專利名稱：阿糖胞苷前藥衍生物及其在抗癌抗腫瘤中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種新型的阿糖胞苷前藥衍生物及其合成路線，本發(fā)明還涉及阿糖胞苷前藥衍生物制劑及其制備方法和阿糖胞苷前藥衍生物及其制劑在抗癌抗腫瘤中的用途。

背景技術(shù)：
癌癥是目前危害人類生命健康的最主要的疾病，治療癌癥的現(xiàn)有手段主要包括手術(shù)切除、放射性療法、化學(xué)療法或這些方法的并用?；瘜W(xué)療法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用而且已經(jīng)用于多種不同類型的癌癥的治療。然而，大多數(shù)化學(xué)療法所用的抗癌藥物都僅限于延緩癌癥的惡化從而延長(zhǎng)病人的生命，很難達(dá)到治愈的目的。各類癌癥的發(fā)病機(jī)理雖然各不相同，但是它們其實(shí)是具有共同特征的一大類癥候群。癌細(xì)胞除了代謝旺盛、不斷地分化之外，與正常細(xì)胞的生理差別不是很大。這對(duì)于開發(fā)選擇性地清除癌細(xì)胞、且不殺傷正常細(xì)胞的藥物是個(gè)巨大的挑戰(zhàn)?？拱┧幬镩_發(fā)的另一大挑戰(zhàn)是癌細(xì)胞耐藥性，即經(jīng)過一段時(shí)間化療之后引起的耐藥抗藥性，用過的化療藥物，即使增加劑量，對(duì)癌細(xì)胞也不再起作用。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也常使得無法用化學(xué)療法進(jìn)行治療。到目前為止，沒有一種抗癌藥物能夠醫(yī)治所有的癌癥。尋找高效、高選擇性、低毒、無耐藥性、而且急需的新型抗癌藥物仍然極具挑戰(zhàn)性。大多化療抗癌藥物都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，從而導(dǎo)致化學(xué)治療不能繼續(xù)進(jìn)行。因此，現(xiàn)有藥物在治療不同種類的腫瘤時(shí)受到極大的限制。所以，尋找高效、低毒的新型抗癌藥物對(duì)維護(hù)人類健康仍然迫切需要。
阿糖胞苷是胞嘧啶核苷的類似物，DNA多聚酶的抑制劑。它能夠阻止DNA合成，也可摻入DNA，干擾DNA的復(fù)制，此外還可阻斷胞嘧啶核苷酸還原成脫氧胞嘧啶核苷酸(Sylvester，R.K.，F(xiàn)isher，A.J.，and Lobell，M.，Drug Intelligence& Clinical PharmacyVol.21，No.2，pp.177-180(1987)；Boyer et al.，NovelCytarabine Monophospate Prodrugs，United States Patent Application Publication，Pub.No.US 2007/0037774 A1，(Feb.15，2007)；Colon-Cesario，M.，Wang，J.，Ramos，X.，Garcia，H.G.，Davila，J.J.，Laguna，J.，Rosado，C.，and Pena de Ortiz，S.，J.Neurosci.，26(20)5524-5533(2006))。
目前，阿糖胞苷主要用于急性白血病的治療。對(duì)急性粒細(xì)胞白血病療效最好，對(duì)急性單核細(xì)胞白血病及急性淋巴細(xì)胞白血病也有效，對(duì)惡性淋巴瘤、肺癌、消化道癌、頭頸部癌有一定療效，對(duì)病毒性角膜炎及流行性結(jié)膜炎等也有一定療效，然而，對(duì)多數(shù)實(shí)體腫瘤無效。阿糖胞苷的活性不是很高，為了提高療效，阿糖胞苷一般均與其他藥物，如甲氧柔紅霉素、全反式維甲酸聯(lián)合三氧化二砷、吡柔比星、拓?fù)涮婵?足葉乙甙-環(huán)磷酰胺、氟達(dá)拉濱等合并使用。阿糖胞苷具有骨髓抑制、消化道反應(yīng)等副作用，少數(shù)病人可有肝功異常、發(fā)熱、皮疹等副作用(Bolwell，B.J.，Cassileth，P.A.，Gale，R.P.Leukemia.2(5)253-60(1988)；Kimby，E.，Nygren，P.，Glimelius，B.Acta Oncol.40(2-3)231-52(2001)；Stamatopoulos，K.Leukemia Research，Volume 22，Issue 8，pp 759-761，(2003)；Burnett，A.K.，Milligan，D.，Prentice，A.G.，Goldstone，A.H.，McMullin，M.F.，Hills，R.K.，Wheatley，K.Cancer.109(6)1007-10(2007))。
阿糖胞苷為抗代謝藥物，在細(xì)胞內(nèi)先經(jīng)脫氧胞苷酶催化磷酸化，轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘陌⑻前账?，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)為相應(yīng)的二磷酸及三磷酸阿糖胞苷而起作用。阿糖胞苷主要通過與DNA合成過程中所需的三磷酸脫氧胞苷競(jìng)爭(zhēng)，而抑制DNA多聚酶，干擾核苷酸摻入DNA，并能抑制核苷酸還原酶，阻止核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗鹾塑账幔珜?duì)RNA和蛋白質(zhì)的合成無顯著作用，屬于作用于S期的細(xì)胞周期特異性藥物，對(duì)處于S增殖期細(xì)胞的作用最為敏感，并對(duì)G1/S及S/G2轉(zhuǎn)換期也有作用。靜脈注射后迅速?gòu)难邢В?0％可通過血腦屏障，藥物在體內(nèi)主要在肝中代謝為無活性的阿糖尿苷，70％～90％通過腎排泄。為了開發(fā)對(duì)實(shí)體腫瘤如肝癌有療效的抗癌新藥，必須尋找對(duì)肝臟靶向性的新藥。顯然，抗肝炎病毒的藥物可以作為極好的借鑒。例如，米夫定及阿德福韋(adefovir，PMEA)己被批準(zhǔn)作為乙型肝炎抗病毒治療藥物(Starrett，et al.，″Synthesis，oralbioavailability determination，and in vitro evaluation of prodrugs of the antiviralagent 9-[2-(phosphonomethoxy)ethyl]adenine(PMEA)，″J Med Chem.，37(12)1857-64(1994)；Shaw，et al.，″Pharmacokinextics and Metabolism ofSelected Prodrugs of PMEA in Rats，″Drug Metabolism Dis.，25(3)362-366(1997)；Wacher，V.J.，et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 4689-102(2001)；Wacher，et al.，″Active Secretion and Enterocytic Drug Metabolism Barriers to DrugAbsorption，″Adv.Drug Del.Rev.，4689-102(2001)；Murono，et al.，″Preventionand inhibition of nasopharyngeal carcinoma growth by antiviral phosphonatednucleoside analogs，″Cancer Res.，61(21)7875-7(2001))。2003年，MetabasisTherapeutics，Inc公司的科學(xué)家K.Raja Reddy，Mark D.Erion，Michael C.Matelich，Joseph J.Kopcho提出用環(huán)磷酸核苷類作為抗肝癌治療藥物的前藥(United States Patent 7,214,668；)，當(dāng)化合物進(jìn)入肝臟后，被肝臟的CYP 3A4代謝酶催化解離成無環(huán)磷酸核苷類衍生物而具有抗癌的活性。2007年，MetabasisTherapeutics，Inc公司又提出新的環(huán)磷酸阿糖胞苷衍生物作為抗癌前藥的專利申請(qǐng)(Novel Cytarabine Monophospate Prodrugs，United States Patent ApplicationPublication，Pub.No.US 2007/0037774 A1，Boyer et al.，F(xiàn)eb.15，2007；Phosphonic acid based prodrugs of PMEA and its analogues，United States Patent7,214,668，Reddy，et al.May 8，2007)。這些專利申請(qǐng)的核心是將環(huán)磷酸接入阿糖胞苷的核糖環(huán)上的-OCH2-核糖位置上，即O5位置，而對(duì)阿糖胞苷胞嘧啶環(huán)上的氨基不加修飾。
阿糖胞苷一般不能用于治療肝癌，其原因在于當(dāng)其胞核苷骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)入肝臟之后，它的N4氨基(見圖1)被代謝失效并引起毒性；另一方面是其糖甙結(jié)構(gòu)上的O5羥基(見圖1)必須被磷酸化而激活，而此激活過程在肝內(nèi)過于緩慢。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服上述已有技術(shù)的不足，提供一種高效、低毒，無耐藥性，能夠被迅速激活的阿糖胞苷前藥衍生物，并提供了阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線以及阿糖胞苷前藥衍生物制劑的制備方法，本發(fā)明還提供了阿糖胞苷前藥衍生物及其制劑在抗癌抗腫瘤方面的應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物，其特征在于所述阿糖胞苷前藥衍生物是具有下述通式(I)、(II)、(III)中的任意一種通式的化合物
其中，W表示C＝O、S(O)O和C(O)O中的任意一種基團(tuán)； 其中，Y表示(CH2)n或H2C-O-CH2，其中，n＝2～6； X表示OH、O-P(O)(OR1)2和磷酸基中的任意一種基團(tuán)，所述磷酸基為單磷酸基、二磷酸基和三磷酸基中的任意一種； R1、R2是C1-18飽和的或不飽和的脂肪基團(tuán)，所述不飽和的脂肪基團(tuán)中含有一個(gè)或多個(gè)不飽和健，所述不飽和健包括順式或反式異構(gòu)體； A表示O或S或CH2或無基團(tuán)； p＝1-5； R3是氨基、烷基取代氨基、芳香基取代氨基、雜環(huán)基取代氨基、NHOH、NHOR4和如下基團(tuán)中的任意一種
其中R4是鹵原子、氨基、硝基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、羧基、羥基、氰基、三氟甲基、芐基、苯基、芳香基、?；?、羰基、取代氨基、黃酸基、酰胺基、黃酰胺基、氨基酸、碳環(huán)基和雜環(huán)基中的任意一種。
其中，R1可以是H、C1-18烷基、C3-18環(huán)烷基，芐基，苯基和芳環(huán)基中的任意一種；R2是H、C1-C18烷基、C3-18環(huán)烷基、C2-18烯基、C2-18炔基、環(huán)烯基、芐基、苯基、芳香基，環(huán)氨基、碳環(huán)基、雜環(huán)基、苯胺基和取代苯胺基中的任意一種。其中每一個(gè)基團(tuán)可以進(jìn)而取代，而且其中可含有雜原子。
本發(fā)明的通式(I)的阿糖胞苷前藥衍生物包括具有下述結(jié)構(gòu)式的代表性化合物

本發(fā)明的通式(II)的阿糖胞苷前藥衍生物包括具有下述結(jié)構(gòu)式的代表性化合物
本發(fā)明的通式(III)的阿糖胞苷前藥衍生物包括具有下述結(jié)構(gòu)式的代表性化合物
為了清晰起見但并非限制本發(fā)明，除另外說明之外，本發(fā)明所使用的所有科技術(shù)語和在本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員常使用和理解的意義相同。本發(fā)明所引用的專利申請(qǐng)或已發(fā)表的申請(qǐng)及其他論文均屬于原始引用并未加修改。
本專利所用“一個(gè)”或“一種”或“一類”意指最少一個(gè)/種/類或一個(gè)/種/類或一個(gè)/種/類以上。
本發(fā)明所用“烷基”意指各種飽和的直鏈的、帶側(cè)鏈的或環(huán)狀的碳?xì)浠鶊F(tuán)，特包括含有十個(gè)或十個(gè)碳以下的小烷基。例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基、異己基、庚基、辛基和壬基等僅為本定義中的一些典型例子。
本發(fā)明所用“烯基”與上述“烷基”定義相同，但其中必須最少有一個(gè)碳碳雙鍵(C＝C)，所以本發(fā)明所用的烯基包括含有兩個(gè)到十個(gè)碳原子的直鏈的、帶有分支鏈的或環(huán)狀的并至少含有一個(gè)碳碳雙鍵的烴基，如乙烯基、丙烯基、丁烯基和戊烯基等。
本發(fā)明所用的“炔基”為上述烷基或烯基并含有至少一個(gè)碳碳三鍵，所以，炔基包括含有兩個(gè)到十個(gè)碳原子并含有至少一個(gè)碳碳三鍵的直鏈的、帶有分支鏈的或環(huán)狀的烴基或炔基，如乙炔基、丙炔基、丁炔基和戊炔基等。
本發(fā)明中的“飽和”意指該基團(tuán)中不含不飽和鍵，如碳碳雙鍵或碳碳三鍵；而“不飽和”則指該基團(tuán)中含有一個(gè)或一個(gè)以上的碳碳雙鍵或碳碳三鍵。
本發(fā)明所用“環(huán)烷基”為環(huán)狀的碳?xì)浠鶊F(tuán)并優(yōu)先選用含有三到八個(gè)碳的環(huán)烷基。因此環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)庚烷和環(huán)辛烷均為本定義下的典型例子。環(huán)烷基中含有一個(gè)或兩個(gè)碳碳雙鍵即形成“環(huán)烯基”。環(huán)烷基上還可帶有烷基、烯基、炔基和其他基團(tuán)。
本發(fā)明所使用的“芳香基”為環(huán)狀共軛芳香系統(tǒng)并可在環(huán)中含有一個(gè)或一個(gè)以上的非碳原子(除碳以外的其他雜原子如氮)，如苯基、萘基和吡啶基等。
本發(fā)明中還常用到的“雜環(huán)基”指任何多個(gè)原子通過共價(jià)鍵構(gòu)成的環(huán)狀基團(tuán)和化合物，并且至少含有一個(gè)非碳原子。特指雜環(huán)基團(tuán)包括含有氮，硫或氧非碳原子的五元和六元環(huán)狀系統(tǒng)如嘧唑、吡咯、吡啶或嘧啶等。
本發(fā)明中的“烷氧基”指把氧原子與直鏈或帶支鏈的烷基連接所形成的烷基氧化基。此類烷氧基團(tuán)的例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基或異丙氧基等。
同樣地，“烷硫基”指把硫原子與直鏈或帶支鏈的烷基連接所形成的烷基硫化基。此類烷硫基團(tuán)的例子包括甲硫基、乙硫基、丙硫基或異丙硫基等。
本發(fā)明中的“鹵原子基”為氟，氯，溴，碘。
本發(fā)明中的“氨基酸”指取代的天然和非天然的氨基酸，純的L-或D-構(gòu)型或外消旋混合物，以及其由氨基和羧基而衍生出來的基團(tuán)。
特別值得進(jìn)一步說明的是，上述所定義的各種取代基還包括它們被進(jìn)一步取代而構(gòu)成的基團(tuán)，其中這些新的取代基也可含有其他的基團(tuán)。例如烷基或芳香基上的氫原子被氨基、鹵素或其他基團(tuán)取代即成為新的屬于上述各定義中的基團(tuán)。
本發(fā)明中所用的“磷酸”或“磷酸酯”是最高氧化態(tài)的五價(jià)磷原子上連有四個(gè)氧原子，一個(gè)氧原子以雙鍵與磷原子相連，兩個(gè)氧原子以單鍵與磷原子相連，而且，這兩個(gè)氧原子上可以是氫原子、負(fù)電荷或如上所定義的各種烷基、芳香基等，如-P(＝O)(O-)2，-P(O)(OR)2。磷原子上的另外一個(gè)氧原子與本發(fā)明中的衍生物相連。
本發(fā)明中的“前藥”指本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物被用到體內(nèi)后，在體內(nèi)斷裂或增加某個(gè)結(jié)構(gòu)單元所形成的起生物作用的化合物。
本發(fā)明中提及的有機(jī)溶劑包括六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、多聚乙二醇(PEG)和四氫呋喃(THF)。
本發(fā)明解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供了多個(gè)通式(I)、(II)或(III)的結(jié)構(gòu)式的阿糖胞苷前藥衍生物的簡(jiǎn)單有效的合成路線，其技術(shù)放案分別如下 1.阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，其特征在于 (1)酸酐化合物與脂肪醇混和，加熱回流或室溫?cái)嚢?，反?yīng)3～5個(gè)小時(shí)，冷卻得到的第一中間產(chǎn)物(B)不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)； (2)阿糖胞苷，第一中間產(chǎn)物(B)，PyBOP和DMAP溶于DMF，室溫～60℃攪拌7～24小時(shí)，得到反應(yīng)液通過柱層析色譜提純，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。
所述酸酐化合物為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一中；所述脂肪醇為甲醇、乙醇、正辛醇、月桂醇、正癸醇、正十四醇、正十六醇和十八醇中的任意一種。(參考合成路線1～5，8、9、11、12、16～23) 2.阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，其特征在于 (1)將2，6-二甲基氨基苯或環(huán)烷基苯并咪唑、酸酐化合物和DMAP溶于四氫呋喃，控制溫度35～50℃反應(yīng)3～5小時(shí)，析出固體，所得第二中間產(chǎn)物(C)不經(jīng)純化，直接用于下一步反應(yīng)； (2)將阿糖胞苷，第二中間產(chǎn)物(C)，PyBOP和DMAP溶于DMF，室溫?cái)嚢?2～24小時(shí)，反應(yīng)液倒入水中，析出固體或?qū)⒎磻?yīng)液通過柱層析色譜提純，得到通式(II)的阿糖胞苷前藥衍生物。
所述酸酐化合物為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一種。(參考合成路線14，15) 3.阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，其特征在于 (1)酸酐化合物與脂肪醇混和，加熱回流或室溫?cái)嚢?，反?yīng)3～5個(gè)小時(shí)，冷卻得到的第一中間產(chǎn)物(B)不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)； (2)第一中間產(chǎn)物(B)，SOCl2和1～2滴DMF溶于二氯甲烷，加熱回流3～4小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓除去溶劑和過量的SOCl2得到第三中間產(chǎn)物(D)，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)； (3)阿糖胞苷鹽酸鹽和第三中間產(chǎn)物(D)溶于DMF，室溫?cái)嚢?～4天，減壓蒸餾除去DMF后得到的油狀物加乙醚攪拌固化，得到的半固體產(chǎn)品用NaHCO3水溶液中和、過濾，所得固體用水洗至中性后用乙酸乙酯重結(jié)晶、過濾或所得固體溶于甲醇，過濾除去不溶物，然后通過柱層析色譜提純，得到通式(III)的阿糖胞苷衍生物。
所述酸酐化合物為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一種；所述所述脂肪醇為甲醇、乙醇、正辛醇、正癸醇、月桂醇，正十四醇、正十六醇和十八醇中的任意一種。(參考合成路線6、7、10，13) 阿糖胞苷前藥衍生物制劑的制備方法，其特征在于 (1)將具有通式(I)、(II)或(III)中的任意一種結(jié)構(gòu)式的阿糖胞苷前藥衍生物溶解到水、生理鹽水、環(huán)糊精水溶液、水溶性的有機(jī)溶劑、非離子性的表面活性劑、水溶性的類脂、脂肪酸、脂肪酸酯和磷脂中的任意一種或多種的組合溶劑而制得制劑溶液； (2)將所述制劑溶液再用生理鹽水或葡萄糖注射液稀釋而制成阿糖胞苷前藥衍生物制劑。
所述有機(jī)溶劑是乙醇、丙二醇、甘油、甘油酯、多聚乙二醇(PEG)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSO)中的任意一種或多種的組合溶劑。
本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物制劑，其特征在于是由上述阿糖胞苷前藥衍生物制劑的制備方法制備得到的產(chǎn)品。
阿糖胞苷前藥衍生物在抗癌抗腫瘤中的用途。所述癌癥包括但不僅限于白血病、固體瘤、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌和腎癌。
本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物制劑在抗癌抗腫瘤中的用途。所述癌癥包括但不僅限于癌癥包括白血病、固體瘤、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌和腎癌。所述阿糖胞苷前藥衍生物制劑還可與其他化療藥物聯(lián)合用在抗癌抗腫瘤中，所述其他化療藥物包括烷化劑、植物生物堿類、抗菌抗腫瘤磺酰胺類藥物、鉑類藥物、抗代謝類及其它已知的抗癌藥物。在所述聯(lián)合用藥過程中，包括運(yùn)用至少一種具有上述所列舉的代表性的阿糖胞苷前藥衍生物。
以本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物為成份制備成藥用制劑，可以用于口服的或非腸道途徑給藥。此處所指的非腸道途徑給藥是指皮下皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、心房?jī)?nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或滴注。
本發(fā)明采用新的設(shè)計(jì)技術(shù)構(gòu)思設(shè)計(jì)出阿糖胞苷前藥衍生物。阿糖胞苷(參照附圖1)不能用于治療肝癌的原因一方面在于當(dāng)其胞核苷骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)入肝臟之后，它的N4氨基被代謝失效并引起毒性，另一方面是其糖甙結(jié)構(gòu)上的O5羥基必須被磷酸化而激活，而此激活過程在肝內(nèi)過于緩慢。
本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物的設(shè)計(jì)是通過對(duì)N4，O5位置進(jìn)行化學(xué)修飾，而設(shè)計(jì)出了新型的前藥衍生物，避免N4氨基被代謝失效并引起毒性；另外，讓O5羥基容易被磷酸化而激活，主要有益效果是增加生物利用度，減少多重抗藥性(多靶向設(shè)計(jì)技術(shù))，增加溶解度，增加酯溶性。本發(fā)明詳細(xì)提供了阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，阿糖胞苷前藥衍生物制劑及其制備方法，并通過大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物在抗癌抗腫瘤方面的用途。



圖1表示阿糖胞苷的結(jié)構(gòu)和N4，O5修飾位置的示意圖。
圖2表示本發(fā)明的通式-I的具有代表性的阿糖胞苷前藥衍生物的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3表示本發(fā)明的通式-II的具有代表性的阿糖胞苷前藥衍生物的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4表示本發(fā)明的通式-III的具有代表性的阿糖胞苷前藥衍生物的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖5表示本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物抑制BEL-7402肝癌細(xì)胞株的藥物濃度-抑制率曲線圖。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的一些代表性阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線列舉如下。本發(fā)明專利中的其他類似阿糖胞苷前藥衍生物通過相同或類似的方法合成得到。合成路線1
第一中間產(chǎn)物B1的合成(路線1)丁二酸酐(25g，250mmol)溶于甲醇(50ml)，加熱回流，反應(yīng)3個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B1不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物1的合成(路線1)阿糖胞苷(1.0g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B1(0.6g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(20ml)，室溫?cái)嚢?4小時(shí)。反應(yīng)液通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝9/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物1(16.9mg)，LC(UV 254nm)純度＞95％。LC-MS m/z 358[M+H]+(分子式C14H19N3O8，分子量357)。
合成路線2
第一中間產(chǎn)物B2的合成(路線2)戊二酸酐(28.5g，250mmol)溶于乙醇(100毫升)，加熱回流，反應(yīng)5個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B2不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物2的合成(路線2)阿糖胞苷(1.0g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B2(0.79g，4.9mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)液通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝9/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物2(46.9mg)，LC(UV 254nm)純度＞95％。LC-MS m/z 386[M+H]+(分子式C16H23N3O8，分子量385)。

第一中間產(chǎn)物B3的合成(路線3)戊二酸酐(11.4g，100mmol)溶于甲醇(50ml)，加熱回流，反應(yīng)3個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B3不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物3的合成(路線3)阿糖胞苷(1.0g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B3(0.72g，4.9mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)液通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝9/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物3(78.3mg)，LC(UV 254nm)純度91％。LC-MS m/z 372[M+H]+(分子式C15H21N3O8，分子量371)。
合成路線4
第一中間產(chǎn)物B 4的合成(路線4)戊二酸酐(3.4g，30mmol)溶于月桂醇(10ml，45mmol)，控制溫度30℃，反應(yīng)5個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B4不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物4的合成(路線4)阿糖胞苷(1.0g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B 4(1.36g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)液通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝9/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物4(169.3mg)，LC(UV 254nm)純度98％。LC-MS m/z 526[M+H]+(分子式C26H43N3O8，分子量525)；1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ10.84(s，1H)，8.06(d，1H)，7.20(d，1H)，6.05(d，1H)，5.49(d，2H)，5.07(t，1H)，4.06(m，1H)，3.99(t，2H)，3.92(m，1H)，3.82(m，1H)，3.61(m，2H)，2.43(t，2H)，2.32(t，2H)，1.79(m，2H)，1.55(m，2H)，1.24(m，18H)，0.85(t，3H)。
合成路線5
第一中間產(chǎn)物B 5的合成(路線5)丁二酸酐(3.0g，30mmol)溶于月桂醇(8.37g，45mmol)，室溫?cái)嚢瑁磻?yīng)5個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B5不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物5的合成(路線5)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B5(1.3g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)液通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝9/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物5(16.3mg)，LC(UV 254nm)純度98％。LC-MS m/z 512[M+H]+(分子式C25H41N3O8，分子量511)。

第一中間產(chǎn)物B 6的合成(路線4)戊二酸酐(3.4g，30mmol)溶于月桂醇(10ml，45mmol)，控制溫度30℃，反應(yīng)5個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B6不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
第三中間產(chǎn)物D6的合成(路線6)第一中間產(chǎn)物B6(4.0g，13.3mmol)，SOCl2(3.17g，26.6mmol)和1滴DMF溶于二氯甲烷(20ml)，加熱回流3小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓除去溶劑和過量的SOCl2得到第三中間產(chǎn)物D6。得到的產(chǎn)物不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物6的合成(路線6)阿糖胞苷鹽酸鹽(0.7g，2.5mmol)和第三中間產(chǎn)物D6(1.04g，3.26mmol)溶于DMF(6ml)，室溫?cái)嚢?天。減壓蒸餾除去DMF。油狀物加12.5ml乙醚攪拌固化，共三次。得到的半固體促產(chǎn)品用5ml，1mol/L的NaHCO3水溶液中和。過濾，所得固體用水洗至中性，用60ml乙酸乙酯重結(jié)晶，過濾，得到阿糖胞苷前藥衍生物6(89.4mg)，LC(UV 254nm)純度＞95％。LC-MS m/z 526[M+H]+(分子式C26H43N3O8，分子量525)；1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ7.46(d，1H)，7.10(brs，1H)，7.01(brs，1H)，6.08(d，1H)，5.65(d，1H)，5.57(m，2H)，4.29(dd，1H)，4.19(dd，1H)，3.98(m，3H)，3.90(m，1H)，3.88(s，1H)，2.38(t，2H)，2.32(t，2H)，1.78(m，2H)，1.55(m，2H)，1.24(m，18H)，0.85(t，3H)。

第一中間產(chǎn)物B 7的合成(路線2)戊二酸酐(28.5g，250mmol)溶于乙醇(100毫升)，加熱回流，反應(yīng)5個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B7不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
第三中間產(chǎn)物D7的合成(路線7)第一中間產(chǎn)物B7(6.0g，37.5mmol)，SOCl2(8.9g，75mmol)，和1滴DMF溶于二氯甲烷(40ml)，加熱回流3小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑和過量的SOCl2得到第三中間產(chǎn)物D7，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物7的合成(路線7)阿糖胞苷鹽酸鹽(1.4g，5mmol)和第三中間產(chǎn)物D7(1.0g，5.6mmol)溶于DMF(12ml)，室溫?cái)嚢?天。蒸餾除去DMF。油狀物加25ml乙醚攪拌固化，共三次。得到的半固體粗產(chǎn)品用10ml，1mol/L的NaHCO3水溶液中和。用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，水洗后，用無水硫酸鈉干燥。過濾、濃縮，放置后析出晶體。過濾，得到阿糖胞苷前藥衍生物7(25.3mg)，LC(UV 254nm)純度＞95％。LC-MSm/z 386[M+H]+(分子式C16H23N3O8，分子量385)。
合成路線8
第一中間產(chǎn)物B8的合成(路線8)二甘醇酐(0.58g，5mmol)溶于乙醇(20ml)，控制溫度40℃，反應(yīng)5個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B8不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物8的合成(路線8)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B8(0.81g，5.0mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)液通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物8(191.5mg)，LC(UV 254nm)純度＞90％。LC-MS m/z 388[M+H]+(分子式C15H21N3O9，分子量387)。
合成路線9
第一中間產(chǎn)物B9的合成(路線9)二甘醇酐(1.276g，11mmol)溶于月桂醇(2.42g，13mmol)，控制溫度40℃，反應(yīng)4個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B9不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物9的合成(路線9)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B 9(1.51g，5.0mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)液通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物9(90.1mg)，LC(UV 254nm)純度＞90％。LC-MS m/z 528[M+H]+(分子式C25H41N3O9，分子量527)。
合成路線10
第一中間產(chǎn)物B10的合成(路線10)二甘醇酐(1.276g，11mmol)溶于月桂醇(2.42g，13mmol)，控制溫度40℃，反應(yīng)4個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B10不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
第三中間產(chǎn)物D10的合成(路線10)第一中間產(chǎn)物B10(1.81g，6.0mmol)，SOCl2(1.43g，12mmol)和1滴DMF溶于二氯甲烷(20ml)，加熱回流4小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑和過量的SOCl2得到第三中間產(chǎn)物D10，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物10的合成(路線10)阿糖胞苷鹽酸鹽(1.4g，5mmol)和第三中間產(chǎn)物D10(1.92g，6.0mmol)溶于DMF(12ml)，室溫?cái)嚢?天。蒸餾除去DMF。油狀物加25ml乙醚攪拌固化，共三次。得到的半固體粗產(chǎn)品用10ml，1mol/L的NaHCO3水溶液中和。過濾，所得固體用水洗至中性，用60ml乙酸乙酯重結(jié)晶，過濾出固體，然后通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝5/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物10(118.0mg)，LC(UV 254nm)純度＞90％。LC-MS m/z 528[M+H]+(分子式C25H41N3O9，分子量527)。
合成路線11
第一中間產(chǎn)物B11的合成(路線11)己二酸酐(1.276g，11mmol)溶于甲醇(2.42g，13mmol)，控制溫度40℃，反應(yīng)4個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B11(己二酸單甲酯)不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物11的合成(路線11)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B11(己二酸單甲酯)(0.72g，4.1mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)液通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物11(58.6mg)，LC(UV 254nm)純度＞95％。LC-MS m/z 386[M+H]+(分子式C16H23N3O8，分子量385)。

第一中間產(chǎn)物B12的合成(路線12)己二酸酐(1.276g，11mmol)溶于乙醇(2.42g，13mmol)，控制溫度40℃，反應(yīng)4個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B 12(己二酸單乙酯)不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物12的合成(路線12)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B12(己二酸單乙酯)(0.8g，4.1mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)液通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物12(47.9mg)，LC(UV 254nm)純度＞95％。LC-MS m/z 400[M+H]+(分子式C17H25N3O8，分子量399)。
合成路線13
第一中間產(chǎn)物B13的合成(路線13)丁二酸酐(1.276g，11mmol)溶于甲醇(2.42g，13mmol)，控制溫度40℃，反應(yīng)4個(gè)小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B13(丁二酸單甲酯)不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng) 第三中間產(chǎn)物D13的合成(路線13)第一中間產(chǎn)物B13(726mg，5.5mmol)，SOCl2(1.31g，11mmol)和1滴DMF溶于二氯甲烷(10ml)，加熱回流3小時(shí)。減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑和過量的SOCl2得到第三中間產(chǎn)物D13，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物13的合成(路線13)阿糖胞苷鹽酸鹽(1.4g，5mmol)和第三中間產(chǎn)物D13(820mg，5.5mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢?天。蒸餾除去DMF。油狀物加乙醚攪拌固化。得到的半固體粗產(chǎn)品用NaHCO3水溶液中和。旋干，固體溶于甲醇，過濾除去不溶物。然后通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝4/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物13(128.4mg)，LC(UV 254nm)純度＞90％。LC-MS m/z 358[M+H]+(分子式C14H19N3O8，分子量357)。
合成路線14
第二中間產(chǎn)物C14的合成(路線14)將如上合成路線中的2，6-二甲基氨基苯(1.21g，10mmol)溶于10毫升THF，然后加入戊二酸酐(1.14g，10mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)，50℃反應(yīng)5小時(shí)，減壓蒸干濾液，所得第二中間產(chǎn)物C14不經(jīng)純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物14的合成(路線14)將阿糖胞苷(2.43g，10mmol)，第二中間產(chǎn)物C14(2.35g，10mmol)，PyBOP(5.7g，11mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢?4小時(shí)。反應(yīng)液通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物14(139.4mg)，LC(UV 254nm)純度＞95％)。LC-MS m/z 461[M+H]+(分子式C22H28N4O7，分子量460)。
合成路線15
第二中間產(chǎn)物C15的合成(路線15)將上述路線15中的環(huán)烷基苯并咪唑(0.53g，2.1mmol)，丁二酸酐(0.25g，2.5ml)與DMAP(0.2g，1.6mmol)溶于四氫呋喃(20ml)中，控制溫度35℃，反應(yīng)3個(gè)小時(shí)。倒入水中，析出固體，過濾所得固體的第二中間產(chǎn)物C15不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。阿糖胞苷前藥衍生物15的合成(路線15)阿糖胞苷(0.39g，1.6mmol)，第二中間產(chǎn)物C15(0.47g，1.3mmol)，PyBOP(0.84g，1.5mmol)和DMAP(0.055g，0.41mmol)溶于DMF(10ml)，室溫?cái)嚢柽^周末。反應(yīng)液倒入水中，析出固體，得到阿糖胞苷前藥衍生物15(104.8mg)，LC(UV 254nm)純度＞99％。LC-MS m/z 599[M+Na]+(分子式C25H29ClN6O8，分子量576)。
合成路線16
第一中間產(chǎn)物B16的合成(路線16)將正癸醇(4g，26mmol)溶于20毫升四氫呋喃中，然后加入戊二酸酐(2.5g，22mmol)，60℃下攪拌反應(yīng)4小時(shí)。得到的第一中間產(chǎn)物B 16不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物16的合成(路線16)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B16(1.36g，5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，室溫下攪拌12小時(shí)。反應(yīng)液倒入水中，析出固體，固體再通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物16(70.2mg)。LC(UV 254nm)純度97％。LC-MSm/z 498[M+H]+(分子式C24H39N3O8，分子量497)。
合成路線17
第一中間產(chǎn)物B17的合成(路線17)戊二酸酐(2.28g，20mmol)與正十四醇(4.28g，20mmol)混合，加熱融熔，反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，得白色固體的第一中間產(chǎn)物B17，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物17的合成(路線17)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B17(1.48g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，40℃下攪拌12小時(shí)。反應(yīng)液倒入水中，析出固體，固體再通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物17(31.6mg)。LC(UV 254nm)純度95％。LC-MSm/z 554[M+H]+(分子式C28H47N3O8，分子量553)。
合成路線18
第一中間產(chǎn)物B18的合成(路線18)戊二酸酐(0.51g，4.5mmol)與正十六醇(1.2g，4.9mmol)混合，加熱融熔，反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，冷卻，得白色固體的第一中間產(chǎn)物B18，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物18的合成(路線18)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B18(1.6g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，60℃下攪拌12小時(shí)。反應(yīng)液倒入水中，析出固體，固體再通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物18(166.7mg)。LC(UV 254nm)純度97％。LC-MSm/z 604[M+Na]+(分子式C30H51N3O8，分子量581)。
合成路線19
第一中間產(chǎn)物B19的合成(路線19)戊二酸酐(2.24g，19.6mmol)與正十八醇(5.4g，20mmol)混合，加熱融熔，反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，冷卻，得白色固體的第一中間產(chǎn)物B 19，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物19的合成(路線19)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B19(1.73g，4.9mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，50℃下攪拌12小時(shí)。反應(yīng)液倒入水中，析出固體，固體再通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物19(149.6mg)。LC(UV 254nm)純度99％。LC-MSm/z 632[M+Na]+(分子式C32H55N3O8，分子量609)。
合成路線20
第一中間產(chǎn)物B20的合成(路線20)將正癸醇(0.77g，4.9mmol)溶于20毫升四氫呋喃中，然后加入二甘醇酐(0.52g，4.5mmol)，回流攪拌反應(yīng)4小時(shí)，得到的第一中間產(chǎn)物B20不用進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物20的合成(路線20)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B20(1.23g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，40℃下攪拌12小時(shí)。反應(yīng)液倒入水中，析出固體，固體通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物20(31.3mg)。LC(UV 254nm)純度97％。LC-MSm/z 500[M+H]+(分子式C23H37N3O9，分子量499)。
合成路線21
第一中間產(chǎn)物B21的合成(路線21)二甘醇酐(0.52g，4.5mmol)與十四醇(1.05g，4.9mmol)混合，加熱融熔，反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，得白色固體的第一中間產(chǎn)物B21，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物21的合成(路線21)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B21(1.48g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，50℃下攪拌12小時(shí)。反應(yīng)液倒入水中，析出固體，固體通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物21(101.2mg)。LC(UV 254nm)純度95％。LC-MSm/z 556[M+H]+(分子式C27H45N3O9，分子量555)。
合成路線22
第一中間產(chǎn)物B22的合成(路線22)二甘醇酐(0.52g，4.5mmol)與十六醇(1.19g，4.9mmol)混合，加熱融熔，反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，得白色固體的第一中間產(chǎn)物B22，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物22的合成(路線22)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B22(1.6g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，60℃下攪拌12小時(shí)。反應(yīng)液倒入水中，析出固體，固體通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物22(62.9mg)。LC(UV 254nm)純度95％。LC-MSm/z 606[M+Na]+(分子式C29H49N3O9，分子量583)。
合成路線23
第一中間產(chǎn)物B23的合成(路線23)二甘醇酐(0.52g，4.5mmol)與十八醇(1.33g，4.9mmol)混合，加熱融熔，反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，得白色固體的第一中間產(chǎn)物B 23，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。
阿糖胞苷前藥衍生物23的合成(路線23)阿糖胞苷(1g，4.1mmol)，第一中間產(chǎn)物B23(1.74g，4.5mmol)，PyBOP(2.35g，4.5mmol)，和DMAP(0.055g，0.45mmol)溶于DMF(10ml)中，室溫下攪拌12小時(shí)。反應(yīng)液倒入水中，析出固體，固體通過柱層析色譜提純(硅膠，展開劑二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到阿糖胞苷前藥衍生物23(43.2mg)。LC(UV 254nm)純度95％。LC-MSm/z 612[M+H]+(分子式C31H51N3O9，分子量611)。
生物活性 本發(fā)明所涵蓋的阿糖胞苷前藥衍生物具有抑制腫瘤細(xì)胞增生的功能，以及抗腫瘤作用。腫瘤細(xì)胞癌癥包括但不限于血癌、腸癌、皮膚癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、子宮癌、腦瘤、色素瘤、前列腺癌等。
合成藥物腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程 本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物及其制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用試驗(yàn) 1.試驗(yàn)材料 1)細(xì)胞株 HL-60細(xì)胞株，懸浮生長(zhǎng)，用含10％胎牛血清(Hyclone公司)的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)保持初始細(xì)胞濃度在3*105/ml左右，三天一次1∶3傳代。實(shí)驗(yàn)前一天傳代(5*105/ml)，實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞濃度在7.5～10*105/ml之間。
BEL-7402細(xì)胞株和HT-29細(xì)胞株，貼壁生長(zhǎng)，用10％胎牛血清(Hyclone公司)的D-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)初始細(xì)胞濃度在3*105/ml左右，2～3天1∶3傳代一次。實(shí)驗(yàn)前一天1∶2傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞濃度在5～10*105/ml之間。
2)藥物的溶解與稀釋根據(jù)提供的阿糖胞苷前藥衍生物的重量和分子量，首先加入DMSO 100～200μl，然后加入NS，使稀釋后得到的藥物濃度為5mM(注意DMSO終濃度不超過10％)。
3)D-MEM或RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基，Gibco公司 4)胎牛血清，Hyclone公司 5)細(xì)胞消化液，0.25％Trypsin+0.02％EDTA 6)PBS磷酸鹽緩沖液 7)MTT液，MTT干粉(Sigma)，用PBS充分溶解配成5mg/ml，0.22μm微孔濾膜過濾后分裝，-20℃保存 8)10％酸化SDS，0.01N HCl 9)離心管、吸管等(BD公司)，96孔板(Costar公司) 2.步驟 1)細(xì)胞接種傳代后24小時(shí)的細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。常規(guī)收獲細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml(貼壁細(xì)胞)～3×105/ml(懸浮細(xì)胞)。貼壁細(xì)胞接種100μl/孔，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h后棄去舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液95μl/孔。懸浮細(xì)胞直接接種95μl/孔。
2)藥物處理每一藥物設(shè)6個(gè)濃度梯度，每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，藥物空白對(duì)照組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每次試驗(yàn)同時(shí)做Ara-C對(duì)照。HT-29和BEL-7402細(xì)胞加入藥物的濃度依次為5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.16mM，每孔5μl，終濃度依次為0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.016、0.008mM，對(duì)照組加入5μl生理鹽水；HL-60細(xì)胞加入藥物的濃度依次為5×10-3、2.5×10-3、1.25×10-3、0.625×10-3、0.3125×10-3、0.16×10-3mM，對(duì)應(yīng)終濃度依次為2.5×10-4、1.25×10-4、6.25×10-5、3.125×10-5、1.6×10-5、8×10-6mM，對(duì)照組加入5μl生理鹽水。
3)細(xì)胞培養(yǎng)與檢測(cè)加入藥物后，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)72h，然后每孔加入MTT 10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加100μl 10％SDS(含0.01N HCl)溶解，24h后用Bio-rad 680型ELISA讀數(shù)儀測(cè)定各孔吸光度(A)，檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm、參考波長(zhǎng)為630nm。
4)計(jì)算首先平均各復(fù)孔的吸光度(去除過于懸殊的數(shù)據(jù))，計(jì)算每種細(xì)胞每個(gè)藥物濃度下的抑制率(IR)，IR(％)＝(1-An/A0)×100％，An為實(shí)驗(yàn)孔平均吸光度，A0為藥物空白對(duì)照孔平均吸光度。用EXCEL軟件，繪制藥物濃度效應(yīng)曲線，選擇合理的計(jì)算方法計(jì)算50％細(xì)胞存活的藥物濃度(IC50)。
圖5是阿糖胞苷前藥衍生物抑制BEL-7402肝癌細(xì)胞株的藥物濃度-抑制率曲線圖，其中，JF001、JF017、JF019、JF020和JF033分別為根據(jù)上述合成路線1、17、19、20和33合成得到的阿糖胞苷衍生物。
表1-2列舉了代表性阿糖胞苷前藥衍生物抑制不同腫瘤細(xì)胞的生物活性。其中，JF004、JF006、JF007、JF009、JF010、JF013、JF014和JF021分別為根據(jù)上述合成路線4、6、7、9、10、13、14和21合成得到的阿糖胞苷衍生物。
表1


表2、代表性阿糖胞苷前藥衍生物的腫瘤細(xì)胞活性

權(quán)利要求
1.阿糖胞苷前藥衍生物，其特征在于所述阿糖胞苷前藥衍生物是具有下述通式(I)、(II)、(III)中的任意一種通式的化合物
通式-I
通式-II
通式-III
其中，W表示C＝O、S(O)O和C(O)O中的任意一種基團(tuán)；
其中，Y表示(CH2)n或H2C-O-CH2，其中，n＝2～6；
X表示OH、O-P(O)(OR1)2和磷酸基中的任意一種基團(tuán)，所述磷酸基為單磷酸基、二磷酸基和三磷酸基中的任意一種；
R1、R2是C1-18飽和的或不飽和的脂肪基團(tuán)，所述不飽和的脂肪基團(tuán)中含有一個(gè)或多個(gè)不飽和健，所述不飽和健包括順式或反式異構(gòu)體；
A表示O或S或CH2或無基團(tuán)；
p＝1-5；
R3是氨基、烷基取代氨基、芳香基取代氨基、雜環(huán)基取代氨基、NHOH、NHOR4和如下基團(tuán)中的任意一種
其中R4是鹵原子、氨基、硝基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、羧基、羥基、氰基、三氟甲基、芐基、苯基、芳香基、酰基、羰基、取代氨基、黃酸基、酰胺基、黃酰胺基、氨基酸、碳環(huán)基和雜環(huán)基中的任意一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿糖胞苷前藥衍生物，其特征在于R1是H、C1-18烷基、C3-18環(huán)烷基，芐基，苯基和芳環(huán)基中的任意一種；R2是H、C1-C18烷基、C3-18環(huán)烷基、C2-18烯基、C2-18炔基，環(huán)烯基，芐基，苯基、芳香基，環(huán)氨基、碳環(huán)基、雜環(huán)基，苯胺基和取代苯胺基中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的阿糖胞苷前藥衍生物，其特征在于所述阿糖胞苷前藥衍生物是通式(I)中的X＝OH時(shí)的阿糖胞苷前藥衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的阿糖胞苷前藥衍生物，其特征在于所述阿糖胞苷前藥衍生物是通式(II)中的X＝OH時(shí)的阿糖胞苷前藥衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的阿糖胞苷前藥衍生物，其特征在于所述阿糖胞苷前藥衍生物是通式(III)的阿糖胞苷前藥衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的阿糖胞苷前藥衍生物，其特征在于所述通式(I)的阿糖胞苷前藥衍生物包括具有下述結(jié)構(gòu)式的代表性化合物
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的阿糖胞苷前藥衍生物，其特征在于所述通式(II)的阿糖胞苷前藥衍生物包括具有下述結(jié)構(gòu)式的代表性化合物
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的阿糖胞苷前藥衍生物，其特征在于所述通式(III)的阿糖胞苷前藥衍生物包括具有下述結(jié)構(gòu)式的代表性化合物
9.阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，其特征在于
(1)酸酐化合物與脂肪醇混和，加熱回流或室溫?cái)嚢瑁磻?yīng)3～5個(gè)小時(shí)，冷卻得到的第一中間產(chǎn)物(B)不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)；
(2)阿糖胞苷，第一中間產(chǎn)物(B)，PyBOP和DMAP溶于DMF，室溫～60℃攪拌7～24小時(shí)，得到反應(yīng)液通過柱層析色譜提純，得到通式(I)的阿糖胞苷衍生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，其特征在于所述酸酐化合物為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一種；所述脂肪醇為甲醇、乙醇、正辛醇、月桂醇、正癸醇、正十四醇、正十六醇和十八醇中的任意一種。
11.阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，其特征在于
(1)將2，6-二甲基氨基苯或環(huán)烷基苯并咪唑、酸酐化合物和DMAP溶于四氫呋喃，控制溫度35～50℃反應(yīng)3～5小時(shí)，析出固體，所得第二中間產(chǎn)物(C)不經(jīng)純化，直接用于下一步反應(yīng)；
(2)將阿糖胞苷，第二中間產(chǎn)物(C)，PyBOP和DMAP溶于DMF，室溫?cái)嚢?2～24小時(shí)，反應(yīng)液倒入水中，析出固體或?qū)⒎磻?yīng)液通過柱層析色譜提純，得到通式(II)的阿糖胞苷前藥衍生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，其特征在于所述酸酐化合物為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一種。
13.阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，其特征在于
(1)酸酐化合物與脂肪醇混和，加熱回流或室溫?cái)嚢瑁磻?yīng)3～5個(gè)小時(shí)，冷卻得到的第一中間產(chǎn)物(B)不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)；
(2)第一中間產(chǎn)物(B)，SOCl2和1～2滴DMF溶于二氯甲烷，加熱回流3～4小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓除去溶劑和過量的SOCl2得到第三中間產(chǎn)物(D)，不經(jīng)進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)；
(3)阿糖胞苷鹽酸鹽和第三中間產(chǎn)物(D)溶于DMF，室溫?cái)嚢?～4天，減壓蒸餾除去DMF后得到的油狀物加乙醚攪拌固化，得到的半固體產(chǎn)品用NaHCO3水溶液中和、過濾，所得固體用水洗至中性后用乙酸乙酯重結(jié)晶、過濾或所得固體溶于甲醇，過濾除去不溶物，然后通過柱層析色譜提純，得到通式(III)的阿糖胞苷衍生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，其特征在于所述酸酐化合物為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二甘醇酐中的任意一種；所述脂肪醇為甲醇、乙醇、正辛醇、正癸醇、月桂醇，正十四醇、正十六醇和十八醇中的任意一種。
15.阿糖胞苷前藥衍生物制劑的制備方法，其特征在于
(1)將具有通式(I)、(II)或(III)中的任意一種結(jié)構(gòu)式的阿糖胞苷前藥衍生物溶解到水、生理鹽水、環(huán)糊精水溶液、水溶性的有機(jī)溶劑、非離子性的表面活性劑、水溶性的類脂、脂肪酸、脂肪酸酯和磷脂中的任意一種或多種的組合溶劑而制得制劑溶液；
(2)將所述制劑溶液再用生理鹽水或葡萄糖注射液稀釋而制成阿糖胞苷前藥衍生物制劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的一種制備阿糖胞苷前藥衍生物制劑的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑是乙醇、丙二醇、甘油、甘油酯、多聚乙二醇、N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的任意一種或多種的組合溶劑。
17.阿糖胞苷前藥衍生物制劑，其特征在于是由權(quán)利要求15的阿糖胞苷前藥衍生物制劑的制備方法制備得到的產(chǎn)品。
18.權(quán)利要求1的阿糖胞苷前藥衍生物在抗癌抗腫瘤中的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的阿糖胞苷前藥衍生物在抗癌抗腫瘤中的用途，其特征在于癌癥包括白血病、固體瘤、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌和腎癌。
20.權(quán)利要求17的阿糖胞苷前藥衍生物制劑在抗癌抗腫瘤中的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的阿糖胞苷前藥衍生物制劑在抗癌抗腫瘤中的用途，其特征在于癌癥包括白血病、固體瘤、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌和腎癌。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的阿糖胞苷前藥衍生物制劑在抗癌抗腫瘤中的用途，其特征在于所述阿糖胞苷前藥衍生物制劑與其他化療藥物聯(lián)合用在抗癌抗腫瘤中，所述其他化療藥物包括烷化劑、植物生物堿類、抗菌抗腫瘤磺酰胺類藥物、鉑類藥物、抗代謝類及其它已知的抗癌藥物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的阿糖胞苷前藥衍生物制劑在抗癌抗腫瘤中的用途，其特征在于在所述聯(lián)合用藥過程中，包括運(yùn)用至少一種具有權(quán)利要求6、7和8所列舉的代表性的阿糖胞苷前藥衍生物。
全文摘要
本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物的設(shè)計(jì)是通過對(duì)N4，O5位置進(jìn)行化學(xué)修飾，而設(shè)計(jì)出的新型的前藥衍生物，可避免N4氨基被代謝失效并引起毒性；另外，讓O5羥基容易被磷酸化而激活，主要有益效果是增加生物利用度，減少多重抗藥性(多靶向設(shè)計(jì)技術(shù))，增加溶解度，增加酯溶性。本發(fā)明詳細(xì)提供了阿糖胞苷前藥衍生物的合成路線，阿糖胞苷前藥衍生物制劑及其制備方法，并通過大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了本發(fā)明的阿糖胞苷前藥衍生物在抗癌抗腫瘤方面的用途。
文檔編號(hào)C07H19/09GK101787065SQ20091000117
公開日2010年7月28日 申請(qǐng)日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者高峰, 徐峻 申請(qǐng)人:高峰, 徐峻