專利名稱：編碼gage腫瘤排斥抗原的分離的截短的核酸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼腫瘤排斥抗原前體的核酸分子。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一些基因，這些基因的腫瘤排斥抗原前體被特別加工成為至少一種HLA-Cw6分子呈遞的腫瘤排斥抗原。所說(shuō)的這些基因似乎與其它已知腫瘤排斥抗原前體編碼序列無(wú)關(guān)。本發(fā)明也涉及HLA-Cw6分子呈遞的肽及其用途。HLA-A29分子呈遞的肽及其用途也是本發(fā)明的一部分。背景和現(xiàn)有技術(shù)哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)對(duì)外源和異己材料的識(shí)別和反應(yīng)過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。此系統(tǒng)的一個(gè)重要方面是T淋巴細(xì)胞，或“T細(xì)胞”反應(yīng)。這種反應(yīng)要求T細(xì)胞識(shí)別細(xì)胞表面分子和肽的復(fù)合物并和其相互作用，這種細(xì)胞表面分子被稱為人白細(xì)胞抗原(“HLA”)或主要組織相容性復(fù)合物(MHCs)。這些肽衍生于呈遞HLA/MHC分子的細(xì)胞加工的更大的分子。關(guān)于這一點(diǎn)上參見(jiàn)Male等，現(xiàn)代免疫學(xué)(J.P. Lipincott公司，1987)，特別是第6-10章。T細(xì)胞和HLA/肽復(fù)合物的相互作用是受限制的，其要求有對(duì)HLA分子和肽特定組合體特異性的T細(xì)胞。如果特異性T細(xì)胞不存在，即使它的配體(partner)復(fù)合物存在，也沒(méi)有T細(xì)胞反應(yīng)。同樣地，如果特異性復(fù)合物不存在，但T細(xì)胞存在，也不會(huì)發(fā)生反應(yīng)。這種機(jī)制和免疫系統(tǒng)對(duì)外源物質(zhì)的反應(yīng)、自身免疫病理學(xué)以及細(xì)胞異常反應(yīng)有關(guān)。許多工作集中在把蛋白質(zhì)加工成HLA結(jié)合肽的機(jī)制上。關(guān)于這一點(diǎn)上，參見(jiàn)Barinaga等，科學(xué)257880(1992)；Fremont等，科學(xué)257919(1992)；Matsumura等，科學(xué)257927(1992)；Latron等，科學(xué)257964(1992)。也參見(jiàn)Engelhard，免疫學(xué)年度綜述12181-207(1994)。
癌癥中也涉及T細(xì)胞識(shí)別細(xì)胞異常的機(jī)制。例如，在PCT申請(qǐng)PCT/US92/04354(1992年5月22日申請(qǐng)，1992年11月年26日公布，本文一并參考)中，公開(kāi)了一個(gè)加工成肽的基因家族，接下來(lái)這種肽在細(xì)胞表面表達(dá)，通過(guò)特異性CTLs胞溶性T-淋巴細(xì)胞或下文的“CTLs”導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的溶解(lysis)。據(jù)說(shuō)這種基因編碼“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”分子，并且由它們衍生的肽稱為“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。有關(guān)這個(gè)基因家族的其它信息參見(jiàn)Traversari等，免疫遺傳學(xué)35145(1992)；van der Bruggen等，科學(xué)2541643(1991)。也可參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)807,043(1991年12月12日申請(qǐng))，現(xiàn)為美國(guó)專利5,342,774。
在美國(guó)專利申請(qǐng)938,334(現(xiàn)為美國(guó)專利5/405,940，其公開(kāi)內(nèi)容本文一并參考)中，解釋了MAGE-I編碼腫瘤排斥抗原前體，其被加工成HLA-A1分子呈遞的九肽(nonapeptides)。由這些參考文獻(xiàn)可知，如果給定特定肽對(duì)特定HLA分子的特異性，人們可以期待結(jié)合到一種HLA分子而非其它HLA分子的特定肽。由于不同的個(gè)體具有不同的HLA表型，所以這一點(diǎn)是重要的。因此，盡管對(duì)特異HLA分子的配體的特定肽的鑒定具有診斷和治療用途，但是其只和具有這種特定HLA表型的個(gè)體相關(guān)。由于細(xì)胞異常不僅限于一種特定的HLA表型，而定向療法則要求這些異常細(xì)胞表型的一些未知信息，所以此領(lǐng)域的工作有必要繼續(xù)進(jìn)行。
在美國(guó)專利申請(qǐng)008,446(1993年1月22日申請(qǐng)，本文一并參考)中，公開(kāi)了這樣一個(gè)事實(shí)，即MAGE-I表達(dá)產(chǎn)物被加工成第二種TRA。HLA-C克隆10分子呈遞這一第二種TRA。本文公開(kāi)的內(nèi)容表明一個(gè)給定的TRAP可以產(chǎn)生很多TRAs。
由美國(guó)專利申請(qǐng)994,928(1992年12月12日申請(qǐng)，本文一并參考)可知，酪氨酸酶，其是正常細(xì)胞(如黑素細(xì)胞)產(chǎn)生的分子，在腫瘤細(xì)胞中加工產(chǎn)生HLA-A2呈遞的肽。
在美國(guó)專利申請(qǐng)08/032,978(1993年3月18日申請(qǐng)，全文參考)中，指出非衍生于酪氨酸酶的第二種TRA由HLA-A2分子呈遞。這種TRA衍生于一種TRAP，但由非MAGE基因編碼。此公開(kāi)內(nèi)容表明特定的HLA分子可呈遞來(lái)源于不同源的TRAs。
在美國(guó)專利申請(qǐng)08/079,110(1993年6月17日申請(qǐng)，本文一并參考)中，描述了一種無(wú)關(guān)的腫瘤排斥抗原前體，即所謂的“BAGE”前體。這種BAGE前體與MAGE家族無(wú)關(guān)。
上述引用的論文、專利和專利申請(qǐng)所描述的工作在很大程度是針對(duì)MAGE家族基因和無(wú)關(guān)的BAGE基因的。然而還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)由細(xì)胞表達(dá)的另外的腫瘤排斥抗原前體。把這些腫瘤排斥抗原前體稱為“GAGE”腫瘤排斥抗原前體。它們對(duì)MAGE基因家族或BAGE基因都不顯示同源性。這樣，本發(fā)明涉及編碼這種TRAPs的基因和這種腫瘤排斥抗原前體本身以及二者的用途。
這樣，本發(fā)明的另一個(gè)特征是具有6至16個(gè)氨基酸任意長(zhǎng)度的并包含下列序列的肽Xaa(1,2)Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr (SEQ ID NO23)其中的Xaa是任意氨基酸，Xaa(1，2)意思是1個(gè)或2個(gè)氨基酸可以是色氨酸殘基的N-末端。這些肽結(jié)合HLA-A29分子和/或被加工成和HLA-A29分子結(jié)合的肽。
在以下的說(shuō)明中進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。附圖簡(jiǎn)要描述

圖1顯示了采用CTL克隆76/6的溶解研究。
圖2顯示了用各種轉(zhuǎn)染子和對(duì)照獲得的的腫瘤壞死因子(“TNF”)釋放測(cè)定。
圖3比較了由克隆CTL76/6的胞溶性T-淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的溶解。試驗(yàn)了包括SEQ ID NO4的各種長(zhǎng)度的肽。
圖4顯示了本文討論的六個(gè)GAGE基因的cDNA的序列對(duì)比。圖中，相同區(qū)用框圈起。也標(biāo)明了翻譯起始位點(diǎn)和終止密碼子。箭頭表明實(shí)施例描述的用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物。
圖5顯示了GAGE家族成員的推導(dǎo)的氨基酸序列的序列對(duì)比。相同區(qū)由框示出，并標(biāo)明SEQ ID NO4的抗原肽。
圖6顯示了由每個(gè)GAGE cDNA與HLA-Cw6 cDNA一道轉(zhuǎn)染進(jìn)COS細(xì)胞獲得的結(jié)果。24小時(shí)后加入CTL76/6樣品，并在24小時(shí)后測(cè)量TNF的釋放。
圖7比較了HLA-A29 cDNA、MAGE、BAGE或GAGE序列(如圖所示)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞對(duì)CTL 22/23的刺激作用。對(duì)照值由MZ2-MEL.43給出并以COS細(xì)胞為刺激器。
圖8顯示了由用包括SEQ ID NO22在內(nèi)的各種肽以及由其衍生的各種肽進(jìn)行的51Cr釋放研究獲得的結(jié)果。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述實(shí)施例1由患者M(jìn)Z2的黑素瘤細(xì)胞利用標(biāo)準(zhǔn)的方法建立一種黑素瘤細(xì)胞系MZ2-M3L。這種細(xì)胞系如在PCT申請(qǐng)PCT/US92/04354(1992年5月22日申請(qǐng)，1992年11月26日公布，這里全文參考)中已描述。細(xì)胞系建立后，照射其樣品以使之不具有增殖能力。然后利用這些照射過(guò)的細(xì)胞分離對(duì)其特異性的胞溶性T細(xì)胞克隆(“CTLs”)。
從患者M(jìn)Z2提取外周血單核細(xì)胞(“PBMCs”)的樣品，并使之和照射過(guò)的黑素瘤細(xì)胞接觸。觀察混合物中黑素瘤細(xì)胞的溶解，其表明對(duì)黑素瘤細(xì)胞呈遞的HLA分子和肽的復(fù)合物特異的CTLs存在于樣品中。
所用的溶解測(cè)定方法是按照Herin等，國(guó)際癌癥雜志39390-396(1987)(其公開(kāi)內(nèi)容本文一并參考)的鉻釋放測(cè)定方法。但是本文描述了這種測(cè)定方法。體外培養(yǎng)靶黑素瘤細(xì)胞，然后以107個(gè)細(xì)胞/ml在添加10mM HEPES和30％FCS的DMEM中懸浮，在30℃下和200uCi/ml Na(51Cr)O4一道培養(yǎng)30分鐘。標(biāo)記的細(xì)胞以添加有10mM Hepes的DMEM洗滌三次，然后將其懸浮在添加有10mM Hepes和10％FCS的DMEM中，然后將含有103個(gè)細(xì)胞的100μl等分試樣分布在96孔的微量板上。加入在同樣培養(yǎng)基中的PBLs的樣品，并進(jìn)行雙份測(cè)定。把平板在100g下離心4分鐘，37℃ 8％ CO2中培養(yǎng)4小時(shí)。
平板再一次離心，收集上清液的100μl等分試樣并計(jì)數(shù)。51Cr釋放的百分?jǐn)?shù)按下式計(jì)算
其中的ER是觀察到的實(shí)驗(yàn)51Cr釋放，SR是由在200μl培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)103個(gè)標(biāo)記細(xì)胞測(cè)量的自發(fā)釋放，而MR是最大釋放，通過(guò)向靶細(xì)胞加入100μl 0.3％的Triton X-100得到的。
顯示高CTL活性的那些單核血液樣品通過(guò)有限稀釋而擴(kuò)增和克隆，利用相同的方法，再一次篩選。這樣就分離了克隆MZ2-CTL 76/6。這種克隆下文稱為“76/6”。
用同樣的方法檢測(cè)靶K562細(xì)胞以及黑素瘤細(xì)胞系。圖1顯示這一CTL克隆識(shí)別和溶解黑素瘤細(xì)胞系，即MZ2-MEL而不識(shí)別和溶解K562。以上述同樣的方法檢測(cè)這一克隆對(duì)其它黑素瘤細(xì)胞系和自身EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞的作用。圖1顯示由Epstein Barr病毒(“EBV”)轉(zhuǎn)化的自身的B細(xì)胞沒(méi)有溶解，而MZZ-MEL 3.0細(xì)胞被CTL克隆76/6溶解，不表達(dá)抗原F的變體細(xì)胞系MZZ-MEL.4F沒(méi)有溶解。因此，此克隆看來(lái)對(duì)這種抗原是特異性的。
上述所示的結(jié)果還不能確定哪種HLA分子呈遞TRA。溶解的細(xì)胞系，即MZ2-MEL，已知表達(dá)HLA-A1、HLA-A29、HLA-B37、HLA-B44、HLA-Cw6和HLA-C克隆10。在本文沒(méi)有報(bào)道但遵循此實(shí)施例的方案的實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了已喪失HLA分子A29、B44和C克隆10表達(dá)的MZ2-MEL的一個(gè)亞系，該亞系被溶解。這表明呈遞分子應(yīng)該是A1、B37或Cw6之一。實(shí)施例2進(jìn)行進(jìn)一步研究以確定在與靶細(xì)胞接觸時(shí)，76/6是否也產(chǎn)生腫瘤壞死因子(“TNF”)。所利用的方法是Traversari等在免疫遺傳學(xué)145-152(1992)中所描述的，其公開(kāi)內(nèi)容本文一并參考。簡(jiǎn)言之，CTL系的樣品與興趣靶細(xì)胞樣品在培養(yǎng)基中結(jié)合。24小時(shí)后，從培養(yǎng)物中取上清液，然后在TNF敏感性WEHI細(xì)胞上檢測(cè)。上述及在引用的文獻(xiàn)中所討論的MZ2-MEL細(xì)胞系的亞系MZ2-MEL.43具有極強(qiáng)烈的反應(yīng)，且用于下列的實(shí)驗(yàn)中。實(shí)施例3實(shí)施例2結(jié)果表明MZ2-MEL.43呈遞感興趣的靶抗原。因此，將其用作總mRNA的來(lái)源以制備cDNA文庫(kù)。
從細(xì)胞系中分離總mRNA。利用寡-dT結(jié)合試劑盒，遵照公知的技術(shù)分離mRNA。獲得mRNA后，利用含有NotI位點(diǎn)的寡dT引物通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將其轉(zhuǎn)錄成cDNA，接下來(lái)合成第二條鏈。然后把cDNA連接到BstXI銜接頭上，以NotI消化，通過(guò)Sephacryl S-500 HR柱分級(jí)分離各片段，然后不定向地將其克隆到pcDNAI/Amp的BstXI和NotI位點(diǎn)。將重組質(zhì)粒電穿孔到DH5α大腸桿菌細(xì)菌中。將總共1500個(gè)集合體(pool)、每個(gè)集合體100個(gè)重組細(xì)菌接種在微孔中。因?yàn)閹缀跛屑?xì)菌都含有一個(gè)插入物，所以每個(gè)集合體含有大約100種cDNA。
對(duì)每一個(gè)集合體進(jìn)行擴(kuò)增至飽和并由堿裂解和醋酸鉀沉淀法而不使用酚提取法提取質(zhì)粒DNA。實(shí)施例4如實(shí)施例3所述制備該文庫(kù)后，用cDNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞。這里所述的轉(zhuǎn)染以雙份進(jìn)行。將COS-7樣品含在補(bǔ)加10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagles培養(yǎng)基(“″DMEM”)中以15,000個(gè)細(xì)胞/孔接種在組織培養(yǎng)平板底部的微孔內(nèi)。將細(xì)胞37℃過(guò)夜培養(yǎng)，除去培養(yǎng)基，然后以50μl/孔更換含有10％ Nu血清、400μg/mlDEAE-葡聚糖、100μM氯喹，另外加入100ng質(zhì)粒的DMEM培養(yǎng)基。如上所述，溶解研究不能確定哪一種HLA分子呈遞抗原，因此利用可能呈遞抗原的每種HLA分子(A1，B37，Cw6)的cDNA獨(dú)立地共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。具體地，利用與轉(zhuǎn)染該文庫(kù)相同的方案，用28ng克隆到pCD-SαR中的編碼HLA-A1的基因、50ng克隆到pcDNA I/Amp中的HLA-B37的cDNA或75ng克隆到pcDNA-I-Amp中的HLA-Cw6的cDNA共轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染在雙孔中進(jìn)行，只有500份HLA-Cw6轉(zhuǎn)染子可以在單孔中檢測(cè)。37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，用含有10％ DMSO的50μl PBS替換。兩分鐘后除去培養(yǎng)基并用補(bǔ)加10％ FCS的200μl DMEM替換。
培養(yǎng)基如此更換后，將COS細(xì)胞在37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)。然后棄掉培養(yǎng)基，并加入存在于100μl含有10％濃集(pooled)人血清并補(bǔ)加20-30U/ml重組IL-2的Iscove’培養(yǎng)基中的CTL克隆76/6的1000-3000個(gè)細(xì)胞。24小時(shí)后除去上清液，在WEHI細(xì)胞上以Traversari等在免疫遺傳學(xué)35145-152(1992)(其公開(kāi)內(nèi)容本文一并參考)所述的分析方法測(cè)定TNF含量。
以HLA-A1轉(zhuǎn)染的1500個(gè)集合體和以HLA-B37轉(zhuǎn)染的1500個(gè)集合體刺激TNF的釋放，濃度分別達(dá)到15-20pg/ml或2-6pg/ml。大多數(shù)HLA-Cw6轉(zhuǎn)染子產(chǎn)生3-20pg/ml釋放，只有一個(gè)集合體產(chǎn)生超過(guò)60pg/ml的釋放。選擇這個(gè)集合體用于進(jìn)一步的工作。實(shí)施例5克隆所選擇的集合體的細(xì)菌，并檢測(cè)600個(gè)克隆。從中提取質(zhì)粒DNA，并以上述相同的方式將其轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞的新樣品中，為了確定CTL克隆76/6的刺激作用，再次檢測(cè)細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)94個(gè)陽(yáng)性克隆，對(duì)其中之一(稱為cDNA克隆2D6)進(jìn)一步檢測(cè)。在比較實(shí)驗(yàn)中，COS細(xì)胞用cDNA克隆2D6和HLA-Cw6 cDNA、單獨(dú)使用HLA-Cw6 cDNA克隆、或單獨(dú)使用cDNA 2D6轉(zhuǎn)染。也使用了對(duì)照細(xì)胞系MZ2-MELF和MZ2-MEL F+。通過(guò)在WEHI細(xì)胞中檢測(cè)TNF(如上述)而測(cè)量進(jìn)入CTL上清液的TNF釋放量。在將細(xì)胞和MTT一道培養(yǎng)后，通過(guò)光密度測(cè)量存活的WEHI細(xì)胞數(shù)量。圖2顯示用HLA-Cw6和cDNA-2D6轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞以及細(xì)胞系MZ2-MEL F+刺激CTL克隆76/6釋放TNF，表明HLA-Cw6呈遞本發(fā)明的TRA。實(shí)施例6按照本領(lǐng)域公知的技術(shù)對(duì)cDNA 2D6測(cè)序。序列檢索表明質(zhì)粒插入物和已知基因或蛋白質(zhì)不顯示同源性。SEQ ID NO1顯示這一已鑒定基因(后文稱為“GAGE”)的cDNA核苷酸信息。一個(gè)推定的開(kāi)放讀框位于這個(gè)分子的51-467位堿基。此序列的前兩個(gè)堿基來(lái)源于攜帶這個(gè)cDNA序列的載體，所以不是cDNA的自身部分。實(shí)施例7如實(shí)施例6所述cDNA測(cè)序后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定是否正常組織的細(xì)胞表達(dá)此基因。為此，如下所示在組織和腫瘤細(xì)胞系中進(jìn)行Northern印跡。印跡實(shí)驗(yàn)利用SEQ ID NO1完整系列的cDNA。然后利用PCT確認(rèn)結(jié)果。
表1.基因GAGE的表達(dá)正常組織PHA激活的T細(xì)胞-CTL克隆82/30 -肝臟 -肌肉 -肺臟 -腦-腎-胎盤 -心臟 -皮膚 -精巢 +腫瘤細(xì)胞系黑素瘤7/16肺癌 1/6肉瘤 0/1甲狀腺髓質(zhì)癌 0/1腫瘤樣品黑素瘤1/1實(shí)施例8通過(guò)使用聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)和上面描述的GAGE基因信息對(duì)正常組織和腫瘤進(jìn)行詳盡分析。
利用本領(lǐng)域的識(shí)別技術(shù)，從特定的樣品中提取總RNA，其用于制備cDNA。制備cDNA的方案涉及合并4μl反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5x、每種dNTP 1μl(10mM)、2μl二硫蘇糖醇(100mM)、2μldT-15引物(20μm)、0.5μl RNasin(40單位/μl)、1μl MOMLV反轉(zhuǎn)錄酶(200單位/μl)，然后加入6.5μl模板RNA(1μg/3.25μl水或2μg總模板RNA)，混合物的總體積為20μl。將其混合并在42℃溫育60分鐘，之后在冰上冷卻。然后加入總量80μl的水，最終體積達(dá)到100μl。混合物在用于PCR之前，保存于-20℃。
為了完成PCR，分別使用如下引物5’-AGA CGC TAC GTA GAG-3’(有義)和5’-CCA TCA GGA CCA TCT-3’(反義)其分別為SEQ ID NO2和3。試劑包含30.5μl水、5μl PCR緩沖液10x、每種dNTP 1μl(10uM)、每種引物2.5μl(20uM)和0.5μl聚合酶Dynazyme(2單位/μl)，總體積是45μl。加入總共5μl的cDNA(相當(dāng)于100ng總RNA)。合并混合物并加一滴礦物油。將混合物轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀部件(block)上，預(yù)熱到94℃，并進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括下列各步第一變性 94℃，4分鐘變性 94℃，1分鐘退火 55℃，2分鐘延伸 72℃，3分鐘最后的延伸72℃，15分鐘循環(huán)完成后，用10μl等分試樣在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，以溴化乙錠染色。
用如上所示的引物擴(kuò)增的cDNA產(chǎn)生238個(gè)堿基對(duì)的片段。污染的基因組DNA(如果存在)沒(méi)有擴(kuò)增。
所得結(jié)果列于下文表2中。所得結(jié)果確認(rèn)表達(dá)GAGE唯一的正常組織是精巢，而大量的腫瘤，包括黑素瘤、肺、乳腺、喉、咽、肉瘤、睪丸的精原細(xì)胞瘤、膀胱和結(jié)腸的腫瘤表達(dá)此基因。這樣，這些腫瘤任何一種都可用于GAGE基因表達(dá)分析。
表2.基因GAGE表達(dá)的RT-PCR分析正常組織心臟-腦 -肝 -肺 -腎 -脾 -淋巴細(xì)胞-骨髓-皮膚-痣 -黑素細(xì)胞-成纖維細(xì)胞 -前列腺 -精巢+卵巢-乳腺-腎上腺 -肌肉-胎盤-臍帶-腫瘤細(xì)胞系 腫瘤樣品黑素瘤 40/6346/146(32％)肺癌表皮樣癌10/41(24％)腺癌4/18小細(xì)胞肺癌 6/23 0/2乳腺癌15/146(10％)頭頸部腫瘤喉 6/15(40％)咽 3/13肉瘤 1/4 6/18(33％)睪丸精原細(xì)胞瘤 6/6(100％)膀胱癌 5/37(14％)前列腺癌 2/20結(jié)腸癌 5/13 0/38腎癌 0/6 0/45白血病 3/6 0/19實(shí)施例9
前面實(shí)施例所涉及的核酸分子的鑒別導(dǎo)致針對(duì)由HLA-Cw6分子呈遞的和衍生于GAGE基因的腫瘤排斥抗原的鑒定的進(jìn)一步的工作。
將在表達(dá)載體pcDNA/Amp中的完整GAGE cDNA以限制性核酸內(nèi)切酶NotI和SpHI消化，然后按供給者說(shuō)明(Erase-a-base System，Promega)用核酸外切酶III消化。這種處理在3’末端產(chǎn)生一系列的漸進(jìn)缺失。
把缺失產(chǎn)物重新連接到pcDNAI/AMp，用公知的方法將其電穿孔進(jìn)入大腸桿菌菌株DH5alpha’IQ，以氨芐青霉素(50mg/ml)選擇轉(zhuǎn)化子。
從每一重組克隆中提取質(zhì)粒DNA，并將其和編碼HLA-Cw6的載體一道轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，所用的方案遵循以上描述的方案。
以TNF釋放測(cè)定法檢測(cè)該轉(zhuǎn)染子，這樣使得能分離陽(yáng)性和陰性克隆。所有陰性克隆顯示整個(gè)GAGE序列的缺失。最小的陽(yáng)性克隆包含SEQ ID NO1的前170個(gè)核苷酸。上述的序列分析注意到開(kāi)放讀框始于第51個(gè)核苷酸。這樣，此片段包含編碼GAGE TRAP前40個(gè)氨基酸的序列。實(shí)施例10進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)以更精確地限定編碼TRA肽的區(qū)域，使用聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)擴(kuò)增完成此任務(wù)。
合成兩個(gè)引物，第一個(gè)是22聚體，其和質(zhì)粒載體pcDNAI/Amp內(nèi)的定位于BamHI位點(diǎn)上游的序列互補(bǔ)。第二個(gè)引物是29-mer，其在3’末端包含SEQ ID NO1的102-119位核苷酸，在5’末端有一個(gè)包含XbaI限制位點(diǎn)的11個(gè)核苷酸的延伸物。
擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物由BamHI和XbaI消化，并克隆到質(zhì)粒pcDNA-3的BamHI-XbaI位點(diǎn)上。按照實(shí)施例4用重組克隆與編碼HLA-Cw6的cDNA共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，并利用CTL76/6按如上所述進(jìn)行TNF釋放分析。
觀察到了TNF釋放，表明“小基因”被加工成TRA。小基因，即SEQ ID NO1的1-119位核苷酸，其編碼區(qū)為51-119位核苷酸并編碼SEQ ID NO1 cDNA的頭23個(gè)氨基酸。這些信息作為下列實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。實(shí)施例11以SEQ ID NO1的頭23個(gè)氨基酸為基礎(chǔ)合成兩條肽，它們是Met Ser Trp Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg(SEQ ID NO12)，和Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Glu Pro Pro Glu Met Ile(SEQ IDNO13)將每條肽脈沖到預(yù)先用HLA-Cw6 cDNA轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中，并和CTL 76/6合并以確定是否誘導(dǎo)了TNF釋放。將肽(20μg/ml)加入到24小時(shí)前用HLA-Cw6cDNA轉(zhuǎn)染的COS-細(xì)胞中，37℃下培養(yǎng)90分鐘后，棄掉培養(yǎng)基，并加入在含有25單位/ml IL-2的100μl培養(yǎng)基中的3000個(gè)CTLs。18小時(shí)后，通過(guò)測(cè)定對(duì)WEHI-164-13細(xì)胞的毒性來(lái)檢測(cè)上清液的TNF含量。發(fā)現(xiàn)第二條肽(SEQ ID NO13)能誘導(dǎo)多于30pg/ml的TNF，而發(fā)現(xiàn)第一條肽(SEQ ID NO12)誘導(dǎo)少于10pg/ml的TNF。利用第二條肽進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例12以SEQ ID NO13為基礎(chǔ)合成及檢測(cè)了各種肽，其中一些如下所示。為了進(jìn)行這些檢測(cè)，將51Cr標(biāo)記的LB33-EBV細(xì)胞(其是HLA-Cw6陽(yáng)性)和下列肽之一一道培養(yǎng)Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr(SEQ ID NO4)Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr(SEQ ID NO5)Thr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val(SEQ ID NO6)Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val(SEQ ID NO7)Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Glu(SEQ ID NO8)Met Ser Trp Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg(SEQ ID NO12)肽濃度變化如圖3所示，CTLLB33-EBV之比(“效應(yīng)器∶靶比值”)是10∶1。37℃培養(yǎng)4小時(shí)測(cè)定51Cr釋放，陽(yáng)性(”F+’，MZ2-MEL.3.1)和陰性(“F”；MZ2-MEL.2.2.5)對(duì)照細(xì)胞的溶解水平如圖3所示。
令人十分驚奇地是，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO4的八聚物是最好的肽，且似乎是腫瘤排斥抗原。這是第一次報(bào)道八聚物由人類MHC分子呈遞。有一些小鼠系統(tǒng)的先例，如Engelhard報(bào)道(上述，199)，其針對(duì)H-2Kb和H-2Kk分子。九聚物SEQ IDNO5和SEQ ID NO6也誘導(dǎo)CTL溶解，盡管比SEQ ID NO4八聚物程度輕。
檢測(cè)了第二個(gè)CTL(CTL 82/31)，但在結(jié)果中未報(bào)道。已知此CTL溶解呈遞MZ2-F的細(xì)胞。在用SEQ ID NO4肽脈沖后，其也溶解HLA-Cw6陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)施例13為了查明上述的GAGE DNA是否是唯一的，將由MZ2-MEL.43的RNA制備的cDNA文庫(kù)(用于克隆GAGE的相同文庫(kù))和來(lái)源于GAGE cDNA的探針雜交。探針是SEQ ID NO1位置20-328之308個(gè)堿基對(duì)的PCR片段。得到20個(gè)陽(yáng)性cDNA。對(duì)其中6個(gè)進(jìn)行完全測(cè)序，它們與GAGE序列高度相關(guān)，但稍有不同。6個(gè)克隆有2個(gè)彼此相同，但其余的彼此不同。這樣，鑒定了5個(gè)和GAGE不同但和其高度相關(guān)的新序列。將它們稱為GAGE-2，3，4，5和6(圖4)并分別如SEQ IDNO14-18所示。其它14個(gè)克隆在5’末端進(jìn)行部分測(cè)序，它們的序列對(duì)應(yīng)于此6個(gè)GAGE cDNAs之一。
這些cDNA和GAGE-I間的主要區(qū)別是在SEQ ID NO1的GAGE序列的379至521位置上缺少143個(gè)堿基的一段序列。除了GAGE-3(其5’末端的頭112個(gè)堿基和其它的GAGE完全不同)，其余序列只在19個(gè)不同的位置錯(cuò)配。GAGE-3 cDNA的此區(qū)含有一個(gè)長(zhǎng)的重復(fù)和一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
對(duì)應(yīng)于腫瘤排斥抗原前體的推定的GAGE-I蛋白質(zhì)比其它5種蛋白質(zhì)長(zhǎng)大約20個(gè)氨基酸，這些其它蛋白質(zhì)的最后七種殘基也不同于GAGE-I的同源殘基(圖5)。其余蛋白質(zhì)序列顯示僅僅10個(gè)錯(cuò)配。這些錯(cuò)配之一是在SEQ ID NO4的抗原肽相對(duì)應(yīng)的區(qū)域。在GAGE-3，4，5，6中此肽序列被修飾，因此現(xiàn)在第2位由W代替了R。實(shí)施例14為評(píng)估第2位的變化是否影響肽的抗原性，6個(gè)GAGE的cDNA各自和HLA-Cw6的cDNA一起轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，由上文所述的CTL76/6測(cè)定其對(duì)轉(zhuǎn)染子的識(shí)別。只有GAGE-1和GAGE-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被識(shí)別，表明在此實(shí)驗(yàn)中GAGE-3，4，5和6編碼的修飾肽不是抗原性的。分析上文所述的14個(gè)其它克隆的5’末端序列，表明他們中的7個(gè)包含編碼抗原肽的序列，因此可能對(duì)應(yīng)于GAGE-1或GAGE-2。實(shí)施例15以上所用的檢驗(yàn)在腫瘤樣品中GAGE表達(dá)的PCR引物，不能區(qū)別GAGE-1或2和其它的四個(gè)不編碼抗原MZ2F的GAGE cDNA。制備一套新的特異性地?cái)U(kuò)增GAGE-1和2而非GAGE-3，4，5的引物。這些引物是VDE44 5’-GAC CAA GAC GCTACG-3’(SEQID NO9)VDE24 5’-CCA TCAGGA CCA TCT-3’(SEQID NO10)如上所述，這些引物在下列溫度條件下用于使用聚合酶的RT-PCR反應(yīng)94℃40分鐘30個(gè)循環(huán)94℃ 1分鐘56℃ 2分鐘72℃ 3分鐘72℃ 15分鐘表3給出了分析結(jié)果。
表3腫瘤樣品和腫瘤細(xì)胞系的GAGE基因表達(dá)組織類型 GAGE陽(yáng)性腫瘤數(shù)所有GAGE基因*GAGE-1和2**腫瘤樣品黑素瘤原位5/39 5/39(13％)轉(zhuǎn)移47/132 36/131(27％)肉瘤 6/20 6/20(30％)肺癌NSCLC 14/6512/64(19％)頭頸扁平細(xì)胞癌13/5510/54(19％)前列腺癌 2/20 2/20乳房癌18/162 14/162(9％)膀胱癌表面的 1/20 1/20浸潤(rùn)的 5/26 3/26睪丸精原細(xì)胞瘤6/6 5/6結(jié)腸直腸癌0/43白血病和淋巴瘤0/25腎癌 0/46腫瘤細(xì)胞系黑素瘤45/7440/74(54％)肉瘤 1/4 1/4肺癌SCLC 7/24 7/24(29％)NSCLC1/2 1/2間皮瘤5/19 5/19(26％)頭頸扁平細(xì)胞癌0/2乳房癌1/4 0/4膀胱癌0/3結(jié)腸癌5/13 5/13白血病3/6 1/6淋巴瘤0/6腎癌 0/6*用VDE-18和VDE-24引物對(duì)總RNA經(jīng)RT-PCR檢測(cè)GAGE的表達(dá)，檢測(cè)到所有的GAGE基因。對(duì)來(lái)源于MZ2-MEL的DNA上用這些引物分析沒(méi)有觀察到PCR產(chǎn)物。
**用VDE-44和VDE-24引物對(duì)總RNA經(jīng)RT-PCR檢測(cè)GAGE-1和GAGE-2的表達(dá)，其將GAGE-1及2與其它四個(gè)GAGE基因區(qū)別開(kāi)。對(duì)來(lái)源于MZ2-MEL的DNA用這些引物分析沒(méi)有觀察到PCR產(chǎn)物。
在進(jìn)一步工作中，設(shè)計(jì)擴(kuò)增所有GAGE基因的新的引物，以確定在正常組織中沒(méi)有它們之中的任何一個(gè)表達(dá)，這些引物是VDE43 5’-GCG GCC CGA GCA GTT CA-3’(SEQ ID NO11)
VDE24 5’-CCA TCA GGA CCA TCT TCA-3’(SEQ ID NO10)如利用VDE44和VDE24引物進(jìn)行PCR一樣使用這些引物，結(jié)果列于表4中。這些結(jié)果確認(rèn)除了精巢以外，正常的組織都是陰性的。
表4在正常成人和胎組織中GAGE基因的表達(dá)成人組織 GAGE表達(dá)腎上腺 -良性痣 -骨髓 -腦 -乳腺 -小腦 -結(jié)腸 -心臟 -腎 -肝 -肺 -黑素細(xì)胞 -肌肉 -卵巢 -前列腺 -皮膚 -脾細(xì)胞 -胃 -精巢 +胸腺細(xì)胞 -膀胱 -子宮 -胎盤 -臍帶 -胎組織*成纖維細(xì)胞 -腦 -肝 -脾 -胸腺 -精巢 +*通過(guò)利用VDE-44和VDE-24引物對(duì)總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)GAGE的表達(dá)，檢測(cè)到所有的GAGE基因(圖7)。用“-”表示沒(méi)有PCR產(chǎn)物，用“+”表示存在PCR產(chǎn)物，在來(lái)源于MZ2-MEL的DNA上分析這些引物，沒(méi)有觀察到PCR產(chǎn)物。
*胎組織來(lái)源于20周以上的胎兒。實(shí)施例16在此處沒(méi)有描述的工作中，已經(jīng)確定胞溶性T細(xì)胞克隆CTL(Van der Eyndeet等，Int.J.Cancer44634-640(1989)，本文一并參考)不能識(shí)別黑素瘤細(xì)胞MZ2-MEL.3.1。Van der Bruggen等已報(bào)道(歐洲免疫學(xué)雜志242134-2140(1994)此黑素瘤細(xì)胞系已經(jīng)喪失MHC分子HLA-A29、HLA-B24和HLA-Cw*1601的表達(dá)。開(kāi)展研究以確定用MHC分子之一轉(zhuǎn)染是否會(huì)使該黑素瘤細(xì)胞系對(duì)CTL 22/23敏感。HLA-A29是第一個(gè)試驗(yàn)的分子。為此，利用市售的提取試劑盒，按照廠商的說(shuō)明，從HLA-A29細(xì)胞系MZ2-MEL.43提取了多聚腺苷酸RNA。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)方法將mRNA轉(zhuǎn)化成cDNA，大小分級(jí)分離，然后單向插入到質(zhì)粒pcDNA-I/Amp的BstI和NotI位點(diǎn)。將質(zhì)粒電穿孔進(jìn)入大腸桿菌菌株DH5α5’IQ，然后用氨芐青霉素(50ug/ml)篩選。細(xì)菌鋪板到硝基纖維素濾膜上并復(fù)制。制備濾膜，然后在6xSSC/0.1％SDS/lx Denhardt溶液中于40℃過(guò)夜雜交，利用32P標(biāo)記探針5’-ACTCCATGAGGTATTTC-3’(SEQ ID NO19)此探針是在大多數(shù)HLA序列的起始密碼子周圍的一個(gè)序列。
在室溫條件下洗滌濾膜兩次，每次在6xSSC中清洗5分鐘，然后在43℃在6xSSC中洗滌兩次。然后用如下探針篩選的陽(yáng)性序列，所述探針為5’-TTTCACCACATCCGTGT-3’(SEQ ID NO20)此探針已用32P標(biāo)記，這個(gè)序列對(duì)HLA-A29是特異的，由參考有關(guān)免疫感興趣序列和蛋白質(zhì)的Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(本文一并參考)確定。此數(shù)據(jù)庫(kù)可在NCBI(美國(guó))或者在Solte網(wǎng)((國(guó)際互聯(lián)網(wǎng))網(wǎng)址WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV.)得到。在室溫條件下洗滌濾膜兩次，每次在6xSSC中清洗5分鐘，然后42℃在6xSSC中洗滌兩次(每次5分鐘)。實(shí)施例17陽(yáng)性HLA-A29克隆分離后，將其利用DEAE-葡聚糖氯喹法(如上文所述)轉(zhuǎn)染到COS-7中。簡(jiǎn)言之，利用含有HLA-A29的50ng質(zhì)粒pcDNA-I/Amp和100ng cDNA處理1.5×104個(gè)COS-7細(xì)胞，所述cDNA包含上文所述的GAGE序列任何一種，或在質(zhì)粒pcDNAα-I或pcDSR-α中的現(xiàn)有技術(shù)MAGE或BAGE序列之一。然后，在37℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子24小時(shí)。
通過(guò)CTLs，利用上文實(shí)施例4敘述的方法檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染子刺激TNF產(chǎn)生的能力。
圖7描述了研究的結(jié)果，表明利用GAGE-3，4，5或6之一和HLA-A29作為轉(zhuǎn)染子得到高水平的TNF產(chǎn)生。相反地，GAGE-1和2不能刺激CTL克隆22/23，因此得出這樣結(jié)論GAGE-3，4，5和6被加工為由HLA-A29分子呈遞的一個(gè)抗原或一些抗原，且能由CTL22/23識(shí)別。實(shí)施例18GAGE-3、4、5和6被加工成HLA-A29+細(xì)胞呈遞的肽，而GAGE-1和2卻不能，這個(gè)事實(shí)表明檢驗(yàn)到GAGE-3、4、5和6共有的推定的氨基酸序列在GAGE-1和2中沒(méi)有。鑒別了以下這個(gè)序列Arg Ser Thr Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Gln (SEQ ID NO21)合成此肽，冷凍干燥，然后溶解在1體積DMSO，9體積10mM醋酸水溶液中。這種方法用于下面所討論的其它的合成肽。
按照上面所描述的方法，在51Cr釋放實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)肽(SEQID NO21)。
發(fā)現(xiàn)這個(gè)肽確實(shí)引起溶解。制備依次的缺失，同樣利用51Cr溶解測(cè)定法檢驗(yàn)他們引起溶解的能力。在圖9中描述了這部分工作。發(fā)現(xiàn)引起溶解的最短的肽是Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr (SEQ ID NO22)，這是GAGE-3至GAGE--6所共有的。具體地，GAGE-3的10-18位氨基酸、GAGE-4，5，6的9-17位氨基酸相當(dāng)于此肽。
圖9所示的和，例如由SEQ ID NO21和22代表的此肽家族的成員與Toubert等描述的資料不相符(“HLA-A29肽結(jié)合基序”，摘要4183，第九屆國(guó)際免疫學(xué)會(huì)議，1995年7月23-29日，舊金山，CA，本文一并參考)。按照Toubert等，在任何一個(gè)和HLA-A29結(jié)合的肽的第三位至少需要一個(gè)苯丙氨酸(Phe)殘基。在本文所表現(xiàn)出的并不是這種情況。
以上實(shí)施例顯示了編碼腫瘤排斥抗原前體和腫瘤排斥抗原的核酸分子的分離。然而，這些分子和任何以前公開(kāi)的以上參考文獻(xiàn)闡述的MAGE和BAGE編碼序列均不同源。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是分離的核酸分子，其包括SEQ ID NO1-6任何一個(gè)所示的核苷酸序列以及其片段，如SEQ ID NO1的1-170位核苷酸和51-170位核苷酸或者加工成腫瘤排斥抗原的任何其它片段。SEQ ID NO1-6的序列既不是MAGE編碼序列，也不是BAGE編碼序列，通過(guò)把那些序列同所引用的參考文獻(xiàn)中描述的基因中的任何一個(gè)的序列比較，將看到這一點(diǎn)。本發(fā)明的另一部分是這樣的核酸分子，這些分子也編碼非MAGE和非BAGE腫瘤排斥抗原前體，但是這些分子在嚴(yán)格的條件下同包含SEQID NO1的所描述的核苷酸序列的核酸分子雜交。這里所用的術(shù)語(yǔ)＂嚴(yán)格條件＂涉及到一些本領(lǐng)域所熟悉的參數(shù)，具體地，作為本文所用的嚴(yán)格條件，指在1M NaCl、1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯中65℃條件下雜交18小時(shí)，其后在2xSSC中在室溫下兩次洗滌濾膜5分鐘，接下來(lái)是在2xSSC，0.1％SDS中在65℃時(shí)洗滌30分鐘。還有一些可以利用的其它條件，試劑等，這導(dǎo)致相同或更高的嚴(yán)格程度。技術(shù)人員將熟悉這樣的條件，因此這里就不列出。
從本實(shí)施例中也將看出，本發(fā)明包括序列在表達(dá)載體中的用途，以及轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞和細(xì)胞系，這些是原核(例如，大腸桿菌)或真核(例如CHO或COS細(xì)胞)。表達(dá)載體需要相關(guān)的序列，即以上所描述的那些，可操作地與啟動(dòng)子連接。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類白細(xì)胞抗原HLA-Cw6和HLA-A29都呈遞從這些基因衍生出來(lái)的腫瘤排斥抗原，表達(dá)載體也可以包括編碼HLA-Cw6或HLA-A29兩個(gè)之一的核酸分子。在載體包含兩種編碼序列情況下，可以用其轉(zhuǎn)染正常情況不表達(dá)任何一個(gè)的細(xì)胞。腫瘤排斥抗原前體編碼序列也可以單獨(dú)利用，例如，在宿主細(xì)胞已表達(dá)HLA-Cw6和HLA-A29中的一個(gè)或兩個(gè)時(shí)。當(dāng)然，在能被利用的特定的宿主細(xì)胞上沒(méi)有限制。如果需要的話，包含兩種編碼序列的載體可以用于呈遞HLA-A29或HLA-Cw6的細(xì)胞，腫瘤排斥抗原前體的基因能用于不能表達(dá)HLA-A29或HLA-Cw6的宿主細(xì)胞中。
本發(fā)明也包括所謂的表達(dá)試劑盒，其使得技術(shù)人員能夠制備一個(gè)需要的表達(dá)載體或多個(gè)載體。這樣的表達(dá)試劑盒至少包括每一個(gè)以前所討論的編碼序列中獨(dú)立的部分。按照需要，可以添加其它的組分，只要所需的以前所述的序列包含于其內(nèi)。
為了把本發(fā)明的核酸分子以及TRAPs和以前所描述的MAGE和BAGE材料區(qū)別開(kāi)，本發(fā)明被稱作GAGE基因家族和TRAPs。因此，當(dāng)在本文中使用＂GAGE＂時(shí)，它指由前述序列編碼的腫瘤排斥抗原前體，＂GAGE編碼分子＂和類似的術(shù)語(yǔ)用來(lái)描述核酸分子本身。
本文描述的本發(fā)明有許多用途，其中的一些這里作描述。首先，本發(fā)明使得技術(shù)人員可以診斷以表達(dá)TRAP或呈遞腫瘤排斥抗原為特征的疾病，例如黑素瘤。這些方法涉及測(cè)定TRAP基因表達(dá)，和/或由其衍生的TRAs，如由HLA-Cw6或HLA-A29呈遞的TRA。在前者的情況下，這種測(cè)定是通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)的核酸測(cè)定方法進(jìn)行的，包括聚合酶鏈反應(yīng)或以標(biāo)記的雜交探針測(cè)定。在后一情況下，用TRA和HLA復(fù)合物的結(jié)合配體(如抗體)來(lái)測(cè)定是尤其優(yōu)選的。另一個(gè)測(cè)定方法是以上描述類型的TNF釋放測(cè)定。為完成此項(xiàng)分析測(cè)定，優(yōu)選確認(rèn)不存在精巢細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞正常表達(dá)GAGE。然而，當(dāng)人們能常規(guī)地區(qū)分精巢細(xì)胞和其它類型細(xì)胞時(shí)，這種方法不是必要的。而且在實(shí)踐上在非睪丸樣品中有精巢細(xì)胞存在是不可能的。
TRAP基因的分離也使TRAP分子本身的分離成為可能，尤其是分離含有SEQID NO2-6中任何之一編碼的氨基酸序列的TRAP。這些分離的分子，當(dāng)作為TRA或TRA和HLA例如HLA-Cw6或HLA-A29的復(fù)合物存在時(shí)，可與佐劑等材料結(jié)合以生產(chǎn)有用的疫苗來(lái)治療以TRAP分子表達(dá)為特征的疾病。
例證性的佐劑包括弗氏完全和不完全的佐劑、滅活的B.pertussis生物體、＂BCG＂或Bacille Calmente-Guerin、氫氧化鋁、胞壁酰二肽和它的衍生物，它們可以在可代謝的油中乳化，如鯊烯、單磷?；珹(MPL)、匙孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)、皂苷提取物如QA-7、QA-19和QA-21(也稱為QS-21)(這些在Kensil等的美國(guó)專利5,057,540都已有描述，本文一并參考)，MTP-MF59、N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲銨硫酸二甲酯(DOTAP)、陽(yáng)離子兩親物DOTMA、中性磷脂如DOPE，以及這些物質(zhì)的組合物。以上所列絕非全部，普通的技術(shù)人員能夠完善此列舉。本文包含所有附加的佐劑。
此外，也可以由在其表面上呈遞TRA/HLA復(fù)合物的細(xì)胞制備疫苗，如非增殖的癌細(xì)胞、非增殖的轉(zhuǎn)染子等。在細(xì)胞用作疫苗的所有情況下，這些細(xì)胞可以是用編碼一個(gè)或兩個(gè)提供CTL反應(yīng)必需組分的序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或是沒(méi)有轉(zhuǎn)染而表達(dá)兩個(gè)分子的細(xì)胞。并且，TRAP分子、它相關(guān)的TRAs以及TRA和HLA的復(fù)合物，通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，都可以用來(lái)產(chǎn)生抗體。
當(dāng)“疾病”用于本文時(shí)，它是指表達(dá)腫瘤排斥抗原前體的任何病理狀態(tài)。這種疾病的一個(gè)例子是癌，特別是黑素瘤。黑素瘤作為一種產(chǎn)生色素的癌細(xì)胞是公知的。
如以上表明，腫瘤排斥抗原，如SEQ ID NO4所述的，也是本發(fā)明的一部分。多肽也是本發(fā)明的一部分，如包含8-16個(gè)氨基酸的分子，只要此多肽包含SEQ IDNO4所示的氨基酸序列。如實(shí)施例表明的，長(zhǎng)于SEQ ID NO4八聚物的多肽由呈遞HLA-Cw6的癌細(xì)胞加工成SEQ ID NO4的腫瘤排斥抗原，并且呈遞這些多肽。呈遞作用通過(guò)存在于體液樣品的胞溶性T-淋巴細(xì)胞和呈遞這種復(fù)合物的細(xì)胞接觸導(dǎo)致溶解。同樣地，長(zhǎng)于SEQ ID NO22肽，如SEQ ID NO21，被癌細(xì)胞(如HLA-A29陽(yáng)性細(xì)胞)加工成合適的TRA，并被呈遞。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)特征是具有9-16個(gè)氨基酸長(zhǎng)且包含以下序列的任何肽Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr(SEQ ID NO23)其中Xaa是任何氨基酸。這些肽與HLA-A29分子結(jié)合和/或加工成和HLA-A29分子結(jié)合的肽。實(shí)施例表明了這些肽被加工成腫瘤排斥抗原這一事實(shí)。
這種性質(zhì)可以用于與其它參數(shù)一起確認(rèn)病理情況診斷，如癌，特別是黑素瘤的診斷。例如，研究者可以研究血液或尿之中的抗原，觀察其生理變化，，然后利用本文所描述的CTL增殖方法確認(rèn)黑素瘤的診斷。
依據(jù)本發(fā)明的肽本身可以用于HLA分型測(cè)定。當(dāng)需要進(jìn)行皮膚移植、器官移植等，必須完成HLA分型測(cè)定以最大限度地減少移植排斥的可能性，這一點(diǎn)是公知的。本發(fā)明的肽可以用來(lái)確定個(gè)體是HLA-Cw6還是HLA-A29陽(yáng)性，以便可以選擇適當(dāng)?shù)墓w。這種測(cè)定簡(jiǎn)單易行，將本發(fā)明的肽和感興趣樣品接觸，其和樣品中的細(xì)胞結(jié)合指示提取樣品的個(gè)體是HLA-Cw6或HLA-A29陽(yáng)性。人們可以標(biāo)記肽本身，將其和標(biāo)記的接頭綴合或以其它的方式結(jié)合，將他們固定在固相中等等，以便優(yōu)化這種測(cè)定。對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其它的標(biāo)準(zhǔn)方法是清楚的，本文不必表述。
以此公開(kāi)內(nèi)容為基礎(chǔ)的治療方法是以受治療者的導(dǎo)致呈遞TRA的細(xì)胞(如HLA-A29 HLA-Cw6細(xì)胞)溶解的免疫系統(tǒng)反應(yīng)為前提。這樣一種方法是施用特異于復(fù)合物的CTL給具有待定表型的異常細(xì)胞的受治療者。體外產(chǎn)生這樣的CTLs在技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。具體地說(shuō)，使細(xì)胞的樣品(如血細(xì)胞)和呈遞復(fù)合物并且能激發(fā)特異性CTL增殖的細(xì)胞接觸，靶細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)染子，如上文所描述類型的COS細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)染子在他們的表面上呈遞所需的復(fù)合物，并且當(dāng)與感興趣CTL結(jié)合時(shí)，刺激其增殖。象本文利用的COS細(xì)胞是很容易得到的，其它合適的宿主細(xì)胞也是很容易得到的。
詳細(xì)地說(shuō)，稱之為過(guò)繼轉(zhuǎn)移法(Greenberg，J.Immunol.136(5)1917(1986)；Riddel等，Science257 238(7-10-92)；Lynch等，Eur.J.Immunol.211403-1410(1991)；Kast等，Cell 59603-614(11-17-89))的這種治療方法，是將呈遞所需復(fù)合物的細(xì)胞和CTLs合并以導(dǎo)致特異于其的CTL增殖。把增殖的CTLs施用給具有細(xì)胞異常的受治療者，所述的細(xì)胞異常的特征是具有某些呈遞特定復(fù)合物的異常細(xì)胞，其中特定復(fù)合物包含相關(guān)的HLA分子。其后CTLs溶解異常細(xì)胞，進(jìn)而完成所要求的治療目的。
以上療法假定至少受治療者的一些異常細(xì)胞呈遞相關(guān)HLA/TRA復(fù)合物。這很容易測(cè)定出來(lái)，因?yàn)楸绢I(lǐng)域十分通曉用于鑒定細(xì)胞呈遞特定HLA分子的方法，也知道如何鑒定表達(dá)相關(guān)序列(在此為GAGE序列)的RNA的細(xì)胞。通過(guò)以上篩選方法鑒別出呈遞相關(guān)復(fù)合物的細(xì)胞后，它們就能和病人的包含CTLs的樣品結(jié)合。如果呈遞復(fù)合物的細(xì)胞被混合的CTL樣品溶解，那么就能夠假定GAGE衍生的腫瘤排斥抗原被呈遞，這個(gè)受治療者就是以上所述的治療方法的合適的候選人。
依據(jù)本發(fā)明，過(guò)繼轉(zhuǎn)移法不是可供使用的療法的唯一形式，利用一些方法，CTLs也能在體內(nèi)產(chǎn)生。例如一種利用非增殖細(xì)胞表達(dá)復(fù)合物的方法，上文已經(jīng)作了詳細(xì)描述。用于此法的細(xì)胞可以是那些正常表達(dá)復(fù)合物的細(xì)胞，如照射的黑素瘤細(xì)胞或用一個(gè)或兩個(gè)呈遞復(fù)合物的所需基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。Chen等(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)88110-114(1月1991年))舉例說(shuō)明了這種方法，示出在治療中應(yīng)用轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)HPV E7肽。各種細(xì)胞類型都可以利用。同樣地，攜帶一個(gè)或兩個(gè)感興趣基因的載體也可以利用，病毒或細(xì)菌載體是尤其優(yōu)選的。在這個(gè)體系中，感興趣的基因由例如一種牛痘病毒或細(xì)菌BCG攜帶，并且這些物質(zhì)確實(shí)感染宿主細(xì)胞。得到的細(xì)胞呈遞感興趣復(fù)合物并能被自身CTLs識(shí)別，之后CTL增殖。把腫瘤排斥抗原或其前體和能促進(jìn)摻入到HLAL-Cw6呈遞細(xì)胞(然后呈遞感興趣的HLA/肽復(fù)合物)的佐劑組合，也能獲得同樣的結(jié)果。TRAP被加工以產(chǎn)生HLA分子的肽配體但TRA呈遞無(wú)須進(jìn)一步加工。
本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的其它方面將會(huì)很清楚，在這里就不必贅述了。
使用的術(shù)語(yǔ)和表述是說(shuō)明性而不是限制性的，利用這樣的術(shù)語(yǔ)和表述并無(wú)意排除任何一個(gè)顯示和描述的特征的等同物或其部分，應(yīng)認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明的范圍內(nèi)，各種修改是可能的。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人皮埃爾·范德布魯根，貝努瓦·范登艾恩德，奧利維爾·德巴克，蒂爾瑞·博恩-法勒爾(ii)發(fā)明名稱編碼GAGE腫瘤排斥抗原的分離的截短的核酸分子，腫瘤排斥抗原和其用途(iii)序列數(shù)18(iv)通訊地址(A)收信人Felfe & Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市紐約市(D)州紐約(E)國(guó)家美國(guó)(F)ZIP10022(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤，5.25英寸，360kb存儲(chǔ)量(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件Wordperfect(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)PCT/US96/00381(B)申請(qǐng)日11-1-1996(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/531,662(B)申請(qǐng)日21-9-1995(C)分類號(hào)435(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/370,648(B)申請(qǐng)日10-1-1995(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/250,162(B)申請(qǐng)日27-5-1994(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/096,039(B)申請(qǐng)日22-7-1993(viii)律師/代理人信息(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登記號(hào)30,946(c)案號(hào)LUD 5323.3-PCT(ix)電信信息(A)電話(212)688 9200(B)傳真(212)838 3884(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度646個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO1CTGCCGTCCG GACTCTTTTT CCTCTACTGA GATTCATCTG TGTGAAATAT 50GAGTTGGCGA GGAAGATCGA CCTATCGGCC TAGACCAAGA CGCTACGTAG 100AGCCTCCTGA AATGATTGGG CCTATGCGGC CCGAGCAGTT CAGTGATGAA 150GTGGAACCAG CAACACCTGA AGAAGGGGAA CCAGCAACTC AACGTCAGGA 200TCCTGCAGCT GCTCAGGAGG GAGAGGATGA GGGAGCATCT GCAGGTCAAG 250GGCCGAAGCC TGAAGCTGAT AGCCAGGAAC AGGGTCACCC ACAGACTGGG 300TGTGAGTGTG AAGATGGTCC TGATGGGCAG GAGATGGACC CGCCAAATCC 350AGAGGAGGTG AAAACGCCTG AAGAAGAGAT GAGGTCTCAC TATGTTGCCC 400AGACTGGGAT TCTCTGGCTT TTAATGAACA ATTGCTTCTT AAATCTTTCC 450CCACGGAAAC CTTGAGTGAC TGAAATATCA AATGGCGAGA GACCGTTTAG 500TTCCTATCAT CTGTGGCATG TGAAGGGCAA TCACAGTGTT AAAAGAAGAC 550ATGCTGAAAT GTTGCAGGCT GCTCCTATGT TGGAAAATTC TTCATTGAAG 600TTCTCCCAAT AAAGCTTTAC AGCCTTCTGC AAAGAAAAAA AAAAAA 646(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO2AGACGCTACG TAGAGCCT 18(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQID NO3CCATCAGGAC CATCTTCA18(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO4Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr5(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQID NO5Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr5(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQID NO6Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val5(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO7Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val5 10(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO8Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Glu5(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO9GACCAAGACG CTACGTAG 18(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO10CCATCAGGAC CATCTTCA18(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO11GCGGCCCGAG CAGTTCA17(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Ser Trp Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg5 10 15(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO13Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Glu Pro Pro Glu Met Ile5 10 15(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度538個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO14ACGCCAGGGA GCTGTGAGGC AGTGCTGTGT GGTTCCTGCC GTCCGGACTC 50TTTTTCCTCT ACTGAGATTC ATCTGTGTGA AATATGAGTT GGCGAGGAAG 100ATCGACCTAT CGGCCTAGAC CAAGACGCTA CGTAGAGCCT CCTGAAATGA 150TTGGGCCTAT GCGGCCCGAG CAGTTCAGTG ATGAAGTGGA ACCAGCAACA 200CCTGAAGAAG GGGAACCAGC AACTCAACGT CAGGATCCTG CAGCTGCTCA 250GGAGGGAGAG GATGAGGGAG CATCTGCAGG TCAAGGGCCG AAGCCTGAAG 300CTCATAGCCA GGAACAGGGT CACCCACAGA CTGGGTGTGA GTGTGAAGAT 350GGTCCTGATG GGCAGGAGAT GGACCCGCCA AATCCAGAGG AGGTGAAAAC 400GCCTGAAGAA GGTGAAAAGC AATCACAGTG TTAAAAGAAG ACACGTTGAA 450ATGATGCAGG CTGCTCCTAT GTTGGAAATT TGTTCATTAA AATTCTCCCA 500ATAAAGCTTT ACAGCCTTCT GCAAAGAAAA AAAAAAAA 538(2)SEQ ID N015的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度560個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO15CTCATATTTC ACACAGATGA GTTGGCGAGG AAGATCGACC TATTATTGGT 50CTAGGCCAAT AATAGGTCGA TCTTCCTCGC CAACTCATAT TTCACACAGA 100TGAATCTCAG TAGAGGAAAA TCGACCTATT ATTGGCCTAG ACCAAGGCGC 150TATGTACAGC CTCCTGAAGT GATTGGGCCT ATGCGGCCCG AGCAGTTCAG 200TGATGAAGTG GAACCAGCAA CACCTGAAGA AGGGGAACCA GCAACTCAAC 250GTCAGGATCC TGCAGCTGCT CAGGAGGGAG AGGATGAGGG AGCATCTGCA 300GGTCAAGGGC CGAAGCCTGA AGCTGATAGC CAGGAACAGG GTCACCCACA 350GACTGGGTGT GAGTGTGAAG ATGGTCCTGA TGGGCAGGAG ATGGACCCGC 400CAAATCCAGA GGAGGTGAAA ACGCCTGAAG AAGGTGAAAA GCAATCACAG 450TGTTAAAAGA AGGCACGTTG AAATGATGCA GGCTGCTCCT ATGTTGGAAA 500TTTGTTCATT AAAATTCTCC CAATAAAGCT TTACAGCCTT CTGCAAAGAA 550AAAAAAAAAA 560(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度540個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO16CGCCAGGGAG CTGTGAGGCA GTGCTGTGTG GTTCCTGCCG TCCGGACTCT 50TTTTCCTCTA CTGAGATTCA TCTGTGTGAA ATATGAGTTG GCGAGGAAGA 100TCGACCTATT ATTGGCCTAG ACCAAGGCGC TATGTACAGC CTCCTGAAAT 150GATTGGGCCT ATGCGGCCCG AGCAGTTCAG TGATGAAGTG GAACCAGCAA 200CACCTGAAGA AGGGGAACCA GCAACTCAAC GTCAGGATCC TGCAGCTGCT 250CAGGAGGGAG AGGATGAGGG AGCATCTGCA GGTCAAGGGC CGAAGCCTGA 300AGCTGATAGC CAGGAACAGG GTCACCCACA GACTGGGTGT GAGTGTGAAG 350ATGGTCCTGA TGGGCAGGAG ATGGACCCGC CAAATCCAGA GGAGGTGAAA 400ACGCCTGAAG AAGGTGAAAA GCAATCACAG TGTTAAAAGA AGGCACGTTG 450AAATGATGCA GGCTGCTCCT ATGTTGGAAA TTTGTTCATT AAAATTCTCC 500CAATAAAGCT TTACAGCCTT CTGCAAAAAA AAAAAAAAAA 540(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度532個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO17AGCTGTGAGG CAGTGCTGTG TGGTTCCTGC CGTCCGGACT CTTTTTCCTC 50TACTGAGATT CATCTGTGTG AAATATGAGT TGGCGAGGAA GATCGACCTA 100TTATTGGCCT AGACCAAGGC GCTATGTACA GCCTCCTGAA GTGATTGGGC 150CTATGCGGCC CGAGCAGTTC AGTGATGAAG TGGAACCAGC AACACCTGAA 200GAAGGGGAAC CAGCAACTCA ACGTCAGGAT CCTGCAGCTG CTCAGGAGGG 250AGAGGATGAG GGAGCATCTG CAGGTCAAGG GCCGAAGCCT GAAGCTGATA 300GCCAGGAACA GGGTCACCCA CAGACTGGGT GTGAGTGTGA AGATGGTCCT 350GATGGGCAGG AGATGGACCC GCCAAATCCA GAGGAGGTGA AAACGCCTGA 400AGAAGGTGAA AAGCAATCAC AGTGTTAAAA GAAGGCACGT TGAAATGATG 450CAGGCTGCTC CTATGTTGGA AATTTGTTCA TTAAAATTCT CCCAATAAAG 500CTTTACAGCC TTCTGCAAAG AAAAAAAAAA AA 532(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度539個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO18GCCAGGGAGC TGTGAGGCAG TGCTGTGTGG TTCCTGCCGT CCGGACTCTT 50TTTCCTCTAC TGAGATTCAT CTGTGTGAAA TATGAGTTGG CGAGGAAGAT 100CGACCTATTA TTGGCCTAGA CCAAGGCGCT ATGTACAGCC TCCTGAAGTG 150ATTGGGCCTA TGCGGCCCGA GCAGTTCAGT GATGAAGTGG AACCAGCAAC 200ACCTGAAGAA GGGGAACCAG CAACTCAACG TCAGGATCCT GCAGCTGCTC 250AGGAGGGAGA GGATGAGGGA GCATCTGCAG GTCAAGGGCC GAAGCCTGAA 300GCTGATAGCC AGGAACAGGG TCACCCACAG ACTGGGTGTG AGTGTGAAGA 350TGGTCCTGAT GGGCAGGAGG TGGACCCGCC AAATCCAGAG GAGGTGAAAA 400CGCCTGAAGA AGGTGAAAAG CAATCACAGT GTTAAAAGAA GACACGTTGA 450AATGATGCAG GCTGCTCCTA TGTTGGAAAT TTGTTCATTA AAATTCTCCC 500AATAAAGCTT TACAGCCTTC TGCAAAAAAA AAAAAAAAA 539
權(quán)利要求
1.一種分離的肽，其由9至16個(gè)氨基酸組成并包含SEQ ID NO23。
2.權(quán)利要求1的分離肽，其由SEQ ID NO23組成。
3.權(quán)利要求1的分離肽，其由SEQ ID NO21組成。
4.權(quán)利要求1的分離肽，其由SEQ ID NO22組成。
5.測(cè)定體液樣品中對(duì)HLA-A29分子和SEQ ID NO23之復(fù)合物特異性的胞溶性T-淋巴細(xì)胞存在的方法，該方法包括在有利于使所說(shuō)的多肽加工成SEQ IDNO23多肽且使SEQ ID NO23和所說(shuō)的HLA-A29分子結(jié)合的條件下，把在其表面呈遞HLA-A29的細(xì)胞樣品和包含SEQ ID NO23的多肽接觸；使據(jù)信含有所說(shuō)的胞溶性T-淋巴細(xì)胞之體液和所說(shuō)的在其表面呈遞SEQ ID NO23和HLA-A29之復(fù)合物的細(xì)胞接觸；并至少測(cè)定下列之一(i)胞溶性T-淋巴細(xì)胞釋放的腫瘤壞死因子或(ii)呈遞所說(shuō)復(fù)合物的細(xì)胞的溶解，以確定在所說(shuō)的樣品中存在所說(shuō)的胞溶性T-淋巴細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，該方法包括測(cè)定腫瘤壞死因子的釋放。
7.權(quán)利要求5的方法，該方法包括通過(guò)測(cè)定放射性標(biāo)記的鉻的釋放來(lái)測(cè)定溶解。
全文摘要
本文公開(kāi)了一個(gè)腫瘤排斥抗原前體新家族以及編碼它們的核酸分子。這些腫瘤排斥抗原前體被稱為GAGE腫瘤排斥抗原前體,而編碼它們的核酸分子被稱為GAGE編碼分子。本文描述了這些編碼序列、腫瘤排斥抗原以及它們的前體分子的各種診斷和治療用途。本文也描述了腫瘤排斥抗原。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1176647SQ96192256
公開(kāi)日1998年3月18日 申請(qǐng)日期1996年1月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月10日
發(fā)明者皮埃爾·范德布魯根, 貝努瓦·范登艾恩德, 奧利維爾·德巴克, 蒂爾瑞·博恩-法勒爾 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所