特異性的CTL活性地殺傷肽加載的T2靶細(xì)胞。肽EC5會(huì)引起誘導(dǎo)CTL活性和IFN-γ分泌的顯性活性。圖3.用編碼人AAC2-2的DNA質(zhì)粒進(jìn)行DNA免疫，會(huì)使來自HLA-A2-Kb轉(zhuǎn)基因小鼠的鼠T細(xì)胞能識(shí)別和分泌IFN-γ。用不同組的肽，重新刺激了來自pEF6-hAAC2-2-免疫的小鼠的脾細(xì)胞。6天后，收獲細(xì)胞，并測試每個(gè)肽組或?qū)φ誋LA-A2-結(jié)合的9-聚物HIV肽引起的IFN-γ分泌。將ELISPOT平板孵育過夜，并顯色。每組反應(yīng)于PMA和用作陽性對照的伊屋諾霉素而產(chǎn)生高水平的IFN-γ(超過250個(gè)斑點(diǎn))。至今測試的來自HLA-A-0201+供體的人淋巴細(xì)胞也識(shí)別出了高反應(yīng)性肽組中的一個(gè)(組6)。圖4.用編碼人AAC2-2的基因進(jìn)行DNA接種，可以完全阻止植入的B16F10黑素瘤細(xì)胞的生長。該作用不是由于非特異性的免疫應(yīng)答，這是由編碼流感-NP蛋白和人flkl的質(zhì)粒(VEGFR-2)不能阻止腫瘤生長所證實(shí)的。圖5.將B16F10黑素瘤細(xì)胞植入C57BL/6小鼠后的小鼠存活率證實(shí)了，用人AAC2-2載體進(jìn)行DNA接種，可以完全保護(hù)免受腫瘤生長的作用。該保護(hù)作用是抗原-特異性的，且不能通過接種其它基因來引起。圖6.用pEF6-hAAC2-2表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行DNA接種后，人AAC2-2的肽能引起來自C57BL/6小鼠的T淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出效應(yīng)細(xì)胞活性，并分泌IFN-γ。這些肽可以表現(xiàn)出B6MHCI類的交叉反應(yīng)性。組1和組5中的肽能誘導(dǎo)C57BL/6T細(xì)胞的強(qiáng)反應(yīng)性。圖7.BFA4cDNA序列。圖8.BFA4氨基酸序列。圖9.針對BFA4肽的免疫應(yīng)答。圖10.BCY1核苷酸(A)和氨基酸(B)序列。圖11.針對特異性的BCY1肽的免疫應(yīng)答。圖12.BFA5cDNA序列。圖13.BFA5氨基酸序列。圖14.針對BFA5-衍生的肽的免疫應(yīng)答。圖15.BCZ4cDNA和氨基酸序列。圖16.針對BCZ4-衍生的肽的免疫應(yīng)答。圖17.BFY3cDNA和氨基酸序列。圖18.針對BFY3-衍生的肽的免疫應(yīng)答。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防癌癥的試劑和方法。在本申請中引用的所有文獻(xiàn)都引作參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對一種或多種腫瘤抗原(″TA″)的免疫應(yīng)答，以預(yù)防和/或治療癌癥。在某些實(shí)施方案中，可以組合一種或多種TA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如施用編碼腫瘤抗原的核酸載體或肽或多肽形式的腫瘤抗原自身后，TA在宿主細(xì)胞中的表達(dá)引起免疫應(yīng)答。如本文所使用的，″抗原″是一種分子，例如多肽或其部分，其能在已經(jīng)施用了該抗原的宿主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以包括能結(jié)合至少一個(gè)抗原表位的抗體的生成和/或針對能表達(dá)抗原表位的細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答的生成。該反應(yīng)可以是現(xiàn)有免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，例如通過造成增強(qiáng)的抗體生產(chǎn)、具有增強(qiáng)的抗原親合力的抗體的生成或增強(qiáng)的或更有效的細(xì)胞應(yīng)答(即，增加的T細(xì)胞或具有更高的抗腫瘤活性的T細(xì)胞)。將能產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原可替換地稱作是免疫原性的或免疫原。在本發(fā)明的描述中，可以將TA稱作″免疫原性靶″。TA包括腫瘤相關(guān)抗原(TAA)和腫瘤-特異性的抗原(TSA)，其中癌細(xì)胞是抗原的來源。TAA是一種抗原，它在腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的量高于在正常細(xì)胞上觀察到的，或者是在胚胎發(fā)育過程中在正常細(xì)胞上表達(dá)的抗原。TSA是腫瘤細(xì)胞特有的抗原，且在正常細(xì)胞上不表達(dá)。TA還包括TAA或TSA、其抗原性片段和保留了它們的抗原性的修飾形式。典型地，根據(jù)它們的表達(dá)圖譜、功能或遺傳起源，將TA分成5類睪丸癌(CT)抗原(即，MAGE，NY-ESO-1)；黑素細(xì)胞分化抗原(即，MelanA/MART-1，酪氨酸酶，gap100)；突變的抗原(即，MUM-1，p53，CDK-4)；超量表達(dá)的“自身”抗原(即，HER-2/neu，p53)；和病毒抗原(即，HPV，EBV)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，合適的TA是能在表達(dá)該TA的宿主中誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的任意TA。合適的TA包括，例如，gap100(Cox等.，Science，264716-719(1994))，MART-1/MelanA(Kawakami等.，J.Exp.Med.，180347-352(1994))，gp75(TRP-1)(Wang等.，J.Exp.Med.，1861131-1140(1996))，酪氨酸酶(Wolfel等.，Eur.J.Immunol.，24759-764(1994)；WO200175117；WO200175016；WO200175007)，NY-ESO-1(WO98/14464；WO99/18206)，黑素瘤蛋白多糖(Hellstrom等.，J.Immunol.，1301467-1472(1983))，MAGE家族抗原(即，MAGE-1，2，3，4，6，12，51；VanderBruggen等.，Science，2541643-1647(1991)；美國專利號(hào)6,235,525；CN1319611)，BAGE家族抗原(Boel等.，Immunity，2167-175(1995))，GAGE家族抗原(即，GAGE-1，2；VandenEynde等.，J.Exp.Med.，182689-698(1995)；美國專利號(hào)6,013,765)，RAGE家族抗原(即，RAGE-1；Gaugler等，Immunogenetics，44323-330(1996)；美國專利號(hào)5,939,526)，N-乙?；咸烟前滨；D(zhuǎn)移酶-V(Guilloux等，J.Exp.Med.，1831173-1183(1996))，pl5(Robbins等.，JImmunol.1545944-5950(1995))，β-連環(huán)蛋白(Robbins等.，J.Exp.Med.，1831185-1192(1996))，MUM-1(Coulie等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927976-7980(1995))，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-4(CDK4)(Wolfel等.，Science，2691281-1284(1995))，p21-ras(Fossum等，Int.J.Cancer，5640-45(1994))，BCR-abl(Bocchia等.，Blood，852680-2684(1995))，p53(Theobald等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9211993-11997(1995))，p185HER2/neu(erb-Bl；Fisk等.，J.Exp.Med.，1812109-2117(1995))，表皮生長因子受體(EGFR)(Harris等.，BreastCancerRes.Treat，291-2(1994))，癌胚抗原(CEA)(Kwong等.，J.Natl.CancerInst.，85982-990(1995)美國專利號(hào)5,756,103；5,274,087；5,571,710；6,071,716；5,698,530；6,045,802；EP263933；EP346710；和EP784483)；與癌相關(guān)的突變的粘蛋白(即，MUC-1基因產(chǎn)物；Jerome等.，J.Immunol.，1511654-1662(1993))；EBV的EBNA基因產(chǎn)物(即，EBNA-1；Rickinson等.，Cancer-Surveys，1353-80(1992))；人乳頭瘤病毒的E7，E6蛋白(Ressing等.，J.Immunol，1545934-5943(1995))；前列腺特異性的抗原(PSA；Xue等.，TheProstate，3073-78(1997))；前列腺特異性的膜抗原(PSMA；Israeli，等.，CancerRes.，541807-1811(1994))；獨(dú)特型表位或抗原，例如，免疫球蛋白獨(dú)特型或T細(xì)胞受體獨(dú)特型(Chen等.，J.Immunol.，1534775-4787(1994))；KSA(美國專利號(hào)5,348,887)，驅(qū)動(dòng)蛋白2(Dietz，等.BiochemBiophysResCommun2000Sep7；275(3)731-8)，HIP-55，TGFβ-1抗凋亡因子(Toomey，等.BrJBiomedSci2001；58(3)177-83)，腫瘤蛋白D52(BryneJ.A.，等.，Genomics，35523-532(1996))，H1FT，NY-BR-1(WO01/47959)，NY-BR-62，NY-BR-75，NY-BR-85，NY-BR-87，NY-BR-96(Scanlan，M.SerologicandBioinformaticApproachestotheIdentificationofHumanTumorAntigens，inCancerVaccines2000，CancerResearchInstitute，NewYork，NY)，BFA4(SEQIDNOS.23和24)，BCY1(SEQIDNOS.25和26)，BFA5(SEQIDNOS.27和28)，BCZ4(SEQIDNOS.29和30)，和BFY3(SEQIDNOS.31和32)，包括″野生型″(即，由通常由基因組編碼的，天然存在的)、修飾的和突變的形式以及其它片段和其衍生物。這些TA中的任一種都可以單獨(dú)地或彼此組合地用于共免疫方案中。在某些情況下，用TA和其它抗原例如血管發(fā)生相關(guān)抗原(″AA″)共免疫患者是有益的。AA是與參與血管的誘導(dǎo)和/或繼續(xù)發(fā)育的細(xì)胞有關(guān)的免疫原性分子(即，肽，多肽)。例如，AA可以在內(nèi)皮細(xì)胞(″EC″)上表達(dá)，它是血管的基本結(jié)構(gòu)組分。針對癌癥的治療，優(yōu)選地在供給腫瘤的血管內(nèi)或附近發(fā)現(xiàn)了AA。對患者進(jìn)行針對AA的免疫，優(yōu)選地產(chǎn)生抗-AA免疫應(yīng)答，由此預(yù)防和/或抑制了發(fā)生在腫瘤附近或內(nèi)部的血管發(fā)生過程。示例性的AA包括，例如，血管內(nèi)皮生長因子(即，VEGF；Bernardini，等.JUrol.，2001，166(4)1275-9；Starnes，等.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，2001，122(3)518-23；Dias，等.Blood，2002，992179-2184)，VEGF受體(即，VEGF-R，flk-1/KDR；Starnes，等.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，2001，122(3)518-23)，EPH受體(即，EPHA2；Gerety，等.1999，Cell，4403-414)，表皮生長因子受體(即，EGFR；Ciardeillo，等.Clin.CancerRes.，2001，7(10)2958-70)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(即，bFGF；Davidson，等.Clin.Exp.Metastasis2000，18(6)501-7；Poon，等.AmJ.Surg.，2001，182(3)298-304)，血小板-衍生的細(xì)胞生長因子(即，PDGF-B)，血小板-衍生的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD-ECGF；Hong，等.J.Mol.Med.，2001，8(2)141-8)，轉(zhuǎn)化生長因子(即，TGF-a；Hong，等.J.Mol.Med.，2001，8(2)141-8)，endoglin(Balza，等.Int.J.Cancer，2001，94579-585)，Id蛋白(Benezra，R.TrendsCardiovasc.Med.，2001，11(6)237-41)，蛋白酶例如uPA，uPAR，和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2，MMP-9；Djonov，等.J.Pathol.，2001，195(2)147-55)，一氧化氮合酶(Am.J.Ophthalmol.，2001，132(4)551-6)，氨肽酶(Rouslhati，E.NatureCancer，284-90，2002)，血小板反應(yīng)蛋白(即，TSP-1，TSP-2；Alvarez，等.Gynecol.Oncol.，2001，82(2)273-8；Seki，等.Int.J.Oncol.，2001，19(2)305-10)，k-ras(Zhang，等.CancerRes.，2001，61(16)6050-4)，Wnt(Zhang，等.CancerRes.，2001，61(16)6050-4)，細(xì)胞周期蛋白-依賴性激酶(CDKs；DrugResist.Updat.2000，3(2)83-88)，微管(Timar，等.2001.Path.Oncol.Res.，7(2)85-94)，熱休克蛋白(即，HSP90(Timar，同上))，肝素結(jié)合因子(即，肝素酶；Gohji，等.Int.J.Cancer，2001，95(5)295-301)，合酶(即，ATP合酶，thymidilate合酶)，膠原受體，整聯(lián)蛋白(即，αυβ3，αυβ5，α1β1，α2β1，α5β1)，表面蛋白多糖NG2，AAC2-1(SEQIDNO.1)，或AAC2-2(SEQIDNO.2)，等等，包括″野生型″(即，由基因組正常編碼的，天然存在的)、修飾的和突變的版本以及其它片段和其衍生物。這些靶中的任一種都可以單獨(dú)地或彼此組合地或與其它試劑組合地用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。在某些實(shí)施方案中，使用了編碼免疫原性靶的核酸分子。該核酸分子可以包含編碼一種或多種免疫原性靶、或其片段或衍生物的核苷酸序列，或由其組成，例如包含在ATCC保藏物中的DNA插入物中的。術(shù)語″核酸序列″或″核酸分子″指DNA或RNA序列。該術(shù)語包含由DNA和RNA的任意的已知堿基類似物形成的分子，例如但不限于4-乙酰基胞嘧啶，8-羥基-N6-甲基腺苷，氮丙啶基-胞嘧啶，假異胞嘧啶，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，肌苷，N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，1-甲基偽尿嘧啶，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基-鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-mannosylqueosine，5′-甲氧基羰基-甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫-N6-異戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸，oxybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，和2，6-二氨基嘌呤，等。分離的核酸分子是這樣的(1)當(dāng)總核酸是分離自源細(xì)胞時(shí)，它分離自至少約50％蛋白、脂類、碳水化合物或天然伴隨它的其它物質(zhì)；(2)它不連接核酸分子天然連接的多核苷酸的全部或一部分；(3)它可操作地連接到天然狀態(tài)下不連接的多核苷酸上；和/或，(4)天然不作為更大的多核苷酸序列的一部分而產(chǎn)生。優(yōu)選地，本發(fā)明的分離的核酸分子基本上不含有任何其它的污染核酸分子或在它的天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的其它污染物，后者會(huì)妨礙它在多肽生產(chǎn)中的應(yīng)用或它的治療、診斷、預(yù)防或研究應(yīng)用。如本文所使用的，當(dāng)與生物材料(例如核酸分子、多肽、宿主細(xì)胞等)組合使用時(shí)，術(shù)語″天然存在的″或″天然的″或″天然發(fā)現(xiàn)的″指在沒有人工操作的情況下天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)。類似地，如本文所使用的，″非天然存在的″或″非天然的″指非天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，或已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上人工修飾或合成的物質(zhì)。通過比較序列，確定兩種或更多核酸或多肽分子的同一性。如本領(lǐng)域已知的，″同一性″指通過組成分子的單元(即，核苷酸或氨基酸殘基)之間的匹配確定的核酸分子或多肽之間的序列相關(guān)性程度。同一性通過有空位的比對(如果存在)測量兩種或更多種序列之間的相同匹配的百分比，所述有空位的比對是通過特定的數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序(即，算法)解決的。通過相關(guān)序列與核酸序列或分離的核酸分子雜交的能力，也可以確定核酸序列之間的同一性。在定義這樣的序列時(shí)，術(shù)語″高度嚴(yán)格的條件″和″中等嚴(yán)格的條件″指能允許序列互補(bǔ)的核酸鏈雜交的方法，且排除了明顯錯(cuò)配的核酸的雜交。雜交和洗滌的″高度嚴(yán)格的條件″的實(shí)例是0.015M氯化鈉，0.0015M乙酸鈉，65-68℃或0.015M氯化鈉，0.0015M乙酸鈉，和50％甲酰胺，42℃(見，例如，Sambrook，F(xiàn)ritsch&Maniatis，MolecularCloningALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratory，1989)；Anderson等.，NucleicAcidHybridisationAPracticalApproachCh.4(IRLPressLimited))。術(shù)語″中等嚴(yán)格的條件″指能形成具有比在″高度嚴(yán)格的條件″下更高的堿基對錯(cuò)配度的DNA雙鏈體的條件。中等嚴(yán)格的條件的實(shí)例是0.015M氯化鈉，0.0015M乙酸鈉，50-65℃或0.015M氯化鈉，0.0015M乙酸鈉，和20％甲酰胺，37-50℃。作為實(shí)例，50℃、在0.015M鈉離子中的中等嚴(yán)格的條件能允許約21％的錯(cuò)配。在雜交過程中，為了減少非特異性的雜交和/或背景雜交，可以將其它試劑包含在雜交和洗滌緩沖液中。實(shí)例是0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％焦磷酸鈉，0.1％十二烷基硫酸鈉，NaDodSO4，(SDS)，ficoll，Denhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚精子DNA(或另一種非互補(bǔ)的DNA)，和硫酸葡聚糖，盡管也可以使用其它合適的試劑?？梢愿淖冞@些添加劑的濃度和類型，而基本上不影響雜交條件的嚴(yán)格性。通常在pH6.8-7.4進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)；但是，在典型的離子強(qiáng)度條件，雜交速度幾乎不依賴于pH。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，使用載體來將編碼多肽的核酸序列轉(zhuǎn)移給細(xì)胞。載體是用于將核酸序列轉(zhuǎn)移給宿主細(xì)胞的任意分子。在某些情況下，使用表達(dá)載體。表達(dá)載體是核酸分子，其適用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，且含有能指導(dǎo)和/或控制轉(zhuǎn)移的核酸序列的表達(dá)的核酸序列。表達(dá)包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、翻譯和剪接(如果存在內(nèi)含子)等過程。表達(dá)載體典型地包含一個(gè)或多個(gè)可操作地連接到編碼多肽的異源核酸序列上的側(cè)翼序列。側(cè)翼序列可以是例如同源的(即，來自與宿主細(xì)胞相同的種和/或株)、異源的(即，來自與宿主細(xì)胞種或株不同的種)、雜合體(即，來自超過一個(gè)來源的側(cè)翼序列的組合)或合成的。側(cè)翼序列優(yōu)選地能實(shí)現(xiàn)編碼序列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，且可操作地連接到編碼序列上。如本文所使用的，術(shù)語“可操作地連接”指多核苷酸元件的功能上有關(guān)系的連接。例如，如果能影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子或增強(qiáng)子是可操作地連接到編碼序列上。但是，側(cè)翼序列無需與編碼序列鄰接，只要它能正確地起作用即可。因而，例如，可以在啟動(dòng)子序列和編碼序列之間存在間插的未翻譯的但是轉(zhuǎn)錄的序列，仍然認(rèn)為啟動(dòng)子序列可操作地連接到編碼序列上。類似地，增強(qiáng)子序列可以位于編碼序列的上游或下游，并影響序列的轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方案中，側(cè)翼序列優(yōu)選地是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其能驅(qū)動(dòng)靶細(xì)胞內(nèi)的高水平的基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以包含，例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、阻遏元件或其組合。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以是組成性的、組織特異性的、細(xì)胞類型特異性的(即，該區(qū)域在一種類型的組織或細(xì)胞中能驅(qū)動(dòng)比在另一種中更高水平的轉(zhuǎn)錄)或可調(diào)節(jié)的(即，能對與化合物的相互作用作出反應(yīng))。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的來源可以是任意的原核生物或真核生物，任意的脊椎動(dòng)物或非脊椎動(dòng)物，或任意的植物，只要側(cè)翼序列能通過導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核酸的轉(zhuǎn)錄而在細(xì)胞中起作用即可?？梢允褂迷S多種類的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)包括，例如，CMV啟動(dòng)子(即，CMV-立即早期啟動(dòng)子)；來自真核生物基因的啟動(dòng)子(即，雌激素-可誘導(dǎo)的雞卵清蛋白基因，干擾素基因，糖皮質(zhì)激素-可誘導(dǎo)的酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，和胸苷激酶基因)；和主要的早期和晚期腺病毒基因啟動(dòng)子；SV40早期啟動(dòng)子區(qū)域(Bernoist和Chambon，1981，Nature290304-10)；包含在勞氏肉瘤病毒(RSV)的3′長末端重復(fù)(LTR)中的啟動(dòng)子(Yamamoto，等.，1980，Cell22787-97)；單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)啟動(dòng)子(Wagner等.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.781444-45)；金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等.，1982，Nature29639-42)；原核生物表達(dá)載體例如β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroff等.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，753727-31)；或tac啟動(dòng)子(DeBoer等.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8021-25)。組織-和/或細(xì)胞-類型特異性的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括，例如，彈性蛋白酶I基因控制區(qū)，它在胰腺腺泡細(xì)胞中是有活性的(Swift等.，1984，Cell38639-46；Ornitz等.，1986，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology7425-515)；胰島素基因控制區(qū)，它在胰腺β細(xì)胞中是有活性的(Hanahan，1985，Nature315115-22)；免疫球蛋白基因控制區(qū)，它在淋巴細(xì)胞中是有活性的(Grosschedl等.，1984，Cell38647-58；Adames等.，1985，Nature318533-38；Alexander等.，1987，Mol.Cell.Biol.，71436-44)；在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細(xì)胞中的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)(Leder等.，1986，Cell45485-95)；肝中的白蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等.，1987，Genes和Devel.1268-76)；肝中的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等.，1985，Mol.Cell.Biol.，51639-48；Hammer等.，1987，Science23553-58)；肝中的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等.，1987，Genes和Devel.1161-71)；骨髓細(xì)胞中的β-珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram等.，1985，Nature315338-40；Kollias等.，1986，Cell4689-94)；腦中的少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等.，1987，Cell48703-12)；骨骼肌中的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Sani，1985，Nature314283-86)；下丘腦中的促性腺釋放激素基因控制區(qū)(Mason等.，1986，Science2341372-78)，和黑素瘤細(xì)胞中的酪氨酸酶啟動(dòng)子(Hart，I.SeminOncol1996Feb；23(1)154-8；Siders，等.CancerGeneTher1998Sep-Oct；5(5)281-91)，等。也可以使用例如在存在某些化合物或條件(例如光、熱、輻射、四環(huán)素或熱休克蛋白)下會(huì)活化的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(見，例如，WO00/10612)。其它的合適的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。如上所述，增強(qiáng)子也可以是合適的側(cè)翼序列。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常長約10-300堿基對，其作用于啟動(dòng)子上，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子典型地是不依賴于方向和位置的，已經(jīng)被鑒別出了在控制的編碼序列的5′和3′。已知可以從哺乳動(dòng)物基因得到的幾種增強(qiáng)子序列(即，珠蛋白，彈性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白和胰島素)。類似地，SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子可以與真核生物啟動(dòng)子序列一起使用。盡管可以將增強(qiáng)子在核酸編碼序列的5′或3′位置剪接進(jìn)載體中，它典型地位于啟動(dòng)子的5′位置。本領(lǐng)域已知其它合適的增強(qiáng)子，且可以應(yīng)用于本發(fā)明。在制備本發(fā)明的試劑時(shí)，可能需要轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。轉(zhuǎn)染指細(xì)胞攝入外來的或外源的DNA，當(dāng)外源DNA已經(jīng)被導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，則細(xì)胞已經(jīng)被轉(zhuǎn)染。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(即，Graham等.，1973，Virology52456；Sambrook等.，MolecularCloning，ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratories，1989)；Davis等.，BasicMethodsinMolecularBiology(Elsevier，1986)；和Chu等.，1981，Gene13197)。這樣的技術(shù)可以用于將一個(gè)或多個(gè)外源DNA部分導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染優(yōu)選地會(huì)導(dǎo)致該細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。當(dāng)細(xì)胞的特征有變化時(shí)，該細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的，當(dāng)它已經(jīng)被修飾成含有新的核酸時(shí)，細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染的核酸可以通過物理地整合進(jìn)細(xì)胞的染色體中，與細(xì)胞的核酸重組，其可以作為不經(jīng)復(fù)制的游離基因元件瞬時(shí)存在，或者可以作為質(zhì)粒獨(dú)立地復(fù)制。當(dāng)核酸隨著細(xì)胞的分裂而復(fù)制時(shí)，則穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化了細(xì)胞。本發(fā)明還提供了分離的多肽形式的免疫原性靶。在下述情況時(shí)，認(rèn)為多肽是分離的(1)當(dāng)從源細(xì)胞分離時(shí)，它已經(jīng)從至少約50％多核苷酸、脂類、碳水化合物或天然伴隨它的其它物質(zhì)中分離出來；(2)它不連接(通過共價(jià)的或非共價(jià)的相互作用)“分離的多肽”天然連接的多肽的全部或一部分；(3)它可操作地連接(通過共價(jià)的或非共價(jià)的相互作用)到天然不連接的多肽上；或，(4)天然不產(chǎn)生。優(yōu)選地，分離的多肽基本上不含有任何其它的污染多肽或在它的天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的其它污染物，后者會(huì)妨礙它的治療、診斷、預(yù)防或研究應(yīng)用。免疫原性靶多肽可以是成熟的多肽，如本文所定義的，且根據(jù)制備它們的方法，可以具有或不具有氨基末端甲硫氨酸殘基。還包括相關(guān)的多肽，例如，片段、變體(即，等位基因的，剪接)、直向同源物、同源物和衍生物，例如，具有免疫原性靶的至少一個(gè)特征或活性(即，活性，抗原性)的那些。另外相關(guān)的是肽，它指一系列鄰接的氨基酸殘基，其具有與它的序列所來源多肽的至少一部分相對應(yīng)的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽包含約5-10個(gè)氨基酸，10-15個(gè)氨基酸，15-20個(gè)氨基酸，20-30個(gè)氨基酸，或30-50個(gè)氨基酸。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽包含9-12個(gè)氨基酸，其適用于呈遞到例如I類MHC分子上。核酸或多肽的片段包含在氨基末端(有或沒有前導(dǎo)序列)和/或羧基末端的序列(即，核酸或多肽)截短。片段也可以包含變體(即，等位基因的，剪接)、直向同源物、同源物和與親本序列相比具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加或取代或內(nèi)部缺失的其它變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短和/或缺失包含約10個(gè)氨基酸，20個(gè)氨基酸，30個(gè)氨基酸，40個(gè)氨基酸，50個(gè)氨基酸，或更多。這樣生產(chǎn)的多肽片段會(huì)包含約10個(gè)氨基酸，25個(gè)氨基酸，30個(gè)氨基酸，40個(gè)氨基酸，50個(gè)氨基酸，60個(gè)氨基酸，70個(gè)氨基酸，或更多。這種多肽片段可以任選地包含氨基末端甲硫氨酸殘基。應(yīng)當(dāng)明白，可以使用這樣的片段，例如生成針對免疫原性靶多肽的抗體或細(xì)胞免疫應(yīng)答。變體是與目標(biāo)序列相比具有一個(gè)或多個(gè)序列取代、缺失和/或添加的序列。變體可以是天然存在的或人工構(gòu)建的?？梢詮膶?yīng)的核酸分子制備出這種變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體具有1-3、或1-5、或1-10、或1-15、或1-20、或1-25、或1-30、或1-40、或1-50、或超過50個(gè)氨基酸的取代、插入、添加和/或缺失。等位基因變體是占據(jù)生物或生物群體的染色體上的特定基因座的基因的幾個(gè)可能的天然存在的替代形式之一。剪接變體是由剪接初級(jí)轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的幾種RNA轉(zhuǎn)錄物之一生成的多肽。直向同源物來自另一物種的類似的核酸或多肽序列。例如，可以認(rèn)為小鼠和人形式的免疫原性靶多肽是彼此的直向同源物。序列的衍生物是從親本序列衍生出的，這些序列具有取代、添加、缺失或化學(xué)修飾的變體。變體也可以包含融合蛋白，它指在至少一種其它序列(例如異源肽)的氨基或羧基末端的一個(gè)或多個(gè)第一種序列(例如肽)的融合體?！逑嗨菩浴迨桥c同一性有關(guān)的一個(gè)概念，只是相似性指相關(guān)性的度量，所述相關(guān)性包含相同的匹配和保守取代匹配。如果2個(gè)多肽序列具有例如10/20個(gè)相同的氨基酸，且剩余的都是非保守的取代，則同一性和相似性的百分比都是50％。如果在同樣的實(shí)例中，多了5個(gè)保守取代的位置，則同一性的百分比仍然是50％，而相似性的百分比卻是75％(15/20)。因此，在有保守取代的情況下，2個(gè)多肽之間的相似性百分比會(huì)高于這2個(gè)多肽之間的同一性百分比。取代可以是保守的、或非保守的、或其任意組合。多肽序列的保守的氨基酸修飾(和對應(yīng)的對編碼核苷酸的修飾)會(huì)產(chǎn)生具有與親本多肽類似的結(jié)構(gòu)和化學(xué)特征的多肽。例如，“保守的氨基酸取代”可以包含用非天然殘基取代天然氨基酸殘基，以便對該位置的氨基酸的大小、極性、電荷、疏水性或親水性的影響較少或無影響，更具體地，不會(huì)產(chǎn)生降低的免疫原性。合適的保守的氨基酸取代如表I所示。表I使用眾所周知的技術(shù)，技術(shù)人員能夠確定合適的多肽變體。為了識(shí)別出合適的可以改變的、且不會(huì)破壞生物活性(即，MHC結(jié)合，免疫原性)的分子區(qū)域，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以靶向認(rèn)為對于活性不重要的區(qū)域。例如，當(dāng)已知了來自相同物種或其它物種的具有類似活性的類似多肽時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將多肽的氨基酸序列與這樣的類似多肽進(jìn)行對比。通過進(jìn)行這樣的分析，可以鑒定出在類似多肽之間保守的分子的殘基和部分。應(yīng)當(dāng)明白，在相對于這樣的類似多肽不保守的分子區(qū)域的變化，不太可能負(fù)面影響多肽的生物學(xué)活性和/或結(jié)構(gòu)。類似地，已知了結(jié)合MHC所需的殘基，且可以修飾它們來改善結(jié)合。但是，在大多數(shù)情況下，導(dǎo)致降低的與MHC的結(jié)合的修飾是不合適的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也知道，即使在相對保守的區(qū)域，也可以用化學(xué)上類似的氨基酸取代天然存在的殘基，同時(shí)保持活性。因此，甚至可以對生物活性或結(jié)構(gòu)重要的區(qū)域進(jìn)行保守的氨基酸取代，而不破壞生物活性，或者不負(fù)面影響多肽結(jié)構(gòu)。其它優(yōu)選的多肽變體包括糖基化變體，其中，與主題氨基酸序列相比，已經(jīng)改變了糖基化位點(diǎn)的數(shù)目和/或類型。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽變體包含比主題氨基酸序列更多或更少數(shù)目的N-連接的糖基化位點(diǎn)。N-連接的糖基化位點(diǎn)的特征在于序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中命名為X的氨基酸殘基可以是脯氨酸以外的任意氨基酸殘基。取代氨基酸殘基來建立該序列，會(huì)提供用于添加N-連接的碳水化合物鏈的潛在新位點(diǎn)?；蛘?，能消除該序列的取代會(huì)去除存在的N-連接的碳水化合物鏈。還提供了N-連接的碳水化合物鏈的重排，其中消除了一個(gè)或多個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)(典型地，是天然存在的那些)，并建立了一個(gè)或多個(gè)新的N-連接的位點(diǎn)。為了影響多肽的O-連接的糖基化，可以修飾絲氨酸和/或蘇氨酸殘基。其它優(yōu)選的變體包括半胱氨酸變體，其中與主題氨基酸序列組相比，缺失了一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基，或者被另一種氨基酸(例如，絲氨酸)取代。當(dāng)多肽必須重新折疊成生物活性的構(gòu)象時(shí)，例如，在分離不溶的包涵體后，半胱氨酸變體是有用的。半胱氨酸變體通常具有比天然蛋白更少的半胱氨酸殘基，且典型地具有偶數(shù)個(gè)，以使未配對的半胱氨酸產(chǎn)生的相互作用最小化。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多肽包括融合多肽片段，其能輔助多肽的純化。可以在其主題多肽變體的氨基端或羧基端產(chǎn)生融合。融合可以是直接的，沒有連接體或接頭分子，或可以通過連接體或接頭分子。連接體或接頭分子可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，典型地約20至約50個(gè)氨基酸殘基。也可以將連接體或接頭分子設(shè)計(jì)成具有DNA限制性核酸內(nèi)切酶或蛋白酶的切割位點(diǎn)，以允許分離融合的部分。應(yīng)當(dāng)明白，一旦構(gòu)建出來，就可以根據(jù)本文所述的方法衍生出融合多肽。合適的融合片段包括，但不限于，金屬結(jié)合域(例如多組氨酸片段)，免疫球蛋白結(jié)合域(即，蛋白A，蛋白G，T細(xì)胞，B細(xì)胞，F(xiàn)c受體，或補(bǔ)體蛋白抗體結(jié)合域)，糖結(jié)合域(例如，麥芽糖結(jié)合域)，和/或″標(biāo)志″域(即，至少一部分α-半乳糖苷酶，strep標(biāo)志肽，T7標(biāo)志肽，F(xiàn)LAG肽，或可以使用能結(jié)合該域的化合物例如單克隆抗體純化的其它域)。典型地，在多肽表達(dá)時(shí)，將標(biāo)志融合到多肽上，且可以用作從宿主細(xì)胞親合純化目標(biāo)多肽序列的方法。例如，通過使用針對標(biāo)志的抗體作為親合基質(zhì)的柱色譜，可以實(shí)現(xiàn)親合純化。任選地，隨后可以通過多種方式，例如使用某些肽酶進(jìn)行剪切，從純化的目標(biāo)多肽序列中去除標(biāo)志。如下所述，也可以在例如TA和共刺激組分例如趨化因子CXC10(IP-10)，CCL7(MCP-3)，或CCL5(RANTES)之間進(jìn)行融合。融合基序可以增強(qiáng)免疫原性靶向MHC加工室(例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng))的運(yùn)輸。這些稱作轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)胞吞序列的序列，包括源自HIVtat(見Kim等.1997J.Immunol.1591666)，Drosophilaantennapedia(見Schutze-Redelmeier等.1996J.Immunol.157650)，或人周期-1蛋白(hPERl；更具體地，SRRHHCRSKAKRSRHH)的序列。另外，多肽或其變體可以融合到同源多肽上，形成同二聚體，或融合到異源多肽上，形成異二聚體。異源肽和多肽包括但不限于用于檢測和/或分離融合多肽的表位；跨膜受體蛋白或其部分，例如胞外域或跨膜域和胞內(nèi)域；能結(jié)合跨膜受體蛋白的配體或其部分；具有催化活性的酶或其部分；能促進(jìn)寡聚的多肽或肽，例如亮氨酸拉鏈域；能提高穩(wěn)定性的多肽或肽，例如免疫球蛋白恒定區(qū)；和具有與多肽或其變體不同的治療活性的多肽。在某些實(shí)施方案中，可以有利地將編碼免疫原性靶、多肽或其衍生物的核酸序列與一種或多種共刺激組分(例如細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞因子或趨化因子)組合在本發(fā)明的組合物中。例如，共刺激組分可以作為多肽或編碼多肽的核酸包含在組合物中。合適的共刺激分子包括，例如，能結(jié)合CD28家族的成員(即，CD28，ICOS；Hutloff，等.Nature1999，397263-265；Peach，等.JExpMed1994，1802049-2058)的多肽，例如CD28結(jié)合多肽B7.1(CD80；Schwartz，1992；Chen等，1992；Ellis，等.J.Immunol.，156(8)2700-9)和B7.2(CD86；Ellis，等.J.Immunol.，156(8)2700-9)；能結(jié)合整聯(lián)蛋白家族成員(即，LFA-1(CDlla/CD18)；Sedwick，等.JImmunol1999，1621367-1375；Wulfing，等.Science1998，2822266-2269；Lub，等.ImmunolToday1995，16479-483)，包括ICAM家族的成員(即，ICAM-1，-2或-3)的多肽；能結(jié)合CD2家族成員(即，CD2，信號(hào)傳遞淋巴細(xì)胞活化分子(CDw150或″SLAM″；Aversa，等.JImmunol1997，1584036-4044))的多肽，例如CD58(LFA-3；CD2配體；Davis，等.ImmunolToday1996，17177-187)或SLAM配體(Sayos，等.Nature1998，395462-469)；能結(jié)合熱穩(wěn)定抗原(HSA或CD24；Zhou，等.EurJImmunol1997，272524-2528)的多肽；能結(jié)合TNF受體(TNFR)家族成員的多肽(即，4-1BB(CD137；Vinay，等.SeminImmunol1998，10481-489)，OX40(CD134；Weinberg，等.SeminImmunol1998，10471-480；Higgins，等.JImmunol1999，162486-493)，和CD27(Lens，等.SeminImmunol1998，10491-499))例如4-1BBL(4-1BB配體；Vinay，等.SeminImmunol1998，10481-48；DeBenedette，等.JImmunol1997，158551-559)，TNFR相關(guān)因子-1(TRAF-1；4-1BB配體；Saoulli，等.JExpMed1998，1871849-1862，Arch，等.MolCellBiol1998，18558-565)，TRAF-2(4-1BB和OX40配體；Saoulli，等.JExpMed1998，1871849-1862；Oshima，等.IntImmunol1998，10517-526，Kawamata，等.JBiolChem1998，2735808-5814)，TRAF-3(4-1BB和OX40配體；Arch，等.MolCellBiol1998，18558-565；Jang，等.BiochemBiophysResCommun1998，242613-620；KawamataS，等.JBiolChem1998，2735808-5814)，OX40L(OX40配體；Gramaglia，等.JImmunol1998，1616510-6517)，TRAF-5(OX40配體；Arch，等.MolCellBiol1998，18558-565；Kawamata，等.JBiolChem1998，2735808-5814)，和CD70(CD27配體；Couderc，等.Cancer基因Ther.，5(3)163-75)。CD154(CD40配體或″CD40L″；Gurunathan，等.JImmunol.，1998，1614563-4571；Sine，等.Hum.GeneTher.，2001，121091-1102)也可以是合適的。一種或多種細(xì)胞因子也可以是合適的共刺激組分或″佐劑″，無論是作為包含在本發(fā)明的組合物中的多肽還是由其中的核酸編碼(Parmiani，等.ImmunolLett2000Sep15；74(1)41-4；Berzofsky，等.NatureImmunol.1209-219)。合適的細(xì)胞因子包括，例如，白介素-2(IL-2)(Rosenberg，等.NatureMed.4321-327(1998))，IL-4，IL-7，IL-12(綜述見Pardoll，1992；Harries，等.J.GeneMed.2000Jul-Aug；2(4)243-9；Rao，等.J.Immunol.1563357-3365(1996))，IL-15(Xin，等.Vaccine，17858-866，1999)，IL-16(Cruikshank，等.J.LeukBiol.67(6)757-66，2000)，IL-18(J.CancerRes.Clin.Oncol.2001.127(12)718-726)，GM-CSF(CSF(Disis，等.Blood，88202-210(1996))，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，或干擾素例如IFN-α或INF-γ。其它細(xì)胞因子也可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，如本領(lǐng)域已知的。也可以使用趨化因子。例如，已經(jīng)證實(shí)了包含融合到腫瘤自身-抗原上的CXCL10(IP-10)和CCL7(MCP-3)的融合蛋白會(huì)誘導(dǎo)抗腫瘤的免疫(Biragyn，等.NatureBiotech.1999，17253-258)。趨化因子CCL3(MIP-1α；)和CCL5(RANTES)(Boyer，等.Vaccine，1999，17(Supp.2)S53-S64)也可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。其它的合適的趨化因子是本領(lǐng)域已知的。本領(lǐng)域還知道，可以阻斷抑制性的或負(fù)調(diào)節(jié)的免疫機(jī)理，產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。例如，已經(jīng)證實(shí)，用下述物質(zhì)治療抗-CTLA-4(Shrikant，等.Immunity，1996，14145-155；Sutmuller，等.J.Exp.Med.，2001，194823-832)，抗-CD25(Sutmuller，同上)，抗-CD4(Matsui，等.J.Immunol.，1999，163184-193)，融合蛋白IL13Ra2-Fc(Terabe，等.NatureImmunol.，2000，1515-520)，和其組合(即，抗-CTLA-4和抗-CD25，Sutmuller，同上)，會(huì)上調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答，且適用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明?？梢詥为?dú)地或與其它試劑組合地使用這些組分中的任一種。例如，已經(jīng)證實(shí)，CD80，ICAM-1和LFA-3的組合(″TRICOM″)可以加強(qiáng)抗癌免疫應(yīng)答(Hodge，等.CancerRes.595800-5807(1999)。其它有效的組合包括，例如，IL-12+GM-CSF(Ahlers，等.J.Immunol.，1583947-3958(1997)；Iwasaki，等.J.Immunol.1584591-4601(1997))，IL-12+GM-CSF+TNF-α(Ahlers，等.Int.Immunol.13897-908(2001))，CD80+IL-12(Fruend，等.Int.J.Cancer，85508-517(2000)；Rao，等.同上)，和CD86+GM-CSF+IL-12(Iwasaki，同上)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明白用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的其它組合。另外，技術(shù)人員能夠明白可以用于調(diào)控這種機(jī)理的其它試劑或方法。這些試劑或方法，以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它的試劑或方法，可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。也可以使用提高基于核酸的免疫的效率的其它方法，包括，例如，使用能自我復(fù)制的病毒復(fù)制子(Caley，等.1999.Vaccine，173124-2135；Dubensky，等.2000.Mol.Med.6723-732；Leiter，等.2000.CancerRes.6051-55)，密碼子優(yōu)化(Liu，等.2000.Mol.Ther.，1497-500；Dubensky，同上；Huang，等.2001.J.Virol.754947-4951)，體內(nèi)電穿孔(Widera，等.2000.J.Immunol.1644635-3640)，CpG刺激基序的整合(Gurunathan，等.Ann.Rev.Immunol.，2000，18927-974；Leitner，同上；Cho，等.J.Immunol.168(10)4907-13)，靶向內(nèi)吞或泛素加工途徑的序列(Thomson，等.1998.J.Virol.722246-2252；Velders，等.2001.J.Immunol.1665366-5373)，馬立克氏病病毒1型VP22序列(J.Virol.76(6)2676-82，2002)，激發(fā)-加強(qiáng)方案(Gurunathan，同上；Sullivan，等.2000.Nature，408605-609；Hanke，等.1998.Vaccine，16439-445；Amara，等.2001.Science，29269-74)，和使用粘膜送遞載體，例如沙門氏菌屬(Darji，等.1997.Cell，91765-775；Woo，等.2001.Vaccine，192945-2954)。其它方法是本領(lǐng)域已知的，其中的一些如下所述。在使用免疫原性靶治療和/或預(yù)防癌癥時(shí)，還可以使用化療劑、輻射、抗血管發(fā)生的化合物或其它試劑(Sebti，等.Oncogene2000Dec27；19(56)6566-73)。例如，在治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌時(shí)，有用的化療劑包括環(huán)磷酰胺，阿霉素，紫杉醇，多西他賽，諾維本，卡培他濱，和絲裂霉素C，以及其它。另外已經(jīng)證實(shí)的有效的組合化療方案包括例如，環(huán)磷酰胺+氨甲蝶呤+5-氟尿嘧啶；環(huán)磷酰胺+阿霉素+5-氟尿嘧啶；或環(huán)磷酰胺+阿霉素。出于各種原因，已經(jīng)使用了其它化合物例如強(qiáng)的松，紫杉烷，諾維本，絲裂霉素C，或長春花堿。許多乳腺癌患者具有雌激素-受體陽性的(ER+)腫瘤，且在這些患者中，內(nèi)分泌療法(即，三苯氧胺)是優(yōu)于化療的。對于這樣的患者，三苯氧胺或者作為二線治療的孕酮(醋酸甲羥孕酮或醋酸甲地孕酮)是優(yōu)選的。芳香酶抑制劑(即，氨魯米特和其類似物例如來曲唑)會(huì)降低維持腫瘤生長所需的雌激素的利用度，且可以用作某些患者的二線或三線內(nèi)分泌療法。其它癌癥可能需要不同的化療方案。例如，典型地，單獨(dú)地或彼此組合地用Camptosar(伊立替康或CPT-11)，5-氟尿嘧啶或亞葉酸治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。蛋白酶和整聯(lián)蛋白抑制劑例如作為MMP抑制劑的馬馬司他(BritishBiotech)，COL-3(Collagenex)，Neovastat(Aeterna)，AG3340(Agouron)，BMS-275291(BristolMyersSquibb)，CGS27023A(Novartis)或整聯(lián)蛋白抑制劑Vitaxin(Medimmune)，或MED1522(MerckKgaA)也可以適用于該用途。這樣，可以與使用這些化療劑的治療相組合，進(jìn)行與結(jié)直腸癌有關(guān)的免疫原性靶的免疫靶向。類似地，用于治療其它類型的癌癥的化療劑是本領(lǐng)域眾所周知的，且可以與本文所述的免疫原性靶相組合。許多抗血管發(fā)生劑是本領(lǐng)域已知的，且適用于與免疫原性靶疫苗共同施用(見，例如，Timar，等.20010.PathologyOncol.Res.，7(2)85-94)。這樣的試劑包括，例如，生理試劑，例如生長因子(即，ANG-2，NK1，2，4(HGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，細(xì)胞因子(即，干擾素例如IFN-α，-β，-γ，血小板因子4(PF-4)，PR-39)，蛋白酶(即，切割的AT-III，膠原XVIII片段(Endostatin))，高分子量激肽釋放酶-d5纖溶酶片段(制管張素)，凝血酶原-Fl-2，TSP-1)，蛋白酶抑制劑(即，金屬蛋白酶的組織抑制劑，例如TIMP-1，-2，或-3；maspin；纖溶酶原活化劑-抑制劑例如PAI-1；色素上皮衍生的因子(PEDF))，Tumstatin(可從ILEX，Inc.得到)，抗體產(chǎn)物(即，膠原-結(jié)合抗體HUIV26，HU177，XL313；抗-VEGF；抗-整聯(lián)蛋白(即，Vitaxin，(Lxsys)))，和糖苷酶(即，肝素酶-I，-III)。已知或認(rèn)為具有抗血管發(fā)生潛力的“化合物”或修飾的生理試劑包括，例如，長春花堿，紫杉醇，酮康唑，沙立度胺，dolestatin，combrestatinA，雷帕霉素(Guba，等.2002，NatureMed.，8128-135)，CEP-7055(可從Cephalon，Inc.得到)，黃酮乙酸，Bay12-9566(BayerCorp.)，AG3340(Agouron，Inc.)，CGS27023A(Novartis)，四環(huán)素衍生物(即，COL-3(Collagenix，Inc.))，Neovastat(Aeterná)，BMS-275291(Bristol-MyersSquibb)，低劑量的5-FU，低劑量的氨甲蝶呤(MTX)，irsofladine，根赤殼菌素，環(huán)孢霉素，卡托普利，塞來昔布，D45152-硫酸化的多糖，陽離子蛋白(魚精蛋白)，陽離子肽-VEGF，蘇拉明(多磺化的萘基脲)，能妨礙VEGF的功能或生成的化合物(即，SU5416或SU6668(Sugen)，PTK787/ZK22584(Novartis))，司他霉素，Angiozyme(核糖酶)，異黃酮，staurosporine衍生物，染料木黃酮，EMD121974(MerckKcgaA)，酪氨酸磷酸化抑制劑，isoquinolones，視黃酸，羧基酰氨基三唑，TNP-470，奧曲肽，2-甲氧基雌二醇，aminosterol(即，squalamine)，谷胱甘肽類似物(即，N-乙酰基-L-半胱氨酸)，combretastatinA-4(Oxigene)，Eph受體阻遏劑(Nature，414933-938，2001)，Rh-制管張素，Rh-Endostatin(WO01/93897)，環(huán)狀-RGD肽，accutin-二整聯(lián)蛋白，benzodiazepenes，人源化的抗-avb3抗體，Rh-PAI-2，氨氯吡嗪脒，對酰氨基苯甲脒，抗-uPA抗體，抗-uPAR抗體，L-phanylalanin-N-甲酰胺(即，Batimistat，馬馬司他)，AG3340，和二甲胺四環(huán)素。許多其它的合適的試劑是本領(lǐng)域已知的，且足以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明也可以與治療癌癥的“非傳統(tǒng)的”方法組合使用。例如，近來已經(jīng)證實(shí)，施用某些厭氧細(xì)菌可以輔助減慢腫瘤生長。在一項(xiàng)研究中，修飾了諾維梭菌以消除攜帶在噬菌體游離體上的毒素基因，并施用給患有結(jié)直腸腫瘤的小鼠(Dang，等.P.N.A.S.USA，98(26)15155-15160，2001)。與化療相結(jié)合，證實(shí)了該治療會(huì)造成動(dòng)物中的腫瘤壞死。本申請中所述的試劑和方法可以與這樣的治療方法相組合。通過幾種可得到的技術(shù)中的任一種，可以將編碼免疫原性靶的核酸施用給患者。已經(jīng)成功地用于將核酸導(dǎo)入宿主中的多種病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒和痘病毒，等。本領(lǐng)域能夠明白，在本領(lǐng)域可以得到許多這樣的病毒載體。使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以廣泛地得到的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)，可以構(gòu)建出本發(fā)明的載體。在普通的分子生物學(xué)文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)這樣的技術(shù)，例如MolecularCloningALaboratoryManual(Sambrook，等.，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress)，GeneExpressionTechnology(MethodsinEnzymology，Vol.185，D.Goeddel編，1991.AcademicPress，SanDiego，CA)，和PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications(Innis，等.1990.AcademicPress，SanDiego，CA)。優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒的衍生物以及鼠和鳥逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例包括，例如，Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)，Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)，SIV，BIV，HIV和勞氏肉瘤病毒(RSV)。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以整合多個(gè)外源核酸序列。由于重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒是有缺陷的，它們需要輔助，以生產(chǎn)感染性的載體顆粒。通過例如編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因的輔助細(xì)胞系，可以提供該輔助。合適的輔助細(xì)胞系包括Ψ2，PA317和PA12，等等。然后，可以使用這樣的細(xì)胞系生產(chǎn)的載體病毒粒子以感染組織細(xì)胞系，例如NIH3T3細(xì)胞，以生產(chǎn)大量的嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒粒子。通過傳統(tǒng)方法(即，注射)，或通過將“生產(chǎn)細(xì)胞系”植入到靶細(xì)胞群體附近，可以施用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Culver，K.，等.，1994，Hum.GeneTher.，5(3)343-79；Culver，K.，等.，ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.，59685-90)；Oldfield，E.，1993，Hum.GeneTher.，4(1)39-69)?？梢詫ιa(chǎn)細(xì)胞系進(jìn)行工程化來生產(chǎn)病毒載體，并將病毒顆粒釋放到靶細(xì)胞附近。一部分釋放的病毒顆粒會(huì)接觸靶細(xì)胞，并感染這些細(xì)胞，從而將本發(fā)明的核酸送遞進(jìn)靶細(xì)胞。隨著靶細(xì)胞的感染，發(fā)生載體核酸的表達(dá)。已經(jīng)證實(shí)，腺病毒載體可以特別地用于將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)真核細(xì)胞(Rosenfeld，M.，等.，1991，Science，252(5004)431-4；Crystal，R.，等.，1994，Nat.Genet.，8(1)42-51)、研究真核生物基因表達(dá)(Levrero，M.，等.，1991，Gene，101(2)195-202)、疫苗開發(fā)(Graham，F(xiàn).和Prevec，L.，1992，Biotechnology，20363-90)，和動(dòng)物模型(Stratford-Perricaudet，L.，等.，1992，BoneMarrowTransplant.，9(Suppl.1)151-2；Rich，D.，等.，1993，Hum.GeneTher.，4(4)461-76)。將重組抗體體內(nèi)地施用給不同組織的實(shí)驗(yàn)途徑已經(jīng)包含了氣管內(nèi)滴注法(Rosenfeld，M.，等.，1992，Cell，68(1)143-55)，注射進(jìn)肌肉(Quantin，B.，等.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(7)2581-4)，外周靜脈內(nèi)注射(Herz，J.，和Gerard，R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(7)2812-6)和立體定位接種到腦中(LeGalLaSalle，G.，等.，1993，Science，259(5097)988-90)，等等。腺伴隨病毒(AAV)證實(shí)了高水平的感染性、廣泛的宿主范圍和整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中的特異性(Hermonat，P.，等.，1984，Proc.Natl.acid.Sci.U.S.A.，81(20)6466-70)。單純皰疹病毒1型(HSV-1)是另一種吸引人的載體系統(tǒng)，特別是用于神經(jīng)系統(tǒng)中，因?yàn)樗挠H神經(jīng)性能(Geller，A.，等.，1991，TrendsNeurosci.，14(10)428-32；Glorioso，等.，1995，Mol.Biotechnol.，4(1)87-99；Glorioso，等.，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49675-710)。痘病毒是另一種有用的表達(dá)載體(Smith，等.1983，Gene，25(1)21-8；Moss，等，1992，Biotechnology，20345-62；Moss，等，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，15825-38；Moss，等.1991.Science，2521662-1667)。證實(shí)了有用的痘病毒包括牛痘，NYVAC，鳥痘(avipox)，禽痘(fowlpox)，金絲雀痘(canarypox)，ALVAC，和ALVAC(2)，等等。通過去除編碼已知的或潛在的毒力因子的基因組的6個(gè)非必需的區(qū)域，從牛痘病毒的哥本哈根疫苗株衍生了NYVAC(vP866)(見，例如，美國專利號(hào)5,364,773和5,494,807)。還工程化了缺失基因座作為用于插入外來基因的受體基因座。去除的區(qū)域是胸苷激酶基因(TK；J2R)；出血區(qū)(u；B13R+B14R)；一種類型的包涵體區(qū)域(ATI；A26L)；血凝素基因(HA；A56R)；宿主范圍基因區(qū)(C7L-K1L)；和大亞基，核糖核苷酸還原酶(I4L)。NYVAC是遺傳工程化的牛痘病毒株，它是通過特異性地去除編碼與毒力和宿主范圍有關(guān)的基因產(chǎn)物的18個(gè)開放讀碼框生成的。已經(jīng)證實(shí)了NYVAC可以用于表達(dá)TA(見，例如，美國專利號(hào)6,265,189)。NYVAC(vP866)，vP994，vCP205，vCP1433，placZH6H4L反向，pMPC6H6K3E3和pC3H6FHVB也在布達(dá)佩斯條約下保藏在ATCC，保藏號(hào)分別是VR-2559，VR-2558，VR-2557，VR-2556，ATCC-97913，ATCC-97912，和ATCC-97914。基于ALVAC的重組病毒(即，ALVAC-1和ALVAC-2)也適用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明(見，例如，美國專利號(hào)5,756,103)。ALVAC(2)與ALVAC(1)相同，只是ALVAC(2)基因組包含處于牛痘啟動(dòng)子控制下的牛痘E3L和K3L基因(美國專利號(hào)6,130,066；Beattie等.，1995a，1995b，1991；Chang等.，1992；Davies等.，1993)。已經(jīng)證實(shí)，ALVAC(1)和ALVAC(2)都可以用于表達(dá)外來DNA序列，例如TA(Tartaglia等.，1993a，b；美國專利號(hào)5,833,975)。ALVAC在布達(dá)佩斯條約下保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，USA，ATCC保藏號(hào)VR-2547。另一種有用的痘病毒載體是TROVAC。TROVAC指減毒的禽痘，它是從禽痘病毒的FP-1疫苗株衍生出的噬斑-克隆的分離物，批準(zhǔn)它用于1日齡小雞的疫苗接種。同樣地，TROVAC在布達(dá)佩斯條約下保藏在ATCC，登記號(hào)2553。″非病毒的″質(zhì)粒載體也可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。優(yōu)選的質(zhì)粒載體可以與細(xì)菌、昆蟲和/或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞相容。這樣的載體包括，例如，PCR-II，pCR3，和pcDNA3.1(Invitrogen，SanDiego，CA)，pBSII(Stratagene，LaJolla，CA)，pET15(Novagen，Madison，WI)，pGEX(PharmaciaBioteeh，Piscataway，NJ)，pEGFP-N2(Clontech，PaloAlto，CA)，pETL(BlueBacII，Invitrogen)，pDSR-α(PCTpub.No.WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，GrandIsl和NY)以及Bluescript質(zhì)粒衍生物(高拷貝數(shù)的基于COLE1的噬菌粒，StratageneCloningSystems，LaJolla，CA)，用于克隆Taq-擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的PCR克隆質(zhì)粒(例如，TOPOTMTAcloning試劑盒，PCR2.1質(zhì)粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)。細(xì)菌載體也可以用于本發(fā)明中。這些載體包括，例如，志賀氏菌屬，沙門氏菌數(shù)，霍亂弧菌，乳酸桿菌，Bacillecalmetteguérin(BCG)，和鏈球菌屬(見例如，WO88/6626；WO90/0594；WO91/13157；WO92/1796；和WO92/21376)。許多其它非病毒的質(zhì)粒表達(dá)載體和系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，且可以用于本發(fā)明中。合適的核酸送遞技術(shù)包括DNA-配體復(fù)合物，腺病毒-配體-DNA復(fù)合物，DNA的直接注射，CaPO4沉淀，基因槍技術(shù)，電穿孔，和膠體分散系統(tǒng)，等等。膠體分散系統(tǒng)包括大分子復(fù)合物，納米膠囊，微球，珠子，和基于脂類的系統(tǒng)包括水包油乳狀液、膠束、混合的膠束和脂質(zhì)體。優(yōu)選的本發(fā)明的膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體，它是可以用作體外和體內(nèi)送遞載體的人工膜泡囊?？梢詫NA、DNA和完整的病毒粒子包封在水性內(nèi)相中，且可以以生物活性形式送遞給細(xì)胞(Fraley，R.，等.，1981，TrendsBiochem.Sci.，677)。脂質(zhì)體的組成通常是磷脂、尤其是高相轉(zhuǎn)變溫度的磷脂的組合，通常與類固醇、尤其是膽固醇組合。也可以使用其它磷脂或其它脂類。脂質(zhì)體的物理特征依賴于pH、離子強(qiáng)度和二價(jià)陽離子的存在?？梢栽谥|(zhì)體生產(chǎn)中使用的脂類的實(shí)例包括磷脂?；衔?，例如磷脂酰甘油，磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，神經(jīng)鞘脂類，腦苷脂，和神經(jīng)節(jié)苷脂。特別有用的是二?；字８视?，其中脂部分含有14-18個(gè)碳原子，尤其是16-18個(gè)碳原子，且是飽合的。示例性的磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。也可以與一種或多種佐劑組合施用免疫原性靶，以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。示例性的佐劑如下面的表II所示表II免疫佐劑的類型也可以使用本發(fā)明的免疫原性靶來生成用于篩選實(shí)驗(yàn)或免疫療法的抗體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能明白其它的應(yīng)用。術(shù)語″抗體″包括抗體片段，如本領(lǐng)域已知的，包括Fab，F(xiàn)ab2，單鏈抗體(例如Fv)，人源化的抗體，嵌合抗體，人抗體，它們是通過本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)的。制備和使用各種類型的抗體的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的，且可以適用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明(見，例如，Harlow，等.AntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，1988；Harlow，等.UsingAntibodiesALaboratoryManual，PortableProtocolNo.1，1998；Kohler和Milstein，Nature，256495(1975))；Jones等.Nature，321522-525(1986)；Riechmann等.Nature，332323-329(1988)；Presta(Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)；Verhoeyen等.(Science，2391534-1536(1988)；Hoogenboom等.，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等.，J.Mol.Biol.，222581(1991)；Cole等.，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，p.77(1985)；Boerner等.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)；Marks等.，Bio/Technology10，779-783(1992)；Lonberg等.，Nature368856-859(1994)；Morrison，Nature368812-13(1994)；Fishwild等.，NatureBiotechnology14，845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；以及美國專利號(hào)4,816,567；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016)。也可以將來自它們的抗體或衍生物連接到治療部分，例如細(xì)胞毒性的藥物或毒素，或其活性片段，例如白喉A鏈，外毒素A鏈，蓖麻毒蛋白A鏈，相思豆毒蛋白A鏈，麻瘋樹毒蛋白，巴豆毒蛋白，酚霉素，依諾霉素，等等。細(xì)胞毒性劑也可以包含放射性化學(xué)試劑。可以將抗體和它們的衍生物包含在本發(fā)明的組合物中，用于體外或體內(nèi)使用。在檢測患者中疾病狀態(tài)的存在、預(yù)測預(yù)后或檢測化療或其它治療方案的有效性的實(shí)驗(yàn)中，可以使用代表著免疫原性靶的核酸、蛋白或其衍生物?？梢允褂萌绫绢I(lǐng)域已知的進(jìn)行的表達(dá)方法，來確定免疫原性靶的相對表達(dá)水平。然后，可以將表達(dá)水平與基礎(chǔ)水平相關(guān)聯(lián)，以確定特定疾病是否存在于患者中、患者的預(yù)后或特定的治療方案是否有效。例如，如果用特定的化療方案治療患者，患者組織中(即，在外周血液中)的免疫原性靶的降低的表達(dá)水平可以指示該方案能降低該宿主中的癌癥負(fù)載。類似地，如果表達(dá)水平增高，可能需要使用另一種治療方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將與編碼免疫原性靶的核酸相對應(yīng)的核酸探針結(jié)合到生物芯片上，如本領(lǐng)域已知的，用于檢測和定量宿主中的表達(dá)。還可以使用核酸、蛋白、它們的衍生物或其抗體作為藥物篩選實(shí)驗(yàn)中的試劑。該試劑可以用于確認(rèn)藥物備選品對免疫原性靶在細(xì)胞系、或患者的細(xì)胞或組織中的表達(dá)的作用。可以將表達(dá)圖譜分析技術(shù)與高通量篩選技術(shù)相組合，以快速鑒別有用的化合物和監(jiān)視藥物備選品的治療的有效性(見，例如，Zlokarnik，等.，Science279，84-8(1998))。藥物備選品可以是化合物、核酸、蛋白、抗體或它們的衍生物，無論是天然存在的還是合成地衍生的。除了別的用途外，這樣鑒別出的藥物備選品還可以用作藥物組合物，以施用給患者或用于其它篩選實(shí)驗(yàn)。使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的許多技術(shù)中的任一種，可以將本發(fā)明的組合物施用給宿主?？梢愿鶕?jù)藥學(xué)的常規(guī)方法加工組合物，生產(chǎn)用于施用給患者、包括人和其它哺乳動(dòng)物的藥劑(即，″藥物組合物″)。優(yōu)選地，將藥物組合物制成劑量單位形式，其含有給定量的例如DNA、病毒載體顆粒、多肽或肽。根據(jù)患者的狀況和其它因素，用于人或其它哺乳動(dòng)物的合適的日劑量可以較寬地變化，但是，再一次，可以使用常規(guī)方法來確定。可以在含有常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑和介質(zhì)的劑量單位制劑中，口服地、腸胃外地、通過吸入噴霧劑、直腸地、淋巴結(jié)內(nèi)地或局部地施用藥物組合物。如本文所使用的，術(shù)語″藥學(xué)上可接受的載體″或″生理學(xué)上可接受的載體″指一種或多種制劑化物質(zhì)，其適用于實(shí)現(xiàn)或增強(qiáng)作為藥物組合物的核酸、多肽或肽的送遞。″藥物組合物″是一種組合物，其包含治療有效量的核酸或多肽。術(shù)語″有效量″和″治療有效量″都指用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)有效的免疫應(yīng)答的核酸或多肽的量。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物能誘導(dǎo)或增強(qiáng)宿主中的抗腫瘤免疫應(yīng)答，這會(huì)保護(hù)宿主免于腫瘤的發(fā)展和/或允許宿主從體內(nèi)消除現(xiàn)有的腫瘤。對于口服施用，藥物組合物可以是任一種形式，包括，例如，膠囊、片劑、懸浮液或液體等等?？梢宰⑸涫┯靡后w，作為含有合適的載體、包含鹽水、葡聚糖或水的組合物。如本文所使用的，術(shù)語“腸胃外的”包括皮下的，靜脈內(nèi)的，肌肉內(nèi)的，胸骨內(nèi)的，輸注，或腹膜內(nèi)的施用。通過將藥物與合適的無刺激的在常溫下是固體、但是在直腸溫度下是液體的賦形劑(例如可可油和聚乙二醇)相混合，可以制備出用于直腸給藥的栓劑。使用本發(fā)明的組合物免疫宿主或治療障礙或疾病的劑量方案是基于許多因素，包括疾病的類型，患者的年齡、重量、性別、醫(yī)學(xué)狀況，狀況的嚴(yán)重性，給藥途徑和使用的具體化合物。例如，可以施用痘病毒載體，作為包含1×106感染性顆粒/劑的組合物。因而，劑量方案可以較大地變化，但是可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法常規(guī)地確定。也可以使用激發(fā)-加強(qiáng)方案(見，例如，WO01/30382Al)，其中，在激發(fā)步驟中以一種形式初次施用靶向的免疫原，然后在加強(qiáng)步驟中以另一種形式施用靶向的免疫原。在激發(fā)和加強(qiáng)步驟中的靶向的免疫原的形式是不同的。例如，如果激發(fā)步驟使用了核酸，可以施用肽來加強(qiáng)。類似地，當(dāng)激發(fā)步驟使用了一種類型的重組病毒(即，ALVAC)時(shí)，加強(qiáng)步驟可以使用另一種類型的病毒(即，NYVAC)。已經(jīng)證實(shí)，該激發(fā)-加強(qiáng)施用方法會(huì)誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答。盡管本發(fā)明的組合物可以作為唯一的活性藥劑來施用，它們也可以與一種或多種其它組合物或試劑(即，其它的免疫原性靶，共刺激分子，佐劑)組合使用。當(dāng)組合施用時(shí)，可以將各組分制成分開的組合物，可以同時(shí)或在不同的時(shí)間施用它們，或者可以將組分制成單一組合物。根據(jù)已知的方法，使用合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑，可以制備出可注射的制品，例如無菌的可注射的水性或油性懸浮液?？勺⑸涞闹破芬部梢允窃跓o毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的可注射的溶液或懸浮液?？梢允褂玫暮线m的介質(zhì)和溶劑是水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液等等。例如，可以將病毒載體(例如痘病毒)制備在0.4％NaCl中。另外，常規(guī)地使用無菌的、不揮發(fā)油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以使用任意的溫和的不揮發(fā)油，包括合成的單或二甘油酯。另外，可以將脂肪酸(例如油酸)用于可注射的制品中。對于局部施用，可以每天施用1-4次、優(yōu)選2或3次合適的局部劑量的組合物。也可以隔日給藥，在隔日時(shí)不給藥。合適的組合物可以占制劑的0.001％至10％重量/重量，例如1重量％-2重量％，盡管它可以在制劑中高達(dá)10％重量/重量，但是優(yōu)選地不超過5％重量/重量，更優(yōu)選O.1％-1重量％。適用于局部施用的制劑包括適用于穿透皮膚的液體或半固體制品(例如，擦劑，洗劑，軟膏，乳劑，或糊劑)和適用于向眼、耳或鼻給藥的滴劑。也可以將藥物組合物制成固體形式(包括顆粒，粉末或栓劑)?？梢詫λ幬锝M合物進(jìn)行常規(guī)的藥學(xué)操作，例如滅菌，和/或可以含有常規(guī)的佐劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、緩沖劑等。用于口服施用的固體劑型可以包括膠囊、片劑、丸劑、粉末和顆粒。在這樣的固體劑型中，可以將活性化合物與至少一種惰性稀釋劑相混合，后者例如蔗糖、乳糖或淀粉。作為常用的實(shí)踐，這樣的劑型也可以包含惰性稀釋劑以外的其它物質(zhì)，例如，潤滑劑，例如硬脂酸鎂。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，該劑型也可以包含緩沖劑。另外，可以給片劑和丸劑制備腸衣。用于口服施用的液體劑型可以包含藥學(xué)上可接受的乳狀液、溶液、懸浮液、糖漿劑和酏劑，其含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，例如水。這樣的組合物也可以包含佐劑，例如潤濕劑、甜味劑、矯味劑和芳香劑。包含本發(fā)明的核酸或多肽的藥物組合物可以采取任意的形式，且可以通過任意的途徑施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過腸胃外的(皮內(nèi)的，肌肉內(nèi)的或皮下的)途徑施用組合物，以誘導(dǎo)宿主中的免疫應(yīng)答。或者，可以將組合物直接施用給淋巴結(jié)(淋巴結(jié)內(nèi)的)或腫瘤塊(即，腫瘤內(nèi)的施用)。例如，可以在第0，7，和14天，皮下給藥。合適的使用包含TA的組合物進(jìn)行免疫的方法是本領(lǐng)域已知的，如對下列物質(zhì)所證實(shí)的p53(Hollstein等.，1991)，p21-ras(Almoguera等.，1988)，HER-2(Fendly等.，1990)，黑素瘤相關(guān)抗原(MAGE-1；MAGE-2)(vanderBruggen等.，1991)，p97(Hu等.，1988)，黑素瘤相關(guān)抗原E(WO99/30737)和癌胚抗原(CEA)(Kantor等.，1993；Fishbein等.，1992；Kaufman等.，1991)，等等。優(yōu)選的可施用的組合物的實(shí)施方案包括，例如，在液體制品(例如懸浮液、糖漿劑或酏劑)中的核酸或多肽。優(yōu)選的可注射的制品包括，例如，適用于腸胃外、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)施用的核酸或多肽，例如無菌的懸浮液或乳狀液。例如，可以將重組的痘病毒與合適的載體、稀釋劑或賦形劑相混合，例如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等。也可以將組合物制成凍干形式，用于例如在等滲的水性、鹽水緩沖液中重配。另外，可以將組合物與其它的抗贅生物劑、抗腫瘤劑或抗癌劑和/或能減少或減輕抗贅生物劑、抗腫瘤劑或抗癌劑的有害作用的藥物共同施用或依次施用。還提供了包含本發(fā)明的組合物的試劑盒。該試劑盒可以包含分開的容器，其裝有合適的載體、稀釋劑或賦形劑。該試劑盒也可以包含用于共同施用或依次施用的其它的抗贅生物劑、抗腫瘤劑或抗癌劑和/或能減少或減輕抗贅生物劑、抗腫瘤劑或抗癌劑的有害作用的藥物。另外，該試劑盒可以包含關(guān)于混合或組合成分和/或施用的說明書。從下面的說明性的實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明和它的許多優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例實(shí)施例1AAC2腫瘤相關(guān)抗原一位合作者提供了AAC2編碼序列(AAC2-1)的一種形式，發(fā)現(xiàn)它與鼠bcl-6-相關(guān)鋅指蛋白(″BAZF″)具有較高的序列相似性?；谠撔蛄行畔?，設(shè)計(jì)了如下所示的PCR引物CACCATGGGTTCCCCCGCCGCCCCGGA(正向引物；SEQIDNO.6)CTAGGGCCCCCCGAGAATGTGGTAGTGCACTTT(反向引物；SEQIDNO.7)按照生產(chǎn)商(LifeTechnologies，Inc.，目錄號(hào)15596)的指導(dǎo)，使用TrizolTM，從匯合的HUVEC(BioWhittacker；目錄號(hào)CC2517，批號(hào)1F0141)培養(yǎng)物分離出了RNA。然后，使用正向和反向引物，進(jìn)行了高保真度RT-PCR(24個(gè)循環(huán)，在94度，2分鐘；94度，30秒；56.8度，30秒；68度，1分40秒；循環(huán)25是68度，7分鐘)，分離了一個(gè)1,447堿基對的cDNA。將該cDNA克隆進(jìn)了pEF6-TOPO真核生物表達(dá)質(zhì)粒，并稱作″pEF6-hAAC2-2″。使用4個(gè)引物，對cDNApEF6-hAAC2-2進(jìn)行測序，并與AAC2-1和鼠BAZF的序列進(jìn)行比對(圖1)。如其中證實(shí)的，AAC2-2缺失在AAC2-1的位點(diǎn)245處發(fā)現(xiàn)的絲氨酸殘基。其次，在AAC2-2的位點(diǎn)298至316處的17個(gè)氨基酸的序列串(SEFFSCQNCEAVAGCSS)僅僅表現(xiàn)出11.8％的與AAC2-1的氨基酸298-316的序列同一性(圖1)。有趣的是，位點(diǎn)298至316之間的17個(gè)氨基酸的序列串與鼠BAZF100％相同，表明這對于長串絲氨酸(鋅指)的轉(zhuǎn)錄因子功能是至關(guān)重要的。然后，將AAC2-2克隆進(jìn)了pcDNA3.1-zeo真核生物表達(dá)質(zhì)粒(″pcDNA3.1-hAAC2-2″)。實(shí)施例2針對AAC-2肽的人T-細(xì)胞應(yīng)答性使用AAC2-2氨基酸序列，構(gòu)建了預(yù)測會(huì)結(jié)合HLA-A-0201的9-聚物肽文庫(表III；″N″表示在小鼠同源物中沒有發(fā)現(xiàn)該序列；而″Y″表示在小鼠同源物中發(fā)現(xiàn)了該序列)。將23個(gè)肽以10mg/ml溶于DMSO中(表IV)，并用于人PBMC培養(yǎng)物，以體外測試它們的引起CD8和CD4αβT-細(xì)胞應(yīng)答的能力。表III預(yù)測的人AAC2-2的HLA-A-0201-結(jié)合九聚物肽使用GM-CSF和IL-4，從能表達(dá)HLA-A-0201的血液供體的外周血單核細(xì)胞生成了樹突細(xì)胞(DC)。用表IV所示的不同的9-聚物AAC2-2肽組對DC進(jìn)行脈沖。表IVAAC2-2肽組使用這些DC來刺激自體T-細(xì)胞富集的PBMC制品。用自體PBMC再次刺激T細(xì)胞，然后用CD40-配體活化的自體B細(xì)胞再次刺激。用每個(gè)肽組刺激3和4個(gè)輪后，ELISPOT分析IFN-γ的生成，表明T細(xì)胞對AAC2-2肽組之一的反應(yīng)最強(qiáng)(肽組6；圖2A)。肽組6包括下面的肽ILTDVTLLV(氨基酸36-44)，TLLVGGQPL(氨基酸41-49)，和FMYTSRLRL(氨基酸95-103)。流式細(xì)胞儀分析(FACS)表明，來自該肽-特異性細(xì)胞系的淋巴細(xì)胞由＞50％具有記憶(CD45RO+)表型的CD8T細(xì)胞組成。非常少的細(xì)胞(＜2％)被抗-CD56抗體染色，表明觀察到的IFN-γ生產(chǎn)不是由于NK細(xì)胞活性。分析該肽組-特異性的T-細(xì)胞系的CTL活性，也證實(shí)了活化的T細(xì)胞能以HLA-A-0201-限制的方式殺傷肽-加載的TAP-缺乏的T2細(xì)胞(圖2B)。該分析還揭示，ILTDVTLLV是顯性肽，它能刺激大部分肽-特異性的CTL活性。因而，證實(shí)了AAC2-2肽在人免疫系統(tǒng)中是免疫原性的。實(shí)施例3AAC2-2的體內(nèi)免疫原性使用DNA免疫HLA-A2-Kb轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)AAC2-2蛋白被加工成了免疫原性肽，且能在體內(nèi)引起HLA-A-0201-限制的T-細(xì)胞應(yīng)答。在第1天，通過注射pEF6-hAAC2-2免疫了小鼠，并在第21天，用相同的質(zhì)粒進(jìn)行加強(qiáng)。加強(qiáng)后21天，從免疫的小鼠收獲淋巴細(xì)胞，并用表IV所示的不同的AAC2-2肽組體外地重新刺激。使用IFN-γELISPOT分析，發(fā)現(xiàn)了針對這些肽的肽-特異性的效應(yīng)物T-細(xì)胞功能(圖3)。發(fā)現(xiàn)在DNA接種后，以前在人PBMC培養(yǎng)物中表現(xiàn)出強(qiáng)免疫原性的相同的肽組(組6)也引起了顯著的T細(xì)胞反應(yīng)性(圖3)。因而，作為基于DNA的疫苗施用的AAC2基因產(chǎn)物是體內(nèi)免疫原性的，且能引起較強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，后者的特征在于CTL活性的激活。實(shí)施例4治療性AAC2-2疫苗發(fā)現(xiàn)使用pEF6-hAAC2-2DNA疫苗進(jìn)行針對AAC2-2基因的治療性接種，會(huì)完全阻斷實(shí)體瘤的生長。用104B16F10黑素瘤細(xì)胞、強(qiáng)的和相對非免疫原性的腫瘤細(xì)胞系皮下地侵襲了一組8只C57BL/6小鼠。然后，在腫瘤侵襲后6天，開始以每周的間隔免疫小鼠。用編碼流感-NP蛋白的質(zhì)?；螓}水單獨(dú)處理的對照小鼠(每組8只)都發(fā)展了大腫瘤。相反地，用pEF6-hAAC2-2免疫的所有小鼠(8/8)都在50天的時(shí)間內(nèi)沒有可檢測到的腫瘤(圖4)。在80天中，所有小鼠都仍然沒有腫瘤(未顯示數(shù)據(jù))。圖5對黑素瘤植入后證實(shí)的用不同的DNA載體處理的小鼠的存活率作圖，這再次證實(shí)了AAC2-2疫苗在保護(hù)小鼠免于黑素瘤生長中的完全有效性。沒有觀察到用人AAC2-2基因編碼載體免疫引起的有害健康的作用(免疫的小鼠和對照小鼠一樣有活力，且沒有表現(xiàn)出體重減少)。如圖4和5所示，用編碼人VEGFR-2的質(zhì)粒(pBLAST-hflkl)進(jìn)行接種，不能保護(hù)腫瘤侵襲的小鼠。實(shí)際上，腫瘤在這些小鼠中甚至更迅速地生長。通過ELISA分析來自用pBLAST-hflkl質(zhì)粒免疫的小鼠的血清，發(fā)現(xiàn)以顯著的滴度誘導(dǎo)了針對VEGFR-2蛋白的IgG(未顯示數(shù)據(jù))。這些結(jié)果表明，基于抗體的針對VEGFR-2的免疫應(yīng)答不能有效地預(yù)防血管發(fā)生和實(shí)體瘤生長。在用pEF6-hAAC2-2免疫的C57BL/6小鼠中的黑素瘤實(shí)體瘤生長的抑制與針對該蛋白的免疫應(yīng)答有關(guān)(圖6)。如上所述，進(jìn)行了C57BL/6小鼠的免疫。用與使用HLA-A2-Kb轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)相同的肽組重新刺激了來自免疫的小鼠的脾細(xì)胞(表III)。相當(dāng)數(shù)量的肽能與C57BL/6I類MHC(Kb和Db分子)交叉反應(yīng)。更具體地，發(fā)現(xiàn)2個(gè)肽組(組1和組5)能在IFN-γELISPOT實(shí)驗(yàn)中引起強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞活性(圖6)。這些組中的所有肽都與鼠BAZF蛋白中的對應(yīng)序列相同。這些結(jié)果強(qiáng)烈地表明，用人AAC2-2免疫會(huì)在小鼠中活化針對它的鼠直向同源物BAZF的免疫應(yīng)答，且結(jié)果可以抑制腫瘤血管發(fā)生。這些結(jié)果來自單個(gè)實(shí)驗(yàn)，并非所有的實(shí)驗(yàn)都顯示了這些結(jié)果。實(shí)施例5BFA4腫瘤抗原發(fā)現(xiàn)BFA4序列是″毛發(fā)、鼻、指(趾)綜合征1″(TRPS-1)基因(GenebankID#6684533；Momeniet等，NatureGenetics，24(1)，71-74，2000)，它是一種已知的轉(zhuǎn)錄因子，以前認(rèn)為它對所有形式的癌癥都沒有作用。BFA4cDNA序列如圖7所示(SEQIDNO.23)，推導(dǎo)的氨基酸序列如圖8所示(SEQIDNO.24)。A.BFA4肽和多克隆抗血清為了監(jiān)測目的，制備了兔抗-BFA4多克隆抗體。設(shè)計(jì)和合成了6個(gè)肽(22-聚物)，以引起針對BFA4的抗體反應(yīng)，如下所示CLP2589MVRKKNPPLRNVASEGEGQILEBFA4(1-22)CLP2590SPKATEETGQAQSGQANCQGLSBFA4(157-178)CLP2591VAKPSEKNSNKSIPALQSSDSGBFA4(371-392)CLP2592NHLQGSDGQQSVKESKEHSCTKBFA4(649-670)CLP2593NGEQIIRRRTRKRLNPEALQAEBFA4(940-961)CLP2594ANGASKEKTKAPPNVKNEGPLNVBFA4(1178-1199)用肽免疫了兔，分離了血清，并觀察到了下面的抗體滴度還通過偶聯(lián)KLH肽，修飾了這些肽，以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，如下所示BFA4(1-22)KLH-MVRKKNPPLRNVASEGEGQILE(CLP-2589)BFA4(157-178)KLH-SPKATEETGQAQSGQANCQGLS(CLP-2590)BFA4(371-392)KLH-VAKPSEKNSNKSIPALQSSDSG(CLP-2591)BFA4(649-670)KLH-NHLQGSDGQQSVKESKEHSCTK(CLP-2592)BFA4(940-961)KLH-NGEQIIRRRTRKRLNPEALQAE(CLP-2593)BFA4(1178-1200)KLH-ANGASKEKTKAPPNVKNEGPLNV(CLP-2594)還使用pcDNA3.2BFA4(3.6mg)進(jìn)行DNA免疫，在小雞中生成多克隆血清。B.BFA4的克隆BFA4的完整cDNA序列是約10kb，并在BT474導(dǎo)管癌細(xì)胞中表達(dá)了基因。設(shè)計(jì)了引物7717(正向引物)和7723(反向引物)，以通過RT-PCR擴(kuò)增4kb，7kb或10kb產(chǎn)物，以擴(kuò)增全長BFA4基因。引物7717含有Kozak的BFA4-BamH1/F1(5′端正向)5′CGGGATCCACCATGGTCCGGAAAAAGAACCCC3′(DNA3.1的BamHI，MP76)引物7723BFA4-BamHI/R1(3′端反向4kb)5′CGGGATCCCTCTTTAGGTTTTCCATTTTTTTCCAC3′(DNA3.1的BamHI，MP76)在RT-PCR中，使用了按照生產(chǎn)商(GibcoBRL)的指示用Trizol從BT-474細(xì)胞分批地分離和冷凍的10mg總RNA，以擴(kuò)增BFA4基因。使用Taq鉑高保真度酶，OPC(OligoPurificationCartridge；AppliedBiosystems)純化的引物和純化的總RNA/polyAmRNA(BT474細(xì)胞)，優(yōu)化了RT-PCR條件。優(yōu)化產(chǎn)生了作為單一條帶的4.0kb片段。為了重新擴(kuò)增BFA4序列，按照生產(chǎn)商的說明書(GibcoBRL)，用脫氧核糖核酸酶處理了mRNA。使用引物7717和7723引物(10皮摩爾/微升)和Taq鉑高保真度聚合酶(GIBCOBRL)酶，通過PCR，再次擴(kuò)增了4kbDNA。2組反應(yīng)的溫度循環(huán)儀條件如下94℃(2分鐘)，然后30個(gè)循環(huán)94℃(30秒)，52℃(30秒)，67℃(4分鐘)和67℃(5分鐘)，和最后40℃持續(xù)10分鐘。在pCR2.1/TOPO-TA克隆后，鑒定出了3個(gè)BFA4克隆。在分析BFA4序列的過程中，鑒定出了幾個(gè)突變。為了校正這些序列，將來自克隆JB-3552-1-2(pCR2.1/TOPO/BFA4)的BFA4基因的BamHI/XhoI片段(5′)替換為來自克隆JB-3552-1-4(pCR2.1/TOPO/BFA4)的BFA4基因的XhoI/BamHI片段(3′)。然后，將該重組片段連接進(jìn)pMCS5BamHI/CAP。生成了克隆JB-3624-1-5，且發(fā)現(xiàn)其含有正確的序列。分離的BFA4克隆的核苷酸344不同于報(bào)道的序列(在BFA4中是C，在TRPS-1中是T)。該變化導(dǎo)致了從phe向ser的氨基酸變化。為了將該序列變成報(bào)道的序列，將來自克隆JB-3552-1-2(pCR2.1/TOPO/BFA4)的BFA4基因的EcoRI/BglII片段(5′)亞克隆進(jìn)pUC82，生成克隆JB-3631-2。該克隆用作Quickchange(Stratagene)誘變的模板，以將BFA4蛋白的氨基酸115從絲氨酸變成苯丙氨酸，象在TRPS1蛋白中一樣。選擇的克隆是JB-3648-2-3。還使用pMCS5BFA4(BT474)作為Quickchange(Stratagene)誘變的模板，重復(fù)誘變，以將BFA4蛋白的氨基酸115從絲氨酸變成苯丙氨酸，象在TRPS1蛋白中一樣。通過DNA測序發(fā)現(xiàn)幾個(gè)克隆是正確的，將一個(gè)克隆(JB-3685-1-18)用于進(jìn)一步的亞克隆。然后，使用JB-3685-1-18，將BFA4編碼序列亞克隆進(jìn)4個(gè)不同的表達(dá)載體的BamHI位點(diǎn)1)痘病毒(NYVAC)載體pSD554VC(COPAK/H6；JB-3707-1-7)；2)pcDNA3.1/Zeo(+)(JB-3707-3-2)；3)pCAMycHis(JB-3707-5-1)；和4)Semiliki森林病毒甲病毒復(fù)制子載體pMP76(JB-3735-1-23)。通過DNA測序，確認(rèn)了JB-3707-1-7，JB-3707-5-1，和JB-3735-1-23中的BFA4編碼序列。將終止密碼子導(dǎo)入到了pcDNA3.1/Zeo/BFA4構(gòu)建體(JB-3707-3-2)中的克隆序列的末端附近。打開并填充了獨(dú)有的EcoRI位點(diǎn)，以便與BFA4編碼序列在同一讀框內(nèi)導(dǎo)入終止密碼子。通過EcoRI位點(diǎn)的喪失，鑒定出了幾個(gè)推定的克隆，但是對3個(gè)克隆(JB-3756-1-2；JB-3756-3-1；和JB-3756-4-1)進(jìn)行了測序。發(fā)現(xiàn)所有3個(gè)克隆的填充區(qū)域都是正確的。鑒定出克隆JB-3756-3-1具有正確的序列和方向。使用寡核苷酸，導(dǎo)入了Myc和myc/his標(biāo)志(Evans等，1985)，將其退火，并連接在pcDNA3.1/Zeo/BFA4構(gòu)建體(JB-3707-3-2)的EcoRI/EcoRV位點(diǎn)。從這些構(gòu)建體得到了幾個(gè)克隆。得到了3個(gè)具有正確的序列和方向的克隆1)PcDNA3.1/Zeo/BFA4/myc-tag(JB-3773-1-2)；2)PcDNA3.1/Zeo/BFA4/mychis-tag(JB-3773-2-1)；和3)PcDNA3.1/Zeo/BFA4/mychis-tag(JB-3773-2-2)。C.BFA4的表達(dá)1.從痘病毒載體表達(dá)使用pSD554VC(COPAK/H6；JB-3707-1-7)載體來生成NYVAC-BFA4病毒。用質(zhì)粒COPAK/H6/BFA4和在RK13/CEF細(xì)胞中的NYVAC，進(jìn)行了體外重組。生成了NYVAC-BFA4(vP2033-NYVAC-RK13)，在完成3次最終原液濃度為1.12×109/ml(10ml)的富集后，擴(kuò)增至P3水平。以0.5pfu/細(xì)胞的M.O.I.，用NYVAC-BFA4感染了Vero細(xì)胞。感染后24小時(shí)，收獲了裂解物和培養(yǎng)基，以確認(rèn)BFA4蛋白的表達(dá)。將1/20的濃縮培養(yǎng)基和1/40的裂解物進(jìn)行蛋白印跡，并與針對BFA4肽CLP2589，2591，2598和2594的兔抗血清一起孵育(見上面關(guān)于肽序列和抗-BFA4抗血清的制備)。在NYVAC-BFA4-感染的Vero細(xì)胞的裂解物和濃縮培養(yǎng)基中，都檢測到了大約120kD的帶，它在Vero對照細(xì)胞(″假感染的″)、感染了親本NYVAC病毒的Vero細(xì)胞或濃縮培養(yǎng)基中都不明顯。2.從基于pcDNA3.1的載體表達(dá)進(jìn)行了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染研究，以驗(yàn)證BFA4從基于pcDNA的載體的表達(dá)，并分析產(chǎn)生的針對BFA4肽的多克隆血清的量。使用了下面的構(gòu)建體來研究BFA4基因的表達(dá)pcDNA3.1zeoR/BFA4，pMP76/BFA4，pcDNA3.1zeoR/BFA4/Myc標(biāo)志和pcDNA3.1zeoR/BFA4/MycHis標(biāo)志。用pGL3熒光素酶(1μg)(Promega)和作為轉(zhuǎn)染劑的Geneporter試劑(GeneTherapySystems)共同轉(zhuǎn)染了BFA4表達(dá)質(zhì)粒(5μg和10μg)。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，通過在細(xì)胞裂解劑(200μl)中研磨細(xì)胞和1個(gè)周期的凍融(-20℃冷凍，37℃融解)，制備了全細(xì)胞提取物。通過一式兩份地檢測相對熒光素酶單位(RLU)，分析熒光素酶報(bào)道基因的表達(dá)，對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了定量。在有和沒有BFA4表達(dá)載體的情況下，在用熒光素酶構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的樣品中得到了類似的RLU值。使用不同量(5μg和10μg)的BFA4表達(dá)載體，沒有觀察到毒性或RLU值的顯著差異。使用堿性磷酸酶系統(tǒng)，對CHOK1細(xì)胞提取物(pCDNA3.1/zeo/BFA4/MycHisTag)和抗-BFA4多克隆抗血清進(jìn)行初步的蛋白印跡分析，揭示了在BFA4載體-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物中的約120kDa的帶。進(jìn)行了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染研究，以得到穩(wěn)定的能表達(dá)COSA2細(xì)胞的BFA4克隆。這些細(xì)胞在體外刺激實(shí)驗(yàn)中是有用的。使用pcDNA3.1zeoR/BFA4(2.5μg和20μg)，和pcDNA3.1zeoR/BFA4/MycHis標(biāo)志(2.5μg)來研究BFA4的表達(dá)。使用pGL3熒光素酶(2.5μg)作為對照載體，以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。使用Geneporter試劑來促進(jìn)DNA載體的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，通過在細(xì)胞裂解劑(200μl)中研磨細(xì)胞和1個(gè)周期的-20℃/37℃凍融，制備了全細(xì)胞提取物，用于第一個(gè)實(shí)驗(yàn)。用胰蛋白酶處理了從第二個(gè)實(shí)驗(yàn)得到的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，建立了冷凍的原液，并將細(xì)胞鋪板到遞增濃度的Zeocin(0，250，500，750和1000μg/ml)中。未轉(zhuǎn)染的CosA2細(xì)胞能在100μg/ml(Zeocin)中存活3周60-80％匯合，在250μg/ml(Zeocin)時(shí)10％匯合。但是，3周后，在更高藥物濃度(500μg/ml)，在含有未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和高Zeocin濃度(500-1000μg/ml)的平板中，沒有觀察到活細(xì)胞。3周后，從10cm平板挑取了能在不同藥物濃度(Zeocin-250，500，750和1000μg/ml)生長的幾個(gè)Zeocin-抗性的克隆。在有500，750和1000μg/mlZeocin存在的情況下，將這些克隆再擴(kuò)展到3.5cm平板中。制備了這些克隆的冷凍批，在有1mg/mlZeocin存在的情況下，將來自每個(gè)組(pcDNA3.1zeoR/BFA4，和pcDNA3.1zeoR/BFA4/MycHis標(biāo)志)的幾個(gè)克隆擴(kuò)展到T75cm2燒瓶中。在有1mg/mlZeocin存在的情況下，將來自每個(gè)組(pcDNA3.1zeoR/BFA4，和pcDNA3.1zeoR/BFA4/MycHis標(biāo)志)的5個(gè)克隆擴(kuò)展到T75cm2燒瓶中。在Zeocin藥物(1mg/ml)選擇下，維持細(xì)胞。在BFA4肽-脈沖的靶實(shí)驗(yàn)中，使用了6個(gè)克隆，通過免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2個(gè)克隆能以中等水平表達(dá)BFA4。還用這些載體轉(zhuǎn)染了未貼壁的細(xì)胞系K562A2和EL4A2，以生成穩(wěn)定的細(xì)胞系。3.原核生物表達(dá)載體將來自pCDNA3.1/BFA4的編碼N-末端54kDaBFDA4的BamHI-Xho-1片段(1.5Kbp)片段克隆進(jìn)了pGEX4Tl-6His(Veritas)質(zhì)粒。該載體含有tac啟動(dòng)子，其后是N-末端谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST，約26kDa)和GST融合蛋白的C末端的六組氨酸標(biāo)志。將BFA4-N54表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)了BL21細(xì)胞，并在25℃、在抗生素選擇培養(yǎng)基(2L培養(yǎng)物)中生長至OD(600nm)，此后，用1mMIPTG誘導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)GST-BFA4-N54是可溶蛋白。將可溶級(jí)分的澄清提取物分批地吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠4B上，并用10mM還原的谷胱甘肽洗脫。估計(jì)蛋白濃度和TCA沉淀后，分析了級(jí)分。通過SDS-PAGE，確認(rèn)了洗脫物中的Mr＝85kDa的特定多肽。將通過谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠純化的重組蛋白吸附到NiNTA柱上，進(jìn)一步純化。用0.25M咪唑洗脫了結(jié)合的蛋白。在含有40％甘油的TBS中，滲析蛋白，產(chǎn)生了4.5mgGST-BFA4-N54-6His(N末端BFA4蛋白)蛋白。通過蛋白印跡，使用兔抗-BFA4多克隆抗體，確認(rèn)了BFA4的表達(dá)。D.抗-BFA4免疫應(yīng)答1.BFA4肽除了BFA4的遺傳免疫載體外，已經(jīng)制備了BFA4的免疫試劑。合成了跨BFA4基因產(chǎn)物的100種九聚物肽的文庫。根據(jù)它們潛在的結(jié)合HLA-A*0201的能力，選擇了肽。表V列出了來自測試的BFA4蛋白的HLA-A*0201的100種九聚物肽表位(見下文)將肽文庫分成了不同的組，每組合有7-10種不同的肽，用于表VI(見下文)所示的免疫學(xué)測試。除了跨BFA4的肽文庫外，已經(jīng)合成和從大腸桿菌中純化了跨N-末端300個(gè)氨基酸(1-300位)的重組蛋白。BFA4肽的免疫反應(yīng)性和人效應(yīng)物T細(xì)胞的生成將BFA4肽分成了不同的組，每組含有7-10種肽，用于免疫學(xué)測試。用溶解的肽組脈沖了自體的HLA-A*0201樹突細(xì)胞，并用于活化自體的T-細(xì)胞富集的PBMC制品。使用CD40L-活化的自體B-細(xì)胞，再刺激來自每個(gè)肽組刺激的培養(yǎng)物的活化的T細(xì)胞3至5次。進(jìn)行了IFN-γELISPOT分析和CTL殺傷肽-刺激的靶細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)這些來自BFA4的表位的免疫原性。人T細(xì)胞證實(shí)了針對許多來自BFA4蛋白的肽的組的效應(yīng)細(xì)胞活性，如它們在ELISPOT實(shí)驗(yàn)中的分泌IFN-γ的能力所證實(shí)的。APC刺激不同輪后，重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生了相同的反應(yīng)肽組。發(fā)現(xiàn)肽組1，2，4，5，6，7，8，9，和10在這些實(shí)驗(yàn)中是免疫反應(yīng)性的(圖9A)。隨后，在其它的IFN-γELISPOT實(shí)驗(yàn)中，測試了這些反應(yīng)性肽組，其中分別測試了來自每組的單獨(dú)的肽。在ELISPOT實(shí)驗(yàn)中，各肽來自BFA4肽組1，5，6，7，8，9，和10(圖9B)。該分析揭示了許多單獨(dú)的強(qiáng)反應(yīng)性肽，它們來自通過人T細(xì)胞識(shí)別出的BFA4蛋白。還觀察到，這些單獨(dú)的肽中的許多也會(huì)誘導(dǎo)殺傷肽-加載的人T2淋巴細(xì)胞靶的CTL活性。這些肽列在表VII中表VII來自BFA4的高免疫反應(yīng)性肽的列表D.體內(nèi)免疫后針對BFA4的免疫應(yīng)答使用pcDNA3.1/Zeo-BFA4質(zhì)粒來免疫轉(zhuǎn)基因小鼠，其能表達(dá)與C57BL/6小鼠(A2-Kb小鼠)中的鼠Kbα3域相融合的雜合體HLA-A*0201α1α2域。DNA免疫和去除活化的脾細(xì)胞后，使用組的肽組進(jìn)行IFN-γELISPOT分析，揭示了許多反應(yīng)性BFA4肽組。這些組中的一些(尤其是組7和8)也在人T-細(xì)胞培養(yǎng)物中強(qiáng)烈反應(yīng)，表明通過人T細(xì)胞識(shí)別出了重疊的肽組，并在接種疫苗后天然地加工和呈遞到HLA-A2上。還使用NYVAC-BFA4和MP76-18-BFA4載體，在A2-Kb小鼠中進(jìn)行了接種實(shí)驗(yàn)。用10-20μgMP-76-18-BFA4和1-2×107pfuvP2033(NYVAC-BFA4)皮下地免疫了小鼠，并在28天后，用相同量的每種載體進(jìn)行加強(qiáng)。用BFA4肽的組重新刺激來自免疫的小鼠的脾細(xì)胞，揭示了BFA4肽組2，3，4，5，7，9，和10在ELISPOT實(shí)驗(yàn)中引起的IFN-γ生產(chǎn)的誘導(dǎo)。因而，在CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的真核生物質(zhì)粒、NYVAC或基于Semliki復(fù)制酶的DNA質(zhì)粒中編碼的BFA4基因都能體內(nèi)誘導(dǎo)針對BFA4蛋白的T-細(xì)胞應(yīng)答。實(shí)施例6BCY1腫瘤抗原發(fā)現(xiàn)BCY1基因是部分的開放讀碼框(ORF)，其與稱作″晚期表達(dá)的母基因-3″(PEM-3)的線蟲基因同源，后者在晚期至早期的秀麗新桿線蟲胚胎形成中起作用。以前尚未記載該基因會(huì)涉及癌癥。A.BCY1和氨基酸DNA序列最初確定了BCY1的部分DNA序列。引物、9616SXC和9617SXC源自BCY1部分DNA序列，并用于RT-PCR，從Calu6總RNA克隆BCY1。設(shè)計(jì)了引物，使PCR產(chǎn)物在兩端具有BamHI位點(diǎn)，且在5′端具有ATG起始密碼子和Kozak序列，如下所示9616SXC5′CAGTACGGATCCACCATGGCCGAGCTGCGCCTGAAGGGC3′9617SXC5′CCACGAGGATCCTTAGGAGAATATTCGGATGGCTTGCG3′在優(yōu)化的條件下，使用ThermoScriptRT-PCR系統(tǒng)(Invitrogen)，得到了1.2Kb的預(yù)期的擴(kuò)增子。用BamHI消化了來自3個(gè)分開的RT-PCR的PCR產(chǎn)物，并分別插入pcDNA3.1/Zeo(+)。得到的克隆是來自第一次RT-PCR的MC50A6，MC50A8和MC50A19；來自第二次RT-PCR的MC54.21和MC55.29；和來自第三次RT-PCR的MC55.32。使用下面的引物對克隆進(jìn)行測序9620MC5′TAATACGACTCACTATAGGG3′9621MC5′TAGAAGGCACAGTCGAGG3′9618MC5′GAAAACGACTTCCTGGCGGGGAG3′9619MC5′GCTCACCCAGGCGTGGGGCCTC3′所有6個(gè)克隆的DNA測序揭示了共有序列(SEQIDNO.25)，如圖10A和10B所示，其與原始的部分BCY1序列有下述不同在位點(diǎn)1031的C至G取代導(dǎo)致了Ala至Gly的氨基酸變化；在位點(diǎn)1032-1034的GC缺失導(dǎo)致了Thr缺失；在位點(diǎn)1177的A至G取代導(dǎo)致了Thr至Ala的氨基酸變化?？寺C50A8和MC55.29與共有序列相同。BCY1的氨基酸序列如圖10B和(SEQIDNO.26)所示。B.BCY1乳腺癌抗原的免疫試劑合成了跨BCY1基因產(chǎn)物的100種九聚物肽的文庫。根據(jù)它們潛在的結(jié)合HLA-A*0201的能力，選擇了肽。表VIII列出了來自測試的BCY1蛋白的HLA-A*0201的100種九聚物肽表位(見下文)表VIII表VIII(續(xù))表IX顯示了用于免疫學(xué)測試的肽組C.BCY1肽的免疫反應(yīng)性和人效應(yīng)物T細(xì)胞的生成將來自BCY1的100種肽的文庫分成10組，每組7-10種肽，用于免疫學(xué)測試。用溶解的肽組脈沖了自體的HLA-A*0201樹突細(xì)胞，并用于活化自體的T-細(xì)胞富集的PBMC制品。使用CD40L-活化的自體B-細(xì)胞，另外刺激來自每個(gè)肽組刺激的培養(yǎng)物的活化的T細(xì)胞3至5次。進(jìn)行了IFN-γELISPOT分析和CTL殺傷肽-刺激的靶細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)這些來自BCY1的表位的免疫原性。人T細(xì)胞證實(shí)了針對許多來自BCY1蛋白的肽組的效應(yīng)細(xì)胞活性，如它們在ELISPOT實(shí)驗(yàn)中的分泌IFN-γ的能力所證實(shí)的。APC刺激不同輪后，重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生了相同的反應(yīng)性肽組。發(fā)現(xiàn)肽組1，2，3，4，5，6，和7在這些實(shí)驗(yàn)中是免疫反應(yīng)性的。隨后，在其它的IFN-γELISPOT實(shí)驗(yàn)中，測試了這些反應(yīng)性肽組，其中分別測試了來自每組的單獨(dú)的肽。該分析揭示了許多單獨(dú)的強(qiáng)反應(yīng)性肽，它們來自通過人T細(xì)胞識(shí)別出的BCY1蛋白(圖11)。這些單獨(dú)的肽中的許多也會(huì)誘導(dǎo)殺傷肽-加載的人T2淋巴細(xì)胞靶的CTL活性。表IX列出了這些肽。實(shí)施例7BFA5/NYBR-1乳腺癌抗原A.BFA5的鑒定微陣列圖譜分析表明，與一系列的52個(gè)正常的、無腫瘤的組織相比，BFA5在54個(gè)乳腺瘤活組織檢查樣品中的41個(gè)(76％)中以從低至高的水平表達(dá)，在54個(gè)乳腺瘤的31個(gè)(57％)中高水平表達(dá)。使用一系列BFA5DNA探針進(jìn)行了原位雜交(ISH)，并確認(rèn)了至少61％腫瘤表現(xiàn)出較強(qiáng)信號(hào)的微陣列。進(jìn)一步的生物信息學(xué)評(píng)價(jià)確認(rèn)了這些基因表達(dá)分析的結(jié)果。BFA5核苷酸序列的序列分析揭示了與2個(gè)未鑒定的人基因的高度相似性KIAA1074(GenBank登記號(hào)XM_159732)；和KIAA0565(GenBank登記號(hào)AB011137)，它們是從許多胎兒和成人腦cDNA克隆分離出來的(Kikuno，等.Thecompletesequencesof100newcDNAclonesfrombrainwhichcodeforlargeproteinsinvitro.DNARes.6197-205)。發(fā)現(xiàn)這些基因含有推定的Zn指區(qū)和核定位序列。有人認(rèn)為BFA5是潛在的乳腺癌抗原(Jager，等.2001.Identificationofatissue-specificputativetranscriptionfactorinbreasttissuebyserologicalscreeningofabreastcancerlibrary.CancerRes.612055-2061和WO01/47959)。在這些文獻(xiàn)中的每一篇中，將核苷酸序列BFA5稱為NYBR-1(″紐約乳腺癌-1″；GenBank登記號(hào)AF269087(核苷酸)和AAK27325(氨基酸)。為了本申請的目的，將該序列稱作BFA-5，術(shù)語BFA-5和NYBR-1是可互換的。如Jager，等以前證實(shí)的和WO01/47959(同上)所述，BFA5特別地在乳腺中表達(dá)，且在12/19分析的乳腺瘤中表達(dá)。BFA5/NYBR-1基因的結(jié)構(gòu)已經(jīng)揭示，它編碼150-160kD核轉(zhuǎn)錄因子，后者含有bZIP位點(diǎn)(DNA-結(jié)合域，其后是亮氨酸拉鏈基序)。該基因也含有5個(gè)串聯(lián)錨蛋白重復(fù)，暗示著在蛋白-蛋白相互作用中的作用。這些錨蛋白重復(fù)可能在蛋白的同二聚化中起作用。BFA5cDNA序列如圖12和SEQIDNO.27所示。BFA5氨基酸序列如圖13和SEQIDNO.28所示。B.BFA5的免疫反應(yīng)性1.人T細(xì)胞的活化和IFN-γ在ELISPOT中的分泌。使用Rammensee和Parker算法，設(shè)計(jì)了來自預(yù)測會(huì)中等至高度結(jié)合HLA-A*0201的BFA5/NYBR-1編碼序列的100種肽的文庫。將該文庫細(xì)分成10組，每組10種肽(見表XI)，并在用肽刺激成熟的自體樹突細(xì)胞后，使用每個(gè)組來活化10種不同的T細(xì)胞培養(yǎng)物。使用BFA5/NYBR-1肽的文庫進(jìn)行的2個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在HLA-A*0201人T細(xì)胞中的免疫反應(yīng)性，如下所述。表XBFA5肽組在通過用每個(gè)BFA5肽組刺激4輪而活化的人T-細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行了ELISPOT分析。在圖14A中，X-軸下的數(shù)字指示著每個(gè)肽組的編號(hào)(1-10)。使用針對CMVpp65肽和流感基質(zhì)肽的反應(yīng)性作為實(shí)驗(yàn)中T-細(xì)胞活化的陽性對照。使用來自稱作″AP10″的單一HLA-A*0201+供體的PBMC和樹突細(xì)胞，進(jìn)行每個(gè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，盡管BFA4在實(shí)驗(yàn)中與高ELISPOT計(jì)數(shù)/100,000細(xì)胞明顯是反應(yīng)性的，BFA5與指示著ELISPOT反應(yīng)性的9/10組是更具有反應(yīng)性的。從具有不同的HLA-A*0201的BFA4和BFA5/NYBR-1，得到了類似的結(jié)果。條柱在600個(gè)斑點(diǎn)達(dá)到最大值，因?yàn)槌^了該值，ELISPOT讀數(shù)器不能產(chǎn)生準(zhǔn)確的讀數(shù)。具有600個(gè)斑點(diǎn)的讀數(shù)的培養(yǎng)物具有大于該數(shù)的斑點(diǎn)數(shù)。如高水平的IFN-γ生產(chǎn)所證實(shí)的，大量BFA5肽組是反應(yīng)性的(圖14A)。然后將每個(gè)反應(yīng)性的肽組分成單個(gè)的肽，并使用ELISPOT實(shí)驗(yàn)分析免疫原性，以分離單個(gè)的反應(yīng)性的BFA5肽。如圖14B所示，與BFA4相比，BFA5和幾種反應(yīng)性的單個(gè)肽是高免疫原性的。在2個(gè)獨(dú)立的PBMC培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，得到了類似的結(jié)果。除了ELISPOT分析外，測試了BFA5肽活化的人T細(xì)胞，以確定它們作為CTL起作用的能力。使用肽-脈沖的樹突細(xì)胞活化了細(xì)胞，然后使用CD40配體-活化的B細(xì)胞(刺激5輪)。使用從HLA-A*0201+供體AP31分離的PBMC，進(jìn)行了所述的實(shí)驗(yàn)。使用肽-加載的T2細(xì)胞，在51Cr-釋放實(shí)驗(yàn)中測試了分離的T細(xì)胞。用BFA5/NYBR-1肽組或各個(gè)肽脈沖的T2細(xì)胞，顯示了在細(xì)胞/靶比是10∶1，5∶1，和1∶1時(shí)的％特異性裂解。該圖證實(shí)了針對加載了非特異性的HLA-A*0201-結(jié)合HIV肽(對照)的靶誘導(dǎo)的CTL活性，針對肽組(組1等)的CTL活性，然后證實(shí)了由來自各組的單個(gè)的肽誘導(dǎo)的活性。在1∶1E∶T比時(shí)，觀察到了一些肽的高水平的細(xì)胞毒性。對照HIV肽誘導(dǎo)的CTL活性(％特異性裂解)一般＜10％。從能表達(dá)HLA-A*0201(AP10)的另一種PBMC供體得到了類似的結(jié)果。圖14C表明，大量的BFA5肽能觸發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的BFA5肽-加載的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性。表XI列出了這些具有免疫原性的肽。發(fā)現(xiàn)5種肽(LMDMQTFKA，ILIDSGADI，ILSWAKLL，SQYSGQLKV，和ELCSVRLTL)能在來自2個(gè)供體的T細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ分泌和CTL活性。表XI來自BFA5的免疫反應(yīng)性肽C.免疫試劑生產(chǎn)了針對下述系列的BFA5的22-至23-聚物肽的多克隆抗血清BFA5(1-23)KLH-MTKRKKTINLNIQDAQKRTALHW(CLP-2977)BFA5(312-334)KLH-TSEKFTWPAKGRPRKIAWEKKED(CLP-2978)BFA5(612-634)KLH-DEILPSESKQKDYEENSWDTESL(CLP-2979)BFA5(972-994)KLH-RLTLNQEEEKRRNADILNEKIRE(CLP-2980)BFA5(1117-1139)KLH-AENTMLTSKLKEKQDKEILEAEI(CLP-2981)BFA5(1319-1341)KLH-NYNNHLKNRIYQYEKEKAETENS(CLP-2982)加工了來自兔的預(yù)取血樣品，并保存在-20℃。如下免疫兔1)將肽作為與弗氏完全佐劑(FCA)的乳狀液施用；和2)2周后，用鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)肽，并作為與弗氏不完全佐劑(FIA)的乳狀液施用。觀察到了下面的結(jié)果表XII預(yù)出血樣品結(jié)果證實(shí)，所有樣品的IgG滴度都小于100。為了評(píng)價(jià)多克隆抗血清的質(zhì)量，使用抗BFA5的血清進(jìn)行了蛋白印跡。針對從BT474，MDMB453，MCF-7，Calu-6，和CosA2細(xì)胞得到的細(xì)胞提取物，分別篩選了血清。大致預(yù)測的BFA5蛋白的分子量是153kDa。在含有CLP2980抗體的BT474提取物中觀察到了220kD的帶，在MDMB453細(xì)胞提取物中沒有觀察到，但是在MDMB453提取物中存在約130kD帶。發(fā)現(xiàn)2條帶都與在該分析中測試的多克隆抗血清一致。2條帶都不存在于負(fù)對照中。因而，可以得出結(jié)論，多克隆抗血清是對BFA5特異性的。實(shí)施例8BCZ4腫瘤抗原A.BCZ4序列作為在乳腺癌樣品中超量表達(dá)的序列，檢測了BCZ4序列。BCZ4的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列如圖15，SEQIDNO.29(BCZ4cDNA)，和SEQIDNO.30(BCZ4氨基酸序列)所示。B.BCZ4乳腺癌抗原的免疫試劑合成了跨BCZ4基因產(chǎn)物的100種九聚物肽的文庫。根據(jù)它們潛在的結(jié)合HLA-A*0201的能力，選擇了肽。表XIII列出了來自測試的BCZ4蛋白的HLA-A*0201的100種九聚物肽表位(見下文)表XIIIBCZ4肽組C.BCZ4肽的免疫反應(yīng)性和人效應(yīng)物T細(xì)胞的生成用來自BCZ4抗原的不同的9-聚物肽的組刺激的自體樹突細(xì)胞(見表XIII中的列表)，活化了來自稱作AP10的HLA-A2.1陽性供體的人PBMC。12天后，用相同的各肽組另外刺激8-10天的自體CD40-配體-活化的B細(xì)胞，再次刺激活化的T細(xì)胞。再次重復(fù)第二次活化，達(dá)到共3次刺激。第三次刺激后，分離活化的T細(xì)胞，ELISPOT分析針對它們各自的所示BCZ4肽組的人IFN-γ生成(圖16A)。在圖16A中，藍(lán)條顯示了針對BCZ4肽組的反應(yīng)性，紅條是作為負(fù)對照的HLA-A2.1-結(jié)合HIV肽的。對于CMV，使用了陽性對照HLA-A2.1-結(jié)合回憶抗原肽，流感作為實(shí)驗(yàn)中的陽性對照。標(biāo)示了標(biāo)準(zhǔn)差。肽刺激另外一輪后，在活化的T細(xì)胞上重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，得到了類似的結(jié)果。使用IFN-γELISPOT實(shí)驗(yàn)，測試了肽組(圖16B)。用表XIII所示的不同的BCZ4肽的組，刺激了來自供體AP10的人T細(xì)胞。按照以前關(guān)于其它抗原所描述的，進(jìn)行了刺激。刺激了4和5個(gè)周期后，收獲T細(xì)胞，并用每個(gè)組中的各單個(gè)的肽進(jìn)行IFN-γ生產(chǎn)的ELISPOT分析。條柱顯示了每個(gè)特定組的各肽的反應(yīng)性。表XIII鑒定出了每種反應(yīng)性肽。另外刺激AP10供體T細(xì)胞一輪，重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，得到了類似的結(jié)果。除了ELISPOT分析外，測試了BCZ4肽活化的人T細(xì)胞，以確定它們作為CTL起作用的能力。使用肽-脈沖的樹突細(xì)胞活化了細(xì)胞，然后使用CD40配體-活化的B細(xì)胞(刺激5輪)。使用從HLA-A*0201+供體AP31分離的PBMC，進(jìn)行了所述的實(shí)驗(yàn)。使用肽-加載的T2細(xì)胞，在51Cr-釋放實(shí)驗(yàn)中測試了分離的T細(xì)胞。用單個(gè)的BCZ4肽脈沖的T2細(xì)胞，顯示了在細(xì)胞/靶比是10∶1時(shí)的％特異性裂解。觀察到了一些肽的高水平的細(xì)胞毒性(圖16C)。對照HIV肽誘導(dǎo)的CTL活性(％特異性裂解)一般＜10％。從能表達(dá)HLA-A*0201(AP10)的另一種PBMC供體得到了類似的結(jié)果。表XIV列出了各肽的反應(yīng)性表XIVD.BCZ4表達(dá)載體使用鉑Taq(Invitrogen)，使用稱作pSporty/BCZ4的質(zhì)粒作為模板，PCR擴(kuò)增了BCZ4。擴(kuò)增條件如下1)94℃2分鐘；2)35個(gè)循環(huán)94℃30秒，53℃30秒，67℃2.5分鐘；和3)67℃7分鐘。設(shè)計(jì)的PCR引物包含EcoRI限制位點(diǎn)，且直接側(cè)翼于ORF(即，沒有無關(guān)的序列)。引物序列如下AS032F(正向引物)5′GGAATTCAACATGGACATTGAAGCATATCTTGAAAGAATTG3′AS034R(反向引物)5′GGAATTCCTGGTGAGCTGGATGACAAATAGACAAGATTG3′。還將Kozak序列包含在正向引物中。用EcoRI切割了pcDNA3.1/Zeo(+)，并用CIP處理，以防止自連接。然后，將BCZ4擴(kuò)增子連接進(jìn)EcoRI消化的pcDNA3.1/Zeo(+)。對生成的一個(gè)克隆(AS-579-5)進(jìn)行測序，該克隆與表達(dá)的BCZ4序列相匹配。然后，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，從該表達(dá)載體表達(dá)了BCZ4蛋白。實(shí)施例9BFY3腫瘤抗原A.BFY3序列作為在乳腺癌樣品中超量表達(dá)的序列，檢測了BFY3序列。使用AS007F(正向引物)5′GGAATTCACCATGCTTTGGAAATTGACGGAT3′和AS010R(反向引物)5′GGAATTCCTCACTTTCTGTGCTTCTCCTCTTTGTCA3′，RT-PCR擴(kuò)增了BFY3w/EcoRI末端，其來自HTB131總RNA。用EcoRI切割了PCR產(chǎn)物，并通過連接，克隆進(jìn)EcoRI消化的和CIP處理的pcDNA3.1/Zeo(+)載體。通過限制性消化，識(shí)別出了幾個(gè)陽性克隆，AS-391-2的序列結(jié)果與預(yù)期的BFY3序列相匹配。BFY3的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列如圖17，SEQIDNO.31(BFY3cDNA)，和SEQIDNO.32(BFY3氨基酸序列)所示。B.BFY3乳腺癌抗原的免疫試劑合成了跨BFY3基因產(chǎn)物的100種九聚物肽的文庫。根據(jù)它們潛在的結(jié)合HLA-A*0201的能力，選擇了肽。表XV列出了來自測試的BFY3蛋白的HLA-A*0201的100種九聚物肽表位(見下文)表XV用于活化人T的BFY3肽組用來自BFY3抗原的不同的9-聚物肽的組脈沖的自體樹突細(xì)胞(見表1中的列表)，活化了來自稱作AP31的HLA-A2.1陽性供體的人PBMC。12天后，用相同的各肽組另外脈沖自體CD40-配體-活化的B細(xì)胞8-10天，再次刺激活化的T細(xì)胞。重復(fù)第二次活化2次，達(dá)到共4次刺激。第四次刺激后，分離活化的T細(xì)胞，ELISPOT分析針對它們各自的所述BFY3肽組的人IFN-γ生成(圖16A)。藍(lán)條顯示了針對BFY3肽組的反應(yīng)性，紅條是作為負(fù)對照的HLA-A2.1-結(jié)合HIV肽的。標(biāo)示了標(biāo)準(zhǔn)差。肽刺激不同輪后，在活化的T細(xì)胞上重復(fù)該實(shí)驗(yàn)2次，得到了類似的結(jié)果(圖18A)。使用IFN-γELISPOT實(shí)驗(yàn)，測試了BFY3肽組。用表XV所示的不同的BFY3肽組，刺激了來自供體AP10的人T細(xì)胞。按照以前關(guān)于其它抗原所描述的，進(jìn)行了刺激。刺激了4輪后，從每個(gè)培養(yǎng)物收獲T細(xì)胞，并用每個(gè)組中的各單個(gè)的肽進(jìn)行IFN-γ生產(chǎn)的ELISPOT分析。圖18B說明了對每個(gè)特定組的各肽的反應(yīng)性。除了ELISPOT分析外，測試了BFY3肽活化的人T細(xì)胞的反應(yīng)性。使用10個(gè)肽組，每個(gè)組10種肽，來生成CTL。使用這10組效應(yīng)物來殺傷用對應(yīng)的肽組脈沖的靶。發(fā)現(xiàn)能識(shí)別出來自組1，3，5，6，和7的肽，表明這些組中的肽能生成CTL(圖18C)。從這10組中，通過CTL明顯識(shí)別出了肽3344，3320，3378，2272，和3387(圖18D)?！暹m度識(shí)別出的″肽包括3369，3355，和3362(圖18D)。從由組1和3生成的CTL殺傷了用BFY3轉(zhuǎn)染了CosA2細(xì)胞，表明從這些組加工和呈遞的表位是免疫學(xué)上相關(guān)的(圖18E)。負(fù)責(zé)該細(xì)胞毒性的肽是3320和3344。表XVI總結(jié)了BFY3肽的性質(zhì)。表XVI免疫活性BFY3九聚物肽的總結(jié)C.BFY3表達(dá)載體為了構(gòu)建BFY3表達(dá)載體，使用AS007F(正向引物)5′GGAATTCACCATGCTTTGGAAATTGACGGAT3′和AS010R(反向引物)5′GGAATTCCTCACTTTCTGTGCTTCTCCTCTTTGTCA3′，RT-PCR擴(kuò)增了BFY3w/EcoRI末端，它來自HTB131總RNA。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，進(jìn)行了PCR。用EcoRI消化了擴(kuò)增產(chǎn)物，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過連接，將其克隆進(jìn)CIP處理的pcDNA3.1/Zeo(+)載體。通過限制性消化和測序，識(shí)別出了幾個(gè)陽性克隆。測序表明，克隆AS-391-2的序列與預(yù)期的BFY3序列相匹配。然后，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，從BFY3表達(dá)載體表達(dá)了BFY3蛋白。實(shí)施例10編碼多種腫瘤抗原的表達(dá)載體在某些情況下，需要構(gòu)建編碼多個(gè)腫瘤抗原的表達(dá)載體。已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)組合在單一表達(dá)載體中時(shí)，抗原的特定組合會(huì)包含許多患者在單一載體中的表達(dá)譜。例如，來自不同患者的乳腺癌樣品的一項(xiàng)研究表明，BFA4和BFA5的組合覆蓋了74％樣品的表達(dá)譜；BCY1和BFA5的組合覆蓋了65％樣品；BCZ4和BFA5的組合覆蓋了69％樣品；BFY3和BFA5的組合覆蓋了67％樣品；BCY1，BFA4和BFA5的組合覆蓋了78％樣品；BCZ4，BFA4和BFA5的組合覆蓋了81％樣品；和BFY3，BFA4，和BFA5的組合覆蓋了74％樣品。因此，可以構(gòu)建多抗原表達(dá)構(gòu)建體，從而可以使用單一載體，解決乳腺癌患者中最常見的表達(dá)譜。使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)，構(gòu)建了這樣的多抗原表達(dá)載體，將編碼每種腫瘤抗原序列的核酸放置在啟動(dòng)子或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列附近?？梢怨こ袒磉_(dá)載體，使得編碼腫瘤抗原的每種核苷酸序列可操作地連接到特定啟動(dòng)子上，或者將腫瘤抗原可操作地集中連接到單一啟動(dòng)子上，并作為單一表達(dá)單位進(jìn)行表達(dá)。當(dāng)構(gòu)建單一表達(dá)單位時(shí)，可以將用于在表達(dá)后分隔腫瘤抗原序列的核苷酸序列插入腫瘤抗原序列之間。有用的序列包括IRES序列、編碼與蛋白酶切割位點(diǎn)相對應(yīng)的氨基酸序列的核苷酸序列，等。合適的用于構(gòu)建這樣的多抗原表達(dá)載體的載體包括，例如，痘病毒例如牛痘，鳥痘，ALVAC和NYVAC。盡管已經(jīng)參考優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)明白，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能進(jìn)行變動(dòng)和修改。因此，所附的權(quán)利要求書意在包括屬于要求保護(hù)的發(fā)明范圍內(nèi)的所有這樣的等同變動(dòng)。序列表SEQIDNO.1AAC2-1核苷酸序列AGCAGGACCGGGGCCTGTGTCGCTATGGGTTCCCCCGCCGCCCCGGAGGGAGCGCTGGGCTACGTCCGCGAGTTCACTCGCCACTCCTCCGACGTGCTGGGCAACCTCAACGAGCTGCGCCTGCGCGGGATCCTCACTGACGTCACGCTGCTGGTTGGCGGGCAACCCCTCAGAGCACACAAGGCAGTTCTCATCGCCTGCAGTGGCTTCTTCTATTCAATTTTCCGGGGCCGTGCGGGAGTCGGGGTGGACGTGCTCTCTCTGCCCGGGGGTCCCGAAGCGAGAGGCTTCGCCCCTCTATTGGACTTCATGTACACTTCGCGCCTGCGCCTCTCTCCAGCCACTGCACCAGCAGTCCTAGCGGCCGCCACCTATTTGCAGATGGAGCACGTGGTCCAGGCATGCCACCGCTTCATCCAGGCCAGCTATGAACCTCTGGGCATCTCCCTGCGCCCCCTGGAAGCAGAACCCCCAACACCCCCAACGGCCCCTCCACCAGGTAGTCCCAGGCGCTCCGAAGGACACCCAGACCCACCTACTGAATCTCGAAGCTGCAGTCAAGGCCCCCCCAGTCCAGCCAGCCCTGACCCCAAGGCCTGCAACTGGAAAAAGTACAAGTACATCGTGCTAAACTCTCAGGCCTCCCAAGCAGGGAGCCTGGTCGGGGAGAGAAGTTCTGGTCAACCTTGCCCCCAAGCCAGGCTCCCCAGTGGAGACGAGGCCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGTGAAGAAGGACCCATTCCTGGTCCCCAGAGCAGGCTCTCTCCAACTGCTGCCACTGTGCAGTTCAAATGTGGGGCTCCAGCCAGTACCCCCTACCTCCTCACATCCCAGGCTCAAGACACCTCTGGATCACCCTCTGAACGGGCTCGTCCACTACCGGGAGTGAATTTTTCAGCTGCCAGAACTGTGAGGCTGTGGCAGGGTGCTCATCGGGGGCTGGACTCCTTGGTTCCTGGGGACGAAGACAAACCCTATAAGTGTCAGCTGTGCCGGTCTTCGTTCCGCTACAAGGGCAACCTTGCCAGTCACCGTACAGTGCACACAGGGGAAAAGCCTTACCACTGCTCAATCTGCGGAGCCCGTTTTAACCGGCCAGCAAACCTGAAAACGCACAGCCGCATCCATTCGGGAGAGAAGCCGTATAAGTGTGAGACGTGCGGCTCGCGCTTTGTACAGGTGGCACATCTGCGGGCGCACGTGCTGATCCACACCGGGGAGAAGCCCTACCCTTGCCCTACCTGCGGAACCCGCTTCCGCCACCTGCAGACCCTCAAGAGCCACGTTCGCATCCACACCGGAGAGAAGCCTTACCACTGCGACCCCTGTGGCCTGCATTTCCGGCACAAGAGTCAACTGCGGCTGCATCTGCGCCAGAAACACGGAGCTGCTACCAACACCAAAGTGCACTACCACATTCTCGGGGGGCCCTAGCTGAGCGCAGGCCCAGGCCCCACTTGCTTCCTGCGGGTGGGAAAGCTGCAGGCCCAGGCCTTGCTTCCCTATCAGGCTTGGGCATAGGGGTGTGCCAGGCCACTTTGGTATCAGAAATTGCCACCCTCTTAATTTCTCACTGGGGAGAGCAGGGGTGGCAGATCCTGGCTAGATCTGCCTCTGTTTTGCTGGTCANACCCTCTTCCCCACAAGCCAGATTGTTTCTGAGGAGAGAGCTAGCTAGGGGCTGGGAAAGGGGAGAGATTGGAGTCCTGGTCTCCCTAAGGGAATAGCCCTCCACCTGTGGCCCCCATTGCATTCAGTTTATCTGTAAAATATAATTTATTGAGGCCTTTGGGTGGCACCGGGGCCTTCATTCGATTGCATTTCCCACTCCCCTCTTCCACAAGTGTGATTAAAAGTGACCAGAAACACAGAAGGTGAGATCACAGCTCTGCTGGCAGAGATTACTAGCCCTTGGCTCTCTCGTTTGGCTTGGGTATTTTATATTATTTCTGTCATAACTTTTATCTTTAGAATTGTTCTTTCTCCTGTTTGTTTGCTTGTTAGTTTGTTTAAAATGGAAAAAGGGGTTCTCTGTGTTCTGCCCCTGTAATTCTAGGTCTGGAACCTTTATTTCTTCTAGGGCAGCTCTGGGAACATGCGGGATTGTGGAATTGGGTCAGGAACCCTCTCTGGTATTCTGGATGTTGTAGGTTCTCTAGCAGTCTAGAAATGGATACAGACATTTCTCTGTTCTTCAAGGGTGATAGGAACCATTATGTTGAGCCCAAAATGGAAGTAATAATAAATGCCTCCTGGAGGCTGTGGGTGTGGGGGATTCTGTATCTGGATTCCGTATCACTCCAACTGGAGGCTGTGGGTGTGGGGGATTCTGTATCTGGATTCCGTATCACTCCAAGTGGAGGCTGGCAGGTTTTTCTGCAAGATGGTCCAGAATCTAAAATGTCCCATTAATCTGGTCACTTGGGTTTGGCTCTGCTGTATCCATCTATAGTGGTAGAGACCCACCAGGGCTCAAGTGGAGTCCATCATCCTCCCACGGGGGCCTGTTCTTAGTACTGAGTTGATCGCTCCATGGGGGAGAGATCAGACATTCCTTATCAGAGATGATGTGACCTTTTCTGACTCTGCCCAGTCTCTATGAATGTTATGGCCTAGGGAAGAATCATGAAACTCTTTAGCTTGATTAGATGGTAAACAGTGTTAACCCATCCTTTACTACAGAGGCATATGGGTTTGAATGTTACCTGGGGTTCTCTCTATTGAGTTGAGCCCCTTCTTCCTTTAGTGGGTTTTGGACATCTTCTGGCAAGTGTCCAGATGCCAGAACCTTCTTTTCCTCTAGAAGGGATGGTGCTTGGTAACCTTACCTTTTAAAAGCTGGGTCTGTGACCTGGTCTTCCCATCCCTGCATTCCTGTCTGGAACCAGTGAATGCATTAGAACCTTCCATAGGAAAAGAAAAGGGGCTGAGTTCCATTCTGGGTTTGCTGTAGTTTGGTTGGGATTATTGTTGGCATTACAGATGTAAAAGATTGACTAGCCCATAGGCCAAAGGCCTGTTCTAGTTGACCAAGTTTCAAGTAGGATTAAGAGGTTGGTTGAGGGGTGCAGTTTCTGGTGTAGGCCAGGTAGGTAGAAAGTGAGGAACAGGGTTGCCTCTTGGCTGGGTGGAGTCTCTGAAATGTTAGAAGAAGCGCTGAAGCCTTGATTGATAGTTCTGCCCCTTGTTGCCCTGGGGCTTATCTGATTATGGGACGAGGGTAGAAAGTAAGAAGCACTTTTGAATTTGTGGGGTAGAACTTCAACAATAAGTCAGTTCTAGTGGCTGTCGCCTGGGGACTAGTGAGAAAGCTACTCTTCTCCCTCTTCCCTCTTTCTCCCCATGGCCCCACTGCAGAATTAAAGAAGGAAGAAGGGAAGGCGGAGGAGTCTATAAGAAGGAATCATGATTTCTATTTAGCAGATTGGATGGGCAGGTGGAGAATGCCTGGGGGTAGAAATGTTAGATCTTGCAACATCAGATCCTTGGAATAAAGAAGCCTCTCTGCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQIDNO.2AAC2-1氨基酸序列MGSPAAPEGALGYVREFTRHSSDVLGNLNELRLRGILTDVTLLVGGQPLRAHKAVLIACSGFFYSIFRGRAGVGVDVLSLPGGPEARGFAPLLDFMYTSRLRLSPATAPAVLAAATYLQMEHVVQACHRFIQASYEPLGISLRPLEAEPPTPPTAPPPGSPRRSEGHPDPPTESRSCSQGPPSPASPDPKACNNKKYKYIVLNSQASQAGSLVGERSSGQPCPQARLPSGDEASSSSSSSSSSSSEEGPIPGPQSRLSPTAATVQFKCGAPASTPYLLTSQAQDTSGSPSERARPLFGVNFSAARTVRLWQGAERGLDSLVPGDEDKPYKCQLCRSSFRYKGNLASHRTVHTGEKPYHCSICGARFNRPANLKTHSRIHSGEKPYKCETCGSRFVQVAHLRAHVLIHTGHKPYPCPTCGTRFRHLQTLKSHVRIHTGEKPYHCKPCGLHFRHKSQLRLHLRQKHGAATNTKVHYHILGGPSEQIDNO.3AAC2-2核苷酸序列TCTGCGTGTGCCGGGGCTAGGGGCTGGAAGTCCTGGCTCTAGTTGCACCTCGGAAGGAAAAGGCAAACAGAGGAGGGAAGGCGTCTTAGGACTGCCTGGATCCAGAGCACTTTCCTCGGCCTCTACAGGCCTGTGTCGCTATGGGTTCCCCCGCCGCCCCCGAGGGAGCGCTGGGCTACGTCCGCGAGTTCACTCGCCACTCCTCCGACGTGCTGGGCAACCTCAACGAGCTGCGCCTGCGCGGGATCCTCACTGACGTCACGCTGCTGGTTGGCGGGCAACCCCTCAGAGCACACAAGGCAGTTCTCATCGCCTGCAGTGGCTTCTTCTATTCAATTTTCCGGGGCCGTGCGGGAGTCGGGGTGGACGTGCTCTCTCTGCCCGGGGGTCCCGAAGCGAGAGGCTTCGCCCCTCTATTGGACTTCATGTACACTTCGCGCCTGCGCCTCTCTCCAGCCACTGCACCAGCAGTCCTAGCGGCCGCCACCTATTTGCAGATGGAGCACGTGGTCCAGGCATGCCACCGCTTCATCCAGGCCAGCTATGAACCTCTGGGCATCTCCCTGCGCCCCCTGGAAGCAGAACCCCCAACACCCCCAACGGCCCCTCCACCAGGTAGTCCCAGGCGCTCCGAAGGACACCCAGACCCACCTACTGAATCTCGAAGCTGCAGTCAAGGCCCCCCCAGTCCAGCCAGCCCTGACCCCAAGGCCTGCAACTGGAAAAAGTACRAGTACATCGTGCTAAACTCTCAGGCCTCCCAAGCAGGGAGCCTGGTCGGGGAGAGAAGTTCTGGTCAACCTTGCCCCCAAGCCAGGCTCCCCAGTGGAGACGAGGCCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGTGAAGAAGGACCCATTCCTGGTCCCCAGAGCAGGCTCTCTCCAACTGCTGCCACTGTGCAGTTCAAATGTGGGGCTCCAGCCAGTACCCCCTACCTCCTCACATCCCAGGCTCAAGACACCTCTGGATCACCCTCTGAACGGGCTCGTCCACTACCGGGAAGTGAATTTTTCAGCTGCCAGAACTGTGAGGCTGTGGCAGGGTGCTCATCGGGGCTGGACTCCTTGGTTCCTGGGGACGAAGACAAACCCTATAAGTGTCAGCTGTGCCGGTCTTCGTTCCGCTACAAGGGCAACCTTGCCAGTCATCGTACAGTGCACACAGGGGAAAAGCCTTACCACTGCTCAATCTGCGGAGCCCGTTTTAACCGGCCAGCAAACCTGAAAACGCACAGCCGCATCCATTCGGGAGAGAAGCCGTATAAGTGTGAGACGTGCGGCTCGCGCTTTGTACAGGTGGCACATCTGCGGGCGCACGTGCTGATCCACACCGGGGAGAAGCCCTACCCTTGCCCTACCTGCGGAACCCGCTTCCGCCACCTGCAGACCCTCAAGAGCCACGTTCGCATCCACACCGGAGAGAAGCCTTACCACTCCCACCCCTGTGGCCTGCATTTCCGGCACAAGAGTCAACTGCGGCTGCATCTGCGCCAGAAACACGGAGCTGCTACCAACACCAAAGTGCACTACCACATTCTCGGGGGGCCCTAGCTGAGCGCAGGCCCAGGCCCCACTTGCTTCCTGCGGGTGGGAAAGCTGCAGGCCCAGGCCTTGCTTCCCTATCAGGCTTGGGCATAGGGGTGTGCCAGGCCACTTTGGTATCAGAAATTGCCACCCTCTTAATTTCTCACTGGGGAGAGCAGGGGTGGCAGATCCTGGCTAGATCTGCCTCTGTTTTGCTGGTCAAAACCTCTTCCCCACAAGCCAGATTGTTTCTGAGGAGAGAGCTAGCTAGGGGCTGGGAAAGGGGAGAGATTGGAGTCCTGGTCTCCCTAAGGGAATAGCCCTCCACCTGTGGCCCCCATTGCATTCAGTTTATCTGTAAATATAATTTATTGAGGCCTTTGGGTGGCACCGGGGCCTTCATTCGATTGCATTTCCCACTCCCCTCTTTCACAAGTGTGATTAAAAGTGACCAGAAACACAGAAGGTGAGATCACAGCTCTGCTGGCAGAGATTACTAGCCCTTGGCTCTCTCGTTTGGCTTGGGTATTTTATATTATTTCTGTCATAACTTTTATCTTTAGAATTGTTCTTTCTCCTGTTTGTTTGCTTGTTAGTTTGTTTAAAATGGAAAAAGGGGTTCTCTGTGTTCTGCCCCTGTAATTCTAGGTCTGGAACCTTTATTTGTTCTAGGGCAGGTCTGGGAACATGCGGGATTGTGGAATTGGGTCAGGAACCCTCTCTGGTATTCTGGATGTTGTAGGTTCTCTAGCAGTCTAGAAATGGATACAGACATTTCTCTGTTCTTCAAGGGTGATAGGAACCATTATGTTGAGCCCAAAATGGAAGTAATAATAAATGCCTCCTGGAGGCTGTGGGTGTGGGGGATTCTGTATCTGGATTCCGTATCACTCCAACTGGAGGCTGTGGGTGTGGGGGATTCTGTATCTGGATTCCGTATCACTCCAAGTGGAGGCTGGCAGGTTTTTCTGCAAGATGGTCCAGAATCTAAAATGTCCCATTAATCTGGTCACTTGGGTTTGGCTCTGCTGTATCCATCTATAGTGGTAGAGACCCACCAGGGCTCAAGTGGAGTCCATCATCCTCCCACGGGGGCCTGTTCTTAGCACTGAGTTGATCGCTCCATGGGGGAGAGATCAGACATTCCTTATCAGAGATGATGTGACCTTTTCTGACTCTCCCCAGTCTCTATGAATGTTATGGCCTAGGGAAGAATCATGAAACTCTTTAGCTTGATTAGATGGTAAACAGTGTTAACCCATCCTTTACTACAGAGGCATATGGGTTTGAATGTTACCTGGGGTTCTCTCTATTGAGTTGAGCCCCTTCTTCCTTTAGTGGGTTTTGGACATCTTCTGGCAAGTGTCCAGATGCCAGAACCTTCTTTTCCTCTAGAAGGGATGGTGCTTGGTAACCTTACCTTTTAAAAGCTGGGTCTGTGACCTGGTCTTCCCATCCCTGCATTCCTGTCTGGAACCAGTGAATGCATTAGAACCTTCCATAGGAAAAGAAAAGGGGCTGAGTTCCATTCTGGGTTTGCTGTAGTTTGGTTGGGATTATTGTTGGCATTACAGATGTAAAAGATTGACTAGCCCATAGGCCAAAGGCCTGTTCTAGTTGACCAAGTTTCAAGTAGGATTAAGAGGTTGGTTGAGGGGTGCAGTTTCTGGTGTAGGCCAGGTAGGTAGAAAGTGAGGAACAGGGTTGCCTCTTGGCTGGGTGGAGTCTCTGAAATGTTAGAAGAAGCGCTGAAGCCTTGATTGATAGTTCTGCCCCTTGTTGCCCTGGGGCTTATCTGATTATGGGACGAGGGTAGAAAGTAAGAAGCACTTTTGAATTTGTGGGGTAGAACTTCAACAATAAGTCAGTTCTAGTGGCTGTCGCCTGGGGACTAGTGAGAAAGCTACTCTTCTCCCTCTTCCCTCTTTCTCCCCATGGCCCCACTGCAGAATTAAAGAAGGAAGAAGGGAAGGGGGAGGAGTCTATAAGAAGGAATCATGATTTCTATTTAGCAGATTGGATGGGCAGGTGGAGAATGCCTGGGGGTAGAAATGTTAGATCTTGCTACATCAGATCCTTGGAATAAAGAAGCCTCTCTGYGCWRAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQIDNO.4AAC2-2開放讀碼框ATGGGTTCCCCCGCCGCCCCGGAGGGAGCGCTGGGCTACGTCCGCGAGTTCACTCGCCACTCCTCCGACGTGCTGGGCAACCTCAACGAGCTGCGCCTGCGCGGGATCCTCACTGACGTCACGCTGCTGGTTGGCGGGCAACCCCTCAGAGCACACAAGGCAGTTCTCATCGCCTGCAGTGGCTTCTTCTATTCAATTTTCCGGGGCCGTGCGGGAGTCGGGGTGGACGTGCTCTCTCTGCCCGGGGGTCCCGAAGCGAGAGGCTTCGCCCCTCTATTGGACTTCATGTACACTTCGCGCCTGCGCCTCTCTCCAGCCACTGCACCAGCAGTCCTAGCGGCCGCCACCTATTTGCAGATGGAGCACGTGGTCCAGGCATGCCACCGCTTCATCCAGGCCAGCTATGAACCTCTGGGCATCTCCCTGCGCCCCCTGGAAGCAGAACCCCCAACACCCCCAACGGCCCCTCCACCAGGTAGTCCCAGGCGCTCCGAAGGACACCCAGACCCACCTACTGAATCTCGAAGCTGCAGTCAAGGCCCCCCCAGTCCAGCCAGCCCTGACCCCAAGGCCTGCAACTGGAAAAAGTACAAGTACATCGTGCTAAACTCTCAGGCCTCCCAAGCAGGGAGCCTGGTCGGGGAGAGAAGTTCTGGTCAACCTTGCCCCCAAGCCAGGCTCCCCAGTGGAGACGAGGCCTCCAGCAGCAGCAGCAGGAGCAGCAGCAGCAGTGAAGAAGGACCCATTCCTGGTCCCCAGAGCAGGCTCTCTCCAACTGCTGCCACTGTGCAGTTCAAATGTGGGGCTCCAGCCAGTACCCCCTACCTCCTCACATCCCAGGCTCAAGACACCTCTGGATCACCCTCTGAACGGGCTCGTCCACTACCGGGAAGTGAATTTTTCAGCTGCCAGAACTGTGAGGCTGTGGCAGGGTGCTCATCGGGGCTGGACTCCTTGGTTCCTGGGGACGAAGACAAACCCTATAAGTGTCAGCTGTGCCGGTCTTCGTTCCGCTACAAGGGCAACCTTGCCAGTCATCGTACAGTGCACACAGGGGAAAAGCCTTACCACTGCTCAATCTGCGGAGCCCGTTTTAACCGGCCAGCAAACCTGAAAACGCACAGCCGCATCCATTCGGGAGAGAAGCCGTATAAGTGTGAGACGTGCGGCTCGCGCTTTGTACAGGTGGCACATCTGCGGGCGCACGTOCTGATCCACACCGGGGAGAACCCCTACCCTTGCCCTACCTGCGGAACCCGCTTCCGCCACCTGCAGACCCTCAAGAGCCACGTTCGCATCCACACCGGAGAGAAGCCTTACCACTGCGACCCCTGTGGCCTGCATTTCCGGCACAAGAGTCAACTGCGGCTGCATCTGCGCCAGAAACACGGAGCTGCTACCAACACCAAAGTGCACTACCACATTCTCGGGGGGCCCTAGSEQIDNO.5AAC2-2氨基酸序列MGSPAAPEGALGYVREFTRHSSDVLGNLNELRLRGILTDVTLLVGGQPLRAHCAVLIACSGSPYSIFRGRAGVGVDVLSLPGGPEARGFAPLLDFMYTSRLRLBPATAPAVLAAATTLQMEHVVQACHRFIQASYPPLGISLRPLEAEPPTPPTAFFPGSPRRSEGHPDPPTESRSCSQGPPSPASPDPKACNNKKYKYIVLNSQASQAGSLVGERSEGQPCPQARLPSGDEASSSSSSSSSSSHEGPIPGPQSRLSPTAATVQFKCGAPASTPYLLTSQAQDTSGSPSERARPLPGSEFFSCQNCEAVAGCSSGLDSLVPGDRDKPYKCQLCRSSFRYKGNLASHRTVHTGEKPYHCSICGARFNRPANLKTHSRIHSGEKPYKCBTCGSRVVQVAHLRAHVLIHTGEKPYPCPTCGTRFRHLQTLKSHVRIHTGEKPYHCDPCGLHFRHKSQLRLHLRQKHGAATNTKVHYHILGGPSEQIDNO.6AAC2-2正向引物CACCATGGGTTCCCCCGCCGCCCCGGASEQIDNO.7AAC2-2反向引物CTAGGGCCCCCCGAGAATGTGGTAGTGCACTTTSEQIDNO.3；7524ATACCCGGAACTCCCTAAGCCTTCTATTAGCTCCAATAATAGTAAGCCTGTCGAAGACAAAGATGSEQIDNO.4；7526GCCTGTGTCCCCTAGACTCCAACTCAGCAACGGAAATAGAACTCTGACCCTGTTTAACGTGACCAGGAACSEQIANO.5；7528ACGTGCTTTACGGACCCGATGCTCCTACAATCAGCCCTCTAAACACAAGCTATAGATCAGGGGAAAATCTSEQIDNO.6；7533ACGTTAAACAGGGTCAGAGTTCTATTTCCGTTGCTGAGTTGGAGTCTAGGGGACACAGGCAGGGACTGGTSEQIDNO.7；7535CTGATCTATAGCTTGTGTTTAGAGGGCTGATTGTAGGAGCATCGGGTCCGTAAAGCACGTTGAGAATCACSEOIDNO.8；7537GATCCACTATTGTTCACGGTAATATTGGGAATGAACAGTTCCTGGGTGGACTGTTGGAAAGTGSEOIDNO.9；7567QACACAGCAAGCTACAAATGCGAAACCCAAAATCCAGTCAGCGCCAGGAGGTCTGATTCAGTGATTCTCASEQIDNO.10；7568TGAATCAGACCTCCTGGCGCTGACTGGATTTTGGGTTTCGCATTTGTAGCTTGCTGTGTCGTTCCTGGTCSEQIDNO.11；7576GATCCTACACGTGCCAAGCTCACAATAGCGACACCGGACTCAACCGCACAACCGTGACGACGATTACCGTGTATGCCGASEQIDNO.12；7587CATCCTCAACTGGGTTAGAATTGTTACTAGTTATGAATGGTTTTGGTGGCTCGGCATACACGGTAATCGTSEQIDNO.13；7677TTCTAACCCAGTTGAGGATGAGGACGCAGTTGCATTAACTTGTGAGCCAGAGATTCAAAATACCACTTATTTATGGTGGGSEQIDNO.14；7678GTCTAATGATAACCGCACATTGACACTCCTGTCCGTTACTCGCAATGATGTAGGACCTTATGAGTGTGGCATTCAGAATGSEQIDNO.15；7679TTTGTATGGCCCAGACGACCCAACTATATCTCCATCATACACCTACTACCGTCCCGGCGTGAACTTGAGCCTTTCTTGCCSEQIDNO.16；7680TGATGGAAACATTCAGCAGCATACTCAAGAGTTATTTATAAGCAACATAACTGAGAAGAACAGCGGACTCTATACTTGCCSEQIDNO.17；7681TAAAACAATAACTGTTTCCGCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGSEQIDNO.18；7682ATGTGCGGTTATCATTAGACAACTGCAAGCGTGGGCTAACCGGCAAACTTTGGTTATTGACCCACCATAAATAAGTGGTASEQIDNO.19；7683GGTCGTCTGGGCCATACAAAACATTAAGGATAACAGGGTCGGAGTGATCAACGGATAATTCATTCTGAATGCCACACTCASEQIDNO.20；7684GCTGCTGAATGTTTCCATCAATCAGCCAGGAGTACTGTGCAGGGGGGTTGGATGCTGCATGGCAAGAAAGGCTCAAGTTCSEQIDNO.21；7685CGGAAACAGTTATTGTTTTAACTGTAGTCCTGCTGTGACCACTGGCTGAGTTATTGGCCTGGCAAGTATAGAGTCCGCTGSEQIDNO.22；7686CCTCAGGTTCACAGGTGAAGGCCACAGCATCCTTGTCCTCCACGGGTSEQIDNO.23；EFA4CDNAATGGTCCGGAAAAAGAACCCCCCTCTGAGAAACGTTGCAAGTGAAGGCGAGGGCCAGATCCTGGAGCCTATAGGTACAGAAAGCAAGGTATCTGGAAAGAACAAAGAATTCTCTGCAGATCAGATGTCAGAAAATACGGATCAGAGTGATGCTGCAGAACTAAATCATAAGGAGGAACATAGCTTGCATGTTCAAGATCCATCTTCTAGCAGTAAGAAGGACTTGAAAAGCGCAGTTCTGAGTGAGAAGGCTGGCTTCAATTATGAAAGCCCCAGTAAGGGAGGAAACTTTCCCTCCTTTCCGCATGATGAGGTGACAGACAGAAATATGTTGGCTTTCTCATTTCCAGCTGCTGGGGGAGTCTGTGAGCCCTTGAAGTCTCCGCAAAGAGCAGAGGCAGATGACCCTCAAGATATGGCCTGCACCCCCTCAGGGGACTCACTGGAGACAAAGGAAGATCAGAAGA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.29或SEQIDNO.31所述的核酸序列；編碼SEQIDNO.30或SEQIDNO..32所述的氨基酸序列的核酸序列；或其片段。2.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中載體是質(zhì)粒或病毒載體。3.權(quán)利要求2的表達(dá)載體，其中病毒載體選自痘病毒，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，和腺伴隨病毒。4.權(quán)利要求3的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒牛痘，NYVAC，鳥痘，金絲雀痘，ALVAC，ALVAC(2)，禽痘，和TROVAC。5.權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒NYVAC，ALVAC，和ALVAC(2)。6.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，還包含至少一種其它的腫瘤相關(guān)抗原。7.權(quán)利要求6的表達(dá)載體，其中載體是質(zhì)?；虿《据d體。8.權(quán)利要求7的表達(dá)載體，其中病毒載體選自痘病毒，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，和腺伴隨病毒。9.權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒牛痘，NYVAC，鳥痘，金絲雀痘，ALVAC，ALVAC(2)，禽痘，和TROVAC。10.權(quán)利要求9的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒NYVAC，ALVAC，和ALVAC(2)。11.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，還包含至少一種編碼血管發(fā)生相關(guān)抗原的核酸序列。12.權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其中載體是質(zhì)?；虿《据d體。13.權(quán)利要求12的表達(dá)載體，其中病毒載體選自痘病毒，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，和腺伴隨病毒。14.權(quán)利要求13的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒牛痘，NYVAC，鳥痘，金絲雀痘，ALVAC，ALVAC(2)，禽痘，和TROVAC。15.權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒NYVAC，ALVAC，和ALVAC(2)。16.權(quán)利要求6的表達(dá)載體，還包含至少一種編碼血管發(fā)生相關(guān)抗原的核酸序列。17.權(quán)利要求16的表達(dá)載體，其中載體是質(zhì)粒或病毒載體。18.權(quán)利要求17的表達(dá)載體，其中病毒載體選自痘病毒，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，和腺伴隨病毒。19.權(quán)利要求17的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒牛痘，NYVAC，鳥痘，金絲雀痘，ALVAC，ALVAC(2)，禽痘，和TROVAC。20.權(quán)利要求18的痘病毒，其中病毒載體是選自下組的痘病毒NYVAC，ALVAC，和ALVAC(2)。21.權(quán)利要求1，6，11或16的表達(dá)載體，還包含至少一種編碼共刺激組分的核酸序列。22.權(quán)利要求22的表達(dá)載體，其中載體是質(zhì)?；虿《据d體。23.權(quán)利要求23的表達(dá)載體，其中病毒載體選自痘病毒，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，和腺伴隨病毒。24.權(quán)利要求24的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒牛痘，NYVAC，鳥痘，金絲雀痘，ALVAC，ALVAC(2)，禽痘，和TROVAC。25.權(quán)利要求18的痘病毒，其中病毒載體是選自下組的痘病毒NYVAC，ALVAC，和ALVAC(2)。26.組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體中的表達(dá)載體，所述的載體包含SEQIDNO.29或SEQIDNO.31所述的核酸序列；編碼SEQIDNO.30或SEQIDNO.32所述的氨基酸序列的核酸序列；或其片段。27.權(quán)利要求26的表達(dá)載體，其中載體是質(zhì)?；虿《据d體。28.權(quán)利要求27的表達(dá)載體，其中病毒載體選自痘病毒，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，和腺伴隨病毒。29.權(quán)利要求28的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒牛痘，NYVAC，鳥痘，金絲雀痘，ALVAC，ALVAC(2)，禽痘，和TROVAC。30.權(quán)利要求29的痘病毒，其中病毒載體是選自下組的痘病毒NYVAC，ALVAC，和ALVAC(2)。31.預(yù)防或治療癌癥的方法，包括給宿主施用表達(dá)載體，其包含SEQIDNO.29或SEQIDNO.31所述的核酸序列；編碼SEQIDNO.30或SEQIDNO.32所述的氨基酸序列的核酸序列；或其片段。32.權(quán)利要求31的表達(dá)載體，其中載體是質(zhì)?；虿《据d體。33.權(quán)利要求32的表達(dá)載體，其中病毒載體選自痘病毒，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，和腺伴隨病毒。34.權(quán)利要求33的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒牛痘，NYVAC，鳥痘，金絲雀痘，ALVAC，ALVAC(2)，禽痘，和TROVAC。35.權(quán)利要求34的痘病毒，其中病毒載體是選自下組的痘病毒NYVAC，ALVAC，和ALVAC(2)。36.從表XV或XVI所示的BFY3衍生的分離的肽。37.對宿主進(jìn)行針對腫瘤抗原BFY3的免疫的方法，包括給患者單獨(dú)地或與另一種試劑組合地施用表XV或XVI所示的肽，其中組合中的各組分是同時(shí)地或彼此分開地施用。38.從表XV或XVI所示的BFY3衍生的分離的肽。39.對宿主進(jìn)行針對腫瘤抗原BFY3的免疫的方法，包括給患者單獨(dú)地或與另一種試劑組合地施用表XV或XVI所示的肽，其中組合中的各組分是同時(shí)地或彼此分開地施用。40.從表XIII或XVI所示的BCZ4衍生的分離的肽。41.對宿主進(jìn)行針對腫瘤抗原BCZ4的免疫的方法，包括給患者單獨(dú)地或與另一種試劑組合地施用表XIII或XIV所示的肽，其中組合中的各組分是同時(shí)地或彼此分開地施用。42.從表XIII或XVI所示的BCZ4衍生的分離的肽。43.對宿主進(jìn)行針對腫瘤抗原BCZ4的免疫的方法，包括給患者單獨(dú)地或與另一種試劑組合地施用表XIII或XVI所示的肽，其中組合中的各組分是同時(shí)地或彼此分開地施用。44.用于表達(dá)多種腫瘤抗原或其片段的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含至少兩種編碼至少兩種不同腫瘤抗原或其片段的核酸序列，該腫瘤抗原選自BFA4，BCY1，BFA5，BCZ4，和BFY3。45.用于表達(dá)多種腫瘤抗原或其片段的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含至少兩種編碼至少兩種不同腫瘤抗原或其片段的核酸序列，該核酸序列選自SEQIDNO.23，SEQIDNO.25，SEQIDNO.27，SEQIDNO.29，和SEQIDNO.31。46.權(quán)利要求44或45的表達(dá)載體，其中載體是質(zhì)?；虿《据d體。47.權(quán)利要求46的表達(dá)載體，其中病毒載體選自痘病毒，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，和腺伴隨病毒。48.權(quán)利要求47的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒牛痘，NYVAC，鳥痘，金絲雀痘，ALVAC，ALVAC(2)，禽痘，和TROVAC。49.權(quán)利要求48的表達(dá)載體，其中病毒載體是選自下組的痘病毒NYVAC，ALVAC，和ALVAC(2)。50.權(quán)利要求44至49中的任一項(xiàng)的表達(dá)載體，還包含至少一種編碼共刺激組分的核酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及編碼多肽的核酸，和核酸或多肽在預(yù)防和/或治療癌癥中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于插入和表達(dá)編碼腫瘤抗原的外來基因的載體，所述的載體用于免疫治療性處理癌癥。文檔編號(hào)A61K39/00GK1910198SQ200480020256公開日2007年2月7日申請日期2004年5月15日優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日發(fā)明者N·貝林斯泰因,S·加利錢,C·羅維特,M·帕林頓,L·拉萬伊,D·辛－桑胡申請人:圣諾菲·帕斯圖爾公司