專利名稱：錨定蛋白功能的調(diào)節(jié)劑的制作方法
本申請(qǐng)是共同未決美國(guó)專利申請(qǐng)系列No.08/503,226(1995年7月17日申請(qǐng)的)的接續(xù)申請(qǐng)，08/503,226是08/404,731(1995年3月15日申請(qǐng))的接續(xù)申請(qǐng)，08/404,731依次又是共同未決美國(guó)專利申請(qǐng)No.08/344,227(1994年11月23日)的接續(xù)申請(qǐng)。
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)鈣蛋白的磷酸酶活性和調(diào)節(jié)由T細(xì)胞所進(jìn)行的白細(xì)胞介素2的表達(dá)。更具體地說，本發(fā)明涉及用特定的肽抑制神經(jīng)鈣蛋白的磷酸酶活性以及通過用特定的其他肽處理細(xì)胞而提高T細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素2的能力。
本發(fā)明背景神經(jīng)鈣蛋白是Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白磷酸酶，而且是許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的參與者(Guerini and Klee，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 869183-9187(1989))。已從酵母到哺乳動(dòng)物的真核細(xì)胞中鑒定了所述酶。
(Cyert andThorner，J.Cell.Biol.107841a(1989)and Klee et al.，Adv.Enzymol.，61149-200(19840))。由于神經(jīng)鈣蛋白在相同細(xì)胞中可以參與許多的信號(hào)途徑，那么肯定存在一些神經(jīng)鈣蛋白活性特異性目標(biāo)確定方式。一種特異性酶活性的目標(biāo)確定細(xì)胞方式是分區(qū)化。分區(qū)化將信號(hào)途徑分成不同的部分，從而促進(jìn)對(duì)不同刺激的細(xì)胞應(yīng)答的特異性。通過酶與特異性錨定蛋白的相互作用而產(chǎn)生特定酶的分區(qū)化。例如，cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)通過與A激酶錨定蛋白(AKAP)的結(jié)合而錨定在特定的細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)。由于已經(jīng)表明AKAP可與PKA以外的蛋白質(zhì)結(jié)合，所以在本文中，通常將該蛋白質(zhì)家族稱為錨定蛋白。(Hirsch et al.，J.Biol.Chem.2672131-2134(1992))。cAMP通過與PKA全酶的調(diào)節(jié)亞單位(R)結(jié)合而激活PKA，然后引起活性催化亞單位(C)的釋放。存在兩類R亞單位分別形成I型和II型PKA全酶的RI和RII。這些PKA異構(gòu)體的亞細(xì)胞分布看起來是不同的。據(jù)報(bào)道RI異構(gòu)體(RIα和RIβ)明顯屬于胞質(zhì)的，而且被排除在核區(qū)外，而高達(dá)75％的RII異構(gòu)體(RIIα或RIIβ)是顆粒狀的，而且與質(zhì)膜、細(xì)胞骨架組分、分泌性顆粒、高爾基體、中心體，也可能與核有聯(lián)系。
已經(jīng)在許多器官中鑒定了錨定蛋白。已經(jīng)鑒定了至少七種與加州海兔，(一種海洋無脊椎動(dòng)物)中的PKA調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合的蛋白(Cheley et al.，J.Biol.Clhem.，2692911-2920(1994))。這些蛋白質(zhì)之一被富集在粗膜組分和紫杉酚固定的微管中，而且可以由此將微管錨定到細(xì)胞膜上并結(jié)合PKA。已經(jīng)鑒定的一種哺乳動(dòng)物錨定蛋白就是與微管有關(guān)的；微管相關(guān)蛋白2(MAP2)將PKA附著到細(xì)胞骨架上(Threurkauf and Vallee，J.Biol.Chem.，2573284-3290(1982)and DeCamilli et al.，J.CellBiol.，103189-203(1986))。在MAP2上的PKA結(jié)合位點(diǎn)是位于該分子氨基末端區(qū)域的31個(gè)殘基的肽(Rubino etal.，Neuron，，3631-638(1989)and Obar et al.，Neuron，3639-645(1989))。
與微管有關(guān)的另一錨定蛋白，AKAP 150，積累在與微管緊密相關(guān)的樹突中(Glantz et al.，Mol.Biol.Cell，31215-1228(1992))。AKAP 150位于數(shù)種神經(jīng)元細(xì)胞中，而且是該錨定蛋白家族是錨定蛋白家族的成員哺乳動(dòng)物腦中主要錨定蛋白質(zhì)的。該家族的其他成員包括在牛腦中發(fā)現(xiàn)的AKAP 75和在人腦中發(fā)現(xiàn)的AKAP 79(Glantz et al.，J.Biol.Chem.，26812796-12804(1993))。AKAP 75通過兩個(gè)靠近AKAP 75 N末端的不連續(xù)區(qū)而與細(xì)胞骨架元件結(jié)合。AKAP 79明顯存在于人前腦突觸后密質(zhì)(PSDs)中(Carr et al.，J.Biol.Chem.，26716816-16823(1992))。
也已被其他錨定蛋白表征了。已經(jīng)表明粒層細(xì)胞暴露于濾泡刺激激素和雌二醇可以提高80kDa AKAP的表達(dá)(Carr et al.，J.Biol.Chem.，26820729-20732(1993))。已經(jīng)從人甲狀腺cDNA文庫(kù)中克隆了另一AKAP，Ht31(Carret al.，J.Biol.Chem.，267；13376-13382(1992))。另一錨定蛋白AKAP95在細(xì)胞周期中改變其細(xì)胞內(nèi)位置。AKAP95是分裂間期的完整核蛋白，但在有絲分裂期間，當(dāng)核膜分裂時(shí)，AKAP95與胞質(zhì)PKA有關(guān)。這表明在與細(xì)胞周期相關(guān)的cAMP應(yīng)答事件中，AKAP95在以PKA特定異構(gòu)體的活性為靶的過程中起作用(Coghlan et al.，J.Biol.Chem.，2697658-7665(1994))。其他已知的錨定蛋白包括將PKA與高爾基體相連的85 kDa AKAP(Rois et al.，EMBO J.，111723-1731(1992))和將PKA與中心體結(jié)合的350 kDa AKAP(Keryer et al.，Exp.Cell Res.，204230-240(1993))。
已知的錨定蛋白通過一種普通的機(jī)制結(jié)合PKA。盡管錨定蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)不是保守的， 但是都有包括一個(gè)兩親的螺旋區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)基元(Scott andMcCartney，Mol.Endo.，85-11(1994))。模擬錨定蛋白PKA結(jié)合區(qū)螺旋結(jié)構(gòu)的肽可以阻斷錨定蛋白與PKA調(diào)節(jié)亞單位的結(jié)合。通過氨基酸取代破壞所述肽的螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)破壞其對(duì)PKA-錨定蛋白結(jié)合的阻斷作用(Carr et al.，J.Biol.Chem.，26614188-14192(1991))，這表明PKA結(jié)合發(fā)生在錨定蛋白的兩親螺旋區(qū)，而且由錨定蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)控制。PKA通過錨定蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合和定位為分離象神經(jīng)鈣蛋白這類激酶提供了方法，所述激酶在可能以途徑特異性方式起作用的許多信號(hào)途徑中是共通的。
PKA在許多細(xì)胞內(nèi)途徑中起作用。例如，在海馬神經(jīng)元中AKAP79和PKA之間結(jié)合的抑制已表明是抑制α-氨基-3羥基-5-甲基-4-異噁唑-丙酸/卡英酸谷氨酸鹽受體。(Rosenmund et al.，Nature，368853-856(1994))。這表明PKA調(diào)節(jié)這些受體。通過可逆地磷酸化糖原磷酸化酶以應(yīng)答激素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)cAMP的增加，PKA還可調(diào)節(jié)糖原磷酸化酶的活性(Walsh et al.，J.Biol.Chem.，2433763-3765(1969))。已表明cAMP還抑制通過MAP激酶途徑傳遞信號(hào)(Wu et al.，Science，2621065-1072(1993))。通過激活抑制經(jīng)Ras的Raf-1活化作用的PKA，可以阻斷MAP激酶途徑，從而介導(dǎo)上述抑制作用(Vojtek et al.，Cell，74205-214(1993)and Hafner et al.，Mol.CellBiol.，146696-6703(1994))。這些途徑在許多細(xì)胞類型中是重要的，而且意味著許多細(xì)胞功能，例如白細(xì)胞介素2基因的轉(zhuǎn)錄激活在T細(xì)胞活化中是重要的(Weiss and Littman，Cell，76263-274(1994)；Owaki et al.，EMBOJ.，124367-4373(1993))。
象PKA一樣，神經(jīng)鈣蛋白與T細(xì)胞活化有關(guān)(Clipstone andCrabtree，Nature，357695-697(1992)；O’Keefe et al.，Nature，357692-694(1992))。在T細(xì)胞中，神經(jīng)鈣蛋白參與T細(xì)胞受激后IL-2表達(dá)的調(diào)節(jié)(Weiss and Littman，同上文)。已經(jīng)表明活化T細(xì)胞的核因子(NFATP)是神經(jīng)鈣蛋白磷酸酶活性的底物。已經(jīng)表明在T細(xì)胞激后，神經(jīng)鈣蛋白介導(dǎo)的NFATP去磷酸化使得NFATP從胞質(zhì)易位到核，在那里NFATP與Fos和Jun相互作用誘導(dǎo)IL-2基因的表達(dá)(Jainetal.，Nature，365352-355(1993))。
神經(jīng)鈣蛋白在T細(xì)胞激活中的作用提供了治療上和各種藥物的對(duì)象，用來治療已證明抑制神經(jīng)鈣蛋白的T細(xì)胞介導(dǎo)的失調(diào)。已在臨床中使用了兩種神經(jīng)鈣蛋白抑制藥物，環(huán)孢菌素A(環(huán)孢菌素cyclosporin)和FK506(Thomsonand Starzl.Immunol.Rev.，13671-98(1993))。只有在與稱為免疫親和蛋白(chclophilin and FKBP 12，分別)的不同細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合后，環(huán)孢菌素和FK506 才會(huì)抑制神經(jīng)鈣蛋白(Schreiber and Crabtree，ImmunologyToday，13136-142(1992))。因此，環(huán)孢菌素和FK506起前藥作用。在與其相應(yīng)的免疫親和蛋白結(jié)合后，藥物/免疫親和蛋白復(fù)合物結(jié)合神經(jīng)鈣蛋白，由此抑制磷酸酶活性。
在器官移植后的移植排異治療中，已經(jīng)最有效地使用了神經(jīng)鈣蛋白抑制作用。已經(jīng)在腎、肝、心、肺和骨髓移植中使用了環(huán)孢菌素和FK506。加拿大多中心移植研究組，N.Engl.J.Med.，3141219-1225(1986)；Oyer etal.，Transplant Proc.)15Suppl 12546-2552(1983)；Starzl et al.，N.Engl.J.Med.，305266-269(1981)；多倫多肺移植組，JAMA，2592258-2262(1988)；和Deeget al.，Blood，651325-1334(1985)。在移植后，這些藥物的使用顯著地延長(zhǎng)了移植存活并降低了發(fā)病率(Najarian et al.，Ann.Surg.，201142-157(1985)and Showstack et al.，N.Engl.J.Med.，3211086-1092(1989))。
還在各種自體免疫相關(guān)的疾病中使用了環(huán)孢菌素。眼色素層炎在治療后幾周內(nèi)得到改善，但在不連續(xù)使用環(huán)孢菌素后很快復(fù)發(fā)(Nussenblatt et al.，Am J.Ophthalmol.，96275-282(1983))相似地，用環(huán)孢菌素治療，牛皮癬通常得到改善，但在治療后，很快復(fù)發(fā)(Ellis et al.，JAMA，2563110-3116(1986))。當(dāng)在兩個(gè)月的胰島素治療中施用環(huán)孢菌素，在I型和II型糖尿病初期，可以誘發(fā)并延長(zhǎng)胰島素非依賴的“蜜月”期(Feutren et al.，Lancet，2119-124(1986)and Bougneres et al.，N.Engl.J.Med.，318663-670(1988))。各種腎病，包括minimal-change focal和segmental，膜性和IgA介導(dǎo)的腎病對(duì)環(huán)孢菌素也是敏感的，盡管觀察到的蛋白尿降低可能是由于腎小球過濾速率的降低而不是基膜的愈合引起的。(Tejani et al.，Kidney Intl.，29206(1986))。環(huán)孢菌素的施用對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎還有劑量依賴作用，盡管這種施用與高發(fā)生率的腎中毒有關(guān)(F O rre et al.，Anthritis Rheum.，3088-92(1987))。
正如上面提到的，環(huán)孢菌素與腎中毒有關(guān)(Mason，Pharmacol.Rev.，42423-434(1989))。實(shí)際上所有用環(huán)孢菌素治療的患者都會(huì)發(fā)生腎功能降低(Kahan，N.Engl.J.Med.，3211725-1738(1989))。但在終止環(huán)孢菌素治療后這種情況一般可以得到回復(fù)。不幸的是，在器官移植受體中，其他常用的免疫抑制劑代替環(huán)孢菌素會(huì)帶來高移植排異風(fēng)險(xiǎn)。在腎移植患者中，這可以用透析來得到控制。在已經(jīng)接受了心、肺或肝移植的患者中，移植排異可能是致命的。盡管通常比腎中毒的發(fā)生率低，但神經(jīng)中毒性和肝毒害性還是與環(huán)孢菌素治療有關(guān)(de Groen et al.，N.Engl.J.Med.，317861-866(1987)and Kahan et al.，Transplantation，43197-204(1987))。
在施用FK506時(shí)，毒性也變得明顯。象環(huán)孢菌素一樣，F(xiàn)K506也與腎中毒有關(guān)(Petersetal.，Drugs，4746-794(1993))。臨床表現(xiàn)，損傷形態(tài)和發(fā)生率均與環(huán)孢菌素的相似(McCauley，Curr.Op.Nephrol.Hyperten.，2662-669(1993))。神經(jīng)毒性也與FK506有關(guān)(Eidelman et al.，Transplant.Proc.，233175-3178(1991)and Fung et al.，Transplant.Proc.，233105-3108(1991))。與環(huán)孢菌素相反，F(xiàn)K506有親肝作用而不是肝毒害作用(Peters et al.，同上文)。
從免疫抑制劑，例如環(huán)孢菌素和FK506的顯著潛在毒性可以清楚地看出，本領(lǐng)域需要其他抑制神經(jīng)鈣蛋白的試劑。這些試劑最好具有比現(xiàn)有的試劑更低的副作用，并因此可以改進(jìn)免疫抑制劑治療。另外，還需要在T細(xì)胞中抑制PKA的試劑，以便提高所述細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素2的水平。
發(fā)明綜述本發(fā)明部分基于神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合AKAP 79的發(fā)現(xiàn)。通過結(jié)合PKA和神經(jīng)鈣蛋白，AKAP 79共定位可以通過特定信號(hào)途徑調(diào)節(jié)的激酶和磷酸酶。由此，本發(fā)明提供了分離神經(jīng)鈣蛋白以及抑制細(xì)胞中神經(jīng)鈣蛋白活性的的組合物和方法。所述分離方法包括將細(xì)胞組分與固定在固體底物上的AKAP 79或其神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合片段接觸，然后從中洗脫神經(jīng)鈣蛋白。神經(jīng)鈣蛋白抑制方法包括將細(xì)胞與AKAP79或其神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合片段接觸。優(yōu)選地，神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合的肽不與PKA結(jié)合。優(yōu)選的肽含有下列氨基酸序列Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro(SEQ ID NO1)在本發(fā)明神經(jīng)鈣蛋白抑制方法中可選的肽包括Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Leu-Gln(SEQ IDNO2)和Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Phe-Lys(SEQ IDNO3)這些肽與結(jié)合神經(jīng)鈣蛋白的AKAP79的氨基酸序列同源。盡管這些肽與FKBP12的神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合區(qū)相似，但是與FK506/FKBP12復(fù)合物的神經(jīng)鈣蛋白抑制作用不同，這些肽不需要與另一分子作用就可以抑制神經(jīng)鈣蛋白。
可以對(duì)這些肽進(jìn)行修飾，例如與脂溶性部分結(jié)合，以便于進(jìn)入細(xì)胞。例如，這些肽可以與肉豆蔻酸結(jié)合。另外，可以將這些肽包裝在可以與細(xì)胞膜融合并將所述肽釋放到細(xì)胞中的脂質(zhì)體中。
本發(fā)明的另一方面是確定細(xì)胞是否含有神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合及PKA結(jié)合錨定蛋白的方法。所述方法通常包括裂解細(xì)胞以形成裂解產(chǎn)物；將裂解產(chǎn)物與固體支持物保溫，所述固體支持物含有固定于其上的神經(jīng)鈣蛋白分子；從固體支持物上洗脫裂解產(chǎn)物；將所述固體支持物與標(biāo)記的PKA調(diào)節(jié)亞單位接觸，從固體支持物上洗掉未結(jié)合的調(diào)節(jié)亞單位；檢測(cè)保留在固體支持物上的標(biāo)記；由此確定在細(xì)胞中是否存在神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合的和PKA結(jié)合的錨定蛋白。另外，可以將PKA調(diào)節(jié)亞單位固定在固體支持物上，神經(jīng)鈣蛋白可以作為標(biāo)記的分子。通常，PKA調(diào)節(jié)亞單位是RII亞單位。
這些方法對(duì)于鑒定與PKA和神經(jīng)鈣蛋白二者都結(jié)合的其它蛋白質(zhì)也是有用的。其它所述蛋白質(zhì)的鑒定為治療提供了組織特異性靶。
本發(fā)明還包括鑒定調(diào)節(jié)神經(jīng)鈣蛋白和神經(jīng)鈣蛋白錨定蛋白之間結(jié)合化合物的方法。神經(jīng)鈣蛋白或錨定蛋白可以與固體底物結(jié)合。用可檢測(cè)標(biāo)記方法標(biāo)記未結(jié)合的配對(duì)物。在存在待測(cè)化合物的條件下，保溫結(jié)合的配對(duì)物。通過觀察與固定的結(jié)合配對(duì)物相結(jié)合的標(biāo)記物的量來確定待測(cè)化合物對(duì)神經(jīng)鈣蛋白和神經(jīng)鈣蛋白錨定蛋白質(zhì)之間結(jié)合的作用。存在待測(cè)化合物時(shí)結(jié)合的標(biāo)記量比沒有待測(cè)化合物時(shí)結(jié)合的標(biāo)記量減少，說明了待測(cè)化合物是神經(jīng)鈣蛋白和神經(jīng)鈣蛋白錨定蛋白之間結(jié)合的抑制劑。其它的檢測(cè)方法也可能被采用，例如閃爍近似檢測(cè)法。
本發(fā)明的另一方面還包括提高T細(xì)胞白細(xì)胞介素2表達(dá)水平的方法。，T細(xì)胞中PKA激酶活性的抑制或PKA的定位提高了在調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素2基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子元件的控制下蛋白質(zhì)的表達(dá)。這些方法通常包括將T淋巴細(xì)胞與下列氨基酸序列之一接觸Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile(SEQ ID NO5)或Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr(SEQ ID NO9)。
SEQ ID NO5的肽是抑制PKA激酶活性的肽。SEQ ID NO9的肽是與HT31錨定蛋白的PKA結(jié)合區(qū)同源的肽。可以將這些肽進(jìn)行修飾以便于進(jìn)入細(xì)胞或如上所述包裝到脂質(zhì)體中。本發(fā)明設(shè)想了使用這些肽的方法的多種用途。例如，可以用所述方法刺激免疫反應(yīng)，刺激用于選擇性克隆擴(kuò)展的活化的T細(xì)胞或提高T細(xì)胞對(duì)試驗(yàn)性刺激的反應(yīng)以評(píng)價(jià)T細(xì)胞生物學(xué)中的早期過程和免疫反應(yīng)的激活。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1A-1B說明全序列AKAP79和AKAP79的神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合片段對(duì)神經(jīng)鈣蛋白磷酸酶活性的抑制作用。
圖2A-2C說明II型PKA和神經(jīng)鈣蛋白的亞細(xì)胞定位以及II型PKA和神經(jīng)鈣蛋白的共定位。
圖3說明克隆11.1和人神經(jīng)鈣蛋白異構(gòu)體11.1之間的同源性。
圖4說明用二萜衍生物和IBMX處理Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的增加。
圖5A-5H是說明PKA抑制作用和離位作用對(duì)由白細(xì)胞介素2啟動(dòng)子控制的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄的作用的FACS圖。
發(fā)明的詳細(xì)描述按照Stewart和Young(Solid Phase Peptide Synthesis，2nd ed.，PierceChemical Company，(1984))或Tam等人(J.Am.Chem.Soc.，1056442(1983))(兩篇文獻(xiàn)均引入本文作為參考)描述的常規(guī)技術(shù)，在溶液中或固體支持物上，可以合成本發(fā)明方法中所用的肽。用Eicholtz等人(J.Biol.Chem.，2681982-1986(1993))(該文獻(xiàn)引入本文作為參考)描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以將所述肽肉豆蔻酸化。按美國(guó)專利4,766,046；5,169,637；5,180,713；5,185,154；5,204,112和5,252,263和PCT專利申請(qǐng)92/02244(上述文獻(xiàn)引入本文作為參考)中描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將所述肽包被在脂質(zhì)體中。
下列實(shí)施例是為了說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1描述了神經(jīng)鈣蛋白與AKAP79和PKA的關(guān)系。實(shí)施例2涉及用來自AKAP79氨基酸序列的肽抑制神經(jīng)鈣蛋白活性。實(shí)施例3說明了II型PKA和神經(jīng)鈣蛋白的亞細(xì)胞分布。實(shí)施例4描述了說明AKAP79和神經(jīng)鈣蛋白之間生理結(jié)合的雙雜交試驗(yàn)。實(shí)施例5論述了對(duì)AKAP79和神經(jīng)鈣蛋白的分析。實(shí)施例6描述了用神經(jīng)鈣蛋白突變體定義AKAP79結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)施例7涉及AKAP79和PKA RI亞單位之間的相互作用。實(shí)施例8描述了篩選PKA分區(qū)化抑制劑的方法。實(shí)施例9描述了錨定蛋白在IL-2表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用。實(shí)施例10涉及其他AKAP79結(jié)合蛋白的鑒定。實(shí)施例11描述了AKAP79和PKC之間的相互作用。實(shí)施例12涉及錨定蛋白潛在的治療應(yīng)用。
實(shí)施例1本實(shí)施例說明了神經(jīng)鈣蛋白與AKAP79和PKA的天然關(guān)系。因此，AKAP79的功能是共定位普遍存在的激酶和普遍存在的磷酸酶。這種共定位通過酶的磷酸化或去磷酸化而提供了酶在信號(hào)途徑中的特異性調(diào)節(jié)。
用Harlowe和Lane(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，Press，ColdSpring Harbor，NY(1988))描述的CaN A或CaN B特異性的親和純化的抗體可以從鈣調(diào)蛋白瓊脂糖純化的牛腦提取物中得到神經(jīng)鈣蛋白(CaN)的免疫沉淀，最后使用緩沖液A(10mM HEPES pH7.9，1.5mMMgCl，10mM KCl，1mM PMSF和10μMIBMX)+0.4M NaCl的洗滌除外。在用0.1mM cAMP洗脫免疫沉淀后，按Scott等人所述的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824379-4383(1985))測(cè)量PKA活性。力加入0.1mM32P-ATP(1.5×105cpm/nmol)引發(fā)免疫沉淀的蛋白質(zhì)的磷酸化，30℃下30分鐘后，加入SDS加樣緩沖液來終止反應(yīng)，然后進(jìn)行SDS-PAGE。按Coghlan等人(J.Biol.Chem.，2697658-7665(1994))(引入本文作為參考)描述的方法，用cAMP瓊脂糖從腦提取物的30-60％(NH4)2SO4級(jí)分中純化PKA R亞單位，用0.5mM Ht31肽(SEQ ID NO4)洗脫蛋白質(zhì)這一步外。按Coghlan等人所述方法(同上文)完成Western印跡和PKA RII涂覆(overlay)。
在鈣調(diào)蛋白純化的提取物中檢測(cè)激酶活性，所述提取物在CaN免疫沉淀中被富集123±3.6倍(±標(biāo)準(zhǔn)偏差；n＝3)，其激酶活性被抑制PKA激酶活性的肽，PKI肽(SEQID NO5)特異性地抑制，表明PKA的催化(C)亞單位是所分離的復(fù)合物的成分。AKAP 79(AKAP75)和RII的牛同源物均是C亞單位的底物，而且也存在于免疫沉淀中并在加入cAMP和32P-ATP后被磷酸化。在互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，在cAMP瓊脂糖上用親和層析，從牛腦的粗提取物中分離PKA的R亞單位。用Ht31肽處理親和柱，特異性地從cAMP結(jié)合的RII中洗脫AKAP75，同時(shí)釋放CaN A和B亞單位。在Western印跡中檢測(cè)的裂解產(chǎn)物中所有CaN的約5％與一樣AKAP75和RII有關(guān)。綜上所述，這些結(jié)果表明PKA和CaN均與錨定蛋白質(zhì)有關(guān)。
實(shí)施例2
本實(shí)施例表明來自AKAP79的肽對(duì)神經(jīng)鈣蛋白磷酸酶活性的抑制作用。
為了確定AKAP79肽結(jié)合是否是抑制性的，在存在重組AKAP79的條件下檢測(cè)神經(jīng)鈣蛋白(CaN)活性。簡(jiǎn)而言之，按Carr等人(J.Biol.Chem.，26716816-16823(1992))所述(引入本文作為參考)在大腸桿菌中表達(dá)重組AKAP 79。按Perrino等人(J.Biol.Chem.，26715965-15969(1992))所述(引入本文作為參考)在Sf9細(xì)胞中表達(dá)CaN和組成型活性截?cái)嗤蛔凅wCaN420(一種截?cái)嗟模珻aN的Ca2+/鈣調(diào)蛋白非依賴性的組成型活性形式(Perrino et al.，J.Biol.Chem.)，在印刷中)，然后在鈣調(diào)蛋白瓊脂糖上純化。按Perrino等人所述(同上文)測(cè)量對(duì)32P RII肽底物的磷酸酶活性。在圖1B中注明的濃度范圍內(nèi)，將CaN(30nM)和鈣調(diào)蛋白(100nM)和32P RII肽(22μM)與AKAP79蛋白和AKAP79肽(SEQ ID NO1-氨基酸81-102)一起保溫。從CaN420檢測(cè)中略去鈣調(diào)蛋白。通過閃爍計(jì)數(shù)，在三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中在各三份樣品中測(cè)量從底物中釋放的32P。通過數(shù)據(jù)的線性回歸分析確定重組AKAP 79對(duì)CaN的抑制常數(shù)(Ki)。用固定在Km(42μM)的底物濃度，通過確定IC50來測(cè)定AKAP79的Ki值。
圖1A表明就磷酸化的RII肽底物而言，在非競(jìng)爭(zhēng)性方式中全序列CaN(Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的)(圓圈)和CaN420(方塊)的AKAP79抑制的Lineweaver-Burk圖?？招姆?hào)表示在沒有AKAP79條件下的磷酸酶活性，實(shí)心符號(hào)表示存在AKAP79時(shí)的磷酸酶活性。對(duì)應(yīng)于AKAP79肽的合成肽抑制全序列CaN(實(shí)心圓圈)和CaN420，而Ht31肽不是CaN的抑制劑(圖1B)。觀察到的抑制作用是神經(jīng)鈣蛋白特異性的對(duì)肽濃度高達(dá)0.4mM時(shí)，AKAP79肽并不顯著地影響蛋白磷酸酶1(空心菱形)或2A(叉)的活性。盡管在AKAP 79和FKBP-12上的CaN結(jié)合位點(diǎn)相似，但它們可能在功能上差異顯著FK506(2μM)不影響抑制效力，而重組AKAP79沒有表現(xiàn)出對(duì)熒光性肽底物的肽基脯氨酰基異構(gòu)酶活性。此外，F(xiàn)K506/FKBP與CaN A亞單位相互作用所需的CaN B亞單位對(duì)于AKAP79與CaN A亞單位相互作用來說，并不是必需的。而且FK506/FKBP與CaN A相互作用是鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性的，而AKAP79對(duì)神經(jīng)鈣蛋白活性的抑制作用是鈣/鈣調(diào)蛋白非依賴性的?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明非活性狀態(tài)的CaN由AKAP79以與結(jié)合了錨定蛋白的PKA相類似的方式定位。
實(shí)施例3本實(shí)施例說明在各種組織中II型PKA和神經(jīng)鈣蛋白的亞細(xì)胞分布。
通過與目標(biāo)亞單位的關(guān)系來限定許多蛋白激酶和蛋白質(zhì)磷酸酶的亞細(xì)胞位置。由于AKAP79在定位PKA和CaN中的雙重功能，所以它是這類調(diào)節(jié)蛋白的一個(gè)新成員。
培養(yǎng)細(xì)胞，用福爾馬林固定，按Rosenmund等人(Nature，368853-856(1994))所述將其免疫染色。用結(jié)合FITC的抗山羊二級(jí)抗血清進(jìn)行RII染色。在CaN的染色中，使用生物素化的抗兔二級(jí)抗血清和鏈霉抗生物素蛋白-Texas-Red(Jackson)。用帶有尼康optiphot 2顯微鏡的Biorad MRC-600共焦點(diǎn)激光掃描系統(tǒng)(A1和A2過濾儀)得到圖像，所述顯微鏡備有60×planappo彩色(1.6NA)浸沒透鏡。共焦點(diǎn)切片的絕對(duì)厚度在1.5-2μm之間。
在牛、豬、兔和鼠腦中觀察到AKAP79同源物。這表明PKA和CaN的共定位可能是使神經(jīng)元適應(yīng)特異性信號(hào)傳導(dǎo)過程的一種普遍現(xiàn)象。用免疫細(xì)胞化學(xué)方法，在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中研究II型PKA和CaN的亞細(xì)胞分布。RII(圖2A中綠標(biāo)記)和CaN(圖2B中的紅標(biāo)記)的染色圖是區(qū)域分布的，而且在軸突處重疊(在圖2C中，RII是紅的，CaN是綠的)。這些發(fā)現(xiàn)與通過錨定蛋白質(zhì)的II型PKA和CaN的共定位一致，而且表明在調(diào)節(jié)突觸傳遞中對(duì)三元復(fù)合物的作用。這與試驗(yàn)表明的RII和AKAP79在這些細(xì)胞中的共定位相一致，而且通過研究表明AKAP79，II型PKA和CaN是突觸后密質(zhì)的組分。定位的三元傳導(dǎo)復(fù)合物的潛在底物可能包括受錨定蛋白定靶的PKA調(diào)節(jié)的AMPA/kainate受體。
實(shí)施例4本實(shí)施例說明在酵母雙雜交試驗(yàn)中AKAP79和神經(jīng)鈣蛋白之間的相互作用。用AKAP79為“餌”，發(fā)現(xiàn)由來自鼠T細(xì)胞文庫(kù)的cDNA編碼的神經(jīng)鈣蛋白與AKAP79結(jié)合。
基本按Durfee等人(Gene and Development 7555-567(1993))所述(該文獻(xiàn)引入本文作為參考)完成所述試驗(yàn)?！鞍小焙汀梆D”是兩個(gè)質(zhì)粒，分別含有部分Gal-4轉(zhuǎn)錄因子?！梆D”質(zhì)粒(pAS1)是一個(gè)兩微米的質(zhì)粒，帶有與Gal-4DNA結(jié)合亞單位(Keeganetal.，Science，231699-704(1986)描述的氨基酸1-147，引入本文作為參考)相連的ADH啟動(dòng)子，其后接有血細(xì)胞凝集素(hemagglutin)(HA)片段，多克隆位點(diǎn)和ADH終止子。用SC-Trp培養(yǎng)基保持選擇?！鞍小睒?gòu)建體是leu2，2微米的質(zhì)粒，含有攜帶Gal-4轉(zhuǎn)錄活化區(qū)II(Ma and Ptashne，Cell，48847-853(1987)中所述氨基酸768-881，引入本文作為參考)的ADH啟動(dòng)子和終止子，其后接有多克隆位點(diǎn)。在構(gòu)建小鼠T細(xì)胞cDNA融合文庫(kù)時(shí)使用載體pACT。在篩選中使用的啤酒酵母y190的基因組中整合了兩個(gè)報(bào)告基因。所述報(bào)告基因位于含有Gal-4結(jié)合位點(diǎn)的Gal-1啟動(dòng)子的控制下。如果由餌質(zhì)粒和靶質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)相連，則同時(shí)帶有Gal-4轉(zhuǎn)錄因子的亞單位連在了一起，并使其起到啟始報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的作用。
從pET11d主鏈中分離含有AKAP79編碼區(qū)的1.3kb NcoI/BamHI片段，然后與pAS1相連以作為用于篩選的“餌”。用標(biāo)準(zhǔn)的乙酸鋰-PEG轉(zhuǎn)化方法，將1μg該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化y190 MATa和y190 MATα中。檢測(cè)每種接合型(y190A pASI AKAP 791-4和y190αpAS1 AKAP 791-4)中的四個(gè)分離物與含有PKA調(diào)節(jié)亞單位(RII氨基酸1-89)的融合構(gòu)建體pACT-RII相互作用的能力。于30℃在YEPD(1％Bacto-酵母提取物，2％Bacto-胨，2％右旋糖和2％Bacto瓊脂)上過夜接合菌株來完成，然后在SC-Leu-Trp平皿上篩選二倍體。根據(jù)半乳糖苷酶活性來檢測(cè)作為報(bào)告基因的E.coli lac Z基因。將接合的菌株復(fù)制到已經(jīng)用Hybond-N(Amersham)濾紙覆蓋了的SC-Leu-Trp平皿上，然后過夜生長(zhǎng)。將濾紙?jiān)谝旱蟹?分鐘以使酵母裂解。用在60mM Na2HPO4，40mM NaH2PO4，10mM KCl和10mM MgSO4中的約3ml 0.1％X-gal飽和3 MM紙圓片。將裂解的酵母濾紙放在圓片的頂上，使其在30℃培養(yǎng)約1-2小時(shí)。通過將酵母斑變成藍(lán)色來表明β-gal活性陽性的含有pAS1AKAP 79和pACT RII的二倍體菌株融合。作為對(duì)照，與空pACT對(duì)照接合時(shí)，餌AKAP 79質(zhì)粒仍為白色。
使y190AAKAP 79(分離物1和2)和y190a AKAP 79(分離物1和2)在每50mlSC-Trp培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到密度為2×107個(gè)細(xì)胞/ml來檢測(cè)Gal-4AKAP 79融合蛋白。以3000×g將細(xì)胞離心10分鐘，然后在25 mM Tris pH8，5mMEDTA，5mM EGTA，2mM鄰二氮雜菲，1mM DTT，25μM 4-(2-氨乙基)-苯磺酰基氟化物-HCl，分子量239.5(AEBSF)，1mM benzanidine，1μg/mlPLACC(胃蛋白酶抑制素，亮肽素，抑肽酶，鈣蛋白酶I和II)，20μg/ml抑氨肽酶B素裂解緩沖液中用200μl玻璃珠(大小為425-600微米)裂解。再將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)1分鐘，然后在冰上1分鐘，共進(jìn)行24分鐘(12個(gè)循環(huán))。確定蛋白質(zhì)濃度，將總蛋白質(zhì)中的30μg上樣到10％SDS-PAGE凝膠上。將凝膠濕轉(zhuǎn)移至Immobilon-P(Millipore)上，通過使用抗HA單克隆抗體12CA5(Bab Co.，Berkeley，CA)和山羊抗小鼠IgG堿性磷酸酶結(jié)合的二級(jí)抗血清(Biorad，Hercules，CA)的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)。約100 kDa的Gal-4AKAP 79融合蛋白是很容易檢測(cè)到的，這表明在這些菌株中存在大小適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物。
選擇y190A pAS1 AKAP 79分離物以篩選pACT鼠T細(xì)胞cDNA文庫(kù)。收集500ml SC-Trp培養(yǎng)物(OD600＝0.6-0.8)，用100ml蒸餾水洗滌，然后再沉淀。取出沉淀放在50ml LiSORB(100mM乙酸鋰，10 mM Tris pH8，1mM EDTA pH8和1M Sorbitol)中，轉(zhuǎn)移到1升燒瓶中，在30℃以220 RPM振蕩培養(yǎng)30分鐘。然后沉淀細(xì)胞，用625μILiSORB再懸浮，接著放在冰上同時(shí)制備DNA。
將400μl 10mg/ml鮭精DNA煮沸10分鐘，然后加入500μl LiSORB并使其緩慢冷卻到室溫。將來自Mu T細(xì)胞文庫(kù)的DNA以1mg/ml加入(40-50μg)。將冰冷的酵母培養(yǎng)物分配到10個(gè)含120μl制得的DNA的Eppendorf試管中。在30℃，以220RPM溫育試管。30分鐘后，900μl在100mM乙酸鋰，10mM Tris pH8和1mMEDTA pH8中的40％PEG3350與各培養(yǎng)物混合，然后再培養(yǎng)30分鐘。集中樣品，取小樣(5μl)來檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率并涂布在SC-Leu-Trp平皿上。將剩余的細(xì)胞加到100ml SC-Leu-Trp-His培養(yǎng)基中，然后在30℃生長(zhǎng)，同時(shí)以220 RPM振蕩。將收集的細(xì)胞再懸浮在5.5mlSC-Leu-Trp-His+50 mM 3AT(3-氨基三唑)培養(yǎng)基中，將300μl的小樣涂布在150mm SC-Leu-Trp-His+50mM 3AT上，在30℃使其生長(zhǎng)1星期。
約4天后，計(jì)數(shù)滴定平皿并篩選了1.1×105個(gè)菌落。在文庫(kù)平皿上完成大規(guī)模的β-gal試驗(yàn)并從單菌落中分離了10個(gè)陽性克隆。這些菌落中的一個(gè)實(shí)際上生長(zhǎng)得比其余的大，并將其命名為克隆11.1.從這些菌株制備總酵母DNA并分離leu2質(zhì)粒DNA。用“獲救”的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化起始y190ApAS1 AKAP79餌菌株和y190a。在y190ApAS1 AKAP 79中，只有克隆11.1仍為β-半乳糖苷酶活性陽性。作為負(fù)對(duì)照的含pACT克隆11.1的y190a仍為白色。
用核酸內(nèi)切酶XhoI進(jìn)行限制消化，釋放出一個(gè)2.3kb的插入片段，以向前和相反的反向?qū)⑺鲑|(zhì)粒測(cè)序。在ABI373A自動(dòng)測(cè)序儀(AppliedBiosystems，Inc.)上分析使用在雙鏈模板上的對(duì)稱聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的染料脫氧終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems，Inc.Foster City，CA)之反應(yīng)。來自克隆11.1的序列有一487個(gè)氨基酸長(zhǎng)(SEQ ID NO6)的開放閱讀框架，它正好與pACT的Gal-4活化區(qū)融合。檢索NIH序列數(shù)據(jù)庫(kù)， 發(fā)現(xiàn)該序列與人鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白質(zhì)磷酸酶(神經(jīng)鈣蛋白)非常同源?？寺?1.1和人A1異構(gòu)體之間的計(jì)算機(jī)分析表明在核酸水平有80％的一致性，在氨基酸水平有93％的一致性(圖3)。在小鼠11.1序列中沒有人序列中的前10個(gè)氨基酸和18個(gè)氨基酸的插入片段?？寺?1.1與小鼠神經(jīng)鈣蛋白Aβ序列很相近，但在C末端明顯不同。同樣，人神經(jīng)鈣蛋白A1和人神經(jīng)鈣蛋白A2異構(gòu)體非常同源，但在其3’末端卻彼此不同。
通過將含神經(jīng)鈣蛋白pACT的菌株與不相關(guān)的餌菌株接合來說明AKAP79與神經(jīng)鈣蛋白之間相互作用的特異性。用含有與RII(1-89)，酪蛋白激酶1，磷酸二酯酶32(HDUN1)和AKAPHt31融合的pAS1的菌株，按上述方法完成交換。在所有這些二倍體菌株中，β-半乳糖苷酶活性均為陰性。
實(shí)施例5為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)AKAP 79與克隆11.1相互作用的性質(zhì)，構(gòu)建一系列神經(jīng)鈣蛋白11.1缺失突變體并在雙雜種系統(tǒng)中檢測(cè)各質(zhì)粒。
用相同的5’寡核苷酸(MH47)和四個(gè)3’寡核苷酸(MH48，MH49，MH50和MH51)完成PCR反應(yīng)以擴(kuò)增神經(jīng)鈣蛋白11.1中分別編碼氨基酸1-104，1-204，1-312和1-400的區(qū)域。用BglII消化這些片段，然后將其克隆到pACT中。用酶切圖譜確定方向，用自動(dòng)測(cè)序確定PCR錯(cuò)誤。確定正確編碼所需缺失突變體的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到y(tǒng)190MATa和y190MATα中。將酵母菌株與y190apAS1和y190apAS1 AKAP 79以及編碼SEQ ID NO6中氨基酸1-487的起始克隆pACT11.1一起接合。所得的接合平皿按上述過濾檢測(cè)，觀察到只有編碼氨基酸1-400或氨基酸1-487的融合蛋白質(zhì)才能啟始所述報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。含有氨基酸1-312的融合蛋白質(zhì)不能啟始轉(zhuǎn)錄的觀察結(jié)果表明AKAP 79的接合需要氨基酸313-400之間的殘基。該區(qū)域已被證明含有FKBP/FK506結(jié)合區(qū)以及神經(jīng)鈣蛋白B結(jié)合區(qū)[Husi，et al.，J.Biol.Chem.，26914199-14204(1994)]。
為了更精確地限定AKAP 79結(jié)合所需的氨基酸序列，構(gòu)建并檢測(cè)用于AKAP 79結(jié)合的其他缺失突變體。用編碼神經(jīng)鈣蛋白11.1區(qū)332-441，332-487和442-487的pACT產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體。象以前一樣，在轉(zhuǎn)化到pAS1 AKAP 79酵母菌株之前，將各構(gòu)建體測(cè)序并確定其是否表達(dá)正確的突變體。
但轉(zhuǎn)化后，未檢測(cè)到報(bào)告基因表達(dá)，這表明突變體不能與AKAP 79相互作用。沒有AKAP 79結(jié)合的一種可能的解釋是這些截?cái)嗟目寺G失了結(jié)合所必需的二級(jí)結(jié)構(gòu)，或某些氨基末端序列可能是結(jié)合所必需的。
以前的觀察已經(jīng)表明免疫親和蛋白復(fù)合物FKBP/FK506與神經(jīng)鈣蛋白A的相互作用需要神經(jīng)鈣蛋白B[Haddy，et al.，F(xiàn)EBS 31437-40(1992)]。為了確定在酵母菌株y190中內(nèi)生表達(dá)的神經(jīng)鈣蛋白B是否參與觀察到的AKAP79/神經(jīng)鈣蛋白A結(jié)合，用稱為y153b(Mat a gal14 gal80 his3 trp1-901 ade2-101ura3-52 leu2-3-112+URA∷GAL--＞lacZ，LYS2∷GAL--＞HIS3cnb1Δ1∷ADE2)的神經(jīng)鈣蛋白B-菌株來消除神經(jīng)鈣蛋白B參與神經(jīng)鈣蛋白A/AKAP 79結(jié)合的可能性。先用pAS1和pAS1 AKAP 79轉(zhuǎn)化y153，然后檢測(cè)在沒有犧牲質(zhì)粒(prey plasmid)情況下的β-gal活性。未檢測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)，這表明用克隆11.1轉(zhuǎn)化后，報(bào)告基因的表達(dá)是AKAP 79/11.1結(jié)合的必然結(jié)果。再通過標(biāo)準(zhǔn)方法，將質(zhì)粒pACT神經(jīng)鈣蛋白11.1和pACT神經(jīng)鈣蛋白1-400分別導(dǎo)入到y(tǒng)153b1 pAS1 AKAP 79中。在用各質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株中觀察到的β-gal活性表明AKAP 79和神經(jīng)鈣蛋白A之間的相互作用不需要神經(jīng)鈣蛋白B。這樣的結(jié)果進(jìn)一步說明免疫親和蛋白復(fù)合物FKBP/FK506和神經(jīng)鈣蛋白A的結(jié)合與AKAP 79的結(jié)合截然不同。
實(shí)施例6為了更精確地限定在神經(jīng)鈣蛋白11.1上的AKAP 79結(jié)合區(qū)，構(gòu)建另一系列編碼缺失突變體(與上述的不同)或點(diǎn)突變的質(zhì)粒。
A.末端缺失本實(shí)施例說明AKAP 79與神經(jīng)鈣蛋白11.1之間的相互作用需要神經(jīng)鈣蛋白的殘基30-336。簡(jiǎn)而言之，設(shè)計(jì)在PCR反應(yīng)中所用的對(duì)各神經(jīng)鈣蛋白11.1區(qū)的引物以產(chǎn)生如表1中所示的特定N末端和C末端缺失。在100μl反應(yīng)體積中，通過將各1μg的3’和5’引物與各200μg dNTPs和1ng質(zhì)粒模板和PCR緩沖液#2(含20mM Tris-HCl，pH 8.75，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，和100μg/mlBSA)(Stra片段ene)，和2.5單位Pyrococus Furiosus(Pfu)DNA聚合酶(Stra片段ene)混合以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。在95℃一分鐘，在50℃2分鐘，在72℃4分鐘完成30個(gè)循環(huán)。純化擴(kuò)增產(chǎn)物并將其克隆在pACT的BglII位點(diǎn)。分析所得構(gòu)建體的PCR錯(cuò)誤，如前述經(jīng)測(cè)序確定方向。
將各構(gòu)建體逐個(gè)轉(zhuǎn)化到y(tǒng)190α，y190a pASI AKAP 79和y153b pASIAKAP79酵母菌株中，分別在實(shí)施例4A中進(jìn)行了描述，并按前述完成β-半乳糖苷酶過濾檢測(cè)。用編碼C末端缺失的第一組載體的結(jié)果確定了AKAP79結(jié)合所需的氨基酸312-400之間的區(qū)域。來自y153bpASI AKAP79轉(zhuǎn)化體的陽性過濾檢測(cè)還證實(shí)AKAP 79結(jié)合不需要神經(jīng)鈣蛋白B。
以前的研究還表明神經(jīng)鈣蛋白B的結(jié)合需要氨基酸348，349，355和356[Watanabe et al.，J.Biol.Chem.270456-460(1995)]，神經(jīng)鈣蛋白自主抑制區(qū)包括氨基酸442-487，F(xiàn)KBP/FK506結(jié)合需要氨基酸350，353和359[Kawamura and Su，J.Biol.Chem.27015463-15466(1995)]。其他編碼另外的C末端缺失的神經(jīng)鈣蛋白11.1構(gòu)建體表明神經(jīng)鈣蛋白11.1/AKAP79結(jié)合需要氨基酸1-336。這些缺失表明神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合區(qū)[所述區(qū)在哪兒？]，自主抑制區(qū)和神經(jīng)鈣蛋白B結(jié)合區(qū)對(duì)于AKAP79和神經(jīng)鈣蛋白A形成復(fù)合物不是必需的。
在表1中列出了所有缺失的結(jié)合結(jié)果。氨基缺失表明AKAP79結(jié)合所需的至少一個(gè)區(qū)位于殘基30-99之間。象以前一樣，表達(dá)N末端缺失的y153bpASI AKAP79轉(zhuǎn)化體不需要神經(jīng)鈣蛋白B結(jié)合。
表1與神經(jīng)鈣蛋白缺失突變體結(jié)合的AKAP79/免疫親和蛋白
用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的引物MH48 (SEQ ID NO 10) 5’-GTATTAGCAGGAGATCTTCCTACTTC-3’MH49 (SEQ ID NO 11) 5’-GTGTGTGTAGATCTGGTGAAAGTCC-3’MH50 (SEQ ID NO 12) 5’-ATTGTAGAGATCTAAGTAATTAGGTGCCG-3’MH51 (SEQ ID NO 13) 5’-GCCAATTGCTCAGATCTTGTTTCTTATG-3’MH52 (SEQ 1D NO 14) 5’-GGAATTCGGATCCTCGAGAGATCTCGCCG-3’MH57 (SEQ ID NO 15) 5’-CCACTTTGAGATCTCTACCGTCCTCCAGCC-3’MH58 (SEQ ID NO 16) 5’-CCCTGAGATCTTCAGCTGCTAAGAC-3’MH59 (SEQ ID NO 17) 5’-GGCTGAGATCTGGCAGACCTTGCAAAGTGG-3’MH66 (SEQ ID NO 18) 5’-GTGATGAAGATCTTACAGTTTAATTGCTCTCC-3’MH74 (SEQ ID NO 19) 5’-TTCTCCAGATCTTGGTAAGGACCATG-3’MH75 (SEQ ID NO 20) 5’-CACCTTCTGTAGATCTTTCATCATCAGAAC-3’MH76 (SEQ ID NO 21) 5’-CATCGGCAGATCTCTGAAGAAGTG-3’MH77 (SEQ ID NO 22) 5’-CCATGGCCAATTTTAGATCTCGATGAAAC-3’MH93 (SEQ ID NO 23) 5’-GGACCATGAGATCTAATCCATAAAATTGGG-3’MH94 (SEQ ID NO 24) 5’-AAATGGGAGATCTAATAAGGATGTGGAGAGC-3’MH95 (SEQ ID NO 25) 5’-GGAGAGCAATTAAAGATCTAAATGTTCATCAC-3’MH96 (SEQ ID NO 26) 5’-TTTTCATAGATCTATACAAGCAGCTTT-3’MH107 (SEQ ID NO 27) 5’-CAACCAGATCTAATGTGGAGAGCAATTAAACTGTCG-3 ’MH108 (SEQ ID NO 28) 5’-CCAATAGAGATCTAAGAGCAATTAAACTGTCG-3’MH109 (SEQ ID NO 29) 5’-TGTGAGATCTAATTAAACTGTCGAATGTTCATCAC-3’MH110 (SEQ ID NO 30) 5’-GGAGAGCAGATCTACTGTCGAATGTTCATCAC-3’MH111 (SEQ ID NO 31) 5’-AAGGATAGATCTAGCAATTAAACTGTCGAATGTTCATCACB·點(diǎn)突變?yōu)榱烁_地評(píng)估哪個(gè)氨基酸參與AKAP79結(jié)合，用PCR為基礎(chǔ)的策略產(chǎn)生神經(jīng)鈣蛋白11.1點(diǎn)突變。產(chǎn)生三個(gè)丙氨酸突變，Cys335→Ala，Ser336→Ala和Pro339→Ala，并根據(jù)在雙雜交系統(tǒng)中調(diào)節(jié)AKAP 79結(jié)合的情況來進(jìn)檢測(cè)。這些突變體中沒有一個(gè)能夠防止AKAP79與神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合，這表明僅僅對(duì)這些殘基進(jìn)行修飾不足以破壞AKAP79結(jié)合。
實(shí)施例7完成用pACT Mu T細(xì)胞文庫(kù)DNA和pASI AKAP79餌菌株進(jìn)行的另一篩選以便用上述方法鑒定其它AKAP 79結(jié)合蛋白。來自約211000個(gè)克隆的篩選結(jié)果是得到了一個(gè)稱為pACT2-1的陽性克隆，在獲救(rescue)和再轉(zhuǎn)化后仍為陽性。用XhoI消化從質(zhì)粒中去除文庫(kù)序列，表明是一個(gè)1200bp的插入片段。測(cè)序和隨后的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索表明該克隆與大鼠1α型蛋白激酶A(RI)的調(diào)節(jié)亞單位有91％的一致性。
用相同的AKAP 79餌再篩選所述文庫(kù)，從約520000個(gè)轉(zhuǎn)化體中得到15個(gè)陽性克隆。在這15個(gè)中，發(fā)現(xiàn)其中的11個(gè)與大鼠PKA調(diào)節(jié)亞單位I型同源。將這些分離物中分別與RI的5’非翻譯區(qū)融合，通過啟始甲硫氨酸時(shí)保持開放。在酶切分析和測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，分離了9個(gè)單個(gè)的克隆，包括起始pACT2-1分離物。
這些結(jié)果首次說明了錨定蛋白同時(shí)與PKA的RII和RI調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合，意想不到的是，兩個(gè)亞單位之間的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同。
為了進(jìn)一步確定RI和AKAP79之間相互作用的序列，并確定這種相互作用對(duì)于AKAP79是否是特有的，開發(fā)了新的酵母菌株。利用在RI前400bp內(nèi)的BgIII位點(diǎn)，從pACT72中分離了編碼氨基酸1-80的片段，并將其與pAS1和pACT相連。通過酶切分析確定方向。用標(biāo)準(zhǔn)的酵母轉(zhuǎn)化方法，將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入到y(tǒng)190MATa中，然后檢測(cè)被轉(zhuǎn)化酵母的β-gal活性。確定截?cái)嗟腞I融合產(chǎn)物不能啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。然后用轉(zhuǎn)化的酵母菌株進(jìn)行一系列的試驗(yàn)以確定截?cái)嗟腞I是否與AKAP79發(fā)生相互作用。
在雙倍轉(zhuǎn)化酵母菌株中觀察到報(bào)告基因的表達(dá)，這表明RI/AKAP79結(jié)合受RI前80個(gè)氨基酸的影響。
最后，確定與RI和RII亞單位的結(jié)合是否是AKAP79特有的，用上述含氨基酸1-80并由質(zhì)粒pASI(1-80)編碼的截?cái)嗟腞I肽通過雙雜交篩選檢測(cè)人甲狀腺AKAP[Carr.et al.，J.Biol.Chem.26713376-13382(1992)]，pACT Ht31的基因產(chǎn)物。觀察到的Ht31/RI結(jié)合與以前Ht31結(jié)合RII的觀察結(jié)果表明錨定蛋白與RI和RII的結(jié)合并不是AKAP79特有的。
實(shí)施例8根據(jù)AKAP79與PKA的RI和RII均會(huì)結(jié)合這一事實(shí)，研制了閃爍近似(proximity)篩選技術(shù)以鑒定通過干擾AKAP79與PKA的結(jié)合而破壞PKA定位的特異性抑制劑。
首先構(gòu)建硫氧還蛋白(TRX)-AKAP79融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。主要參見LaVallie等人，BIO/TECHOLOGY 11187-193(1993)。簡(jiǎn)而言之，將Xbal/HindIII硫氧還蛋白片段亞克隆到含有一個(gè)lacZ基因和一個(gè)tacZ啟動(dòng)子的pUC19中。所得的質(zhì)粒稱為TRX F/S pUC19。為了將AKAP79編碼序列插入到TRXF/SpUC19中，用含有末端SpeI和HindIII序列的寡核苷酸(SEQID NO32)產(chǎn)生一個(gè)NcoI位點(diǎn)。SpeI/HindIII消化后，將所述寡核苷酸插入到所述載體中并將編碼AKAP79的NcoI/XhoI片段在框架中與硫氧還蛋白基因相連。在大腸桿菌中表達(dá)所述融合蛋白，并將其固定在96孔平皿(Wallac Turbu，F(xiàn)inland)中，所述平皿含有植入固體支持物中的閃爍器。為了固定小鼠TRX免疫特異性單克隆抗體，用兔抗小鼠抗體預(yù)涂覆所述平皿。然后經(jīng)抗TRX抗體將TRX-AKAP79融合蛋白俘獲在所述平皿上，存在或不存在參考抑制劑(reference inhibitor)如未結(jié)合的RII的情況下將3H-RII加到所述平皿中。當(dāng)3H-RII與AKAP79結(jié)合時(shí)，標(biāo)記被帶到充分接近植入支持物中的閃爍器處，用MicroBeta閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)輻射。
來自該試驗(yàn)的結(jié)果表明上述未標(biāo)記的RII和Ht31肽能夠分別以1mM和50 nM的IC50抑制AKAP79/RII結(jié)合。這些結(jié)果與報(bào)告的其他錨定蛋白的值相似[Carr，et al.，J.Biol.Chem.26713376-13382(1992)]。上述脯氨酸取代的Ht31肽并未阻斷AKAP79/RII結(jié)合。由于這些結(jié)果與在以前Western印跡和涂覆試驗(yàn)中觀察到的一致，因此，認(rèn)為這項(xiàng)技術(shù)可以迅速篩選AKAP79/RII結(jié)合的潛在抑制劑，以及AKAP79與其他已知生理配對(duì)物，如神經(jīng)鈣蛋白和蛋白激酶C結(jié)合的抑制劑。
實(shí)施例9本實(shí)施例說明在T細(xì)胞中PKA與錨定蛋白的結(jié)合調(diào)節(jié)PKA對(duì)NFAT活化的活性，由此調(diào)節(jié)白介素2的產(chǎn)生。
IL-2基因的表達(dá)與T細(xì)胞活化緊密相連。用PMA和伊屋諾霉素激活后，研究IL-2的轉(zhuǎn)錄。已知這兩種試劑分別促進(jìn)蛋白激酶C和鈣第二信使反應(yīng)(包括CaN的活化)。蛋白激酶C激活參與NFAT核成分誘導(dǎo)的Ras-Raf-1-Mek-MAP激酶途徑。增加的鈣濃度激活了神經(jīng)鈣蛋白，然后神經(jīng)鈣蛋白又激活了NFAT的胞質(zhì)成分并轉(zhuǎn)移到核中。NFAT成分的活化包括IL-2基因表達(dá)。為了定量轉(zhuǎn)錄，用一載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染JurkatT細(xì)胞系(NFATZ)，所述載體含3個(gè)串聯(lián)拷貝的NFAT結(jié)合位點(diǎn)，和編碼β-半乳糖苷酶(β-gal)的lacZ基因融合的哺乳動(dòng)物IL-2啟動(dòng)子。通過β-gal的熒光激活細(xì)胞分類器(FACS)分析來確定IL-2轉(zhuǎn)錄的量。
一般情況下，在37℃ 1ml培養(yǎng)基中的1×106NFATZ細(xì)胞與不同濃度的環(huán)孢菌素，包括AKAP75(SEQ ID NO8；Glantz等人，J.Biol.Chem.，26812796-12804(1993)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考)的氨基酸81-108的肉豆蔻酸化(myristilated)肽，PKI(PKA抑制劑肽)(GRRNAIHDI-SEQ ID NO5)和Ht31肽(SEQ ID NO9，Carretal.，J.Biol.Chem.，26713376-13382(1992)中描述的全序列Ht31蛋白質(zhì)的氨基酸493-515，它阻斷錨定蛋白與PKARII亞單位的相互作用，該文獻(xiàn)引入本文作為參考)一起預(yù)保溫60分鐘。按Eichholtz等人(J.Biol.Chem.，2681982-1986(1993))所述將所述各肽肉豆蔻酸化。
在用環(huán)孢菌素，PKI(SEQ ID NO5)和Ht31肽(SEQ ID NO9)的試驗(yàn)中，與環(huán)孢菌素或相應(yīng)的肽一起保溫后，再與二萜衍生物(25μM)異丁基-甲基-黃嘌呤(IBMX；0.1mM)一起保溫30分鐘。與二萜衍生物/IBMX一起保溫增加了細(xì)胞內(nèi)的cAMAP濃度(圖4)，由此激活了PKA。最后加入佛波醇12-肉豆蔻酸酯13乙酸酯(PMA)(10ng/ml)和伊屋諾霉素(2μM)并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。對(duì)照只與PMA/伊屋諾霉素或二萜衍生物/IBMX和PMA/伊屋諾霉素在上述條件下培養(yǎng)。在進(jìn)行PMA/伊屋諾霉素培養(yǎng)的后20分鐘，加入氯喹(300μM)以抑制內(nèi)生溶酶體β-gal活性。將細(xì)胞離心并再懸于50μl培養(yǎng)基中，向其中加入50μl熒光素二β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)(0.1mM的終濃度；分子探針)。使?jié)B壓休克過程持續(xù)75秒，然后通過加入1ml冷FACS緩沖液(包括氯喹)而使細(xì)胞返回等滲條件。通過用于熒光素分析的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量lacZ β-gal活性。
圖5A-5H說明了本試驗(yàn)的結(jié)果。圖5A和5B是加入了或未加染料的試驗(yàn)的背景熒光的FACS圖。圖5C表示用PMA/伊屋諾霉素處理NFATZ Jurkat細(xì)胞使β-gal活性增加了6-7倍。正如預(yù)期到CaN在IL-2轉(zhuǎn)錄中的重要信號(hào)作用一樣，環(huán)孢菌素(CsA)完全破壞了這種活性(圖5D)。
當(dāng)在培養(yǎng)基中使用10μM的肉豆蔻酸化AKAP 75肽(SEQ ID NO8)時(shí)，發(fā)現(xiàn)PMA/伊屋諾霉素誘導(dǎo)的β-gal活性降低了40-50％。
圖5E表明二萜衍生物和IBMX使PMA/伊屋諾霉素誘導(dǎo)的β-gal活性降低了約50％。用100μM肉豆蔻酸化的PKI肽(SEQ ID NO5)和100μM肉豆蔻酸化的Ht31肽(SEQ D NO9)可以完全恢復(fù)這種抑制(圖5F和5G)。圖5H表示帶有脯氨酸取代的肉豆蔻酸化的Ht31肽并不影響二萜衍生物/IBMX阻斷，已知所述取代使所述肽在阻斷PKA錨定時(shí)失活。這些結(jié)果表明了PKA的重要性以及它通過在調(diào)節(jié)IL-2基因表達(dá)中的錨定蛋白而定位。如上所述，可以用干擾PKA活性或定位來增強(qiáng)免疫反應(yīng)，激活用于選擇性克隆擴(kuò)展的T細(xì)胞或研究T細(xì)胞激活的早期過程。
實(shí)施例10鑒定編碼另一蛋白質(zhì)相同區(qū)域的兩個(gè)單獨(dú)的分離物pACT 59和pACT74。這些克隆的序列分別列在SEQ ID NO33和34中。胚細(xì)胞檢索結(jié)果表明與三個(gè)未知功能的基因產(chǎn)物有顯著的氨基酸同源性C.elegans(319個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在數(shù)據(jù)庫(kù)目錄中稱為No.U00032)，人胎兒腦表達(dá)的序列片段(97個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，稱為T08697)，和HL60表達(dá)的序列片段(90個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，稱為D20731)。還在稱為PAD1+的S.pombe基因產(chǎn)物(308個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，產(chǎn)物D31731)之間發(fā)現(xiàn)了同源性，已知所述基因產(chǎn)物是PAP1+的正調(diào)節(jié)因子，AP-1樣轉(zhuǎn)錄因子。
另外，用這種篩選方法還鑒定了另兩個(gè)陽性克隆；pACT36，編碼與Ga14正確融合的143個(gè)氨基酸的開放閱讀框架，和pACT 60，編碼因一明顯缺失而產(chǎn)生的稍微短一點(diǎn)的區(qū)域。分別在SEQ ID NO35和36中列出了這些克隆的序列。這兩個(gè)分離物彼此是獨(dú)特的，而且與在NIH中的任何已知序列均沒有一致性。
實(shí)施例11以前的工作表明AKAP79是一個(gè)多功能的錨定蛋白，能夠與至少兩個(gè)信號(hào)酶發(fā)生關(guān)聯(lián)；PKA和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸酶神經(jīng)鈣蛋白(CaN)。各信號(hào)酶與錨定蛋白的不同區(qū)結(jié)合，錨定后所述酶受到抑制。另外，已經(jīng)表明Ca2+/磷脂依賴性蛋白激酶C(PKC)在不同于PKA和CaN的區(qū)域也與AKAP79結(jié)合。象PKA和CaN一樣，PKC的活性通過它與錨定蛋白結(jié)合而受到抑制。在錨定蛋白的前75個(gè)殘基內(nèi)含有PKC結(jié)合位點(diǎn)，肽研究表明含有AKAP79殘基31-52的片段抑制PKC活性。此外，有證據(jù)表明鈣調(diào)蛋白(CaM)與錨定蛋白結(jié)合可以釋放PKC活性，這說明AKAP79序列的競(jìng)爭(zhēng)。為了更全面地表征PKC結(jié)合位點(diǎn)，從牛腦中分離PKC/AKAP復(fù)合物并確定CaM是否是PKC/AKAP79相互作用的生理調(diào)節(jié)因子。
用兔腦PKC作為探針，首先在牛腦裂解產(chǎn)物上完成PKC涂覆。用識(shí)別PKCα和β異構(gòu)體的單克隆抗體(M7)檢測(cè)PKC結(jié)合。在50-300kDa內(nèi)檢測(cè)到數(shù)個(gè)PKC結(jié)合蛋白，包括與明顯的75kDa RII結(jié)合蛋白有相似遷移率的蛋白質(zhì)。對(duì)照試驗(yàn)表明PKC結(jié)合是特異性的，而且只有存在1.2mM CaCl2和20μg/ml磷脂酰絲氨酸并將PKC加到反應(yīng)混合物中時(shí)，才能檢測(cè)到。
為了確定鑒定的75kDa蛋白質(zhì)是否可能是AKAP79的牛同源物，用PKC涂覆試驗(yàn)探測(cè)AKAP79和有關(guān)的片段。簡(jiǎn)而言之，用SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，然后按標(biāo)準(zhǔn)方法印跡到硝酸纖維素膜上。在Blotto[1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，5％在Tris緩沖鹽(TBS)中的干奶]中阻斷樣品，然后在室溫檢測(cè)緩沖液[含1mg/mlBSA，1.2mM鈣，1mMEGTA，20μg/ml磷脂酰絲氨酸(PS)，2μg/ml亮肽素，2μg/ml胃酶抑素，和3μg/ml部分純化的兔腦PKC的TBS]中保溫1小時(shí)。按標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法，用識(shí)別PKCα和β的單克隆抗體M7檢測(cè)結(jié)合的PKC。
PKC與全序列重組AKAP79蛋白質(zhì)結(jié)合，含所述蛋白質(zhì)前75個(gè)殘基的重組片段結(jié)合PKC，但覆蓋CaN和RII結(jié)合區(qū)的C末端不結(jié)合。對(duì)照試驗(yàn)表明，32P-放射性標(biāo)記的RII與全序列AKAP79和C末端都結(jié)合。這些結(jié)果說明AKAP 79是PKC結(jié)合蛋白，而且主要的結(jié)合位點(diǎn)在所述蛋白質(zhì)的前75個(gè)氨基酸內(nèi)。
以前對(duì)PKC結(jié)合蛋白的研究已經(jīng)說明來自PKC結(jié)合位點(diǎn)的堿性和疏水區(qū)參與了與所述酶的磷酸脂鍵的形成。AKAP 79的前75個(gè)殘基在位置31-52之間含有堿性和疏水區(qū)，而一些跡象表明該區(qū)域是與PKC接觸的主要位點(diǎn)。正如用涂覆試驗(yàn)評(píng)估的，殘基31-52的合成肽阻斷PKC/AKAP 79相互作用。
為了檢測(cè)這些肽調(diào)節(jié)PKC活性的能力，在存在和不存在AKAP 79肽片段的條件下，完成下列試驗(yàn)。將PKC[50nM，裂解在50mM Tris-HCl(pH7.4)，5mMMgCl2，1.2mM CaCl2，1mM DTT，1mM EGTA和100μg/mlPS中]與EGF受體肽底物(5μM)在30℃保溫5分鐘。通過加入100μM32P-ATP(500cpm/pmol)而啟動(dòng)磷酸化反應(yīng)，使反應(yīng)在30℃進(jìn)行10分鐘。取反應(yīng)樣品，點(diǎn)到P81濾紙上，用過量75mM磷酸洗滌濾紙而終止反應(yīng)(洗3次，每次3分鐘)。最后用乙醇洗滌，干燥P81濾紙，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量放射性。
含有殘基31-52的肽和AKAP 79前75個(gè)氨基酸的重組片段分別是IC50為2μM和25nM的PKC活性的有效抑制劑。更詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)分析表明用表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體肽為底物，AKAP79 31-52肽表現(xiàn)出混合的PKC活性抑制作用，Ki為1.411±0.28μM。另外，該區(qū)還類似CaM結(jié)合區(qū)，將重組1-75片段或31-52肽在存在過量Ca2+的條件下，與防止PKC抑制的CaM(15μM)一起保溫。由于AKAP 79是CaM結(jié)合蛋白，所以這些發(fā)現(xiàn)表明Ca2+/CaM可以調(diào)節(jié)PKC與錨定蛋白的結(jié)合。
綜上所述，這些結(jié)果表明PKC在體外與AKAP79結(jié)合，PKC結(jié)合位點(diǎn)在AKAP79的前75個(gè)殘基內(nèi)，而且含殘基31-52的肽抑制PKC活性。結(jié)果還表明象與過量Ca2+/CaM保溫可以防止31-52肽產(chǎn)生的PKC抑制作用一樣，由CaM可以調(diào)節(jié)PKC/AKAP 79間的作用(圖3)。為了更全面地了解AKAP 79/PKC作用的本質(zhì)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以1)鑒定對(duì)于PKC與AKAP 79結(jié)合起重要作用的殘基，2)從細(xì)胞中分離PKC/AKAP 79復(fù)合物和3)確定CaM是否可調(diào)節(jié)PKC/AKAP 79間的作用。
數(shù)種PKC結(jié)合蛋白的序列分析表明與PKC結(jié)合可能需要高的正表面電荷。這種假設(shè)與以前的結(jié)果一致，其中含有堿性和疏水殘基簇的AKAP79氨基酸31-52的肽片段抑制PKC活性(Ki為1.4±0.28μM)，而該區(qū)域的重組片段甚至是更強(qiáng)的所述激酶抑制劑(IC50＝25±5nM)。為了評(píng)價(jià)位于AKAP 79殘基31-52的堿性側(cè)鏈作為PKC抑制決定簇的作用，在含氨基酸-75的重組AKAP 79多肽中產(chǎn)生一系列的AKAP 79突變體，用涂覆方法和對(duì)PKC β I抑制能力的變化來檢測(cè)各突變體的PKC結(jié)合特性。
構(gòu)建了5個(gè)AKAP 79突變體，其中用丙氨酸取代堿性殘基簇。假設(shè)有高密度的正電荷，在記錄到PKC結(jié)合親和性的顯著變化前就可能需要同時(shí)取代數(shù)個(gè)堿性側(cè)鏈。因此，多個(gè)堿性殘基被取代。利用Hausken等人[J.Biol.Chem.26924245-24251(1994)]描述的方法，通過丙氨酸掃描誘變產(chǎn)生AKAP 79序列中的點(diǎn)突變。將各AKAP79蛋白表達(dá)為His-片段融合蛋白，并用鎳親和層析純化至均一。下文列出了所述丙氨酸突變肽。SEQ ID NO37是天然的AKAP 79序列。
AKAP 79(37-50)FXRRKKAAKALAPK (SEQ D NO37)AKAP 79 AA38，39 FAARKKAAKALAPK (SEQ D NO38)AKAP 79 AAA40-42 FKRAAAAAKALAPK (SEQ D NO39)AKAP 79 4A38-42 FAAAAAAAKALAPK (SEQ ID NO40)AKAP 79 AA45，50 FKRRKKAAAALAPA (SEQ ID NO41)AKAP 79 A37-50FAAAAAAAAALAPA (SEQ ID NO42)在棒狀病毒中表達(dá)PKC β I，通過下列方法，用單克隆抗體M4和M7檢測(cè)PKCα和β異構(gòu)體。
此外，用上述方法檢測(cè)各AKAP 79片段突變體抑制PKC的能力。
由于最初的數(shù)據(jù)表明PKC和AKAP 79體外結(jié)合，那么如果在體內(nèi)發(fā)生相同或相似的結(jié)合，就有可能從細(xì)胞中分離AKAP 79/PKC復(fù)合物。為了從牛腦中分離PK/AKAP 79二元復(fù)合物或PKC/AKAP 79/CaN三元復(fù)合物，使用兩種獨(dú)立的生物化學(xué)方法，以前用這些方法成功地分離了體內(nèi)AKAP 79/CaN復(fù)合物。所述技術(shù)簡(jiǎn)述如下。
開始的研究涉及用抗AKAP 79的單克隆抗體MC16免疫沉淀來自牛腦的AKAP79同源物，AKAP 75。用可識(shí)別主要的腦PKC異構(gòu)體α，βI，βIII和γ的免多克隆抗血清，通過Western印跡檢測(cè)在免疫沉淀物中共純化的PKC。另外，用識(shí)別腦PKCα和β異構(gòu)體的單克隆抗體M7從牛腦提取物中免疫沉淀PKC，然后用RII涂覆或Western印跡檢測(cè)共純化的AKAP75。最后，用識(shí)別牛CaN A亞單位的單克隆抗體C24探測(cè)用抗PKC抗體免疫沉淀的相同樣品中的CaN。這些試驗(yàn)可以確定是否形成了三元AKAP79/PKC和CaN復(fù)合物。
另外，完成親和純化以便從牛腦中分離RII，AKAP79和PKC的三元復(fù)合物。在cAMP瓊脂糖上通過親和層析純化PKA的R亞單位，分別用M7和MC16單克隆抗體，通過Western印跡篩選洗脫物中存在的PKC和AKAP。由于重組AKAP 79和PKC并不結(jié)合cAMP瓊脂糖，所以檢測(cè)在cAMP洗脫物中的蛋白質(zhì)可以確定是否形成了激酶和錨定蛋白復(fù)合物。用過量的錨定抑制肽，通過從cAMP瓊脂糖中洗脫P(yáng)KC和AKA79來確定三元復(fù)合物。已表明所述肽從固定在cAMP瓊脂糖上的RII中置換AKAP/CaN復(fù)合物。
實(shí)施例12已表明AKAP 79結(jié)合神經(jīng)鈣蛋白，這是與神經(jīng)鈣蛋白是兩種有效且有臨床意義的免疫抑制劑，環(huán)孢菌素和FK505的靶有關(guān)的，所述環(huán)孢菌素和FK506均能抑制神經(jīng)鈣蛋白的活性。如上所述，環(huán)孢菌素和FK506在各種疾病的治療中均是有用的，但是有明顯的副作用。設(shè)想調(diào)節(jié)錨定蛋白/神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合的因子可以最終以與環(huán)孢菌素或FK506活性相似的方式調(diào)節(jié)神經(jīng)鈣蛋白活性。所述的調(diào)節(jié)劑的鑒別，特別是與其他免疫抑制劑相比有較小副作用的那些，就可能在治療目前用環(huán)孢菌素或FK506治療的許多疾病中有廣泛的治療用途。
已經(jīng)報(bào)告了許多環(huán)孢菌素和FK506的臨床指征。例如，環(huán)孢菌素已被確定為移植后的標(biāo)準(zhǔn)免疫抑制劑，甚至盡管通常認(rèn)為FK506是一種更強(qiáng)的免疫抑制劑，但仍使肝、肺、腸和胰腺移植成為可能。對(duì)于不耐受或不能用環(huán)孢菌素或FK506的移植患者有時(shí)可成功地?fù)Q其他藥物。
作為另一實(shí)例，炎性腸病(IBD)是有兩種不同臨床表現(xiàn)的疾病，節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的通用術(shù)語。已經(jīng)用環(huán)孢菌素成功地治療節(jié)段性回腸炎，在至少一種疾病活性指數(shù)上已經(jīng)有統(tǒng)計(jì)意義的顯著治療效果[Brynskov，Dan.Med.Bull.41332-344(1994)]。然而，與急性惡化情況的解決最相關(guān)的其他指數(shù)并沒有明顯改善的跡象。環(huán)孢菌素還在嚴(yán)重的急性抗類固醇UC中有活性(由于倫理上的原因而終止了試驗(yàn)，所以數(shù)據(jù)不顯著)。患硬化膽管炎和UC的患者的試驗(yàn)表明對(duì)UC緩和期來說界限顯著。在中止并因毒性而限制治療后常常復(fù)發(fā)[Choi and Targan，Dig.Dis.and Sci.391885-1892(1994)]。另外，在IBD中還成功地使用了其他免疫抑制劑，如氨甲蝶呤，硫唑嘌呤和6-MP。
作為另一實(shí)例，在一些試驗(yàn)中，當(dāng)用環(huán)孢菌素作為疾病的第二或第三線治療方法時(shí)，即用其他成熟的治療方法不成功并且有嚴(yán)重的疾病的患者，環(huán)孢菌素在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中是有效的。在這些試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素與第二線藥物，如金、抗瘧藥，硫唑嘌呤，D-青霉胺1和氨甲蝶呤有一樣效果和毒性[Wells and Tugwell，Br.J.Rheum.，32(suppl 1)51-56(1993)；Forre etal.，Arth.Rheum.，3088-92(1987)]由于環(huán)孢菌素的“潛在不可逆毒性”，這些試驗(yàn)僅報(bào)告了治療“很嚴(yán)重的，難治的活性RA”[Dougados and Torley，Br.J.Rheum.，32(suppl 1)57-59(1993)]。認(rèn)為腎毒性主要是通過腎血管收縮介導(dǎo)的，所述腎血管收縮會(huì)加重NSAID腎毒性和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎本身的腎病[Leaker and Cairns，Br.J.Hosp.Med.，52520-534(1994)；Sturrock et al.，Nephrol.Dial.Transplant，91149-1156(1994)；Ludwin and Alexopolulou，Br.J.Rheum.，32(suppl 1)60-64(1993)]。約10％來自用環(huán)孢菌素治療的RA患者的腎解剖表明了環(huán)孢菌素毒性的形態(tài)學(xué)特征[Intemational Kidney BiopsyRegistry of Cyclosporin in Autoimmune Diseases，Br.J.Rheum.，32(suppl1)65-71(1993)]。
還有另一實(shí)例，已經(jīng)報(bào)告了環(huán)孢菌素對(duì)于治療類固醇依賴性氣喘是有效的。在一個(gè)試驗(yàn)中，給少量的患者隨機(jī)施用環(huán)孢菌素或安慰劑，環(huán)孢菌素組的空氣流量和FVC增加，潑尼松龍的解毒期減短。
另一實(shí)例是表明環(huán)孢菌素在治療類固醇依賴性微小病變腎病綜合癥中是有效的。在該試驗(yàn)中，環(huán)孢菌素劑量低時(shí)，患者有較低的類固醇需求，但當(dāng)停止環(huán)孢菌素用藥時(shí)全部復(fù)發(fā)。抗類固醇腎病綜合癥對(duì)環(huán)孢菌素只有20-30％的反應(yīng)率[Meyrier，Nephrol.Dial.Transplant，9596-598(1994)；Hulton et al.，Pediatr.Nephrol.，8401-403(1994)]。
從系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的治療來看，一項(xiàng)研究報(bào)告說在前瞻的非隨機(jī)化，無對(duì)照組的研究中，SLE活性指數(shù)有顯著的降低[Tokuda et al.，Arthr.Theumat.，37551-558(1994)]。而其他研究未表明在SLE中是有效的。
另一實(shí)例是，在開始出現(xiàn)的早期，環(huán)孢菌素會(huì)介導(dǎo)胰島素依賴性糖尿病的緩解。平均緩解約一年，盡管有些長(zhǎng)達(dá)850天[Jenner et al.，Diabetologia，35884-888(1992)；Bougneres et al.，Diabetes，391264-1272(1990)]。在一項(xiàng)研究的擴(kuò)大的隨訪中，環(huán)孢菌素沒有持續(xù)的長(zhǎng)期效果[Martinetal.，diabetologia，34429-434(1991)]。但在另一研究中，在治療的12-18個(gè)月中腎功能惡化，并不能恢復(fù)到安慰劑水平，這表明可能發(fā)生了一些慢性腎損傷[Feldt-Rasmussen et al.，Diabetes Mediacine，7429-433(1990)]。早期的發(fā)明需要提高對(duì)胰島素依賴性糖尿病密期的免疫移植治療效果。有些研究者正在篩選最相關(guān)的物質(zhì)并成功地預(yù)防性地治療有糖尿病跡象的患者[Elliottand Chase Diabetologia，34362-365(1991)]。
還有另一實(shí)例，用環(huán)孢菌素可以治療某些牛皮癬[Cuellar et al.，Balliere’sClin.Rheum.，8483-498(1994)；Ellis et al.，JAMA 2563110-3116(1986)]。高劑量治療對(duì)于牛皮癬關(guān)節(jié)炎，特別是破壞性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重情況是有效的，治療中止后，通常會(huì)加重皮膚和關(guān)節(jié)病。從潛在的副作用和需要連續(xù)的長(zhǎng)期治療來看，環(huán)孢菌素只對(duì)用其他方法不能治療的難以醫(yī)治的牛皮癬關(guān)節(jié)炎有效。
另外，在安慰劑控制的雙盲研究中，環(huán)孢菌素對(duì)于治療嚴(yán)重的特應(yīng)性皮炎是有效的[Van Joost et al.，Br.J.Derm.，130634-640(1994)；Cooper，J.Invest.Derm.，102128-137(1994)]。比起未治療的疾病，患者寧愿接受因藥物而產(chǎn)生的惡心、腹部不適、感覺異常、膽汁郁積和腎功能不全的副作用。另一隨機(jī)化的雙盲安慰劑控制研究發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素治療顯著的提高患嚴(yán)重特應(yīng)性皮炎的患者的生活質(zhì)量[Saleketal.，Br.J.Derm.，129422-430(1993)]。在停止環(huán)孢菌素用藥后，皮膚損傷迅速?gòu)?fù)發(fā)，但生活質(zhì)量仍得到保持。
作為另一實(shí)例，已經(jīng)用環(huán)孢菌素來治療手的慢性皮炎(其報(bào)告的發(fā)生率為4-22％，通常用局部類固醇來治療，但該藥對(duì)許多患者無效。在一項(xiàng)開放研究中，低劑量的環(huán)孢菌素能有效地治療6/7的患者[Reitamo andGranlund，Br.J.Derm.，13075-78(1994)]。在停用環(huán)孢菌素后，約一半的患者復(fù)發(fā)。
作為另一實(shí)例，已經(jīng)用環(huán)孢菌素來治療蕁麻疹和血管性水腫，表現(xiàn)為蕁麻疹和皮下腫脹的特發(fā)性皮膚病。病理與肥大細(xì)胞有關(guān)，治療常常無效。在一項(xiàng)試驗(yàn)中，用環(huán)孢菌素治療患難治的蕁麻疹和血管性水腫的三名患者，所有癥狀均在一星期內(nèi)消除[Fradin et al.，J.Am.Acad.Derm.，251065-1067(1991)]。由于副作用，所有患者不得不停止治療，而且在治療停止后，癥狀復(fù)發(fā)。
關(guān)于其他風(fēng)濕病，研究報(bào)告說環(huán)孢菌素在治療其他不太常見的自身免疫性疾病，包括白塞病[Pacoretal.，Clin.Rheum.，13224-227(1994)]，Wegner’s肉芽腫病[Allen et al.，Cyclosporin A Therapy for Wegner’s Granulomatosis inANCA-Associated VasculitidesImmunological and Clinical Aspects，Grossed.Plenum Press(1993)]和免疫介導(dǎo)的血小板減少癥[Schultz et al.，Blood851406-1408(1995)]方面是有效的。
在上述的許多試驗(yàn)中，環(huán)孢菌素或FK506的使用會(huì)帶來許多不必要的副作用。通常，感染和惡性腫瘤危險(xiǎn)的增加與一般的免疫抑制相關(guān)，錨定蛋白相關(guān)的免疫抑制不會(huì)沒有相似的危險(xiǎn)。但通過錨定蛋白組織特異性可以避免或降低其他副作用。環(huán)孢菌素和FK506最常見的嚴(yán)重副作用是腎毒性，至少在某些程度上是與劑量相關(guān)的，而且在大多數(shù)患者中均可能發(fā)生，主要是在治療期間降低腎小球的濾過率。但當(dāng)中止藥物時(shí)，至少部分副作用是可逆的[Leaker and Cairns.同上文]。通常進(jìn)行性腎功能不全不會(huì)發(fā)展，盡管需要更多的隨訪來進(jìn)行確定的評(píng)價(jià)。在接受低劑量(3-4mg/kg/d)環(huán)孢菌素的患者中也會(huì)觀察到慢性損傷，這些患者活檢的40％都有間質(zhì)纖維化，血管萎縮和動(dòng)脈并發(fā)癥(arteriolopathy)的變化[Svarstad et al.，Nephrol.Dial.Transplant，91462-1467(1994)；Young et al.，Kidney International，461216-1222(1994)]。在組織切片中，內(nèi)皮細(xì)胞的變化也很明顯[Kahan，N.Engl.J.Med.，3211725-1748(1989)]。盡管表明藥物也對(duì)血管細(xì)胞和血管間質(zhì)細(xì)胞有直接毒性[Platz et al.，transplantation，58170-178(1994)]，但認(rèn)為腎毒性主要是由于小動(dòng)脈血管收縮和慢性低級(jí)局部缺血而造成的[Leaker andCarins.同上文]。有些報(bào)告表明使用FK506，腎毒性的發(fā)生率和嚴(yán)重程度可能稍微高一點(diǎn)[Platz et al.，同上文]。
環(huán)孢菌素和FK506的另一顯著毒性是神經(jīng)毒性，臨床表現(xiàn)包括癲癇發(fā)作，精神錯(cuò)亂，失明，昏迷，頭痛，共濟(jì)失調(diào)，帕金森綜合癥，感覺異常，精神病，聚焦缺乏(focal deficits)，運(yùn)動(dòng)不能性緘默癥，震顫，神經(jīng)病和睡眠障礙[Shimizu et al.，Pediatr.Nephrol.，8483-385(1994)；Wilsonetal.，Muscle andNerve，17528-532(1994)；Reece et al.，Bone Marrow Transpl.，8393-401(1991)；Eidelman et al.，Transpl.Proc.，233175-3178(1991)；de Groen et al.，N.Engl.J.Med.，317861-566(1987)]。在肝移植后，在用FK506治療的10-20％的患者和用環(huán)孢菌素治療的3-12％的患者中發(fā)生了中等程度到嚴(yán)重的神經(jīng)中毒。神經(jīng)中毒還與血清脂異常和肝功能障礙有關(guān)。
環(huán)孢菌素和/或FK506的其他副作用包括肝毒害性，葡萄糖不耐受癥，高血壓，多毛癥，胃腸綜合癥，靜脈血栓形成，胰腺炎和齦增生[Morris J.HeartLung Transplant，12s275-s286(1993)；Fung et al.，Transpl.Proc.，233105-3108(1991)；Mason，Pharmacol，Rev.，42423-434(1989)；Kahan，N.Engl.J.Med.，3211725-1738(1989)；Thomason et al.，Renal Failure 16731-745(1994)]。因此，從廣泛利用環(huán)孢菌素和FK506及其利用所帶來的固有副作用來看，開發(fā)另一種免疫抑制劑可能是極其有益的。
例如，從推測(cè)的T細(xì)胞錨定蛋白使神經(jīng)鈣蛋白去定位可以抑制在T活動(dòng)抑制中的神經(jīng)鈣蛋白活性，由此提供有環(huán)孢菌素或FK506利用性的T細(xì)胞特異性免疫抑制，但副作用較低。前面觀察到PKA從T細(xì)胞錨定蛋白的去定位，可以提高IL-2在受刺激的細(xì)胞中的表達(dá)，這表明錨定蛋白定位的PKA在T細(xì)胞激活過程中以一定的方式在IL-2表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用。因此，PKA的T細(xì)胞特異性去定位可以提供一種提高IL-2體內(nèi)分泌的方法，由此模擬重組IL-2的施用并可能降低以前報(bào)道的如下文描述的IL-2毒性。
IL-2已被允許治療轉(zhuǎn)移性腎癌，而且15-20％患轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌或惡性黑瘤的患者對(duì)IL-2治療有反應(yīng)。這些反應(yīng)中的一部分是可持續(xù)的，持續(xù)達(dá)66個(gè)月以上[Dillman，Cancer Biotherapy，9183-209(1994)；whittington andFaulds，Drugs 46446-514(1993)]。高劑量的單次快速注射治療與幾種嚴(yán)重的副作用(如下所述)相關(guān)，低劑量皮下或連續(xù)輸注治療會(huì)產(chǎn)生中度的反應(yīng)率(12％)，但毒性降低[Vogelzang et al.，J.Clin.Oncol.，11；1809-1816(1993)]。
已經(jīng)在其他惡性腫瘤的治療中研究了IL-2治療(帶和不帶α干擾素和其他試劑)。例如，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤切除后，發(fā)現(xiàn)將IL-2直接用于瘤床就會(huì)有持續(xù)的臨床反應(yīng)，但不能治愈[Merchangt et al.，J.Neuro.，8173-188(1990)]。在其他試驗(yàn)中，在淋巴瘤[Dillman，同上文]，結(jié)腸癌[Whittington and Faulds，同上文]，有限的AML[Bruton and Koeller，Pharmacotherapy 14635-656(1994)]，卵巢癌和早期膀胱癌[Whittington and faulds，同上文]中報(bào)告有有限的療效。但各試驗(yàn)的參與者太少而不能得出有關(guān)有效性的顯著結(jié)論。
還將IL-2與繼承性免疫治療相結(jié)合，而且表明對(duì)于治療轉(zhuǎn)移性腎癌是有效的[Pierce et al.，Sem.Oncol.，2274-80(1995)；Belldegrun et al.，J.Urol.，1501384-1390(1993)]。另外，通過降低皮膚細(xì)菌負(fù)載和通過皮下注射降低麻風(fēng)病患者的抗原水平，IL-2對(duì)于治療特定的感染性疾病也是有效的[Kaplan，J.Infect.Dis.，167(suppl 1)s18-22(1993)]。還觀察到，與PPD陽性健康對(duì)照相比，結(jié)核病患者的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的IL-2[Sanchez etal.，Inf.Immun.，625673-5678(1994)]，這表明IL-2在治療分支桿菌的感染中是有價(jià)值的。
盡管IL-2有潛在的治療價(jià)值，但這種細(xì)胞因子仍有顯著的毒性[除特別說明，來源是Whittington and faulds，Dillman and Bruton and Koeller，同上文]。治療上主要的副作用是毛細(xì)管滲漏綜合癥。IL-2治療增加了血管的通透性引起間質(zhì)和肺水腫，相當(dāng)多患者發(fā)展成需增壓藥的低血壓。強(qiáng)烈的液體回生導(dǎo)致威脅生命的肺水腫。高達(dá)20％的患者需要插管和機(jī)械通氣。高劑量的單次快速注射會(huì)引起比低劑量或慢輸注更嚴(yán)重的滲漏，在有些方案中，在IL-2治療期間100％的患者需要ICU支持。還觀察到心肌炎，心肌病和心率失常。由毛細(xì)管滲漏綜合癥誘導(dǎo)的sypotension還可能發(fā)生急性腎衰竭。
IL-2還會(huì)引起腹瀉，同時(shí)伴有電解質(zhì)失衡，膽固醇沉著病，甲狀腺異常和急性胰腺炎。15-20％治療過的患者發(fā)生需要輸注的貧血[MacFarlane etal.，Cancer 751030-1037(1995)]?？赡軙?huì)發(fā)生伴有出血的血小板減少癥，凝血途徑缺陷是常見的。70％以上的患者經(jīng)歷了精神狀態(tài)的變化，包括偏執(zhí)狂樣妄想，幻想，興趣喪失，睡眠障礙和倦睡。還報(bào)告了昏迷，視覺缺陷，暫時(shí)性腦缺血發(fā)作和感覺異常。與外源IL-2有關(guān)的這些缺陷表明，應(yīng)開發(fā)其它的潛在療法例如可以調(diào)節(jié)內(nèi)源IL-2的產(chǎn)生，從而減少對(duì)外源IL-2治療的需求。
除提供可能的方法以鑒定免疫抑制藥物和IL-2生產(chǎn)調(diào)節(jié)劑外，錨定蛋白的鑒定使得通過已表明錨定蛋白參與其中的不同代謝途徑調(diào)節(jié)其他細(xì)胞活性成為可能。例如，在神經(jīng)元突觸后密質(zhì)中，推測(cè)AKAP79可能經(jīng)結(jié)合PKA，PKC和神經(jīng)鈣蛋白在調(diào)節(jié)谷氨酸受體調(diào)節(jié)的離子通道方面起重要作用。PKA調(diào)節(jié)AMPA受體調(diào)節(jié)通道的活性，PKA的去定位或抑制減弱了AMPA離子通道活性。PKC調(diào)節(jié)NMDA受體調(diào)節(jié)通道的活性，已經(jīng)表明神經(jīng)鈣蛋白減弱NMDA受體對(duì)刺激的敏感度。這些觀察結(jié)果表明定位的激酶(PKA和PKC)可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元中谷氨酸受體的活性。由神經(jīng)鈣蛋白去磷酸化是NMDA受體的計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)機(jī)制。該模型在生理上與由環(huán)孢菌素或FK506誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作是一致的。
另外，谷氨酸受體與許多神經(jīng)性疾病有關(guān)。谷氨酸和其他興奮性氨基酸可以在神經(jīng)元中產(chǎn)生興奮毒性(excitotoxicity)，而且已經(jīng)表明突觸后谷氨酸受體的過度刺激對(duì)神經(jīng)元有毒，會(huì)導(dǎo)致急性神經(jīng)元變性。已經(jīng)表明氧不足(如中風(fēng)或心搏驟停后)和CNS損傷會(huì)使谷氨酸明顯地瀉流到細(xì)胞外空間，然后與谷氨酸受體相互作用，從而引發(fā)興奮毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。已經(jīng)在動(dòng)物模型中表明抗興奮劑可以抵御腦損傷[Olney，Neurobiology of Aging，15259-260(1994)]。令人感興趣的是，NMDA拮抗劑對(duì)有些類型的神經(jīng)元是有毒的，這表明谷氨酸可能在那些細(xì)胞中抑制其他興奮途徑。大環(huán)內(nèi)酯抗體，如FK506也抗NMDA(但不抗kainate)在培養(yǎng)的神經(jīng)元中的興奮毒性[Manevetal.，Brain Res.，624331-335(1993)]。
谷氨酸也與帕金森綜合癥有關(guān)。在暴露于MPTP的猴黑質(zhì)中NMDA拮抗劑保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，MPTP是一種在人和其他靈長(zhǎng)類中誘發(fā)帕金森綜合癥的化學(xué)物質(zhì)。金剛胺和二甲金剛胺是NMDA拮抗劑并已在歐洲用于治療帕金森綜合癥，但是兩種藥物在某些患者中均會(huì)引起精神病。還有些跡象表明谷氨酸能神經(jīng)元在帕金森病中活動(dòng)過強(qiáng)，其抑制可以降低該病的運(yùn)動(dòng)癥狀[Lange and Riederer，Life Sciences，552067-2075(1994)]。
谷氨酸還在癲癇發(fā)作中起作用，參與發(fā)作的開始，擴(kuò)散和保持。NMDA和非NMDA拮抗劑是潛在的抗驚厥藥[Meldrum，Neurology，44(suppl 8)S14-S23(1994)]。AMPA受體還與ALS有關(guān)，目前正在進(jìn)行一系列的受體拮抗劑試驗(yàn)。49從總的這些結(jié)果看，大量其他免疫抑制劑正在臨床試驗(yàn)中并不使人感到驚奇。有關(guān)這些試驗(yàn)的信息來自Haydon and Haynes，Balliere’s ClinGastroentero.，8455-45(1994)；Thomason and Starzi，Immunol.Rev.1993，71-98(1993)；和Morris J.Heart Lung Transplant.，12S275-S286(1993)。例如，azaspirane是一種SKB化合物，抑制移植細(xì)胞滲入物和IL-2R誘導(dǎo)，并破壞IL-2和IFN-γ生產(chǎn)。顯然，azaspirane誘導(dǎo)某些類型的抑制細(xì)胞，而且有些與環(huán)孢菌素有協(xié)同效果。
作為另一實(shí)例，麥考酚酸mofetial是一種Syntex產(chǎn)化合物，抑制嘌呤合成，并有T和B細(xì)胞選擇性抗生殖作用。它減少抗體。麥考酚酸mofetial還減少來自細(xì)胞表面的粘附分子。 而所述藥物的毒性明顯很低，它可能會(huì)引起白細(xì)胞減少，并已經(jīng)用其治療牛皮癬達(dá)20年。
作為另一實(shí)例，咪唑立賓是一種抑制DNA合成的Sumitomo產(chǎn)化合物。其作用機(jī)制與麥考酚酸的相同。
作為另一實(shí)例，brequinar是通過阻斷二氫乳清酸脫氫酶而抑制嘧啶合成的DuPont-Merck產(chǎn)化合物。正在等待臨床試驗(yàn)的全部結(jié)果。已經(jīng)報(bào)告該藥物可與環(huán)孢菌素協(xié)調(diào)作用，但可能會(huì)引起血小板減少癥，皮炎和粘膜炎。
作為另一實(shí)例，15-脫氧精胍菌素是一種Nippon-Kayaku產(chǎn)化合物，主要影響單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的功能，包括抑制氧化代謝，溶酶體酶合成，IL-1生產(chǎn)和MHC II型抗原的細(xì)胞表面表達(dá)。在難治的腎排斥中有70-90％的效力，但在高劑量時(shí)可能會(huì)發(fā)生骨髓毒性。
作為另一實(shí)例，來福米物(leflunomide)是抑制細(xì)胞因子作用，阻斷T細(xì)胞激活以及抗體合成的Hoechst化合物。它對(duì)腎和骨髓沒有毒性。
作為另一實(shí)例，雷怕霉素(rapamycin)是與FK506有關(guān)的Wyeth-Ayerst化合物。它是必須與一種免疫親和蛋白結(jié)合才有活性并不抑制神經(jīng)鈣蛋白或阻斷T細(xì)胞細(xì)胞因子生產(chǎn)的前藥物。借助未知的機(jī)制，雷怕霉素阻斷G1到S轉(zhuǎn)運(yùn)。
在上述舉證性實(shí)施例中所列的大量修飾和變化對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是可預(yù)期的。結(jié)果只應(yīng)將權(quán)利要求中的限制放在本發(fā)明上。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Lockerbie，Robert Owen，et al.
(ii)發(fā)明題目神經(jīng)鈣蛋白抑制化合物和固定蛋白(iii)序列數(shù)42(iv)相關(guān)地址(A)收件人Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray & Borun(B)街道233 South Wacker Drive，6300 Sears Tower(C)城市Chicago(D)州Illinois(E)國(guó)家United States of America(F)郵編60606(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件atentIn Release#1.0，Version#125(vi)目前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/404，731(B)申請(qǐng)日15/5,1995(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/344，227(B)申請(qǐng)日23/11，1995(viii)代理人/代理資料(A)姓名Williams Jr.，Joseph A.
(B)登記號(hào)38，659(C)文獻(xiàn)/檔案號(hào)27866/32861
(ix)通訊資料(A)電話312-474-6300(B)電傳312-4740448(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Arg Arg Lys Arg Ser Gln Ser Ser Lys Glu Glu Lys Pro1 510(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Arg Arg Lys Arg Ser Gln Ser Ser Lys Glu Glu Lys Pro Leu Gln1 51015(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Arg Arg Lys Arg Ser Gln Ser Ser Lys Glu Glu Lys Pro Phe Lys1 51015(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Val Ser Arg Ile Val Asp Ala ValIle1 51015Glu Glu Val Lys Ala Ala Gly Ala20(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Gly Arg Arg Asn Ala Ile His Asp Ile1 5(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2257個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..1461(xi)序列描述SEQ ID NO6CCG CCC CCG CCC CCG CCC CCA CCG CCC CCT CTC GGG GCC GAC CGC GTC48Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Asp Arg Val1 5 10 15GTC AAA GCT GTT CCT TTT CCC CCA ACT CAT CGG CTG ACA TCT GAA GAA96Val Lys Ala Val Pro Phe Pro Pro Thr His Arg Leu Thr Ser Glu Glu20 25 30GTG TTT GAT ATG GAT GGG ATA CCC AGG GTT GAT GTT CTG AAG AAC CAC144Val Phe Asp Met Asp Gly Ile Pro Arg Val Asp Val Leu Lys Asn His35 40 45TTG GTA AAA GAA GGG CGG GTG GAT GAA GAA ATT GCA CTA AGA ATT ATC192Leu Val Lys Glu Gly Arg Val Asp Glu Glu Ile Ala Leu Arg Ile Ile50 55 60AAT GAG GGT GCT GCC ATA CTT CGG CGG GAG AAA ACC ATG ATA GAA GTA240Asn Glu Gly Ala Ala Ile Leu Arg Arg Glu Lys Thr Met Ile Glu Val65 70 75 80GAA GCT CCA ATT ACA GTG TGT GGT GAC ATC CAT GGC CAA TTT TTT GAT288Glu Ala Pro Ile Thr Val Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Phe Asp85 90 95CTG ATG AAA CTT TTT GAA GTA GGA GGA TCA CCT GCT AAT ACA CGA TAC336Leu Met Lys Leu Phe Glu Val Gly Gly Ser Pro Ala Asn Thr Arg Tyr100 105 110CTT TTT CTT GGT GAT TAT GTG GAC AGA GGT TAT TTT AGT ATA GAG TGT384Leu Phe Leu Gly Asp Tyr Val Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Glu Cys115 120 125GTC TTA TAT TTA TGG GTC TTG AAG ATT CTA TAC CCA AGC ACA TTA TTC432Val Leu Tyr Leu Trp Val Leu Lys Ile Leu Tyr Pro Ser Thr Leu Phe130 135 140CTT CTG AGA GGC AAC CAT GAA TGC AGA CAC CTT ACT GAA TAT TTT ACC480Leu Leu Arg Gly Asn His Glu Cys Arg His Leu Thr Glu Tyr Phe Thr145 150 155 160TTT AAG CAG GAA TGT AAA ATT AAA TAT TCA GAA AGA GTC TAT GAA GCT528Phe Lys Gln Glu Cys Lys Ile Lys Tyr Ser Glu Arg Val Tyr Glu Ala165 170 175TGT ATG GAG GCT TTT GAC AGC TTG CCC CTT GCT GCA CTT CTA AAC CAA576Cys Met Glu Ala Phe Asp Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Leu Asn Gln180 185 190CAA TTT CTT TGT GTT CAT GGT GGA CTT TCA CCA GAA ATA CAC ACA CTG624Gln Phe Leu Cys Val His Gly Gly Leu Ser Pro Glu Ile His Thr Leu195 200 205GAT GAT ATT AGG AGA TTA GAT AGA TTT AAA GAG CCA CCT GCA TTT GGA672Asp Asp Ile Arg Arg Leu Asp Arg Phe Lys Glu Pro Pro Ala Phe Gly210 215 220CCA ATG TGT GAC TTG CTA TGG TCT GAT CCT TCT GAA GAC TTT GGA AAT720Pro Met Cys Asp Leu Leu Trp Ser Asp Pro er Glu Asp Phe Gly Asn225 230 235240GAA AAA TCA CAA GAA CAT TTT AGT CAT AAT ACA GTT CGA GGA TGT TCT768Glu Lys Ser Gln Glu His Phe Ser His Asn Thr Val Arg Gly Cys Ser245 250 255TAT TTT TAT AAC TAT CCA GCA GTG TGT GAA TTT TTG CAA AAC AAT AAT816Tyr Phe Tyr Asn Tyr Pro Ala Val Cys Glu Phe Leu Gln Asn Asn Asn260 265 270TTG TTA TCG ATT ATT AGA GCT CAT GAA GCT CAA GAT GCA GGC TAT AGA864Leu Leu Ser Ile Ile Arg Ala His Glu Ala Gln Asp Ala Gly Tyr Arg275 280 285ATG TAC AGA AAA AGT CAA ACT ACA GGG TTT CCT TCA TTA ATA ACA ATT912Met Tyr Arg Lys Ser Gln Thr Thr Gly Phe Pro Ser Leu Ile Thr Ile290 295 300TTT TCG GCA CCT AAT TAC TTA GAT GTC TAC AAT AAT AAA GCT GCT GTA960Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Leu Asp Val Tyr Asn Asn Lys Ala Ala Val305 310 315 320CTA AAG TAT GAA AAT AAT GTG ATG AAC ATT CGA CAG TTT AAT TGC TCT1008Leu Lys Tyr Glu Asn Asn Val Met Asn Ile Arg Gln Phe Asn Cys Ser
325 330 335CCA CAT CCT TAT TGG TTG CCC AAT TTT ATG GAT GTC TTT ACA TGG TCC1056Pro His Pro Tyr Trp Leu Pro Asn Phe Met Asp Val Phe Thr Trp Ser340 345 350TTA CCA TTT GTT GGA GAA AAA GTG ACA GAA ATG TTG GTA AAT GTT CTG1104Leu Pro Phe Val Gly Glu Lys Val Thr Glu Met Leu Val Asn Val Leu355 360 365AGT ATT TGT TCT GAT GAT GAA CTA ATG ACA GAA GGT GAA GAC CAG TTT1152Ser Ile Cys Ser Asp Asp Glu Leu Met Thr Glu Gly Glu Asp Gln Phe370 375 380GAT GTA GGT TCA GCT GCA GCC CGG AAA GAA ATC ATA AGA AAC AAG ATC1200Asp Val Gly Ser Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ile Ile Arg Asn Lys Ile385 390 395 400CGA GCA ATT GGC AAG ATG GCA AGA GTC TTC TCT GTT CTC AGG GAG GAG1248Arg Ala Ile Gly Lys Met Ala Arg Val Phe Ser Val Leu Arg Glu Glu405 410 415AGT GAA AGC GTG CTG ACA CTC AAG GGC CTG ACT CCC ACA GGG ATG TTG1296Ser Glu Ser Val Leu Thr Leu Lys Gly Leu Thr Pro Thr Gly Met Leu420 425 430CCT AGT GGA GTG TTG GCT GGA GGA CGG CAG ACC TTG CAA AGT GGT AAT1344Pro Ser Gly Val Leu Ala Gly Gly Arg Gln Thr Leu Gln Ser Gly Asn435 440 445GAT GTT ATG CAA CTT GCT GTG CCT CAG ATG GAC TGG GGC ACA ACT CAC1392Asp Val Met Gln Leu Ala Val Pro Gln Met Asp Trp Gly Thr Thr His450 455 460TCT TTT GCT AAC AAT ACA CAT AAT GCA TGC AGG GAA CTC CTT CTG CTT1440Ser Phe Ala Asn Asn Thr His Asn Ala Cys Arg Glu Leu Leu Leu Leu465 470 475 480TTT AGT TCC TGT CTT AGC AGC TGACATATGC AGGGTATTAT GTGATAGGCA1491Phe Ser Ser Cys Leu Ser Ser485TCTGATTAGT ACCTGGCCAG GGCATAATAT TGATAGAACA AGTTGTCTTT TAACTGAAAA1551TAACAATCAG TTTCCCAGAT TTTCATAAGG TGATATGGGG AGCAGCTCAT GTCATAATTC1611CGAAATATTT ATTCATTTGT TTAATGCACC CCTTTCTTTC AAAAGCCTCA GTCAAGAATG1671TGAATCAGGG ATATATCTAT ATATCTATTT ACACACATAC ATAAATATAT ATAACTAAAA1731TGGAAATGTA ATTCCGAGTT TCTTACTTTT AAAATTTACG TAATTGTATT AGATTTTGCT1791TATGTTTTCA AGTATTTATT TTTTGAGTTA AAATTCTGCT TAGGCCCCAA AACTTCCTTT1851ATGCACTCAT TTGCCAAAAG ATTTATGCTA AATTTTGTAC CCTGGTAAAT GATTAGAGTT1911TGTTTTCTGT GGTGTTTGTC AAACGTTCTA TGTATAATTG ACTGTCTGTA ACATGCTGTT1971TCCTTCCTCT GCAGATATAG CTGCTTTCCT AAATCTGTCT GTCTTTCTTT AGGATAGCTG2031TATGTCTGTA AATATATGTT CAATTAAATT ACTCTATCAG ACGCTTGTCT GTCTTTTGAT2091GTAGAAGCAA CTTTGTAGCA CCTTGATTTT AGGTTTGCTG CATTTGTTGC TGCACTTGGT2151TCAGTCTGAA TATGAATGTA ACATTAGATA TTGAGCTATT GTTATAAAGG GTTGAATTTA2211AATCATGTAA GTCAAAATTG AAAGGGTGTT ATAAAGTGTG CCTTTA2257(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度487個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO7Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Asp Arg Val1 5 10 15Val Lys Ala Val Pro Phe Pro Pro Thr His Arg Leu Thr Ser Glu Glu20 25 30Val Phe Asp Met Asp Gly Ile Pro Arg Val Asp Val Leu Lys Asn His35 40 45Leu Val Lys Glu Gly Arg Val Asp Glu Glu Ile Ala Leu Arg Ile Ile50 55 60Asn Glu Gly Ala Ala Ile Leu Arg Arg Glu Lys Thr Met Ile Glu Val65 70 75 80Glu Ala Pro Ile Thr Val Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Phe Asp85 90 95Leu Met Lys Leu Phe Glu Val Gly Gly Ser Pro Ala Asn Thr Arg Tyr100 105 110Leu Phe Leu Gly Asp Tyr Val Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Glu Cys115 120 125Val Leu Tyr Leu Trp Val Leu Lys Ile Leu Tyr Pro Ser Thr Leu Phe130 135 140Leu Leu Arg Gly Asn His Glu Cys Arg His Leu Thr Glu Tyr Phe Thr145 150 155 160Phe Lys Gln Glu Cys Lys Ile Lys Tyr Ser Glu Arg Val Tyr Glu Ala165 170 175Cys Met Glu Ala Phe Asp Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Leu Asn Gln180 185 190Gln Phe Leu Cys Val His Gly Gly Leu Ser Pro Glu Ile His Thr Leu195 200 205Asp Asp Ile Arg Arg Leu Asp Arg Phe Lys Glu Pro Pro Ala Phe Gly210 215 220Pro Met Cys Asp Leu Leu Trp Ser Asp Pro Ser Glu Asp Phe Gly Asn225 230 235 240Glu Lys Ser Gln Glu His Phe Ser His Asn Thr Val Arg Gly Cys Ser245 250 255Tyr Phe Tyr Asn Tyr Pro Ala Val Cys Glu Phe Leu Gln Asn Asn Asn260 265 270Leu Leu Ser Ile Ile Arg Ala His Glu Ala Gln Asp Ala Gly Tyr Arg275 280 285Met Tyr Arg Lys Ser Gln Thr Thr Gly Phe Pro Ser Leu Ile Thr Ile290 295 300Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Leu Asp Val Tyr Asn Asn Lys Ala Ala Val305 310 315 320Leu Lys Tyr Glu Asn Asn Val Met Asn Ile Arg Gln Phe Asn Cys Ser325 330 335Pro His Pro Tyr Trp Leu Pro Asn Phe Met Asp Val Phe Thr Trp Ser340 345 350Leu Pro Phe Val Gly Glu Lys Val Thr Glu Met Leu Val Asn Val Leu355 360 365Ser Ile Cys Ser Asp Asp Glu Leu Met Thr Glu Gly Glu Asp Gln Phe370 375 380Asp Val Gly Ser Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ile Ile Arg Asn Lys Ile385 390 395 400Arg Ala Ile Gly Lys Met Ala Arg Val Phe Ser Val Leu Arg Glu Glu405 410 415Ser Glu Ser Val Leu Thr Leu Lys Gly Leu Thr Pro Thr Gly Met Leu420 425 430Pro Ser Gly Val Leu Ala Gly Gly Arg Gln Thr Leu Gln Ser Gly Asn435 440 445Asp Val Met Gln Leu Ala Val Pro Gln Met Asp Trp Gly Thr Thr His450 455 460Ser Phe Ala Asn Asn Thr His Asn Ala Cys Arg Glu Leu Leu Leu Leu465 470475 480Phe Ser Ser Cys Leu Ser Ser485(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQID NO8Ser Ile Lys Arg Leu Val Thr Arg Arg Lys Arg Ser Glu Ser Ser Lys1 5 10 15Gln Gln Lys Pro Phe Lys Ala Lys Leu Gln Ser Glu20 25(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) 線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Val Ile Glu1 5 10 15Gln Val Lys Ala Ala Gly Ala Tyr20(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GTATTAGCAG GAGATCTTCC TACTTC26
(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11GTGTGTGTAG ATCTGGTGAA AGTCC25(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12ATTGTAGAGA TCTAAGTAAT TAGGTGCCG29(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)關(guān)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13GCCAATTGCT CAGATCTTGT TTCTTATG28(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GGAATTCGGA TCCTCGAGAG ATCTCGCCG
29(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15CCACTTTGAG ATCTCTACCG TCCTCCAGCC30(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQID NO16CCCTGAGATC TTCAGCTGCTAAGAC25(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17GGCTGAGATC TGGCAGACCT TGCAAAGTGG30(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18GTGATGAAGA TCTTACAGTT TAATTGCTCT CC32(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO19TTCTCCAGAT CTTGGTAAGG ACCATG26(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO20CACCTTCTGT AGATCTTTCA TCATCAGAAC30(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO21CATCGGCAGA TCTCTGAAGA AGTG24(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO22CCATGGCCAA TTTTAGATCT CGATGAAAC29(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO23GGACCATGAG ATCTAATCCA TAAAATTGGG30(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO24AAATGGGAGA TCTAATAAGG ATGTGGAGAG C3l(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO25GGAGAGCAAT TAAAGATCTA AATGTTCATC AC32(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO26TTTTCATAGA TCTATACAAG CAGCTTT27(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO27CAACCAGAFC TAATGTGGAG AGCAATTAAA CTGTCG36(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO28CCAATAAGAG ATCTAAGAGC AATTAAACTG TCG33(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) 線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO29FGTGAGATCT AATTAAACTG TCGAATGTTC ATCAC38(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO30GGAGAGCAGA TCTACTGTCG AATGTTCATC AC32(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31AAGGATAGAT CTAGCAATTA AACTGTCGAA TGTTCATCAC40(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度54個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO32TACAACTAGT ACCATGGTCG ATGGTCGACA GATCTCTCGA GAAGCTTAGC TAGC54(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度981個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO33CAGAGTATCG ATGAAATCTA CAAATATGAC AAAAAACAAC AACAAGAAAT CCTGGCGGCG60AAACCCTGGA CTAAGGATCA CCACTACTTT AAATACTGCA AAATCTCAGC ATTGGCTCTA120CTGAAAATGG TGATGCATGC CAGGTCAGGA GGCAACTTGG AAGTGATGGG TTTGATGCTC180GGGAAAGTCG ACGGCGAGAC CATGATCATC ATGGACAGTT TCGCTTTGAC TGTAGAGGGC240ACAGAAACTC GAGTAAATGC TCAAGCTGCT GCGTATGAGT ATATGGCTGC ATACATAGAA300AATGCCAAAC AGGTTGGCCG CCTTGAGAAT GCAATCGGTT GGTATCATAG CCACCCTGGT360TATGGCTGCT GGCTCTCCGG GATTGATGTT AGTACACAGA TGCTGAACCA GCAGTTTCAA420GAACCATTTG TAGCAGTGGT GATTGATCCA ACCAGAACAA TCTCTGCAGG AAAAGTGAAT480CTTGGCGCCT TTAGGACATA TCCAAAGGGC TACAAACCTC CTGATGAAGG ACCTTCTGAG540TACCAGACTA TCCCACCTTA ATAAAATAGA AGATTTGGGC GTGCACTGAA ACAATATTAT600GCCTTAGAAG TCTCATATTT CAAATCATCT TGGATCGTAA ACTACTTGAG CTTTGGTGGA660ATAAATACTG GGTGAATACC CTGAGTCCTC TAGCTTGCTT ACTAATGCAG ACTACACCAC720AGGCCAGGTG TTGATTTGTC TGAGAAGTTA GAGCAGTCGG AAGCCCAACT GGGACGTGGC780AGTTTCATGT TGGGCTTAGA AACACATGAC CGCAAGTCGG AAGACAAACT TGCCAAAGCT840ACTAGAGACA GCTGTAAAAC CACCATAGAA GCCACCATGG ACTGATGTCT CAGGTTATTA900AGGATAAACT GTTTAATCAG ATTAACGTTG TTAGTTACCA CCACGTACTT CTCAAAGTGG960TGTGTGGAAG GAAAAGAGCT C981(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度919個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO34AAACCCTGGA CTAAGGATCA CCACTACTTT AAATACTGCA AAATCTCAGC ATTGGCTCTA60CTGAAAATGG TGATGCATGC CAGGTCAGGA GGCAACTTGG AAGTGATGGG TTTGATGCTC120GGGAAAGTCG ACGGGGAGAC CATGATCATC ATGGACAGTT TCGCTTTGCT GTAGAGGGCA180CAGAAACTCG AGTAAATGCT CAAGCTGCTG CGTATGAGTA TATGGCTGCA TACATAGAAA240ATGCCAAACA GGTTGGCCGC CTTGAGAATG CAATCGGTTG GTATCATAGC CACCCTGGTT300ATGGCTGCTG GCTCTCCGGG ATTGATGTTA GTACACAGAT GCTGAACCAG CAGTTTCAAG360AACCATTTGT AGCAGTGGTG ATTGATCCAA CCAGAACAAT CTCTGCAGGA AAAGTGAATC420TTGGCGCCTT TAGGACATAT CCAAAGGGCT ACAAACCTCC GATGAAGGAC CTTCTGAGTA480CCAGACTATC CCACCTTAAT AAAATAGAAG ATTTGGGCGT GCACTGAAAC AATATTATGC540CTTAGAAGTC TCATATTTCA AATCATCTTG GATCGTAAAC TACTTGAGCT TTGGTGGAAT600AAATACTGGG TGAATACCCT GAGTCCTCTA GCTTGCTTAC TAATGCAGAC TACACCACAG660GCCAGGTGTT GATTTGTCTG AGAAGTTAGA GCAGTCGGAA GCCCAACTGG GACGTGGCAG720TTTCATGTTG GGCTTAGAAA CACATGACCG CAAGTCGGAA GACAAACTTG CCAAAGCTAC780TAGAGACAGC TGTAAAACCA CCATAGAAGC CACCATGGAC TGATGTCTCA GGTTATTAAG840GATAAACTGT TTAATCAGAT TAACGTTGTT AGTTACCACC ACGTACTTCT CAAAGTGGTG900TGTGGAAGGA AAAGAGCTC919(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度541個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO35GACCACCGAG ATGCCAATTC CAGTGTCATG AGATTTCTGC GAGACCTCAT CCACACAGGA60GTAGCCAATG ATTTATCTGT TTTCTTACAG CATGAAGAAG ATTTTGTTGC GGAAGGAACT120AATTGGACAG GTGATGAGCC AGCTTGGGCA GCAACTTGTC AGCCAGCTGC TCCACACATG180CTGCTTTTGG TTCCCCCCTA CACCCTACCC GACGTGGTTG AAGTGCTCTG GGAGATCATG240CAGGTTGACA GACCGACTTT CTGTCGGTGG CTAGAGAATT CCTTGAAAGG TTTGCCAAAA300GAGACCACAG TGGGAGCTGT CACAGTGACA CATAAACAAC TTACAGATTT CCACAAGCAA360GTCACTAGTG CCGAGGAATG TAAGCAAGTT TGCTGGGCCT TGAGAGACTT CACCAGGTTG420TTTCGATAGC TCAAGCTCAC ACTCCTGCAC TGTGCCTGTC ATCCAGGAAT GTCTTTTTTT480ATTAGAAGAC AGGAAGAAAA CAACCCAGAC TGTGTCCCAC AATCAGAAAC CTCTGTTGTG540G541(2)SEQ ID NO36的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度519個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO36CGAGATGCCA ATTCCAGTGT CATGAGATTT CTGCGAGACC TCATCCACAC AGGAGTAGCC60AATGATCATG AAGAAGATTT TGAATTGCGG AAGGAACTAA TTGGACAGGT GATGAGCCAG120CTTGGCCAGC AACTTGTCAG CCAGCTGCTC CACACATGCT GCTTTTGTCT TCCCCCTACA180CCCTACCCGA CGTGGTTGAA GTGCTCTGGG AGATCATGCA GGTTGACAGA CCGACTTTCT240GTCGGTGGCT AGAGAATTCC TTGAAAGGTT TGCCAAAAGA GACCACAGTG GGAGCTGTCA300CAGTGACACA TAAACAACTT ACAGATTTCC ACAAGCAAGT CACTAGTGCC GAGGAATGTA360AGCAAGTTTG CTGGGCCTTG AGAGACTTCA CCAGGTTGTT TCGATAGCTC AAGCTCACAC420TCCTGCACTG TGCCTGTCAT CCAGGAATGT CTTTTTTTAT TAGAAGACAG GAAGAAAACA480ACCCAGACTG TGTCCCACAA TCAGAAACCT CTGTTGTGG519(2)SEQ ID NO37的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO37Phe Xaa Arg Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys1 5 10(2)SEQ ID NO38的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO38Phe Ala Ala Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys1 5 10(2)SEQ ID NO39的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO39Phe Lys Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys1 5 10(2)SEQ ID NO40的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO40Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys1 5 10(2)SEQ ID NO41的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO41Phe Lys Arg Arg Lys Lys Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro Ala1 5 10(2)SEQ ID NO42的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO42Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro Ala1 5 10
權(quán)利要求
1.純化并分離的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO33所示序列的pACT59多肽。
2.由權(quán)利要求1的多核苷酸編碼的pACT 59多肽。
3.純化并分離的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO34所示序列的pACT74多肽。
4.由權(quán)利要求3的多核苷酸編碼的pACT 74多肽。
5.純化并分離的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO35所示序列的pACT36多肽。
6.由權(quán)利要求5的多核苷酸編碼的pACT 36多肽。
7.純化并分離的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO36所示序列的pACT60多肽。
8.由權(quán)利要求7的多核苷酸編碼的pACT 36多肽。
9.鑒定可能的抑制劑化合物的方法，所述化合物抑制錨定蛋白和結(jié)合配對(duì)物之間的結(jié)合，所述方法包括在存在和不存在可能的抑制劑化合物時(shí)，在適宜錨定蛋白和所述結(jié)合配對(duì)物結(jié)合的條件下將錨定蛋白和帶標(biāo)記的結(jié)合配對(duì)物保溫，其中所述錨定蛋白被固定在一固體支持物上；從固體支持物上洗脫未結(jié)合的結(jié)合配對(duì)物；確定與固定的錨定蛋白結(jié)合的結(jié)合配對(duì)物的量；比較存在所述化合物時(shí)與錨定蛋白結(jié)合的結(jié)合配對(duì)物的量和不存在所述化合物時(shí)結(jié)合錨定蛋白的結(jié)合配對(duì)物的量；和從中確定所述化合物是否抑制錨定蛋白和所述結(jié)合配對(duì)物間的結(jié)合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述結(jié)合配對(duì)物是帶放射性標(biāo)記的。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述結(jié)合配對(duì)物是用熒光基團(tuán)標(biāo)記的。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述結(jié)合配對(duì)物是PKA的I型調(diào)節(jié)亞單位。
13.權(quán)利要求9的方法，其中所述結(jié)合配對(duì)物是PKA的II型調(diào)節(jié)亞單位。
14.利要求9的方法，其中所述錨定蛋白是AKAP 79。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所述結(jié)合配對(duì)物是神經(jīng)鈣蛋白多肽。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述神經(jīng)鈣蛋白多肽是選自由SEQIDNO7的氨基酸1-487，1-400，1-312，1-204，1-104，332-487，441-487，332-441，1-375，1-354，30-375，98-375，1-347，1-340，1-330，1-320，1-338，1-336，1-334，1-332和1-335組成的一組缺失突變體。
17.選自由SEQ ID NO7的氨基酸1-487，1-400，1-312，1-204，1-104，332-487，441-487，332-441，1-375，1-354，30-375，98-375，1-347，1-340，1-330，1-320，1-338，1-336，1-334，1-332和1-335組成的一組神經(jīng)鈣蛋白缺失突變體。
18.提高T淋巴細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素2的方法，包括將T淋巴細(xì)胞與下列氨基酸序列之一接觸Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile或Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述氨基酸序列是Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述氨基酸序列被肉豆蔻酸化。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述氨基酸序列是Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述氨基酸序列被肉豆蔻酸化。
23.權(quán)利要求18的方法，還包括用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和伊屋諾霉素激活T細(xì)胞。
24.從含有神經(jīng)鈣蛋白的細(xì)胞組分中分離神經(jīng)鈣蛋白的方法，包括將所述細(xì)胞組分與固定在固體底物上的AKAP 79或其神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合片段接觸，然后從中洗脫神經(jīng)鈣蛋白。
25.在細(xì)胞中抑制神經(jīng)鈣蛋白活性的方法，包括將所述細(xì)胞與含有下列氨基酸序列的神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合肽接觸Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述肽是Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Leu-Gln。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述肽是Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Phe-Lys。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述肽不結(jié)合PKA。
29.確定細(xì)胞是否含有結(jié)合神經(jīng)鈣蛋白和結(jié)合PKA的錨定蛋白的方法，包括裂解細(xì)胞以形成裂解產(chǎn)物；將裂解產(chǎn)物與固體支持物一起保溫，所述固體支持物上固定有神經(jīng)鈣蛋白分子；從固體支持物上洗脫裂解產(chǎn)物；將所述固體支持物與結(jié)合在錨定蛋白上的帶標(biāo)記的PKA調(diào)節(jié)亞單位接觸；從固體支持物上洗脫調(diào)節(jié)亞單位；檢測(cè)保留在固體支持物上的標(biāo)記；從中確定在細(xì)胞中是否存在結(jié)合神經(jīng)鈣蛋白和結(jié)合PKA的錨定蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于分離神經(jīng)鈣蛋白并抑制神經(jīng)鈣蛋白活性的組合物和方法。所述組合物是含有與AKAP79的神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合區(qū)同源的區(qū)域的肽。還提供了確定細(xì)胞中是否含有結(jié)合神經(jīng)鈣蛋白和結(jié)合PKA的錨定蛋白的方法。該方法有助于識(shí)別同時(shí)與神經(jīng)鈣蛋白和PKA結(jié)合的其它蛋白。另一方面，本發(fā)明也提供了增加T細(xì)胞的白細(xì)胞介素2表達(dá)的方法。
文檔編號(hào)C07K1/113GK1148407SQ95192219
公開日1997年4月23日 申請(qǐng)日期1995年11月22日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月23日
發(fā)明者R·O·洛卡比, V·M·科蘭, M·L·霍華德, W·M·加拉丁, J·D·施科特 申請(qǐng)人:艾科斯有限公司, 俄勒岡州政府