專(zhuān)利名稱(chēng)：Mage腫瘤排斥抗原前體衍生的與hla-a2分子形成復(fù)合物的分離肽的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本發(fā)明是1994年8月15日申請(qǐng)的序列號(hào)08/290,381的部分繼續(xù)申請(qǐng)，后者是1994年6月17日申請(qǐng)的序列號(hào)08/261,160的部分繼續(xù)申請(qǐng)，而08/261,160又是1994年3月24日申請(qǐng)的序列號(hào)07/217,186的部分繼續(xù)申請(qǐng)，本案要求所有申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，所有這些申請(qǐng)引入本文作參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及免疫遺傳學(xué)與肽化學(xué)。特別地，它涉及到肽類(lèi)，尤其是應(yīng)用于各種方式，包括作為免疫原和HLA-A2分子配位體使用的十肽和九肽。更特別地，它涉及到一種稱(chēng)作“腫瘤排斥抗原”的，來(lái)自于腫瘤排斥抗原前體的。并且被HLA-A2分子所呈遞的肽。
有關(guān)癌細(xì)胞被宿主有機(jī)體識(shí)別或是這種識(shí)別作用的喪失的研究已在許多不同的方向上開(kāi)展起來(lái)。對(duì)該領(lǐng)域的了解意味著對(duì)基礎(chǔ)的免疫學(xué)及腫瘤學(xué)的一些了解。
在小鼠腫瘤方面的早期研究揭示出，這些被呈遞的分子能夠在把腫瘤細(xì)胞移植到同源動(dòng)物體內(nèi)時(shí)導(dǎo)致對(duì)這些腫瘤細(xì)胞的排斥作用。這些分子被受體動(dòng)物的T-細(xì)胞“識(shí)別”，喚起一種細(xì)胞溶解性T-細(xì)胞反應(yīng)，將移植的細(xì)胞溶解。這一證據(jù)的第一次獲得是在體外用化學(xué)致癌物質(zhì)，例如甲基膽蒽誘發(fā)的腫瘤中。后來(lái)發(fā)現(xiàn)由腫瘤所表達(dá)的能引起T-細(xì)胞反應(yīng)的抗原在每種腫瘤中是不同的。見(jiàn)以下有關(guān)講授用化學(xué)致癌物誘發(fā)腫瘤及細(xì)胞表面抗原差異的文獻(xiàn)Prehn，etal.，J.Natl.Canc.Inst.18769-778(1957)；Klein et al.，Cancer Res.201561-1572(1960)；Gross，Cancer Res.3326-333(1943)；Basombrio，Cancer Res.302458-2462(1970)。這一類(lèi)抗原后來(lái)被稱(chēng)作“腫瘤特異性移植抗原”或“TSTAS”。在觀察到當(dāng)用化學(xué)致癌物誘導(dǎo)時(shí)這類(lèi)抗原的存在以后，當(dāng)在體外通過(guò)紫外照射誘發(fā)腫瘤時(shí)也得到了類(lèi)似的結(jié)果。見(jiàn)Kripke，J.Natl.Canc.Inst.53333-1336(1974)。
當(dāng)在上述類(lèi)型的腫瘤中觀察到T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)時(shí)，自發(fā)性腫瘤通常被認(rèn)為是非免疫原性的。因而相信在這些腫瘤攜帶者體內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)能引起針對(duì)這些腫瘤的反應(yīng)的抗原。見(jiàn)Hewitt，et al.，Brit.J.Cancer 33241-259(1976)。
tum-抗原呈遞細(xì)胞株家族是通過(guò)誘變小鼠腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株而得到的致免疫性突變體，如Boon et al.，J.Exp.Med.1521184-1193(1980)所述，該文獻(xiàn)引入本文作參考。為了驗(yàn)證，通過(guò)突變?cè)谕葱∈笾胁划a(chǎn)生免疫應(yīng)答并將形成腫瘤的腫瘤細(xì)胞(即“tum-”細(xì)胞)而獲得tum-抗原。當(dāng)這些tum+細(xì)胞被誘變時(shí)，它們被同源小鼠排斥，不能形成腫瘤(因而叫“tum-”)。見(jiàn)Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74272(1977)(引入本文作參考)許多種類(lèi)型的腫瘤已被發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出這種現(xiàn)象。見(jiàn)Frost etal.，Cancer Res.43125(1983)。
因?yàn)閠um-突變體能產(chǎn)生一個(gè)免疫排斥過(guò)程，因而它們似乎不能形成進(jìn)行性的腫瘤。支持該假說(shuō)的證據(jù)包括，不能以正常方式形成腫瘤的“tum-”腫瘤突變體，在其免疫系統(tǒng)被亞致死量射線處理抑制過(guò)的小鼠中又恢復(fù)了形成腫瘤的能力。見(jiàn)Van Pel et al.，Proc.Natl.AcadSci.USA 765282-5285(1979)。還包括觀察到的腹腔注射的肥大細(xì)胞瘤P815 tum-細(xì)胞在以指數(shù)級(jí)數(shù)增殖12-15天后，在注入淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞僅僅幾天后就消失了。(Uyttenhove et al.J.Exp.Med.1521175-1183，1980)。更多的證據(jù)包括觀察到小鼠獲得了一種免疫記憶，這樣使得它們能抵抗隨后的同種tum-突變體的攻擊，即使是在給予同種tum-突變體之前給予免疫抑制量的射線時(shí)。見(jiàn)Boon et al.，Proc Natl Acad.Sci.USA 74272-275(1977)；Van Pel etal.，supra；Uyttenhove et al.，supra。
后期的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自發(fā)性腫瘤易被誘變時(shí)，就生產(chǎn)出能引起反應(yīng)的致免疫性突變體。確實(shí)，這些突變體能夠引發(fā)一種針對(duì)原始腫瘤的免疫保護(hù)性反應(yīng)。見(jiàn)Van Pel et al.，J.Exp.Med.1571992-2001(1983).由此可見(jiàn)在腫瘤中引起作為同源排斥反應(yīng)的靶的物的“腫瘤排斥抗原”的呈遞是可能的。在外源基因轉(zhuǎn)染到自發(fā)性腫瘤中時(shí)也得到了類(lèi)似的結(jié)果。見(jiàn)Fearon et al.，Cancer Res.482975-1980(1988)。
已經(jīng)辯認(rèn)出一種抗原，它被呈遞于腫瘤細(xì)胞的表面，并被細(xì)胞溶解性T細(xì)胞所識(shí)別，從而導(dǎo)致溶解。后文中將把這類(lèi)抗原稱(chēng)作“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRAs可能也可能不會(huì)引起抗體反應(yīng)。有關(guān)這些抗原的進(jìn)一步的研究是通過(guò)體外的細(xì)胞溶解性T細(xì)胞特征研究，例如通過(guò)特定細(xì)胞溶解性T細(xì)胞亞系(后文中稱(chēng)之為“CTL”)對(duì)抗原的鑒定的研究而進(jìn)行的。該亞系在識(shí)別被呈遞的腫瘤排斥抗原后增殖，呈遞抗原的細(xì)胞被溶解。特征性研究已經(jīng)鑒別出特異性裂解表達(dá)該抗原的細(xì)胞的CTL克隆。這些工作的實(shí)例可見(jiàn)Levy et al.，Adv.Cancer Res.241-59(1977)；Boon et al.，J.Exp.Med.1521184-1193(1980)；Brunner et al.J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol 126406-412(1982)；Palladino et al.，Canc.Res.475074-5079(1987)。其它類(lèi)型的被CTLS識(shí)別的抗原也要求進(jìn)行這類(lèi)分析，包括次要組織相容性抗原，雄性特異性H-Y抗原，以及在此討論的被認(rèn)為是“tum-”抗原的抗原。
以上所述的腫瘤的一個(gè)范例是P185。見(jiàn)Deplaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852274-2278(1988)；Szikora et al.，EMBO J.91041-1050(1990)，以及Sibille et al.，JExp.Med.17235-45(1990)，所述文獻(xiàn)引入本文作參考。P815腫瘤是一種肥大細(xì)胞瘤，用甲基膽蒽在DBA/2小鼠中誘發(fā)，并以體外腫瘤及細(xì)胞株形式培養(yǎng)。P815株經(jīng)過(guò)誘變后產(chǎn)生許多tum-突變體，包括P91A(Deplaen，supra)，35B(Szikora，supra)以及P198(Sibille，supra)突變體。與腫瘤排斥抗原形成對(duì)照的是-并且這是一個(gè)關(guān)鍵性的差別-tum-抗原僅僅在腫瘤細(xì)胞被誘變后才呈遞。腫瘤排斥抗原呈遞于給定的無(wú)須誘變的腫瘤細(xì)胞。因此，一種細(xì)胞株可以是tum+的，例如稱(chēng)作P1的株，也能夠被引發(fā)而產(chǎn)生tum-突變體。由于tum-的表型與其父代細(xì)胞株有差異，因此可以預(yù)期這兩種細(xì)胞株的DNA也會(huì)有差別，這種差別就可以被開(kāi)發(fā)來(lái)在tum-細(xì)胞中定位感興趣的基因。其結(jié)果是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)tum-突變體，例如P91A，35B和P198，其基因與其正常等位基因的差別在于基因的編碼區(qū)域發(fā)生了點(diǎn)突變。見(jiàn)Szikoraand Sibille，supra，以及Lurquin et al.，Cell 58293-303(1989)。已證明本發(fā)明的TRAs不是這種情況。這些文獻(xiàn)還闡明了衍生于tum-抗原的肽為了被CTLs識(shí)別而被Ld分子呈遞。P91A被Ld呈遞。P35被Dd以及P198被Kd所呈遞。
于1992年5月22日申請(qǐng)的PCT申請(qǐng)PCT/US92/04354，講授了一個(gè)人的腫瘤排斥抗原前體編碼基因家族，稱(chēng)作MAGE家族。這些基因中的幾個(gè)還在以下文獻(xiàn)中討論過(guò)Van der Bruggen et al.，Science 2541643(1991)。另外參見(jiàn)USP5,342,774，作為公開(kāi)MAGE基因的文獻(xiàn)引入本文作參考?，F(xiàn)已清楚MAGE家族的各種基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并可作為診斷這種腫瘤的標(biāo)記，并用于該文討論的各種應(yīng)用。另外參見(jiàn)Traversari et al.，Immunogenetics 35145(1992)；Van der Bruggen et al.，Science 2541643(1991)。有關(guān)某蛋白質(zhì)被修飾及其在細(xì)胞表面呈遞的機(jī)制現(xiàn)在已得到很好的證明。對(duì)該領(lǐng)域發(fā)展的粗略的了解可參看Barinaga“Getting Some‘Backbone’How MHC Binds Peptides”，Science 257880(1992)；Fremont et al.，Science 257919(1992)；Matsumura etal.，Science 257927(1992)，Latron etal.，Science 257964(1992)。這些文獻(xiàn)普遍地指出的一個(gè)要求是，這些結(jié)合到MHC/HLA分子的肽長(zhǎng)度為9個(gè)氨基酸(一種“九肽”)，而且九肽的第一個(gè)和第九個(gè)殘基很重要。如此處所述，若這一“規(guī)則”普遍正確，則MHC-I類(lèi)分子能結(jié)合的肽類(lèi)的長(zhǎng)度還有一些余地。
有關(guān)MAGE家族基因的研究現(xiàn)已揭示出，在一些腫瘤細(xì)胞的表面確實(shí)呈遞著某特定的九肽，而且要求呈遞分子是HLA-A1。MAGE-1腫瘤排斥抗原(TRAs或九肽)復(fù)合物導(dǎo)致呈遞它的細(xì)胞被細(xì)胞溶解生T細(xì)胞(“CTLs”)所溶解。
應(yīng)注意的是，例如Traversari et al.，的申請(qǐng)?zhí)?8/217,188，申請(qǐng)日1994年3月24日，以及Melief et al.的申請(qǐng)?zhí)?8/217,187，申請(qǐng)日1994年3月24日中的其它MAGE衍生肽類(lèi)；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)Serial No.07/938,334(1992年8月31日申請(qǐng))及073,103，(1993年6月7日申請(qǐng))的研究表明，比較MAGE-1基因中編碼相關(guān)九肽的區(qū)域與各種MAGE基因的同源區(qū)域時(shí)，有著大量的同源性。實(shí)際上，這些觀察結(jié)果導(dǎo)致本發(fā)明的一個(gè)方面，即九肽家族中的所有成員具有相同的N-端和C-端氨基酸。這些九肽可用于各種目的，包括用作免疫原，無(wú)論是單獨(dú)使用還是與載體肽偶聯(lián)。九肽已有足夠的大小以構(gòu)成抗原決定簇，由其而產(chǎn)生的抗體可用來(lái)鑒定這些九肽，無(wú)論其單獨(dú)存在，或者作為一個(gè)較大的多肽的一部分。
這些文獻(xiàn)，尤其是申請(qǐng)?zhí)枮?73,103的申請(qǐng)，顯示出在HLA-A1與MAGE-3之間的一種聯(lián)系；然而，僅僅有大約26％的白人和17％的黑人在其細(xì)胞表面呈遞HLA-A1分子。因此，尋找一些能被其它類(lèi)型的MHC分子呈遞的肽的信息是極其有用的，這樣相當(dāng)比例的人口將從以上的討論過(guò)的研究工作中受益。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MAGE-3衍生肽的抗原呈遞并非僅僅局限于HLA-A1分子。本發(fā)明鑒定出了衍生于MAGE-3及其它MAGE TRAPs的肽類(lèi)，它們能與MHC一類(lèi)I分子HLA-A2形成復(fù)合物。這一發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用，包括在治療和診斷方面的用途，都在本發(fā)明的內(nèi)容之內(nèi)并在下文中描述。


圖1顯示在本文所描述的肽類(lèi)的初步篩選結(jié)果；圖2顯示用SEQ ID NO2及SEQ ID NO6所得到的滴定數(shù)據(jù)。
圖3描述了在確定對(duì)肽與HLA分子復(fù)合物特異的CTLs能否被激活的實(shí)驗(yàn)中所得到的結(jié)果。X軸表示效應(yīng)子靶細(xì)胞的比例，Y軸通過(guò)鉻釋放表示溶解百分?jǐn)?shù)。
圖4A，4B，4C及4D顯示了在有限稀釋分析實(shí)驗(yàn)中得到的四種特異性CTLs中的每一種的溶解百分?jǐn)?shù)；靶細(xì)胞是T2細(xì)胞。
圖5A-5D顯示每種CTLs在針對(duì)各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的試驗(yàn)中所得到的結(jié)果。
圖6A與6B顯示當(dāng)COS-7細(xì)胞被一種或多種HLA-A2，MAGE-3和MAGE-12cDNA轉(zhuǎn)染后所得到的結(jié)果。所用的分析方法是使用了WEHI-164克隆13細(xì)胞的一種TNF釋放分析方法。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，僅使用HLA-A2，MAGE-3以及MAGE-12cDNA的一種。圖6A包括使用CTL克隆279/19的試驗(yàn)，而圖6B用了CTL克隆297/22。
圖7A與7B顯示一個(gè)TNF釋放分析的結(jié)果，其中將細(xì)胞HLA-A2+/MAGE-3+與MAGE-3或HLA-A2陽(yáng)性細(xì)胞做了比較，但后者未同時(shí)使用。在圖7A中用了CTL279/19，而圖7B中用了CTL297/22來(lái)產(chǎn)生數(shù)據(jù)。
圖8表示一個(gè)51Cr釋放分析，其中HLA-A2+細(xì)胞被驗(yàn)證其與SEQ ID NO6(細(xì)胞株T2)的結(jié)合，還試驗(yàn)了HLA-A2+/MAGE-3+細(xì)胞(即SK23-MEL，LB43-MEL，LB273-MEL4.0)。
圖9顯示T2細(xì)胞與下述之一溫育后的溶解情況(i)九肽Phe LeuTrp Gly Pro Arg Ala Leu Val(SEQ IDNO6)或(ii)Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile(SEQ ID NO12)。
實(shí)施例1在這一系列實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的方法學(xué)是根據(jù)下述文獻(xiàn)中的描述Elvinet al.，J.Imm.Meth.158161-171(1993)；Townsend et al.，Nature 340443-448(August 10，1989)；Townsend et al.，Cell 62285-290(July 27，1990)，所有文獻(xiàn)引入本文作參考。
如同所述使用了細(xì)胞株174。它是一種呈遞HLA-A2細(xì)胞株，在將肽運(yùn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的MHC-I類(lèi)雜合二聚體裝配位點(diǎn)這一途徑有缺陷。該細(xì)胞可以裝配MHC-I類(lèi)分子，但它們不穩(wěn)定，當(dāng)細(xì)胞溶解時(shí)，在保溫過(guò)夜后解離成自由的重鏈與輕鏈。然而，在體外通過(guò)加上合適的肽類(lèi)配位體可以使雜合二聚體得到穩(wěn)定。見(jiàn)Townsend et al.，Nature 340443-448(1989)；Townsend et al.，Cell 62285-295(1990)。這樣，穩(wěn)定后的分子可以與對(duì)MHC-I類(lèi)分子有特異性的抗體一起免疫沉淀。
在這些實(shí)驗(yàn)的第一部分中，檢測(cè)肽類(lèi)以確定它們是否使HLA-A2在細(xì)胞株中易于裝配。被試驗(yàn)的肽包括SEQ ID NO1 Gly Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala LeuSEQ ID NO2 Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu LeuSEQ ID NO3 Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly LeuSEQ ID NO4 ILe Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu LeuSEQ ID NO5 His Leu Tyr ILe Phe Ala Thr Cys LeuSEQ ID NO6 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu ValSEQ ID NO7 Thr Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu ValSEQ ID NO8 Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu ValSEQ ID NO9 Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro ValSEQ ID NO10 Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val細(xì)胞通過(guò)暴露于[35S]甲硫氨酸中進(jìn)行標(biāo)記(1-2×107細(xì)胞懸液，用100-200μCi用60分鐘接觸標(biāo)記)。然后用磷酸緩沖鹽水洗滌細(xì)胞一次，再重懸于10ml溶解緩沖液中(0.5％ NP-40；0.5％Mega 9，150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris[PH7.5]，2mM 苯基甲基磺酰氟，5mM吲哚乙酰胺)。然后將溶解液與肽(10μM和20μM)保溫15-18小時(shí)。在微型離心管中沉淀細(xì)胞核，溶解液于4℃用0.2ml洗滌過(guò)的10％(w/v)的Staphylococcus A預(yù)澄清處理過(guò)夜。將溶解液分成兩部分，加入單克隆抗體BB7.2使其終濃度為5μg/ml。該單抗是一種構(gòu)象專(zhuān)一性的，HLA-A2識(shí)別性單抗，見(jiàn)Parham et al.，Hum Immunol.3277-299(1981)所述?；旌弦核?0分鐘，隨后加入終濃度為1％(w/v)的牛血清白蛋白，以及100μl 5％(w/v)的蛋白-ASepharose顆粒。轉(zhuǎn)動(dòng)管子45分鐘，然后用1ml洗滌緩沖液(0.5％NP-40，150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris[PH7.5])洗滌顆粒四次。樣品洗脫出來(lái)后，在12％聚丙烯酰胺凝膠上參照Townsend et al.，Nature 340443-448(1989)的方法分析。
圖1顯示了在這些實(shí)驗(yàn)中給出陽(yáng)性結(jié)果的肽。它們是SEQ ID NOS2，6，7，8以及10，在圖中顯示出黑帶，指明在所有的膠中是相同的，并代表著在電泳前與這些肽復(fù)合的MHC分子(HLA-A2)的免疫沉淀。
圖中按從左到右的順序顯示了有關(guān)SEQ ID NOS2，6，7，8和10的工作。垂直的帶將有關(guān)SEQ ID NO10的實(shí)驗(yàn)與標(biāo)有“.174”，“A2 Line”以及“.174 Matrix”的條帶分開(kāi)。174是一個(gè)MHC-I類(lèi)分子重鏈的“陰性”對(duì)照。根據(jù)上文所提到的該細(xì)胞系在沒(méi)有外源肽類(lèi)存在時(shí)不呈遞穩(wěn)定的MHC-I類(lèi)分子，而且由于BB7.2是構(gòu)象特異性的，它將不能沉淀未復(fù)合的MHC-I類(lèi)分子?！癆2”是指一種已知的呈遞HLA-A2的細(xì)胞株(該細(xì)胞株為L(zhǎng)BL721，描述于DeMars et al.，Hum.Immunol.1177(1984)，但任何呈遞穩(wěn)定的HLA-A2分子的細(xì)胞將以相同的方式起作用?！?174Matrix”顯示當(dāng).174細(xì)胞與一種對(duì)照肽GILGFVFTL(SEQID NO11)一起保溫時(shí)的結(jié)果，該肽來(lái)源于流感病毒，并已知能被HLA-A2呈遞。
通過(guò)重鏈(HC)條帶與那些從A2和.174Matrix中得到的條帶的比較所得的事實(shí)，表明了MHC-I類(lèi)分子的穩(wěn)定化。事實(shí)上，MHC分子已被還原性膠所破壞；但是，若在被還原前是穩(wěn)定的，其重鏈分子將仍然與構(gòu)象特異性的單克隆抗體結(jié)合在一起。這就是事實(shí)上凝膠所顯示的，即所述的肽類(lèi)結(jié)合到HLA-A2分子上，并使之穩(wěn)定。實(shí)施例2一旦結(jié)合的肽類(lèi)被鑒別出來(lái)，就進(jìn)行一系列的滴定實(shí)驗(yàn)。此時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)Townsend et al.，Cell 62285-295(July27，1990)中293頁(yè)(引入本文作參考)，各種不同濃度的肽類(lèi)，被加入到上文所述的細(xì)胞溶解液中，根據(jù)免疫沉淀的發(fā)生情況以確定這些肽發(fā)生結(jié)合時(shí)的最佳濃度。
圖2顯示了從兩種肽SEQ ID NO2和6中得到的結(jié)果。對(duì)照一種已知的HLA-A2結(jié)合肽SEQ ID NO11滴定這些肽，從20μM開(kāi)始進(jìn)行10倍的稀釋?zhuān)瑵舛冉抵?，0.2和0.002μM。
使用這些肽(即SEQ ID NO2和6)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在SEQ ID NO2實(shí)驗(yàn)中，此處未報(bào)道的是該肽在5-10nM滴定，這個(gè)濃度與對(duì)照(SEQ ID NO11)相當(dāng)。實(shí)施例3進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)，來(lái)顯示肽SEQ ID NO6誘導(dǎo)對(duì)該肽與HLA-A2的復(fù)合物有特異性并能溶解這類(lèi)復(fù)合物的細(xì)胞溶解性T淋巴細(xì)胞(“CTLs)的能力。在此描述這些反應(yīng)中的第一個(gè)步驟。
外周血液淋巴細(xì)胞(“PBLs”)取自于正常的供給者，即沒(méi)有任何癌癥腫瘤的個(gè)體。該稱(chēng)之為“LB705”的供給者，分類(lèi)為HLA-A1，A2，B8，B27。在開(kāi)始時(shí)(“O日”)，從供給者中得到的PBLs以106細(xì)胞/ml的濃度懸浮于Iscove’s培養(yǎng)基以及10％胎牛血清和“AAG”(Asp＋Arg＋Glu)、20ug/ml的兔抗人IgM抗體，20ng/ml重組人IL-4(“r-hu-IL4”)以及0.005％Pansorbin細(xì)胞中。該混合液分到24孔組織培養(yǎng)板中(每孔2ml)。
在第3日，將細(xì)胞離心并重懸于Iscove’s培養(yǎng)基和10％人血清與AAG及20ng/ml r-hu-IL4中。
兩天以后，即第5日，再次離心細(xì)胞，并重懸于新鮮的Iscove’s培養(yǎng)基與10％人血清和AAG以及20ng/ml r-hu-IL4，20u/ml重組人γ干擾素中。
在第6日，將細(xì)胞再次離心，以5×106細(xì)胞/ml濃度重懸于無(wú)血清Iscove’s培養(yǎng)基以及50μg/ml的肽SEQ ID NO6中，并加入2.5ug/ml的人β2微球蛋白。該混合液中的細(xì)胞于37℃培養(yǎng)4小時(shí)，然后以50Gy放射線處理。再次離心細(xì)胞，重懸于Iscove’s培養(yǎng)基和10％人血清+AAG。然后將細(xì)胞放入24孔組織培養(yǎng)板的每個(gè)孔中，每孔1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。
然后加入應(yīng)答細(xì)胞，它們是同樣取自于供給者LB705的CD8+T細(xì)胞，使用公知的分離T細(xì)胞部分的技術(shù)從供給者的PBLs中獲得了CD8+細(xì)胞，應(yīng)答細(xì)胞以5×106細(xì)胞/孔的濃度加到孔中。最終的體積是2ml。在加完細(xì)胞之后，隨之加入1000U/ml的重組人IL-6(“r-hu-IL-6”)，10ng/ml的重組人IL-12(“r-hu-1L-12”)。
七天以后，即在第十三日，重新刺激應(yīng)答細(xì)胞即CD8+細(xì)胞。該步驟的完成是通過(guò)將上述混合培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到自粘連細(xì)胞中并加入10U/ml r-hu-IL-2及5ng/ml的r-hu-IL-7而實(shí)現(xiàn)的。自粘連細(xì)胞預(yù)先如下制備，培養(yǎng)5×106放射處理過(guò)(50Gy)的從LB705中得來(lái)的PBLs，于37℃在1ml Iscove′s培養(yǎng)基+10％人血清+AAG中培養(yǎng)2小時(shí)。移棄任何非粘連細(xì)胞，并加入溶于0.5ml無(wú)血清培養(yǎng)基中的50μg/ml的肽SEQ ID NO6和2.5μg/ml的人β2微球蛋白。該混合液于37℃培養(yǎng)2小時(shí)，然后洗滌。隨后將應(yīng)答CD8+細(xì)胞加入其中。
在第21天，再刺激一次應(yīng)答細(xì)胞，即加入2×106PBLs，后者于50Gy放射線處理，并已在無(wú)血清培養(yǎng)基+50μg/ml人β2微球蛋白+50μg/ml SEQ ID NO6中培養(yǎng)2小時(shí)，隨后并洗滌過(guò)。
該程序的結(jié)果是產(chǎn)生了對(duì)SEQ ID NO6和HLA-A2的復(fù)合物有專(zhuān)一性的CTLs，如下面的實(shí)施例中所顯示。實(shí)施例4這些實(shí)驗(yàn)在第28天進(jìn)行以確定根據(jù)本發(fā)明的肽類(lèi)分子當(dāng)其與HLA-A2復(fù)合時(shí)，是否會(huì)激起被CTLs溶解的反應(yīng)。
使用了T2細(xì)胞系。該細(xì)胞系在其表面呈遞HLA-A2分子，但它在抗原加工上有缺陷因此有著增強(qiáng)了的呈遞外源肽類(lèi)的能力。見(jiàn)Cerundolo，et al.，Nature 345449(1990)，該文描述了這個(gè)細(xì)胞系。其它等價(jià)的細(xì)胞系也是可以接受的。
T2細(xì)胞樣品用放射性鉻(51Cr)標(biāo)記，并與1μM的肽SEQ IDNO6一起培養(yǎng)。在引入CTLs之前預(yù)培養(yǎng)進(jìn)行一個(gè)小時(shí)。T2細(xì)胞的對(duì)照樣品不與肽一起培養(yǎng)。
根據(jù)上文中實(shí)施例3，制備CTLs，使用自發(fā)APCs刺激CD8+細(xì)胞，并與SEQ ID NO6肽一起預(yù)培養(yǎng)21天。
圖3顯示了結(jié)果。X軸表示效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞的比例，而Y軸表示特異性溶解的百分?jǐn)?shù)。該百分比通過(guò)測(cè)定鉻的釋放確定，參看文獻(xiàn)Boon，et al.，J.Exp.Med 1521184(1980)，引入本文作參考。在每一試驗(yàn)小孔中，通過(guò)在使用的1,000個(gè)51Cr標(biāo)記的T2靶細(xì)胞中加入50,000個(gè)K562細(xì)胞，可消除非特異性溶解的影響。K562細(xì)胞之所以能消除非特異性溶解，是因?yàn)槠渥鳛樘烊粴?xì)胞或稱(chēng)“NK”的細(xì)胞優(yōu)先溶解該細(xì)胞株。
可以清楚地看到該肽被HLA-A2分子呈遞時(shí)，能夠激發(fā)T2細(xì)胞的溶解。實(shí)施例5在實(shí)施例4中所描述的工作產(chǎn)生了一種混合培養(yǎng)物，其中有對(duì)SEQ IDNO6與其呈遞的HLA-A2分子形成的復(fù)合物具有特異性的CD8+T細(xì)胞，還有非特異性CTLs。為了分離出具有所要特異性的CTL克隆，參照簡(jiǎn)述于此的Herin et al.，Int.J.Cancer 39390-396(1987)上的方法(該文引入本文作參考)，進(jìn)行一種有限稀釋分析。
在第29日，參照上述的Herin et al的方法用已知可表達(dá)MAGE-3和HLA-A2的射線處理過(guò)的SK23-MEL細(xì)胞，與作為飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder cells)的LG2 EBV細(xì)胞一起，與CTLs混合培養(yǎng)物結(jié)合。同時(shí)加入到混合物中的還有50U/ml的IL-2，5U/ml的IL-4。結(jié)果產(chǎn)生了CTL克隆297/19，CTL297/22，CTL297/27，以及CTL297/36。實(shí)施例6
在實(shí)施例4中，使用固定量的肽及變化的效應(yīng)子/靶細(xì)胞比例，顯示出了呈遞肽SEQ ID NO6的細(xì)胞溶解的誘導(dǎo)作用。而在本例的這些實(shí)驗(yàn)中，效應(yīng)子/靶細(xì)胞的比率保持恒定，改變的是肽的數(shù)量。如同實(shí)施例4中對(duì)T2細(xì)胞及CTLs做的一樣，進(jìn)行一次51Cr釋放分析。使用的是實(shí)施例5中的四種不同的CTLs。
圖4A，4B，4C和4D顯示了這些結(jié)果，指出溶解作用有一定的劑量依賴(lài)性。當(dāng)T2細(xì)胞未與肽溫育過(guò)時(shí)，溶解總是低于2％。實(shí)施例7在另外一套實(shí)驗(yàn)中，在一個(gè)宿主細(xì)胞本身不表達(dá)HLA-A2的模型中檢驗(yàn)了肽SEQ ID NO6的溶解效應(yīng)。
使用細(xì)胞株COS-7。該細(xì)胞用以下之一轉(zhuǎn)染(i)HLA-A2.01的染色體DNA和MAGE-3的cDNA；(ii)僅僅是HLA-A201的染色體DNA或(iii)僅僅是MAGE-3的cDNA。在每種情況中，轉(zhuǎn)染載體都是pcDNA/AmpI，其中DNA連接在EcoRI人工接頭上，并根據(jù)廠商指導(dǎo)被克隆到質(zhì)粒的EcoRI位點(diǎn)中。受體細(xì)胞以15,000個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于裝有DMEM＋10％胎牛血清的培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)平板底部的小孔內(nèi)。細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)后，棄掉培養(yǎng)基，再加入30μl/孔的含有10％Nu血清，400μg/ml DEAE葡聚糖，100μM氯喹以及100ng按此處所述制備的質(zhì)粒的DMEM。作為又一個(gè)對(duì)照，COS-7細(xì)胞單獨(dú)用HLA-A2轉(zhuǎn)染(通過(guò)在pcDNA/AmPI中的HLA-A2.01)，并根據(jù)實(shí)施例4，與1μM的肽SEQ ID NO6預(yù)先培育1小時(shí)。
另外，還使用了已知可以表達(dá)MAGE-3的并且屬于HLA-A2+的黑素瘤細(xì)胞株。在圖中這些細(xì)胞分別是LB373，LB43，LB24克隆409，以及SK23。細(xì)胞株MZ2-MEL.43是HLA-A2-的。在附加試驗(yàn)中該細(xì)胞株也用pcDNA/AmpI中的HLA-A2基因轉(zhuǎn)染。
參照Traversari et al.，Immunogenetics 35145-152(1992)中的方法(引入本文作參考)，并做了一些改變后，進(jìn)行了TNF釋放分析。具體地，1500個(gè)CTLs與30,000個(gè)靶細(xì)胞結(jié)合(CTLs是以上討論過(guò)的一種克隆)，細(xì)胞在有25U/ml的IL-2存在下共同培養(yǎng)。24小時(shí)以后，培養(yǎng)上清用對(duì)TNF敏感的WEHI164克隆13細(xì)胞進(jìn)行檢驗(yàn)。在WEHI164克隆13中加入了LiCl以提高其敏感性(20mM)，參看Beyart，et al，PNAS869494-9498(1989)。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果描述于圖5A-5D。每張圖中表示的是不同的CTL克隆中，轉(zhuǎn)染過(guò)細(xì)胞(圖的上條帶)以及腫瘤細(xì)胞(圖的下條帶)分別具有的TNF釋放值(pg/ml)。圖中表明單獨(dú)用MAGE-3或是用HLA-A2轉(zhuǎn)染，都不足以激起溶解反應(yīng)，而并不讓人吃驚的是，用MAGE-3和HLA-A2共同轉(zhuǎn)染則足以激起反應(yīng)。然而，真正出乎意料的是，當(dāng)把肽SEQ ID NO6加入到用HLA-A2單獨(dú)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中后，促成了溶解的升高。圖中的第二條帶也注意到這種模式，表示“MZ2-MEL.43/HLA-A2＋1μM SEQ NO6”的數(shù)據(jù)證明了相對(duì)于其它所有的來(lái)說(shuō)的超常的溶解。這種模式，正如所指示出的，在所有被檢驗(yàn)的CTL克隆中都是重復(fù)出現(xiàn)的。實(shí)施例8進(jìn)行了另外一套實(shí)驗(yàn)來(lái)試驗(yàn)在腫瘤細(xì)胞鉻釋放分析中該肽的溶解效應(yīng)。實(shí)施例6中的TNF分析比鉻釋放分析要敏感得多，所以后者將能更加確證TNF分析的結(jié)果。
有關(guān)51Cr釋放分析的描述可見(jiàn)Boon，et al.，J.ExpMed.1521184-1193(1980)。使用同樣的分析方法，并使用了CTL克隆297/19和297/22，以及一系列已知是HLA-A2陽(yáng)性的靶細(xì)胞。細(xì)胞株LB4和SK23也已知能表達(dá)MAGE-3。而細(xì)胞株T2是HLA-A2+及MAGE-3-的。
下表中列出了在不同的效應(yīng)子/靶細(xì)胞比率中得到的數(shù)據(jù)。但是，該比率都很低。數(shù)據(jù)表示為在4小時(shí)及20小時(shí)后細(xì)胞溶解的百分?jǐn)?shù)。表1 HLA-A2＋MAGE-3＋細(xì)胞的溶解在收集上清前將鉻標(biāo)記的靶細(xì)胞與CTL保溫4小時(shí)或20小時(shí)
最小 12446764275 64 213最大 871830734 720 352 338自發(fā)釋放(％) 12％ 35％ 8％ 28％ 15％ 39％即使是在低的E/T(效應(yīng)子/靶細(xì)胞)比值下，仍然有顯著的溶解發(fā)生，顯示出誘導(dǎo)溶解的能力。實(shí)施例9延續(xù)著實(shí)施例7中的工作路線進(jìn)行了一個(gè)實(shí)驗(yàn)。檢驗(yàn)了用含有HLA-A2基因，以及編碼MAGE-12或MAGE-3的cDNA中的一種的pcDNA/Amp轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞對(duì)CTL克隆297/19和297/22的刺激作用。作為對(duì)照的細(xì)胞用HLA-A2，MAGE-3或MAGE-12cDNA中的一種轉(zhuǎn)染。為了提供一個(gè)表達(dá)HLA-A2的對(duì)照，一個(gè)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞樣品與肽SEQ ID NO6預(yù)先保溫了1個(gè)小時(shí)。總量為1500的CTLs加到轉(zhuǎn)染子中，24小時(shí)后，按前述的方法，通過(guò)分析其對(duì)WEHI-164克隆13細(xì)胞的毒性，測(cè)得上清中的TNF水平。
如圖6A和6B所示，MAGE-3和MAGE-12被加工成似乎相同的腫瘤排斥抗原。給出的MAGE-12腫瘤排斥抗原的氨基酸序列含有一段與SEQ ID NO6相同的氨基酸順序。因此可以說(shuō)，許多MAGE-TRAPS中的一個(gè)能夠產(chǎn)生相同的腫瘤排斥抗原。實(shí)施例10在另外一套實(shí)驗(yàn)中，用以前已經(jīng)被鑒定分類(lèi)為HLA-A2+和MAGE-3+的黑素瘤細(xì)胞檢驗(yàn)了CTL克隆297/19和297/22。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了30,000個(gè)腫瘤細(xì)胞(靶細(xì)胞)，1500個(gè)CTLs(效應(yīng)細(xì)胞)，共同培養(yǎng)使其結(jié)合。通過(guò)以上所述的方法及WEHI-164克隆13細(xì)胞測(cè)定了釋放到共培養(yǎng)液中的TNF。
分別對(duì)應(yīng)于CTL297/19和CTL297/22的圖7A和7B，顯示CTLs可以溶解那些HLA-A2+及MAGE-3+的細(xì)胞，但不溶解那些僅僅表現(xiàn)為一種陽(yáng)性的細(xì)胞。注意HLA-A2+/MAGE-3+的細(xì)胞MZ2-MEL.43/HLA-A2，它是由MZ2-MEL.43(HLA-A2-，MAGE-3+)被HLA-A2轉(zhuǎn)染而得到的。實(shí)施例11在此實(shí)施例中檢驗(yàn)了HLA-A2+/MAGE-3+的黑素瘤細(xì)胞被CTL克隆297/22溶解的情況。在這些實(shí)驗(yàn)中，靶細(xì)胞黑素瘤細(xì)胞與100U/ml IFN-γ和1ng/ml TNFα一起預(yù)先培養(yǎng)72小時(shí)，并用與上述相同的方法用51Cr標(biāo)記。標(biāo)記后的細(xì)胞與不同比例的效應(yīng)細(xì)胞一起培養(yǎng)。5個(gè)小時(shí)以后測(cè)量51Cr的釋放。
結(jié)果描繪于圖8中，再一次顯示出呈遞HLA-A2與肽SEQ IDNO6的復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞被CTLs所溶解。實(shí)施例12進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)，其中的COS-7細(xì)胞樣品用編碼HLA-A2的DNA和/或編碼MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-4和MAGE-12的cDNA中的一種轉(zhuǎn)染。
在這些實(shí)驗(yàn)中，使用前述的DEAE-葡聚糖-氯喹方法，使用以下之一的DNA轉(zhuǎn)染15,000個(gè)COS-7細(xì)胞(a)100ng的質(zhì)粒pcDNAI/Amp(含有編碼HLA-A2的染色體DNA)，(b)100ng的質(zhì)粒pcD-SRα，(c)100ng的質(zhì)粒pcDNAI/Amp，含有MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-4或MAGE-12的cDNA中的一種；或者是(d)，(a)和(c)一起轉(zhuǎn)染。
在一天以后，使用胞溶性T細(xì)胞系CTL297/22及前述的TNF釋放分析方法，檢驗(yàn)得到的轉(zhuǎn)染子。進(jìn)行TNF釋放分析時(shí)，在100μl的含有10％人血清及20U/ml的重組人IL-2的Iscove’s培養(yǎng)基中，加入了1500個(gè)CTLs。24小時(shí)以后，收集上清，按前述的操作步驟，使用一種MTT比色分析法，通過(guò)檢驗(yàn)其對(duì)TNF敏感性WEHI-164克隆13細(xì)胞的毒性效應(yīng)來(lái)確定TNF的水平。這些實(shí)驗(yàn)中的50％死亡的WEHI-164克隆13細(xì)胞是用6pg/ml的TNF-β得到的。
表2列出了結(jié)果。
表2LB705-CTL297/22對(duì)經(jīng)HLA-A2基因和MAGE-2，MAGE-3或MAGE-12 cDNA中的一種轉(zhuǎn)染后的COS-7細(xì)胞的識(shí)別用下述材料轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞 由LB705-CTL297/22釋放的TNF(pg/ml)no DNA 6HLA-A2 2MAGE-1 5MAGE-2 4MAGE-3 6MAGE-4 3MAGE-12 5HLA-A2＋MAGE-1 7HLA-A2＋MAGE-2 56HLA-A2＋MAGE-3 93HLA-A2＋MAGE-4 5HLA-A2＋MAGE-12 8015000個(gè)COS-7細(xì)胞通過(guò)DEAE-葡聚糖-氯喹方法用100ng的質(zhì)粒pcDNA1/Amp(含有HLA-A2基因)與100ng質(zhì)粒pcD-SRα或pcDNA1/Amp(含有MAGE-1，2，3，4或12的cDNA)轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染子一天后通過(guò)LB705-CTL294/22檢驗(yàn)其刺激TNF產(chǎn)生的能力。
在含有靶細(xì)胞的小孔中，于含10％的人血清和20U/ml r-hu-IL2的100μl Iscove培養(yǎng)基(Gibco BRL)中加入1,500個(gè)LB705-CTL297/22細(xì)胞。
24小時(shí)以后，收集上清，在一個(gè)MTT比色分析中檢測(cè)其對(duì)WE HI-164克隆13細(xì)胞的細(xì)胞毒性以確定上清中TNF的含量。
在此實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)6pg/ml的TNFβ得到50％致死的WEHI-164克隆13細(xì)胞。
MAGE-3和MAGE-12的成功是不出意料的，因?yàn)樗鼈兌技庸殡腟EQ ID NO6。肽SEQ ID NO6也被MAGE-6編碼。因此，可以預(yù)期的是，CTL297/22應(yīng)該能識(shí)別源于SEQ ID NO6的加工的HLA-A2和SEQ ID NO6的復(fù)合體。而MAGE-2的成功，則暗示還有其它的九肽參與。MAGE-2包括一段與SEQ IDNO12相對(duì)應(yīng)的序列，即Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile但不是SEQ ID NO6。實(shí)施例13根據(jù)實(shí)施例12給出的結(jié)果，合成了一個(gè)與SEQ ID NO12相對(duì)應(yīng)的肽，然后在一個(gè)按前述方法進(jìn)行的51Cr釋放分析實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了驗(yàn)證。使用不同濃度的肽，并用了不同比例的E/T，所有其它參數(shù)如前述。
如圖9中所示，九肽SEQ ID NO12確實(shí)能夠激起呈遞它的細(xì)胞的溶解反應(yīng)。
前面描述了來(lái)源于MAGE腫瘤排斥抗原前體并能夠與MHC-I類(lèi)分子HLA-A2相互作用的肽類(lèi)的鑒定。特別感興趣的并且是本發(fā)明的一部分的，是由SEQ ID NO1-10和12所代表的肽類(lèi)。這一些肽類(lèi)很容易用Merrifield合成法或者是其它肽類(lèi)合成方法來(lái)合成。
具有特殊興趣的肽是符合下列公式的肽(Xaa)1(Xaa)2-7(Xaa)8(Xaa)9(SEQ ID NO13)更為特別的是Xaa Leu Xaa Gly(Xaa)nLeu(SEQ ID NO14)以及Xaa Leu Xaa Gly(Xaa)n Val(SEQ ID NO15)其中n＝4或5，Xaa為任一氨基酸。在SEQ ID NO13中，(Xaa)1優(yōu)選的是Ala，Leu，Ile或Cys，最優(yōu)選的是Gly或Phe。在(Xaa)2-7中的六個(gè)氨基酸可以是任意氨基酸，條件是(Xaa)2-7中的第二個(gè)氨基酸，或(Xaa)3，不能是Asp，(Xaa)3可以是Leu，Met或Pro，而(Xaa)9是任一氨基酸。特別優(yōu)選的是像SEQ IDNO6這樣的肽，它是所有這些種類(lèi)中的例子。
同樣優(yōu)選的還有以下形式的肽Phe (Xaa)2-7Leu Xaa(SEQ ID NO16)其中Xaa是任一氨基酸，或是Gly (Xaa)2-7Leu Xaa(SEQ ID NO17)同樣其中的Xaa是任意氨基酸，除了(Xaa)3有前面所述的限制。這些組合包括在其它的MAGE基因中與SEQ ID NO6和SEQ ID NO12相應(yīng)的九肽。這樣的肽的例子有Phe Leu Leu PheLys Tyr Gln Met Lys(SEQ ID NO18)；Phe Ile Glu Gly Tyr Cys Thr Pro Glu(SEQ ID NO19)；Gly Leu Glu Gly AlaGln Ala Pro Leu(SEQ ID NO20)；以及Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu(SEQ ID NO2，見(jiàn)前述)。這些九肽預(yù)期有強(qiáng)的結(jié)合HLA-A2的能力，因此可以用做確定某細(xì)胞是否HLA-A2陽(yáng)性的試劑。尤其優(yōu)選的是那些能滿足前述的結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)，并能結(jié)合HLA-A2，以及能激發(fā)對(duì)九肽和HLA分子復(fù)合物特異的細(xì)胞溶性T細(xì)胞的溶解反應(yīng)的九肽。
正如所指出的，這些肽能與HLA-A2結(jié)合，這些復(fù)合體己被免疫沉淀，導(dǎo)致了本發(fā)明的另一方面，即分離的由這些肽中的任何一個(gè)與HLA-A2分子形成的復(fù)合體。
這些肽及其復(fù)合體在多個(gè)方面都是有用的。正如所顯示出來(lái)的，這些肽與HLA-A2可結(jié)合，因而它們可用來(lái)分析在一個(gè)樣品中是否存在HLA-A2呈遞細(xì)胞。肽可以以某種可確定的形式與感興趣的樣品接觸，例如一種被標(biāo)記的肽(放射性標(biāo)記、顯色標(biāo)記、等等)，或結(jié)合到固相支持物上，例如一種柱子或瓊脂糖或SEPHAROSE微粒上，以及使用標(biāo)準(zhǔn)的分析方法，結(jié)合待確定的細(xì)胞。
這些肽及其分離的復(fù)合體均可用于生產(chǎn)對(duì)前面所提到的復(fù)合體有特異性的單克隆抗體或細(xì)胞溶解性T細(xì)胞克隆。完成此工作所需的方法對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很熟悉，而且有關(guān)細(xì)胞溶解性T細(xì)胞克隆的生產(chǎn)在前面已有例子。由于某些癌癥細(xì)胞呈遞MAGE-3衍生肽如SEQ ID NOS2，6，7，8，10和12與HLA-A2的復(fù)合體，這些單克隆抗體和細(xì)胞溶解性T細(xì)胞克隆可做為試劑用于診斷癌癥，因?yàn)闆](méi)有發(fā)現(xiàn)正常的細(xì)胞即非致癌細(xì)胞呈遞這些復(fù)合體。上述的鉻釋放分析是用CTLs確定感興趣的靶細(xì)胞的一種分析方法的范例，而且現(xiàn)有技術(shù)非常熟悉免疫分析及其操作方法。
如此衍生而來(lái)的細(xì)胞溶解性T細(xì)胞可用于諸如過(guò)繼轉(zhuǎn)移等方案。見(jiàn)Greenberg et al.，J.Immunol.136(5)1917(1986)；Reddel et al.，Science 257238(1992)；Lynch et al.，Eur.J.Immunol.211403(1991)；Kast et al.，Cell 59603(1989)所有文獻(xiàn)引入本文作參考。在這種方法中，前面所列舉出的肽與抗原呈遞細(xì)胞(“APCS”)結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體。已知許多這類(lèi)方法，例如，披露于Leuscher et al.，Nature 35172-74(1991)；Rometo et al.，J.Exp.Med.174603-612(1991)；Leuscher et al.，J.Immunol.1481003-1011(1992)；Romeroet al.，J.Immunol.1503825-3831(1993)；Romero et al.，J.Exp.Med.1771247-1256(1993)等文獻(xiàn)上的方法(所有文獻(xiàn)引入本文作參考)。隨后，使呈遞細(xì)胞接觸細(xì)胞溶解性T細(xì)胞(源)，產(chǎn)生對(duì)感興趣的復(fù)合體有特異性的細(xì)胞溶解性T細(xì)胞克隆。較好的做法是使用發(fā)現(xiàn)于待用CTLs治療的患者血樣中的一種自體性T細(xì)胞克隆。CTLs產(chǎn)生之后，就重注入待治療的對(duì)象體內(nèi)，其劑量應(yīng)足以改善癌變的狀況，如抑制其繁殖，或是通過(guò)溶解癌細(xì)胞。
如實(shí)施例中所表明的，本發(fā)明的另一方面，是聯(lián)合使用IL-6和IL-12來(lái)激活T細(xì)胞，特別是細(xì)胞溶解性T細(xì)胞。同在此處的術(shù)語(yǔ)“激活”，指的是促使T細(xì)胞行使其預(yù)定功能的能力。當(dāng)然，對(duì)于CTLs來(lái)說(shuō)，就是識(shí)別與溶解在其表面呈遞合適的肽與MHC分子的結(jié)合體的細(xì)胞。激活的T細(xì)胞可以用于診斷，如，確定某特定肽/MHC結(jié)合體，是否存在于其試驗(yàn)樣品的某一細(xì)胞亞群中。使用結(jié)合的細(xì)胞因子也能使某特定CTLs的鑒別變得容易。已知在一CTL樣品中，僅僅只有很小的一個(gè)亞群是可能對(duì)某一MHC/肽結(jié)合體有特異性的。通過(guò)在與呈遞所需結(jié)合體的樣品的結(jié)合中使用細(xì)胞因子，并通過(guò)溶解反應(yīng)，比較其與對(duì)照值，就可確定激活與否。對(duì)照中，除了樣品中未混有附加的材料外，其它都保持不變。它提供必不可少的對(duì)照值。
本發(fā)明的另一方面是一種用于T細(xì)胞激活作用的藥盒。該藥盒包括兩個(gè)獨(dú)立的組分白介素-6和白介素-12，兩個(gè)獨(dú)立的組分包裝于一個(gè)容器之內(nèi)。感興趣的藥盒還可以包括例如一份分開(kāi)的待呈遞的肽，和/或一種載體或HMC的編碼區(qū)域，甚而或者是一種載體或MHC分子與該肽兩者編碼的序列。例如，該肽可能是SEQ ID NO6。載體可能包含有一個(gè)HLA-A2編碼區(qū)或是HLA-A2與SEQ ID NO6的聯(lián)合。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種基本上由IL-6和IL-12組成的組合物，其數(shù)量足以激活T細(xì)胞，例如CTLs。
用于此處時(shí)，“IL-6”和“IL-12”指的是這些分子的所有形式，它們可能是天然產(chǎn)生的也可能是重組生產(chǎn)的，人類(lèi)的，鼠類(lèi)的，或任何其它種屬的，以及其它所有具有IL-6和IL-12的相同的激活性質(zhì)的不同分子。
所用的IL-6和IL-12的量可以不同；然而，優(yōu)選的方案是從約500-約1000U/ml的IL-6，以及從約1-約10ng/ml的IL-12，當(dāng)然根據(jù)技術(shù)人員的發(fā)現(xiàn)，這些范圍可以不同。
本發(fā)明的其它方面對(duì)于熟練技術(shù)人員很清楚，在此無(wú)須重述。
在此處所用的一些術(shù)語(yǔ)與表達(dá)僅是出于描述的需要而非限制，并且這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)的使用不排除任意等價(jià)的被顯示或描述的特征或其部分，在本發(fā)明的范疇之內(nèi)各種修改是可能的。
權(quán)利要求
1.選自以下一組的分離的肽SEQ ID NO2SEQ ID NO6SEQ ID NO7SEQ ID NO8SEQ ID NO10以及SEQ ID NO12。
2.權(quán)利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO2。
3.權(quán)利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO6。
4.權(quán)利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO7。
5.權(quán)利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO8。
6.權(quán)利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO10。
7.權(quán)利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO12。
8.具有通式(Xaa)1(Xaa)2-7(Xaa)8(Xaa)9(SEQ ID NO13)的分離的肽，其中(Xaa)1指的是任一氨基酸，(Xaa)2-7是任意六個(gè)氨基酸，條件是所說(shuō)的六個(gè)氨基酸中的第二個(gè)不能是Asp，(Xaa)8是Leu，Met，或Pro，(Xaa)9是任一氨基酸。
9.權(quán)利要求8的分離的肽，具有通式(Xaa)1Leu(Xaa)3Gly(Xaa)5-8Leu(SEQ ID NO14)。
10.權(quán)利要求8的分離的肽，具有通式(Xaa)1Leu(Xaa)3Gly(Xaa)5-8Val(SEQ ID NO15)。
11.權(quán)利要求8的分離的肽，其中(Xaa)1是Ala，Leu，Ile，Cys，Phe，或Gly。
12.權(quán)利要求11的分離的肽，其中(Xaa)1是Phe或Gly。
13.權(quán)利要求8的分離的肽，其中(Xaa)1是Phe，(Xaa)8是Leu。
14.權(quán)利要求8的分離的肽，其中(Xaa)1是Gly，(Xaa)8是Leu。
15.權(quán)利要求11的分離的肽，選自由SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，和SEQ ID NO20′組成的一組。
16.HLA-A2和權(quán)利要求1的分離的肽的分離的復(fù)合體。
17.權(quán)利要求16的分離的復(fù)合體，其中所說(shuō)的肽被命名為SEQ ID NO6。
18.權(quán)利要求16的分離的復(fù)合體，其中所說(shuō)的肽是SEQ ID NO12。
19.分離的細(xì)胞溶解性T細(xì)胞克隆，它對(duì)HLA-A2與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10以及SEQ ID NO12一組的肽形成的復(fù)合體有特異性。
20.單克隆抗體，它特異性地結(jié)合HLA-A2與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10以及SEQ ID NO12一組的肽形成的復(fù)合體。
21.治療帶有癌變的患者的方法，所述癌變的特征是在其表面呈遞HLA-A2與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10以及SEQ ID NO12一組的肽形成的復(fù)合體的癌細(xì)胞，所述方法包括對(duì)所說(shuō)的患者給予足以溶解所說(shuō)癌細(xì)胞的量的權(quán)利要求16的分離的細(xì)胞溶解性T細(xì)胞克隆。
22.鑒定處于癌變狀況的患者的方法，包括使從所說(shuō)患者中取得的樣品于體外接觸對(duì)HLA-A2與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQID NO10以及SEQ ID NO12一組的肽形成的復(fù)合體有特異性的試劑，確定由所說(shuō)的試劑與所說(shuō)樣品中的細(xì)胞的反應(yīng)來(lái)確定癌變癥狀。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所說(shuō)的試劑是細(xì)胞溶解性T細(xì)胞克隆。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所說(shuō)的試劑是單克隆抗體。
25.激活T細(xì)胞的方法，包括使T細(xì)胞接觸足以激活所說(shuō)T細(xì)胞的數(shù)量的IL-6和IL-12的結(jié)合物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所說(shuō)的T細(xì)胞是細(xì)胞溶解性T細(xì)胞。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所說(shuō)的IL-6的給藥量從大約500-1000u/ml，所說(shuō)的IL-12的給藥量從約1-10ng/ml。
28.用于激活T細(xì)胞的藥盒，包括分開(kāi)的IL-6和IL-12各一份，其量足以激活T細(xì)胞，以及包裝這兩個(gè)獨(dú)立成分的容器。
29.權(quán)利要求28的藥盒，還包括一份分開(kāi)的肽。
30.權(quán)利要求28的藥盒，還包括一種編碼MHC分子的核酸分子。
31.權(quán)利要求28的藥盒，還包括一種編碼MHC分子以及被所說(shuō)的MHC分子呈遞的肽的核酸分子。
32.權(quán)利要求28的藥盒，還包括一種編碼腫瘤排斥抗原前體或腫瘤排斥抗原的核酸分子。
33.權(quán)利要求28的藥盒，還包括一種編碼MHC分子以及能加工成被所說(shuō)的MHC分子呈遞的腫瘤排斥抗原的腫瘤排斥抗原前體的核酸分子。
34.基本上由其量足以刺激T細(xì)胞的IL-6及IL-12組成的組合物。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所說(shuō)的IL-6的數(shù)量范圍從大約500ug/ml到大約1000ug/ml。
36.權(quán)利要求34的組合物，其中所說(shuō)的IL-12的數(shù)量范圍從大約1ng/ml到大約10ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明鑒定了衍生于MAGE腫瘤排斥抗原前體的腫瘤排斥抗原。這些“TRAs”結(jié)合MHC-I類(lèi)分子HLA-A2，所得到的復(fù)合體刺激溶解呈遞細(xì)胞的細(xì)胞溶解性T細(xì)胞的產(chǎn)生。該肽與復(fù)合體能用于診斷，治療，以及作為生產(chǎn)抗體的免疫原，或作為產(chǎn)生細(xì)胞溶解性T細(xì)胞克隆的靶等多種用途。
文檔編號(hào)C07K7/06GK1150805SQ95192261
公開(kāi)日1997年5月28日 申請(qǐng)日期1995年3月22日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月24日
發(fā)明者阿蘭·湯森, 朱迪·巴斯廷, 蒂爾瑞·博恩-法勒爾, 皮埃爾·范德布魯根, 皮埃爾·庫(kù)利, 托馬斯·加耶夫斯基, 科尼利斯·J·M·梅利夫, M·W·威塞倫, W·M·凱斯特 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所, 牛津大學(xué), 萊頓大學(xué)