專利名稱：：一種用于生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中國(guó)冬蟲夏草菌(拉丁學(xué)名為Cordycepssinensis)的無性型一中國(guó)被毛孢(拉丁學(xué)名為Hirsutellasinensis)采用工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵冬蟲夏草菌粉的生產(chǎn)方法，具體地說是涉及其在工業(yè)生產(chǎn)過程中的培養(yǎng)基的配方。
背景技術(shù)：
：冬蟲夏草是一種天然存在的稀有中藥材，除含糖、脂肪、粗纖維等一般成分外，還含有甘露醇、麥角甾醇、腺苷、蟲草酸、冬蟲夏草素、維生素B,2等活性成分。其滋補(bǔ)和治療功用在人參、鹿茸之上。但天然冬蟲夏草生長(zhǎng)期長(zhǎng)，分布在高海撥的高山草甸地帶，資源緊缺，采集不易，價(jià)格十分昂貴。杭州中美華東制藥有限公司以人工發(fā)酵方法獲得冬蟲夏草菌絲體及其制劑"百令膠囊"(內(nèi)含發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體粉末)，并已收載在《中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部》中。此外，在中國(guó)專利《中國(guó)冬蟲夏草真菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法》(專利號(hào)ZL97110448.4,公告日2001年3月28日)中公開了一種中國(guó)冬蟲夏草真菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，該方法是將菌種植入液體培養(yǎng)基置于搖床上，溫度2(TC以下，培養(yǎng)8天，然后植入一級(jí)種子罐，溫度2(TC以下，發(fā)酵5-8天，然后以培養(yǎng)基量的IO倍擴(kuò)大，逐級(jí)培養(yǎng)，直至達(dá)到所需要的量，出罐過濾而成。這一發(fā)酵過程均在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，培養(yǎng)基為碳源0.5-5%，氮源0.2-5%，微量元素，維生素少許，其余為水份。該專利只是公開了液體培養(yǎng)基的配方，沒有公開菌種的斜面培養(yǎng)基，而菌種的斜面培養(yǎng)是整個(gè)生產(chǎn)過程的起點(diǎn)，沒有菌種的斜面培養(yǎng)就不能為發(fā)酵生產(chǎn)提供種子，從而無法進(jìn)行發(fā)酵冬蟲夏草菌粉的生產(chǎn)；而且，天然冬蟲夏草作為嚴(yán)寒高原物種，要使其在平原環(huán)境下生長(zhǎng)，是比較困難的，只有選擇適合冬蟲夏草菌生長(zhǎng)的斜面培養(yǎng)基才能保證新采集菌種的成功分離及純正冬蟲夏草菌種的不斷傳代，并保持其優(yōu)良性狀，從而為后續(xù)的發(fā)酵生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)種子，因此，冬蟲夏草的斜面培養(yǎng)在整個(gè)生產(chǎn)過程中是至關(guān)重要的。斜面培養(yǎng)屬固體培養(yǎng)，其生長(zhǎng)環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)要求都與液體培養(yǎng)不同，在中國(guó)專利ZL97110448.4中沒有公開斜面培養(yǎng)基的組成，如果用此專利中的液體培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)，斜面生長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)不良現(xiàn)象，無法為發(fā)酵提供有利保障；此外在目前的文獻(xiàn)中均沒有對(duì)斜面培養(yǎng)基的報(bào)導(dǎo)。此外，采用中國(guó)專利ZL97110448.4中的液體培養(yǎng)基進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)其存在著產(chǎn)量低、成本大的缺陷，并且此專利培養(yǎng)基配方中的牛肉湯等受原材料影響較大，質(zhì)量難以控制等，不適合工業(yè)化大生產(chǎn)的需要。發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中無固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基質(zhì)量難以控制不適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)等不足，提供一種用于發(fā)酵冬蟲夏草菌絲的斜面培養(yǎng)方法，為發(fā)酵提供保障；同時(shí)也提供一種原材料營(yíng)養(yǎng)豐富，價(jià)格低廉，生產(chǎn)容易控制，從而能夠生產(chǎn)出高品質(zhì)、質(zhì)量穩(wěn)定的冬蟲夏草菌粉的發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明公開了一種用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體的培養(yǎng)基，包括斜面培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征是斜面及發(fā)酵階段采用不同的培養(yǎng)基。本發(fā)明公開的斜面培養(yǎng)基，按重量體積比(g/ml)計(jì)，包括碳源1.08.0%，氮源1.68.0%，無機(jī)鹽00.1%,瓊脂粉0.5.5%，其余為水；優(yōu)選碳源3.05.0%，氮源2.56.0%,無機(jī)鹽0.020.06%，瓊脂粉0.51.0%，其余為水；其中所述的碳源選自葡萄糖、玉米粉、土豆汁和糊精中的幾種氮源選自酵母粉、麩皮、蠶蛹粉，或再加蛋白胨；無機(jī)鹽選自氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂、氯化錳、氯化鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、硫酸錳中的幾種。更優(yōu)選的斜面培養(yǎng)基為葡萄糖1.03.0%,玉米粉02.0%，土豆汁01.0%，糊精01.0%;酵母粉0.11.0%，麩皮0.52.0%，蠶蛹粉1.03.0%,蛋白胨02.0%;硫酸鎂00.05%,磷酸二氫鉀00.05%;瓊脂粉0.51.0%，其余為水。本發(fā)明公開的發(fā)酵培養(yǎng)基，按重量體積比(g/ml)計(jì)，碳源2.04.0%，氮源2.04.0%，無機(jī)鹽00.1%;其余為水；其中所述的碳源為葡萄糖、玉米漿、糖蜜中的幾種；氮源為蠶蛹粉、黃豆餅粉、酵母膏中的幾種；無機(jī)鹽為氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂、氯化錳、氯化鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、硫酸錳中的一種或多種。其中優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖1.01.5%，玉米漿01.0%，糖蜜1.01.5%;蠶蛹粉0.51.0%，黃豆餅粉1.02.0%，酵母膏0.51.0%;硫酸鎂00.05°/0，磷酸二氫鉀00.05%,其余為水。更優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖1.0%，糖蜜1.0%,蠶蛹粉0.5%，黃豆餅粉1.0%，酵母膏0.5%，硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀0.02%，其余為水。在工業(yè)生產(chǎn)中，先將菌種接種于斜面培養(yǎng)基，在1216'C培養(yǎng)2535天，然后將菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基于搖床上，溫度1216。C培養(yǎng)810天，然后接種于一級(jí)種子罐，溫度12-16'C培養(yǎng)810天，然后以培養(yǎng)基量的810倍擴(kuò)大，逐級(jí)發(fā)酵，直至達(dá)到所需的量，出罐后進(jìn)行固液分離，將固體烘干、粉碎而成。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基，在不同的培養(yǎng)階段采用不同的培養(yǎng)基，既保證了冬蟲夏草菌能夠在平原生長(zhǎng)，又確保了發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體粉末具有與天然冬蟲夏草相當(dāng)?shù)馁|(zhì)量。本發(fā)明采用不同培養(yǎng)基帶來的主要優(yōu)勢(shì)是斜面培養(yǎng)基不同于發(fā)酵培養(yǎng)基的最主要一點(diǎn)是氮源中含有麩皮，同時(shí)采用酵母粉和蠶蛹粉，這三種原材料的組合，經(jīng)試驗(yàn)證明保證了新采集的冬蟲夏草菌能夠在斜面上生長(zhǎng)，并保證了傳代的穩(wěn)定，不易退化，為生產(chǎn)提供了保障。本發(fā)明對(duì)中國(guó)專利ZL97110448.4中的液體培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，通過大量的小試和中試，確定了最適宜工業(yè)化的培養(yǎng)基，并且在改善產(chǎn)品質(zhì)量和提高產(chǎn)量方面都有一定的效果，既保障了其具有與天然冬蟲夏草營(yíng)養(yǎng)相當(dāng)?shù)奶攸c(diǎn)，又使其適合于工業(yè)化大生產(chǎn)的需要。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基與中國(guó)專利ZL97110448.4上的培養(yǎng)基相比，根據(jù)天然冬蟲夏草所生長(zhǎng)的環(huán)境，為了更適合工業(yè)化大生產(chǎn)的需要，通過大量的實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行的工藝改進(jìn)，其不同之處在于碳源的選擇上由蔗糖改為葡萄糖，這更有利于菌體的吸收；而且在氮源上又增加了酵母膏這一原材料，更有利于包括氨基酸、腺苷、甘露醇等主要代謝產(chǎn)物的生成；另外，培養(yǎng)基中的原材料基本上都是糧食原料，簡(jiǎn)單易得，營(yíng)養(yǎng)豐富，價(jià)格低廉，而且經(jīng)過培養(yǎng)基的精心組合后，可以大大地減少培養(yǎng)基的總量，從而進(jìn)一歩地降低生產(chǎn)成本，更適宜工業(yè)化生產(chǎn)的需要。所以，用本發(fā)明生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體不但成本低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)的需要，而且質(zhì)量?jī)?yōu)，具有與天然冬蟲夏草相當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值。具體實(shí)施方式-本發(fā)明所述的1.0%的土豆汁是指取10g土豆，用1000ml水，煮爛過濾，取其濾液，定容至1000ml。實(shí)施例I.將菌種接種于斜面，培養(yǎng)基配方為葡萄糖1.5%，玉米粉1.0%，糊精0.5%，麩皮1.5%,酵母粉0.5%，蠶蛹粉1.5%，蛋白胨1.0%;硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀0.02%;瓊脂粉0.8%，其余為水，在12i:培養(yǎng)25天；然后將菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為葡萄糖1.0%，糖蜜1.0%;蠶蛹粉0.5%，黃豆餅粉1.0%，酵母膏0.5%;硫酸鎂0.01%,磷酸二氫鉀0.02%,其余為水，置于搖床上，溫度14'C培養(yǎng)8天；然后接種于一級(jí)發(fā)酵罐，溫度14'C培養(yǎng)8天，然后以培養(yǎng)基量的IO倍擴(kuò)大，逐級(jí)發(fā)酵，直至30噸罐。出罐后進(jìn)行固液分離，將固體烘千、粉碎而成。實(shí)施例2:發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖1.5%，玉米漿1.0%,糖蜜1.5%;蠶蛹粉1.0%，2.0%，酵母膏1.0%;硫酸錳0.0125%,氯化鉀0.01%，其余為水，通氣量為5:1。斜面培養(yǎng)基及其余步驟及條件與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3:將菌種接種于斜面，培養(yǎng)基配方為葡萄糖1.0%，玉米粉2.0%,土豆汁1.0%，糊精1.0%;麩皮1.5%，酵母粉0.1%,蠶蛹粉3.0%-，硫酸鎂0.01%，氯化鉀0.01%;瓊脂粉0.8%，其余為水，發(fā)酵培養(yǎng)基及其余步驟及條件與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4:對(duì)比實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例1、2和3所獲得的產(chǎn)品與按ZL97110448.4公開的實(shí)施例生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比(具體數(shù)據(jù)見下表。除培養(yǎng)基配方及其所加的量不同外，其他生產(chǎn)條件等同)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所生產(chǎn)的發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體的產(chǎn)量高于"中國(guó)專利ZL97110448.4"所生產(chǎn)的冬蟲夏草菌絲體的產(chǎn)量。并按《中華人民共和國(guó)藥典2005年版》中所收載的"百令膠囊"的測(cè)定方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明所生產(chǎn)-的全部符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，而"中國(guó)專利ZL97110448.4"所生產(chǎn)的冬蟲夏草菌絲體粉末與藥典標(biāo)準(zhǔn)有一定的偏差。本發(fā)明經(jīng)過對(duì)原材料的精心篩選，既便發(fā)酵培養(yǎng)基所加的量很少，比如碳源與氮源都只用2%，如實(shí)施例1與實(shí)施例3所公開的技術(shù)方案，其產(chǎn)量與"ZL97110448.4專利"中各實(shí)施例相當(dāng)，而工業(yè)成本卻降低了許多。而如果采用與"ZL97110448.4專利"中各實(shí)施例相當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基的量，如實(shí)施例2所公開的技術(shù)方案，則產(chǎn)量大大地優(yōu)于它。本發(fā)明與采用中國(guó)專利ZL97U0448.4技術(shù)方案生產(chǎn)的發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體質(zhì)量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>其中，樣品1為采用"ZL97110448.4專利實(shí)施例1"生產(chǎn)的發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體粉末，樣品2為采用"ZL97110448.4專利實(shí)施例2"生產(chǎn)的發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體粉末，樣品3為采用"ZL97110448.4專利實(shí)施例3"生產(chǎn)的發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體粉末，樣品4為采用本專利實(shí)施例1生產(chǎn)的發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體粉末，樣品5為采用本專利實(shí)施例2生產(chǎn)的發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體粉末，樣品6為采用本專利實(shí)施例3生產(chǎn)的發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體粉末。其中，總氨基酸、腺苷、甘露醇的含量為每0.2§發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體粉末中所含的量。從以上表格可以得出，本發(fā)明用于生產(chǎn)中，得率高，同時(shí)質(zhì)量?jī)?yōu)于ZL97U0448.4，并符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。權(quán)利要求1.一種用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體的培養(yǎng)基，包括斜面培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，按重量體積比計(jì)，所述的斜面培養(yǎng)基包括碳源1.08.0%，氮源1.68.0%，無機(jī)鹽00.1%，瓊脂粉0.51.5%，其余為水；其中所述的碳源選自葡萄糖、玉米粉、土豆汁或糊精中的幾種；氮源選自酵母粉、蠶蛹粉、蛋白胨或麩皮中的幾種；無機(jī)鹽選自氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂、氯化錳、氯化鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵或硫酸錳中的幾種。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，按重量體積比計(jì)，碳源3.05.0%，氮源2.56.0%，無機(jī)鹽0.020.06%，瓊脂粉0.51.0%，其余為水；其中所述的碳源選自葡萄糖、玉米粉、土豆汁和糊精中的幾種；氮源選自酵母粉、蠶蛹粉、蛋白胨和麩皮中的幾種；無機(jī)鹽選自氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂、氯化錳、氯化鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、硫酸錳中的幾種。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述培養(yǎng)基，其特征在于，按重量體積比計(jì)，葡萄糖1.03.0%，玉米粉02.0%,土豆汁01.0%，糊精01.0%;酵母粉0.11.0%，麩皮0.52.0%，蠶蛹粉1.03.0%，蛋白胨02.0%;硫酸鎂00.05%，磷酸二氫鉀00.05%;瓊脂粉0.51.0%，其余為水。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，按重量體積比計(jì)，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源2.04.0%，氮源2.04.0%，無機(jī)鹽00.1%，其余為水；其中所述的碳源為葡萄糖、玉米漿、糖蜜中的幾種；氮源為蠶蛹粉、黃豆餅粉、酵母膏中的幾種；無機(jī)鹽為氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂、氯化錳、氯化鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、硫酸錳中的一種或多種。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其特征在于，按重量體積比計(jì)，所述的葡萄糖1.01.5%，玉米漿01.0%，糖蜜1.01.5%;蠶蛹粉0.51.0%，黃豆餅粉1.02.0%，酵母膏0.51.0%;硫酸鎂00.05%，磷酸二氫鉀00.05%，其余為水。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基，其特征在于，按重量體積比計(jì)，所述的葡萄糖1.0%，糖蜜1.0%，蠶蛹粉0.5%，黃豆餅粉1.0%，酵母膏0.5%，硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀0.02%，其余為水。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體的培養(yǎng)基，包括斜面培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基，在不同的培養(yǎng)階段采用不同的培養(yǎng)基，既保證了冬蟲夏草菌能夠在平原生長(zhǎng)，又確保了發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體粉末具有與天然冬蟲夏草相當(dāng)?shù)馁|(zhì)量。并且在改善產(chǎn)品質(zhì)量和提高產(chǎn)量方面都有一定的效果，既保障了其具有與天然冬蟲夏草營(yíng)養(yǎng)相當(dāng)?shù)奶攸c(diǎn)，又使其適合于工業(yè)化大生產(chǎn)的需要。文檔編號(hào)C12N1/14GK101096641SQ20071002432公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年6月13日優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日發(fā)明者李邦良,珍王,袁水金,靜許申請(qǐng)人:杭州中美華東制藥有限公司