本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：，尤其涉及一種采用原核表達(dá)體系獲取鴿子磁敏蛋白的方法。
背景技術(shù)：
：：生物地磁導(dǎo)航普遍存在于生物界內(nèi)。鴿子、園林鶯、羅賓鳥等鳥類和其它一些生物如海龜、棕蝠、加勒比海多刺龍蝦、紅蜥蜴，甚至是果蠅等昆蟲也具備地磁感應(yīng)能力。目前，國內(nèi)外對生物地磁導(dǎo)航進(jìn)行了大量研究，主要集中在動物行為學(xué)和理論模擬計(jì)算上。針對其具體生物生理機(jī)制已有不少研究，也提出了一些假設(shè)和解釋，但仍然存在諸多不明確的方面，也未達(dá)成很好的共識。隱花色素(Cryptochrome，Cry)蛋白，被認(rèn)為是生物體內(nèi)最可能的地磁敏感物質(zhì)。其作為生物最可能的地磁響應(yīng)機(jī)制—自由基對機(jī)理中的關(guān)鍵蛋白，一直以來都受到廣泛關(guān)注。研究認(rèn)為隱花色素Cry在受到光激發(fā)后，蛋白上的色氨酸殘基Trp會和蛋白輔基FAD發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)而形成一對自由基對FADH°-Trp°中間態(tài)產(chǎn)物。這個(gè)中間態(tài)的壽命受地磁場影響，而某些生物就通過特定的方式感應(yīng)到這種微弱變化，進(jìn)而對地磁場做出響應(yīng)。由此可見，對Cry蛋白光化學(xué)反應(yīng)的磁響應(yīng)過程開展研究，對揭示生物地磁導(dǎo)航機(jī)制具有重要意義。體外獲取Cry蛋白是開展相關(guān)研究的必要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外普遍采用異源表達(dá)系統(tǒng)獲取Cry蛋白。有文獻(xiàn)報(bào)道采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)磁導(dǎo)航鳥類園林鶯的隱花色素gwCry，但表達(dá)量只有2μg/L。我們實(shí)驗(yàn)室前期也采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功獲得鴿子ColumbialiviaCryptochrome1(ClCry1)活性蛋白，但在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，這種表達(dá)存在較多問題，首先就是操作繁瑣、成本高，其次表達(dá)量低、蛋白易降解、輔基易脫落。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡單、快速、低成本的，能高效表達(dá)鴿子磁敏蛋白ClCry1的方法。為解決上述技術(shù)問題，提供了一種采用原核表達(dá)體系獲取鴿子磁敏蛋白的方法，包括以下步驟：S1、提取含ClCry1的目的基因；S2、雙酶切目的基因片段和載體；S3、將酶切后的目的基因連接到載體上得到重組載體；S4、將所述重組載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆；S5、將所述陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)、蛋白表達(dá)、純化得到鴿子磁敏蛋白。上述的方法，優(yōu)選的，所述S1步驟具體為：S1-1、設(shè)計(jì)含HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)的引物；S1-2、以含ClCry1的目的基因的載體為模板，通過S1-1中設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，即為含ClCry1的目的基因。上述的方法，優(yōu)選的，所述含HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)的引物為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列。SEQIDNO.1所示的序列具體為：CGCGGATCCGCGATGGGGGTGAACGCCGT。SEQIDNO.2所示的序列具體為：CCCAAGCTTGGGTGTGCTCTGTCGCTGGACT。上述的方法，優(yōu)選的，所述S2步驟中采用HindIII和BamHI對所述目的基因和載體進(jìn)行雙酶切。上述的方法，優(yōu)選的，所述載體為pet21a載體。上述的方法，優(yōu)選的，所述S4步驟中所述轉(zhuǎn)化方法為：將重組載體加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰內(nèi)放置30min～50min，42℃熱激80s～90s，然后立即置于冰中3min～8min，加入無抗生素LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)45min～60min，取出置于離心機(jī)內(nèi)常溫5000rpm～6000rpm離心1min，去掉離心后的上清液，取重懸菌體均勻涂布于含有Amp的固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。上述的方法，優(yōu)選的，所述S5步驟中所述培養(yǎng)方法為：將所述陽性克隆置于含Amp的LB培養(yǎng)基內(nèi)37℃搖床培養(yǎng)12h～16h獲得陽性轉(zhuǎn)化菌液。上述的方法，優(yōu)選的，所述S5步驟中所述蛋白表達(dá)的方法為：將培養(yǎng)后的陽性轉(zhuǎn)化菌液接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8之間；然后加入IPTG誘導(dǎo)劑，在16℃～30℃下繼續(xù)培養(yǎng)10h～24h。進(jìn)一步優(yōu)選的，培養(yǎng)時(shí)間為14h～24h。所述陽性轉(zhuǎn)化液的接種比例為1％～5％(體積百分含量)。上述的方法，優(yōu)選的，所述IPTG誘導(dǎo)劑的濃度為0.1mM～1mM。上述的方法，優(yōu)選的，所述S5步驟中所述純化的具體包括以下步驟：S5-1、將經(jīng)過蛋白表達(dá)后的菌液置于冰上停止表達(dá)，然后離心收集菌體；S5-2、在收集的菌體中加入裂解液于冰上裂解得到裂解后的菌體；S5-3、將所述裂解后的菌體超聲破碎、離心，收集離心后的上清液；S5-4、將所述上清液倒入含鎳柱的純化柱中，使蛋白與鎳柱結(jié)合；S5-5、排出流出液，然后用洗滌液洗脫雜蛋白；S5-6、加入目的蛋白洗脫液洗脫，得到鴿子磁敏蛋白。上述的方法，優(yōu)選的，所述S5-1步驟中，所述經(jīng)過蛋白表達(dá)后的菌液置于冰上10min～20min，使其停止表達(dá)；然后于4℃、5000rpm～8000rpm條件下離心10min～20min，倒掉上清，收集菌體；和/或，所述S5-2步驟中，在收集好的菌體中加入40mL～60mL配制好的裂解液，混勻，于冰上裂解30min～40min得到裂解后的菌體；和/或，所述S5-3步驟中，將裂解后的菌體進(jìn)行超聲波破碎，超聲時(shí)設(shè)置工作時(shí)間5s，休息10s，功率30，共超聲10min；超聲完成后，置于冰上使其冷卻；然后將液體倒入離心管內(nèi)于4℃、10000rpm～15000rpm條件下離心50min～60min得到上清液和沉淀；和/或，所述S5-4步驟中，將所述上清液倒入含鎳柱的純化柱中，將柱子置于4℃，避光條件下緩慢旋轉(zhuǎn)10min～60min使蛋白與鎳柱結(jié)合。和/或，所述S5-5步驟中，所述洗滌液包括70mM～90mM的咪唑溶液；和/或，所述S5-6步驟中，所述目的蛋白洗脫液包括250mM～500mM的咪唑溶液。上述的方法，優(yōu)選的，所述鴿子磁敏蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。所述SEQIDNO.3所示的序列，具體為：MGVNAVHWFRKGLRLHDNPALRECIQGADTVRCVYILDPWFAGSSNVGINRWRFLLQCLEDLDANLRKLNSRLFVIRGQPADVFPRLFKEWNITKLSIEYDSEPFGKERDAAIKKLASEAGVEVIVRISHTLYDLDKIIELNGGQPPLTYKRYQTLISRMEPLEMPVETITPEVMEKCTTPVSDDHDEKYGVPSLEELGFDTDGLPSAVWPGGETEALTRLERHLERKAWVANFERPRMNANSLLASPTGLSPYLRFGCLSCRLFYFKLTDLYKKVKKNSSPPLSLYGQLLWREFFYTAATNNPRFDKMEGNPICVQIPWDKNPEALAKWAEGRTGFPWIDAIMTQLRQEGWIHHLARHAVACFLTRGDLWISWEEGVKVFEELLLDADWSVNAGSWMWLSCSSFFQQFFHCYCPVGFGRRTDPNGDYIRRYLPVLRGFPAKYIYDPWNAPESIQKAAKCIIGVNYPKPMVNHAEASRLNIERMKQIYQQLSRYRGLGLLATVPSNPNGNGNGGLMGYSPGESISGCGSTGGTQLGTGDGQAVVQPCALGDSHTGASGVQQQGYCQASSILHYAHGDNQQSHLLQAGRTALGTGISAGKRPNPEEETQSVGPKVQRQSTN。鴿子磁敏蛋白是由620個(gè)氨基酸組成，分子量為69.6KDa，等電點(diǎn)為7.53。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明提供了一種采用原核表達(dá)體系獲取鴿子磁敏蛋白的方法，首次采用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行鴿子磁敏蛋白ClCry1的表達(dá)，并成功獲得優(yōu)化的Cry蛋白表達(dá)模板和高效表達(dá)的技術(shù)條件，利用這項(xiàng)發(fā)明技術(shù)，可使蛋白表達(dá)量提高到1.5mg/L。并且，原核表達(dá)系統(tǒng)在技術(shù)復(fù)雜和成本花費(fèi)上都比較低，因而，更方便獲得滿足需求的大量蛋白，為后續(xù)磁導(dǎo)航鳥類Cry磁敏蛋白結(jié)構(gòu)和機(jī)制的研究工作提供了一個(gè)很好的物質(zhì)保障，對揭開動物磁導(dǎo)航行為的神秘面紗具有重要意義。(2)本發(fā)明提供了一種采用原核表達(dá)體系獲取鴿子磁敏蛋白的方法，首次使用了低溫誘導(dǎo)的方法，顯著降低了包涵體蛋白的表達(dá)量，使得可溶性的蛋白表達(dá)量顯著提高。(3)本發(fā)明提供了一種采用原核表達(dá)體系獲取鴿子磁敏蛋白的方法，選擇了原核表達(dá)載體pet21a，只含有一個(gè)簡單的His-tag標(biāo)簽，這樣對表達(dá)獲得的目的蛋白結(jié)構(gòu)影響最小，同時(shí)也便于后期的切除標(biāo)簽。附圖說明為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的pFastBacHTA載體圖譜。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1的pet21a載體圖譜。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1的PCR獲得的用于連接pet21a載體的ClCry1基因片段。圖4為本發(fā)明實(shí)施例1的菌落PCR結(jié)果。圖5為本發(fā)明實(shí)施例1的測序DNA序列對比結(jié)果。圖6為本發(fā)明實(shí)施例1的氨基酸序列對比結(jié)果。圖7為本發(fā)明實(shí)施例1的表達(dá)蛋白westen-blot分析結(jié)果。圖8為本發(fā)明實(shí)施例1的表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果。具體實(shí)施方式以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。實(shí)施例1：1、獲取目的基因序列：以實(shí)驗(yàn)室已有含ClCry1基因序列的pFastBacHTA載體為模板(pFastBacHTA載體的圖譜參見圖1)，以HindIII和BamHI為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，用PCR的方式從pFastHTA載體上獲得目的基因序列。pFastBacHTA載體上連接的ClCry1基因序列如下：ATGGGGGTGAACGCCGTGCACTGGTTCCGCAAGGGGCTGCGGCTCCACGACAACCCGGCGCTGCGGGAGTGCATCCAGGGCGCCGACACGGTCCGCTGCGTCTACATCCTGGACCCCTGGTTCGCCGGCTCTTCCAACGTGGGCATCAACAGGTGGCGATTCCTGCTTCAATGTCTTGAGGATCTTGATGCCAATCTACGGAAACTGAATTCACGTTTGTTTGTTATTCGTGGACAGCCAGCAGATGTTTTCCCCAGACTTTTTAAGGAATGGAATATTACAAAACTTTCTATTGAATATGATTCTGAACCATTCGGGAAGGAAAGAGATGCAGCGATTAAGAAGTTGGCTAGTGAAGCTGGAGTGGAGGTCATTGTTCGAATTTCCCACACATTATATGACCTAGACAAAATAATAGAATTAAATGGAGGACAACCTCCTCTTACTTACAAGCGATACCAGACCCTAATTAGCAGAATGGAGCCACTAGAGATGCCAGTGGAGACTATAACCCCAGAAGTAATGGAAAAATGTACTACTCCAGTTTCTGATGACCATGACGAGAAATACGGTGTCCCATCACTTGAAGAGCTAGGTTTTGACACAGATGGTTTGCCTTCTGCAGTATGGCCAGGGGGAGAAACAGAAGCTCTCACACGATTGGAAAGACATTTAGAACGAAAGGCTTGGGTAGCAAACTTTGAAAGACCACGAATGAATGCGAATTCCCTTCTGGCAAGCCCTACGGGGCTTAGTCCCTACCTCCGCTTTGGCTGTTTGTCCTGTCGTCTCTTTTATTTCAAGTTAACGGATCTGTACAAAAAGGTAAAAAAGAACAGCTCCCCTCCCCTCTCCCTCTATGGCCAGCTGTTATGGCGTGAATTTTTCTACACAGCGGCAACTAACAATCCACGGTTTGATAAAATGGAGGGGAATCCTATCTGTGTTCAAATTCCATGGGATAAGAATCCTGAGGCTTTGGCCAAGTGGGCAGAAGGCAGGACAGGTTTTCCTTGGATTGATGCAATTATGACACAGCTTCGTCAGGAAGGTTGGATTCACCATTTAGCCCGGCATGCTGTAGCATGCTTTTTGACTCGAGGTGACCTCTGGATTAGCTGGGAAGAAGGAGTGAAGGTCTTTGAAGAGCTCTTACTTGATGCAGATTGGAGTGTAAATGCTGGAAGCTGGATGTGGCTCTCCTGTAGTTCCTTCTTTCAGCAGTTTTTTCACTGCTACTGTCCAGTGGGTTTTGGCAGAAGAACTGACCCAAATGGGGATTATATCAGACGTTATTTACCAGTACTTAGAGGCTTCCCTGCAAAATACATCTATGATCCTTGGAATGCCCCAGAGAGCATCCAGAAGGCTGCAAAATGTATTATAGGAGTTAATTATCCCAAACCAATGGTAAATCATGCAGAGGCAAGCCGTCTGAATATTGAGAGGATGAAACAAATCTACCAGCAGCTTTCACGATACAGAGGACTGGGTCTTCTTGCAACAGTGCCTTCTAATCCAAATGGAAATGGAAATGGTGGCCTAATGGGCTATTCACCAGGCGAAAGCATTTCTGGTTGTGGTAGTACAGGAGGAACTCAGCTGGGAACTGGTGACGGTCAGGCAGTTGTTCAGCCGTGTGCCCTGGGAGACTCGCATACAGGAGCAAGCGGAGTACAGCAGCAAGGTTACTGTCAAGCAAGTAGTATCTTACACTATGCTCATGGAGACAATCAGCAATCGCACTTATTGCAAGCAGGACGAACAGCCCTTGGTACTGGCATTAGTGCAGGGAAACGCCCAAATCCAGAAGAAGAAACTCAGAGCGTTGGACCAAAAGTCCAGCGACAGAGCACAAATTAA。具體方法包括以下步驟：1.1選擇酶切位點(diǎn)：選擇pet21a做為表達(dá)載體(圖2為pet21a載體圖譜)，根據(jù)其多克隆位點(diǎn)所提供的酶切位點(diǎn)，選擇ClCry1基因序列中所不含有的酶切位點(diǎn)。本文選擇HindIII和BamHI做為酶切位點(diǎn)。1.2設(shè)計(jì)PCR引物：設(shè)計(jì)含HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基的引物。HindIII：CCCAAGCTTGGG；BamHI：CGCGGATCCGCG；上游引物：CGCGGATCCGCGATGGGGGTGAACGCCGT(SEQIDNO.1)；下游引物：CCCAAGCTTGGGTGTGCTCTGTCGCTGGACT(SEQIDNO.2)。1.3PCR反應(yīng)：以含ClCry1基因序列的pFastHTA載體為模板，通過步驟1.2的上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物。表1為PCR反應(yīng)體系1，表2為PCR反應(yīng)條件。表1：PCR反應(yīng)體系組分體積/μLrTaqenzyme(DNA聚合酶)0.510×Buffer5dNTPs4上游引物(10μM)2.5下游引物(10μM)2.5cDNA2ddH2O33.5體系總體積50表2：PCR反應(yīng)條件1.4瓊脂糖凝膠電泳：將步驟1.3中得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測結(jié)果參見圖3。圖3所示為PCR獲得的用于連接pet21a載體的ClCry1基因片段pet21a/ClCry1。對凝膠電泳中的目的條帶切膠回收。2、構(gòu)建表達(dá)載體2.1雙酶切pet21a載體和ClCry1基因片段；取步驟1中回收的瓊脂糖凝膠(pet21a/ClCry1)置于表3的雙酶切體系中，在37℃條件下雙酶切反應(yīng)1h得到酶切產(chǎn)物。表3：雙酶切體系組分體積/μLBamHⅠ2.5HindⅢ2.510×Kbuffer5pet21a/ClCry120ddH2O20體系總體積50將酶切產(chǎn)物電泳然后進(jìn)行膠回收。2.2連接：將ClCry1基因片段連接到pet21a載體上獲得重組載體。采用DNALigationkitver2.1試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)，具體連接反應(yīng)體系如表4所示。表4：連接反應(yīng)體系組分體積/μLpet21a2ClCry12SolutionI(溶液I)10ddH2O6Total20將連接反應(yīng)體系置于16℃條件下，反應(yīng)30min，反應(yīng)完成后取出，在反應(yīng)體系中加入10μLSolutionIII(溶液III)，混勻得到混合溶液。2.3轉(zhuǎn)化：取10μL上述步驟2.2的混合溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。具體步驟為：2.3.1將10μL連接產(chǎn)物加入100μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，冰內(nèi)放置30min，42℃熱激90s，然后立即置于冰中5min，加入800μL無抗生素LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)50min，取出置于離心機(jī)內(nèi)常溫5000rpm離心1min，倒掉部分上清，留存約100μL左右上清重懸細(xì)胞，然后將其均勻涂布于含有Amp的固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。2.3.2挑取含有Amp的固體培養(yǎng)基上的單菌落，置于表5的菌落PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行菌落PCR得到PCR產(chǎn)物。F-Primer：CCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGC；R-Primer：GAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAG。表5：菌落PCR體系組分體積/μL10×DreamTaqBuffer5dNTPs4F-Primer(10μM)2.5R-Primer(10μM)2.5Template5DreamTaqDNApolymerse0.25ddH2O30.75Total50菌落PCR的反應(yīng)條件參見表6。表6：菌落PCR反應(yīng)條件2.3.3將反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。圖4為菌落PCR結(jié)果；從圖4中可知，挑取的6個(gè)單克隆全部都是陽性克隆。2.3.4將挑取的陽性克隆加入5mL含Amp的液體LB培養(yǎng)基中，置于37℃搖床中培養(yǎng)14h。然后采用天根的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，將其送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。圖5為DNA序列對比結(jié)果，圖6為氨基酸序列對比結(jié)果。如圖5和圖6所示，檢測的DNA序列與原始模板存在一個(gè)堿基的變化；但是翻譯得到的氨基酸序列沒有改變。至此，獲取正確的基因序列并構(gòu)建表達(dá)載體成功。3、ClCry1蛋白的表達(dá)3.1轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞：將步驟2中構(gòu)建好的重組載體(重組載體就是表達(dá)載體，一般在構(gòu)建時(shí)習(xí)慣性稱之為表達(dá)載體，構(gòu)建成功后稱之為重組載體)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中，轉(zhuǎn)化方法和前面轉(zhuǎn)化DH5α的方法(即2.3步驟)一樣。轉(zhuǎn)化成功后選取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，具體為：將單克隆置于含Amp的5mL的LB培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)過夜或者14h左右；獲得陽性轉(zhuǎn)化菌液。3.2蛋白表達(dá)：將步驟3.1的陽性轉(zhuǎn)化菌液按照2％的比例接種到2L含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm條件下培養(yǎng)至OD600到0.6之間。然后加入誘導(dǎo)劑IPTG，使得IPTG的終濃度為1mM，置于16℃條件下，培養(yǎng)24h。3.3蛋白純化步驟：3.3.1培養(yǎng)完成后收集菌液，置于冰上10min，使其停止表達(dá)；然后于4℃、5000rpm條件下離心15min，倒掉上清，收集菌體。3.3.2向收集好的菌體當(dāng)中加入40mL配制好的裂解液(裂解液的成分為：50mMNa2HPO4，150mMNaCl，pH8.0)，混勻，于冰上裂解40min。3.3.3將裂解后的菌體進(jìn)行超聲波破碎，超聲時(shí)設(shè)置工作時(shí)間5s，休息10s，功率30，共超聲10min。3.3.4超聲完成后，置于冰上5min，使其冷卻；然后將液體倒入離心管內(nèi)于4℃、15000rpm條件下離心60min得到上清液和沉淀。3.3.5吸取100μL上清(標(biāo)記為可溶性上清蛋白)用SDS-PAGE和western-blot檢測可溶性蛋白占表達(dá)蛋白的總量，其余上清輕輕地倒入到含鎳柱的純化柱中，將柱子置于4℃，避光條件下緩慢旋轉(zhuǎn)60min，使蛋白與鎳柱充分結(jié)合。3.3.6在此期間，將離心管內(nèi)剩余的沉淀用同樣體積的裂解液(裂解液的成分與3.3.2步驟一致)重懸，用SDS-PAGE和western-blot檢測包涵體占表達(dá)蛋白的總量。3.3.7之后，將結(jié)合完成的柱子塞子取出，使其液體自然流出，待液體流至剩余2/3后，收集100μL左右流出液，用SDS-PAGE和western-blot檢測蛋白結(jié)合情況。3.3.8液體流完后，塞住塞子，加入150mL含70mM咪唑的洗滌液洗雜蛋白；取出塞子，使液體自然流出，收集不同時(shí)間段的流出液各100μL左右，用SDS-PAGE和western-blot檢測雜蛋白洗脫情況。3.3.9雜蛋白洗脫完成后，塞住塞子，加入8mL含500mM咪唑的目的蛋白洗脫液；置于4℃條件下，旋轉(zhuǎn)混合30min，取出塞子，使液體自然流出，收集全部流出液，取出100μL左右流出液用SDS-PAGE檢測目的蛋白洗脫情況。剩余液體置于-80℃冰箱內(nèi)保存。3.4western-blot分析3.4.1處理檢測樣品：分別取13μL步驟3.3.5中的上清液、13μL步驟3.3.6中的懸浮液、15μL步驟3.3.9的目的蛋白、10μL步驟3.3.9的目的蛋白、13μL步驟3.1中的陽性轉(zhuǎn)化菌液進(jìn)行western-blot分析。具體處理體系參見表7。表7：樣品處理體系組分體積/μL4×samplebuffer(SDS處理液)510×reducingAgentbuffe(還原劑)2樣品10～15Total20將配制好的樣品處理體系置于70℃條件下加熱10min，即完成樣品處理。3.4.2跑膠將蛋白質(zhì)marker和按照步驟3.4.1處理好的檢測樣品，吸取20μL置于蛋白預(yù)制膠(預(yù)制膠為NuPAGE4-12％Bis-Tris，購買于lifetechnology公司)對應(yīng)膠孔內(nèi)，預(yù)制膠提前放入含緩沖液的蛋白質(zhì)膠槽內(nèi)。根據(jù)所使用的預(yù)制膠類型和緩沖液，選擇合適的電壓和時(shí)間，如200v，30min進(jìn)行跑膠(跑膠條件還可以為165v，35min)。3.4.3轉(zhuǎn)印PVDF膜跑完膠后，立即取出膠將其置于配制好的轉(zhuǎn)膜液(轉(zhuǎn)膜液的配制：取5.8g的Tris，2.9g的Gly，0.37g的SDS，適當(dāng)水溶解，加入200mL甲醇，調(diào)節(jié)pH至8.3，最終定容為1L。)中，在搖床上輕輕搖動10min處理膠，以便更好的轉(zhuǎn)膜，同時(shí)，剪裁比膠稍微大一點(diǎn)點(diǎn)大小的PVDF膜和濾紙，將濾紙置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡10min，PVDF膜先泡在甲醇中2min以活化膜，然后也置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡10min。處理完成后，取出三層濾紙，一層一層的放入轉(zhuǎn)膜儀正中，每放一層用玻璃棒小心的趕掉氣泡，然后放入PVDF膜，再放入膠，保持膠和膜的完全接觸；再一層一層加入三層濾紙，用玻璃棒輕輕趕掉氣泡。這樣，轉(zhuǎn)膜“三明治”就算做好了。蓋上轉(zhuǎn)膜儀蓋子，插上電源，打開轉(zhuǎn)膜儀(型號為∶BIO-RADTRANS-BLOTSDSEMI-DRYTRANSFERCELL)，根據(jù)蛋白性質(zhì)輸入合適電壓和時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，如10v，45min(轉(zhuǎn)膜條件還可以為15v，25min)。反應(yīng)完成后即完成轉(zhuǎn)膜。3.4.4封閉轉(zhuǎn)膜完成后，小心的取出PVDF膜，立即將其置于配制好的封閉液中，置于搖床上緩慢搖動1h，使得膜上未被蛋白占據(jù)的位置充分被封閉。3.4.5洗膜封閉完成后，用洗膜液洗膜，10mL洗膜液(洗膜液體積為10～15mL均可)洗10min，共洗2次(洗滌2～3次均可)。3.4.6孵育加入含his-tag抗體的孵育液15mL，于搖床上緩慢搖動，4℃過夜。HisProbe-HRP3.4.7洗膜孵育完成后，用洗膜液洗膜，10mL洗膜液洗10min(10～15mL洗膜液洗10～15min均可)，共洗3次(3～4次均可)。3.4.8顯色洗膜完成后，加入10mL配置好的顯色液(顯色液成分：1∶1的Supersignalwestpicoluminol/enhancersolution和Supersignalwestpicostableperoxidesolution，避光配制)，顯色5min。置于顯色儀器內(nèi)進(jìn)行拍照分析。拍照結(jié)果如圖7所示，其中：第1道為marker。第2道為步驟3.3.6中檢測包涵體占表達(dá)蛋白的總量，看其圖上相應(yīng)條帶的粗細(xì)來判斷的，可以看出包涵體蛋白占表達(dá)蛋白量的50％以下。第3道為步驟3.3.5中檢測的可溶性上清蛋白占表達(dá)蛋白的總量，結(jié)果是看其圖上相應(yīng)條帶的粗細(xì)來判斷的，可以看出可溶性蛋白占表達(dá)蛋白量的50％以上。第4道和第5道分別是10μL、15μL步驟3.3.9中得到的目的蛋白，可以看出洗脫的目的蛋白條帶單一，比較粗，說明目的蛋白獲得量大且純度高。第6道為步驟3.1中的陽性轉(zhuǎn)化菌液；可以看出，單純的陽性轉(zhuǎn)化菌液沒法大量表達(dá)蛋白，只是很少量的本底表達(dá)。只有添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)以后才會大量表達(dá)。說明誘導(dǎo)表達(dá)的方法確實(shí)可行。同時(shí)，圖中沉淀和可溶性上清的位置相對要大一些，可能原因是沉淀和上清中含有其它雜蛋白或者其它組分，因而分子量比較大，在膠圖上的位置比較靠近后面，純化蛋白由于被洗掉了雜蛋白和其它組分，因而只是目的蛋白本身的分子量，故在膠圖上位置比較靠前。3.5、SDS-PAGE分析3.5.1.按照和western-blot分析相同的方法進(jìn)行檢測樣品的處理和跑膠。3.5.2.跑膠完成后，取出膠置于配置好的固定液(固定液的成分：25％異丙醇，10％乙酸)中固定30min(20～40min均可)，倒掉固定液，加入卡馬斯亮藍(lán)染色液染色45min(染色30～60min均可)(考馬斯亮藍(lán)染色液成分為：10％乙酸，0.006％G-250)，染色完成后倒掉染色液，加入脫色液(脫色液為10％乙酸)脫色，直到可以看清條帶為止。所得結(jié)果如圖8所示：圖中箭頭所指的即為獲得的目的蛋白。圖8表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果：第1道和第2道分別是10μL、15μL步驟3.3.9中得到的目的蛋白，可以看出洗脫的目的蛋白條帶單一，比較粗，說明目的蛋白獲得量大且純度高。第3道和第4道分別為步驟步驟3.3.8中完全洗滌和洗滌一半時(shí)的收集液。因?yàn)殡s蛋白是一點(diǎn)一點(diǎn)被洗下來的，150mL體積的洗滌液能否將雜蛋白洗完全并不知道，所以需要收集不同階段的流出液，看看雜蛋白含量多少，如果越到后面，雜蛋白量越少，就說明洗的效果不錯(cuò)。第3道是洗滌完收集的，可以看出基本沒有什么蛋白了，所以說明雜蛋白洗的效果很好。從圖中可知雜蛋白基本被洗脫干凈。第5道為穿透液，從圖中可以看出穿透液中基本不含目的蛋白，說明蛋白基本100％結(jié)合在了鎳柱上。第6道為上柱液，從第6道中可以看出蛋白太濃，看不清楚。但隱隱可以發(fā)現(xiàn)有很多各種各樣的蛋白。第7道為marker。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3