專利名稱：冬蟲夏草菌絲體抽提物的分離物及經(jīng)口攝取用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有藥理效果的源自冬蟲夏草的分離物及該分離物的制造方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有該分離物的經(jīng)口攝取組合物、醫(yī)藥組合物、飲食品組合物，或具有免疫激活效果的和/或用于預(yù)防或治療癌癥的醫(yī)藥品、醫(yī)藥外部品、飲食品等。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草是由昆蟲等生成的菌的總稱，處于子囊菌類·麥角菌目·麥角菌科的一屬。其中中華蟲草(Cordyceps sinensis(Berkely)Saccardo)寄生于鱗翅類蝙蝠蛾的幼蟲上，是分布于中國、西藏、尼泊爾、喜馬拉雅的高山地帶、海拔3000～4000米的荒草原上的菌。在中國自古以來就作為長生不老、強(qiáng)精壯骨的中藥而倍受珍視、傳承下來。近年來，通過研究知道了冬蟲夏草中所含的成分具有各種各樣的生理活性，對于免疫激活效果、抗腫瘤活性、降低血糖值作用、降血壓作用及血管擴(kuò)張作用進(jìn)行了報(bào)道(參照非專利文獻(xiàn)1～6)。關(guān)注這樣的生理活性，為了有效地?cái)z取有效成分也作出了嘗試(參照專利文獻(xiàn)1)，但是對于抽提物中的有效成分的含量及活性方面還很難說非常充分。
另外，隨著近年來培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，可以生產(chǎn)出與天然物幾乎相同的冬蟲夏草的菌絲體培養(yǎng)物。因而與過去利用的子實(shí)體的部分相比，冬蟲夏草的菌絲體更適合作為在工業(yè)生產(chǎn)上的原料。因此，利用該菌絲體培養(yǎng)物，用于高效抽提含有冬蟲夏草的有效成分的部分的方法正被探求。
專利文獻(xiàn)1特開平11-228440號公報(bào)非專利文獻(xiàn)1Biol.Pharm.Bull.，第22卷(第9號)，第966-970頁，1990年非專利文獻(xiàn)2Jpn.J.Pharmacol.，第79卷，第505-508頁，1999年非專利文獻(xiàn)3J.Kanazawa Med.Univ.，第16卷，第46-54頁，1991年非專利文獻(xiàn)4Biol.Pharm.Bull.，第16卷(第12號)，第1291-1293頁，1993年非專利文獻(xiàn)5Phytochemistry，第51卷，第891-898頁，1999年非專利文獻(xiàn)6Life Science，第66卷(第14號)，第1369-1376頁，2000年發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人為解決所述問題進(jìn)行了精心的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性地具有生理活性的冬蟲夏草菌絲體的分離物的調(diào)制方法。
本發(fā)明的目的是提供具有免疫激活效果和/或預(yù)防或治療癌癥的效果的源自冬蟲夏草菌絲體的分離物，及含有該分離物的經(jīng)口攝取用組合物，以及含有該經(jīng)口攝取組合物的飲食品、免疫激活劑、抗癌劑及癌癥預(yù)防劑。
即通過本發(fā)明的一個(gè)側(cè)面，可以提供沉淀部分，該沉淀部分是通過在熱水抽提冬蟲夏草菌絲體而得的抽提液中加入乙醇而得到的。在此加入的乙醇的量，可以是例如相對于上述抽提液的容積比為0.5～2.0倍的量。
通過本發(fā)明的其他側(cè)面，在上述抽提液中加入相對于所述抽提液的容積比為0.5～2.0倍量的乙醇，去除生成的沉淀部分，將上清液作為得到的抽提液，向其中進(jìn)一步加入使得該抽提液含有的乙醇量按容積比計(jì)為70％～90％的量的乙醇，從而提供所得到的沉淀部分。
通過本發(fā)明的其他側(cè)面提供沉淀部分，所述沉淀部分是在冬蟲夏草菌絲體的熱水抽提液和/或該抽提液中加入一定量的乙醇，得到去除了生成的沉淀部分的上清液，在加入乙醇之前對其進(jìn)行濃縮，然后再向其中加入乙醇，從而得到的沉淀。通過本發(fā)明的其他側(cè)面提供，作為預(yù)處理將用乙醇進(jìn)行加熱抽提而得的殘?jiān)鳛樯鲜龆x夏草菌絲體，通過在經(jīng)熱水抽提而得的抽提液中加入乙醇而得到的沉淀部分。進(jìn)而，通過本發(fā)明的其他側(cè)面提供以含有具有10萬或更高的分子量的多糖類為特征的上述沉淀部分。進(jìn)而通過本發(fā)明的其他側(cè)面，提供以對于哺乳類具有促進(jìn)干擾素-γ(IFN-γ)或腫瘤壞死因子-α(TNF-α)產(chǎn)生的活性為特征的上述沉淀部分。
通過本發(fā)明的其他側(cè)面，提供通過將上述沉淀部分進(jìn)一步用透析進(jìn)行分子量分離而得到的分子量為10萬或更高的部分。
通過本發(fā)明的其他側(cè)面，提供含有上述沉淀部分或分子量為10萬或更高的部分的經(jīng)口攝取用組合物。通過本發(fā)明的其他側(cè)面，還提供含有上述經(jīng)口攝取用組合物的飲食品。進(jìn)而，通過本發(fā)明的其他側(cè)面，提供含有上述經(jīng)口攝取用組合物的免疫激活劑。進(jìn)一步地，通過本發(fā)明的其他側(cè)面，提供含有上述經(jīng)口攝取用組合物的抗癌劑或癌癥預(yù)防劑。
通過本發(fā)明的進(jìn)一步的其他的側(cè)面，還提供上述部分的制造方法，該方法含有以下工序，a)將冬蟲夏草菌絲體在85～100℃下用水進(jìn)行加熱抽提，得到抽提液的工序；b)在抽提液中加入相對于所述抽提液的容積比為0.5～2.0倍量的乙醇，回收產(chǎn)生的沉淀的工序。
進(jìn)一步通過本發(fā)明的其他的側(cè)面，還提供上述部分的制造方法，該方法含有以下工序，a)將冬蟲夏草菌絲體在85～100℃下用水進(jìn)行加熱抽提，得到抽提液的工序；b)在抽提液中加入相對于所述抽提液的容積比為0.5～2.0倍量的乙醇，將產(chǎn)生的沉淀去除、回收上清液的工序；c)通過進(jìn)一步在所述上清液中加入使得上清液含有的乙醇量按容積比計(jì)為70％～90％的量的乙醇，從而回收得到的沉淀的工序。
以下進(jìn)一步具體說明本發(fā)明本發(fā)明中的冬蟲夏草是指子囊菌類·麥角菌目·麥角菌科的一屬，例如中華蟲草(Cordyceps sinensis(Berkely)Saccardo)。
本發(fā)明中的冬蟲夏草菌絲體可以是由培養(yǎng)生產(chǎn)的物質(zhì)，也可以是由自然獲取的物質(zhì)，例如可以使用培養(yǎng)物的干燥粉末等。
本發(fā)明中進(jìn)行的熱水抽提，例如在液體溫度70～120℃下進(jìn)行。優(yōu)選溫度為85～100℃，更優(yōu)選90～95℃。抽提時(shí)間例如為1小時(shí)～24小時(shí)，優(yōu)選2～12小時(shí)，更優(yōu)選3～7小時(shí)。熱水抽提可以多次進(jìn)行，例如1～4次，優(yōu)選進(jìn)行2～3次。用于抽提的水的pH值沒有特別的限定，例如可以使用蒸餾水進(jìn)行。
由上述熱水抽提而得的抽提液，可以原樣使用，但為了降低使用的乙醇的量并高效地得到分離物，可以濃縮該抽提液后使用。濃縮率沒有特別的限定，例如可以是容積比為80～20％，優(yōu)選60％～25％，進(jìn)一步優(yōu)選50％～30％。另外，該濃縮可以在常壓下或減壓下的任一條件下進(jìn)行，但優(yōu)選在減壓下進(jìn)行。
向抽提液中加入乙醇的量沒有特別的限定，例如可以是相對于濃縮后的抽提液的容積比為0.5～2.0倍的量，優(yōu)選0.8～1.2倍，不濃縮時(shí)亦然。得到的沉淀部分可以用該技術(shù)領(lǐng)域周知的方法進(jìn)行精制，例如可以通過將其溶解于水中后加入乙醇而得到沉淀部分的操作再進(jìn)行一次或多次來進(jìn)行精制。
另外，在上述抽提液中加入一定量的乙醇，將生成的沉淀部分回收后，在作為上清液而得到的抽提液中，通過進(jìn)一步加入乙醇進(jìn)而可以得到沉淀部分。作為該上清液而得的抽提液，可以原樣使用，也可以濃縮后使用。濃縮率沒有特別的限定，例如可以是容積比為80～20％，優(yōu)選60％～25％，進(jìn)一步優(yōu)選50％～30％。另外，該濃縮可以在常壓下或減壓下的任一條件下進(jìn)行，但優(yōu)選在減壓下進(jìn)行。另外，最初加入的乙醇的量沒有特別的限定，例如可以是相對于濃縮后的抽提液的容積比為0.5～2.0倍的量，優(yōu)選0.8～1.2倍。第二次加入乙醇后抽提液中所含乙醇的量沒有特別的限定，例如可以是容積比為70％～90％，優(yōu)選75％～85％。例如加入相對于抽提液的容積比為0.5～2.0倍的乙醇，在回收生成的沉淀部分后的上清液中，例如進(jìn)行減壓濃縮除去乙醇后，加入容積比為3.0～5.0倍的乙醇，也可以得到沉淀部分。
本發(fā)明中的經(jīng)口攝取組合物例如包括飲食品組合物及醫(yī)藥組合物等。
為得到有效成分含量高的分離物，在本發(fā)明中對于進(jìn)行熱水抽提的冬蟲夏草菌絲體而言，可以進(jìn)行預(yù)處理。該預(yù)處理沒有特別的限定，可例舉出使用碳原子數(shù)為1～4的醇或該醇水溶液的加熱抽提等，優(yōu)選使用乙醇。加熱時(shí)的溫度為例如液體溫度70～120℃，優(yōu)選80～100℃，更優(yōu)選90～95℃。抽提時(shí)間為例如1小時(shí)～24小時(shí)，優(yōu)選2～12小時(shí)，更優(yōu)選3～7小時(shí)。乙醇抽提可以進(jìn)行多次，例如1～4次，優(yōu)選2～3次。也可以使用不同的溶劑來多次進(jìn)行，例如可以使用95～99.5％的乙醇進(jìn)行抽提后，將其殘?jiān)萌莘e比為60～80％的乙醇水溶液進(jìn)行抽提，將其殘?jiān)鳛檫M(jìn)行熱水抽提的原料而使用。
本發(fā)明中得到的沉淀部分，作為其成分可含有例如多糖類等。該多糖類沒有特別的限定，是由天然存在的單糖類所構(gòu)成的物質(zhì)，在其分子中的1個(gè)或2個(gè)或更多個(gè)部位可以接受?；?、磷酸化等的修飾，或通過蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合的修飾。該多糖類的分子量沒有特別的限定，例如可以是10萬～200萬。本發(fā)明的沉淀部分的糖含量，可以用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員周知的方法進(jìn)行測定，例如可以用苯酚硫酸法等。本發(fā)明的含糖量沒有特別的限定，例如用D-葡萄糖換算為40～90重量％，優(yōu)選50～80重量％，進(jìn)而優(yōu)選60～80重量％。
上述沉淀部分，例如通過透析等方法可以分離為例如分子量小于5萬的部分、分子量為5萬或更高而小于10萬的部分、分子量為10萬或更高的部分。
本發(fā)明的免疫激活劑，由于具有促進(jìn)哺乳類中干擾素-γ和/或腫瘤壞死因子-α產(chǎn)生的作用，因而對于需要免疫激活的被試驗(yàn)者，可以作為預(yù)防藥和/或治療藥而使用。另外，本發(fā)明的抗癌劑因?yàn)轱@示出有意義的抗腫瘤效果，所以可以成為對癌癥有效的預(yù)防藥及治療藥。因此，本發(fā)明的免疫激活劑及抗癌劑可以作為醫(yī)藥組合物的有效成分而使用。該醫(yī)藥組合物可以含有一般所使用的各種成分，例如可以含有1種或更多種的在藥學(xué)上容許的賦形劑、稀釋劑、濕潤劑、乳化劑、分散劑、輔助劑、防腐劑、緩沖劑、粘合劑、穩(wěn)定劑等。
本發(fā)明的免疫激活劑及抗癌劑的給藥量，可以根據(jù)患者的體形、年齡、身體狀況、病情程度、發(fā)病后的經(jīng)過時(shí)間等適當(dāng)選擇，例如，一般的使用量為1～5000mg/日/成人。
另外，本發(fā)明的經(jīng)口攝取組合物可以原樣作為功能性食品而使用，還可以作為醫(yī)藥外部品、飲食品等的成分、食品添加物等而使用。通過這種使用，使本發(fā)明的具有免疫激活效果及抗腫瘤效果的經(jīng)口攝取組合物可以日常性地及持續(xù)性地?cái)z取，可以通過有效的免疫激活來改善體質(zhì)、治療癌癥及預(yù)防癌癥的發(fā)生。本發(fā)明的經(jīng)口攝取組合物作為食品材料而使用的例子，可以舉出具有免疫激活效果或治療癌癥效果或預(yù)防癌癥效果的功能性食品、健康食品、一般食品(果汁、點(diǎn)心、加工食品等)、營養(yǎng)輔助食品(營養(yǎng)飲料等)。
本發(fā)明的經(jīng)口攝取組合物由于具有免疫激活作用和/或抗腫瘤作用，因而本發(fā)明提供了用于免疫激活的有效手段及對于癌癥的有效的預(yù)防手段或治療手段，還提供在健康食品的制造中有用的組合物。


圖1為顯示通過用人末梢血的in vitro試驗(yàn)來測定熱水抽提部分(HWE)、50％乙醇沉淀部分(50％EP)、80％乙醇沉淀部分(80％EP)、乙醇萃取物(Et Ext)、70％乙醇萃取物(70Et Ext)的IFN-γ的產(chǎn)生量促進(jìn)活性的結(jié)果的圖。
圖2為顯示通過用人末梢血的in vitro試驗(yàn)來測定熱水抽提部分(HWE)、50％乙醇沉淀部分(50％EP)、80％乙醇沉淀部分(80％EP)、乙醇萃取物(Et Ext)、70％乙醇萃取物(70Et Ext)的TNF-α的產(chǎn)生量促進(jìn)活性的結(jié)果的圖。
圖3為顯示通過用人末梢血的in vitro試驗(yàn)來測定用透析的分子量分離而得到的分子量為10萬或更高的部分(M1)、分子量為5萬或更高而小于10萬的部分(M2)及分子量小于5萬的部分(M3)、熱水抽提部分(HWE)及50％乙醇沉淀部分(50％EP)的IFN-γ的產(chǎn)生量促進(jìn)活性的結(jié)果的圖。
圖4為顯示通過用人末梢血的in vitro試驗(yàn)來測定用透析的分子量分離而得到的分子量為10萬或更高的部分(M1)、分子量為5萬或更高而小于10萬的部分(M2)及分子量小于5萬的部分(M3)、熱水抽提部分(HWE)及50％乙醇沉淀部分(50％EP)的TNF-α的產(chǎn)生量促進(jìn)活性的結(jié)果的圖。
圖5為通過給予鼠熱水抽提部分(HWE)、50％乙醇沉淀部分(50％EP)、80％乙醇沉淀部分(80％EP)而顯示出的腫瘤體積變化的圖。
具體實(shí)施例方式
以下，就本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
中華蟲草菌絲體的分離物的調(diào)制在本發(fā)明的實(shí)施中，成為原料的中華蟲草菌絲體培養(yǎng)物的粉末可以使用例如中國市售的“發(fā)酵蟲草菌粉”(商品名CORBRIN CAPSULE，制造公司杭州中美華東制藥有限公司)。
將原料冬蟲夏草菌絲體粉末用99.5％的乙醇在90～95℃下抽提6小時(shí)。乙醇量為每1g菌絲體用2mL。濾過殘?jiān)?，再次將殘?jiān)迷摲椒ǔ樘?，用過濾分開抽提液和殘?jiān)?次抽提所得到的抽提液合起來進(jìn)行減壓濃縮，得到用原料換算為15.0％(重量比)的粘稠的濃褐色液體乙醇萃取物(Et Ext)。接著將殘?jiān)?0％的乙醇水溶液(體積比)在90～95℃下抽提6小時(shí)。70％的乙醇的量為每1g殘?jiān)?mL。濾過殘?jiān)?，再次用此方法抽提殘?jiān)?，用過濾分開抽提液和殘?jiān)?次抽提所得的抽提液合起來進(jìn)行減壓濃縮，直至體積變?yōu)榧s40％，通過冷凍干燥得到用原料換算為45.8％(重量比)的濃褐色粉末70％乙醇萃取物(70％Et Ext)。接著將殘?jiān)谜麴s水在90～95℃下抽提6小時(shí)。蒸餾水量為每1g殘?jiān)?mL。濾過殘?jiān)俅斡么朔椒ǔ樘釟堅(jiān)?，用過濾分開抽提液和殘?jiān)?。?次抽提而得的抽提液合起來進(jìn)行減壓濃縮，直至體積為約40％，添加體積比為等量的99.5％的乙醇，靜置于冷且暗的地方一晚。通過離心分離回收沉淀物，使其溶解于蒸餾水中并冷凍，經(jīng)冷凍干燥得到用原料換算為17.9％(重量比)的吸濕性高的濃茶色粉末50％乙醇沉淀部分(50％EP)。將上清進(jìn)行減壓濃縮直至體積為約40％后，添加體積比為4倍量的99.5％乙醇，靜置于冷且暗的地方一晚。通過離心分離回收沉淀物，使其溶解于蒸餾水中并冷凍，經(jīng)冷凍干燥得到用原料換算為6.0％(重量比)的茶色粉末80％乙醇沉淀部分(80％EP)。
將50％乙醇沉淀部分溶解于蒸餾水中，用Spectrum公司制Spectra/Por(注冊商標(biāo))CE Membrane MWCO100000對蒸餾水進(jìn)行透析。溶解50％乙醇沉淀部分的蒸餾水的量為每1g沉淀部分用50mL。通過冷凍干燥透析內(nèi)液得到用原料換算為10.0％(重量比)的分子量為10萬或更高的部分(M1)。將透析外液減壓濃縮，用Spectrum公司制Spectra/Por(注冊商標(biāo))6Membrane MWCO50000對蒸餾水進(jìn)行透析。通過冷凍干燥透析內(nèi)液得到用原料換算為3.94％(重量比)的、分子量為5萬或更高而小于10萬的部分(M2)。將透析外液減壓濃縮，通過冷凍干燥得到用原料換算為3.45％(重量比)的、分子量小于5萬的部分(M3)。
對于M1部分，用苯酚硫酸法對含糖量作定量，結(jié)果M1部分的含糖量用D(+)-葡萄糖換算為69.9％。在此，苯酚硫酸法是用一般的方法而進(jìn)行的(例如參照“新實(shí)驗(yàn)化學(xué)講座20生物化學(xué)[II]”，1085頁，日本化學(xué)會編，1978年10月20日發(fā)行，丸善株式會社)[制造例1]熱水抽提物的調(diào)制例實(shí)施例中的作為比較對照用的熱水抽提物，用以下的方法進(jìn)行調(diào)制。將冬蟲夏草菌絲體粉末用蒸餾水在90～95℃下邊攪拌邊抽提4小時(shí)。蒸餾水量為每1g菌絲體用20mL。濾過殘?jiān)?，通過減壓濃縮濾液后冷凍干燥而得到有吸濕性的茶褐色粉末熱水抽提物(HWE)。
使用人末梢血測定免疫激活效果在48孔細(xì)胞培養(yǎng)用板上，添加從人采集的末梢血500μL和與末梢血等量的RPMI1640培養(yǎng)基。添加被檢測物質(zhì)使其最終濃度為200μg/mL，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)24小時(shí)?；厥张囵B(yǎng)上清，使用利用酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)的測定試劑盒(BIOSOURCE公司制)分別對干擾素-γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作定量測定。試劑盒的使用方法和定量結(jié)果的解析方法按照試劑盒所附的操作說明書而行。
對于在實(shí)施例1中調(diào)制的50％乙醇沉淀部分(50％EP)、80％乙醇沉淀部分(80％EP)、乙醇萃取物(Et Ext)、70％乙醇萃取物(70％Et Ext)以及制造例1中調(diào)制的熱水抽提物(HWE)，測定IFN-γ產(chǎn)生量及TNF-α產(chǎn)生量，結(jié)果分別顯示于圖1及圖2中。由該測定結(jié)果可知，與HWE、Et Ext及70％Et Ext相比，50％EP及80％EP無論是對于IFN-γ還是對于TNF-α都有顯著的促進(jìn)產(chǎn)生量的效果，確認(rèn)了在使用源自人的末梢血的試驗(yàn)系中本發(fā)明的分離物的效果。另外，也明確了50％EP與80％EP相比具有更高的促進(jìn)效果。
對于在實(shí)施例1中調(diào)制的50％乙醇沉淀部分(50％EP)的分子量分離物M1(分子量為10萬或更高的部分)、M2(分子量為5萬或更高而小于10萬的部分)以及M3(分子量小于5萬的部分)，測定IFN-γ及TNF-α產(chǎn)生量，結(jié)果分別顯示于圖3及圖4中。由該測定結(jié)果可知，無論是對于IFN-γ產(chǎn)生量還是對于TNF-α產(chǎn)生量，M1都具有超過50％EP的促進(jìn)產(chǎn)生量的效果。另外，確認(rèn)了該促進(jìn)產(chǎn)生量的活性只集中于M1(分子量為10萬或更高的部分)，50％EP的促進(jìn)IFN-γ及TNF-α的產(chǎn)生量活性，與分子量為10萬或更高的化合物有很深的關(guān)系。
使用患癌鼠測定抗腫瘤效果從日本SLC株式會社購入6周齡的雜交群Slc:BDF1雄鼠32只，以8只為一組分成4組，將4只放入一個(gè)籠子中馴養(yǎng)1周。對7周齡的鼠于右腋下的皮下接種1×106cell/mouse的鼠的腫瘤Sarcoma180。另外，在接種前先剃掉接種部位的體毛，使得對于腫瘤的附著及成長的觀察更正確地進(jìn)行。腫瘤的成長是用數(shù)碼游標(biāo)卡尺測量腫瘤的短徑和長徑，算出腫瘤的大小(長徑×短徑2/2mm3)。4組分別為對照組(control組)、熱水抽提物組(HWE組)、50％乙醇沉淀部分組(50％EP組)和80％乙醇沉淀部分組(80％EP組)，各組從接種腫瘤日開始每天上午10點(diǎn)用探針經(jīng)口給予被檢測物質(zhì)。給予量為，control組每10g體重給予生理鹽水0.1mL，HWE組使HWE溶解于生理鹽水中成為250mg/kg而給予，50％EP組使50％EP溶解于生理鹽水中成為44.8mg/kg而給予，80％EP組使80％EP溶解于生理鹽水中成為15.0mg/kg而給予。
第7日及第10日的腫瘤體積的測定結(jié)果示于圖5中。由該測定結(jié)果可以確認(rèn)，在in vivo的試驗(yàn)系中本發(fā)明的分離物具有抗腫瘤活性。進(jìn)而，給予量為HWE的1/5或更低的50％EP明示出超過HWE的抗腫瘤效果，同時(shí)該結(jié)果也支持了實(shí)施例2的結(jié)果。
A431細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)將A431細(xì)胞(人扁平上皮癌細(xì)胞株；從大日本制藥而得)懸濁于含有10％FBS的Dulbecco’s改變的Eagle培養(yǎng)基(SIGMA公司制)中，使其成為4×104個(gè)/mL，分別以50μL(2×103個(gè)/孔)添加到96孔微培養(yǎng)板(住友BAKELITE制)的各孔中。培養(yǎng)6小時(shí)后(37℃、5％CO2)，將含有作為被檢測物質(zhì)的、各自為2000μg/ml的HWE、70％Et Ext、50％EP、80％EP及10％FBS的培養(yǎng)基分別以50μL添加到各孔中(終濃度為1000μg/ml)。將添加有50μL的含有200μM的Genistein的培養(yǎng)基的物質(zhì)作為陽性對照。培養(yǎng)4天后，向各孔中分別添加Cell counting kit-8(和光純藥)5μL，60分鐘后測定吸光度(波長450nm)。根據(jù)與不含有被檢測物質(zhì)的體系的比較來算出抑制率。
試驗(yàn)結(jié)果示于以下的表1中。在該試驗(yàn)結(jié)果中，所有的被檢測物質(zhì)都顯示出抑制細(xì)胞增殖的效果，其中特別是80％EP的抑制率顯著地高。
表1
A431細(xì)胞損害性試驗(yàn)將A431細(xì)胞(人扁平上皮癌細(xì)胞株；從大日本制藥而得)懸濁于含有10％FBS的Dulbecco’s改變的Eagle培養(yǎng)基(SIGMA公司制)中，使其成為5×105個(gè)/mL，分別以100μL(5×104個(gè)/孔)添加到96孔微培養(yǎng)板(住友BAKELITE制)的各孔中。培養(yǎng)24小時(shí)后(37℃、5％CO2)，用分別含有1000μg/mL HWE、70％Et Ext、50％EP、80％EP的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行交換。培養(yǎng)48小時(shí)后，在各孔中分別添加5μL的Cell counting kit-8(和光純藥)，測定30分鐘后的吸光度(波長450nm)。根據(jù)與不含有被檢測物質(zhì)的體系的比較來算出生存率。
試驗(yàn)結(jié)果示于以下的表2中。在該試驗(yàn)結(jié)果中，HWE及70％Et Ext顯示出一些細(xì)胞毒性，與此相對，本發(fā)明的分離物50％EP及80％EP對A431細(xì)胞的生存率未顯示出任何影響。由此，確認(rèn)了在實(shí)施例4中50％EP及80％EP所顯示的細(xì)胞增殖抑制效果不是因細(xì)胞損害性所致的。
表2

權(quán)利要求
1.沉淀部分，其特征為，在將中華蟲草的菌絲體經(jīng)熱水抽提而得的抽提液中，通過加入相對于抽提液的容積比為0.5～2.0倍量的乙醇而得到的。
2.沉淀部分，其特征為，以去除了通過在上述抽提液中加入相對于抽提液的容積比為0.5～2.0倍量的乙醇而生成的、權(quán)利要求1所述的沉淀部分后的上清液作為所得到的抽提液，通過向其中進(jìn)一步加入使得該抽提液含有的乙醇量按容積比計(jì)為70％～90％的量的乙醇而得到的。
3.權(quán)利要求1或2所述的沉淀部分，其特征為，所述抽提液是在加入乙醇之前通過濃縮而得到的物質(zhì)。
4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的沉淀部分，其中，所述菌絲體是作為前處理而用乙醇進(jìn)行加熱抽提后的殘?jiān)?br> 5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的沉淀部分，其特征為，含有具有10萬或更高的分子量的多糖類。
6.權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的沉淀部分，其特征為，對于哺乳動物，具有促進(jìn)干擾素-γ或腫瘤壞死因子-α產(chǎn)生的活性。
7.通過將權(quán)利要求1所述的沉淀部分進(jìn)一步通過透析進(jìn)行分子量分離而得到的分子量為10萬或更高的部分。
8.權(quán)利要求7所述的部分，其特征為，含糖量用D-葡萄糖換算為60～80重量％。
9.經(jīng)口攝取用組合物，其特征為，含有權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的部分。
10.飲食品，其特征為，含有權(quán)利要求9所述的經(jīng)口攝取用組合物。
11.權(quán)利要求10所述的飲食品，其特征為，具有抗癌作用、預(yù)防癌癥作用或免疫激活作用。
12.免疫激活劑，其特征為，含有權(quán)利要求11所述的經(jīng)口攝取用組合物。
13.抗癌劑，其特征為，含有權(quán)利要求11所述的經(jīng)口攝取用組合物。
14.權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的部分的制造方法，其特征為，含有下述工序，a)將冬蟲夏草菌絲體在85～100℃下用水進(jìn)行加熱抽提，得到抽提液的工序；b)在抽提液中加入相對于所述抽提液的容積比為0.5～2.0倍量的乙醇，回收產(chǎn)生的沉淀的工序。
15.權(quán)利要求2～8中任一項(xiàng)所述的部分的制造方法，其特征為，含有下述工序，a)將冬蟲夏草菌絲體在85～100℃下用水進(jìn)行加熱抽提，得到抽提液的工序；b)在抽提液中加入相對于所述抽提液的容積比為0.5～2.0倍量的乙醇，將產(chǎn)生的沉淀去除、回收上清液的工序；c)在所述上清液中進(jìn)一步加入使得所述上清液含有的乙醇量按容積比計(jì)為70％～90％的量的乙醇，回收由此得到的沉淀的工序。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供含有冬蟲夏草中所含的有效成分的分離物。另外，提供用于免疫激活的有效手段，及對癌癥有效的預(yù)防手段或治療手段，還提供在健康食品的制造中有用的組合物。本發(fā)明提供通過向冬蟲夏草菌絲體熱水抽提而得的抽提液中加入乙醇所得到的沉淀部分。進(jìn)而提供含有該沉淀部分的經(jīng)口攝取用組合物。另外通過本發(fā)明提供含有經(jīng)口攝取用組合物的飲食品、免疫激活劑、抗癌劑等，該經(jīng)口攝取用組合物的特征為，具有抗癌作用、預(yù)防癌癥作用或免疫激活作用。進(jìn)而通過本發(fā)明，還提供上述經(jīng)口攝取用組合物的有效制造方法。
文檔編號A61K35/64GK1822847SQ20048002021
公開日2006年8月23日 申請日期2004年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月14日
發(fā)明者山口能宏, 國友榮治, 內(nèi)田健志 申請人:小林制藥株式會社