本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三聯(lián)肽Cec Md3js、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗菌肽是生物體抵御外界病原微生物入侵的有效屏障，具有廣譜抗菌作用，而且具有不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、食品、動物飼料等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。目前，已發(fā)現(xiàn)了上千種抗菌肽，但是能夠應(yīng)用于臨床的抗菌肽種類依然有限。因此，人們希望通過分子設(shè)計和重新改造獲得活性更好的新型抗菌肽。

由于抗菌肽屬于小分子肽，其克隆、表達(dá)、分離、純化和檢測工序都相對繁瑣，為了提高目的蛋白的回收效率，有效的保持抗菌肽活性、降低宿主細(xì)胞毒性、增加抗菌肽穩(wěn)定性和表達(dá)量，通常采用串聯(lián)表達(dá)的方式來表達(dá)抗菌肽。

天蠶素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蠅天蠶素抗菌肽(Cec Md)與天蠶素抗菌肽的同源性達(dá)81％，但家蠅天蠶素抗菌肽仍具有一定的溶血活性，且分離純化步驟繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的一種三聯(lián)肽Cec Md3js、制備方法及應(yīng)用，利用該三聯(lián)肽Cec Md3js制備的抗菌肽Cec Md溶血性低、抗菌活性高，該制備方法分離純化步驟簡單。

本發(fā)明提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3js，用于編碼所述三聯(lián)肽Cec Md3js的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三聯(lián)肽Cec Md3js的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3js的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的目的基因；

步驟2，以限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切載體pGAPZαA，并回收得到3147bp的載體片段；將所述目的基因和所述載體片段連接，得到含有重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的連接液；

步驟3，將步驟2的連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，并提取重組載體pGAPZαA/Cec Md3js，得到重組載體pGAPZαA/Cec Md3js；

步驟4，將重組載體pGAPZαA/Cec Md3js轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到表達(dá)工程菌；

步驟5，培養(yǎng)步驟4的表達(dá)工程菌，進(jìn)行三聯(lián)肽Cec Md3js的表達(dá)，并提取三聯(lián)肽Cec Md3js，得到三聯(lián)肽Cec Md3js。

優(yōu)選的，上述三聯(lián)肽Cec Md3js的制備方法中，步驟4的宿主細(xì)胞為畢赤酵母GS115。

本發(fā)明還提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3js，在制備抗菌肽Cec Md中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3js，在制備治療革蘭氏陰性菌疾病藥物或者治療革蘭氏陽性菌疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3js，在制備動物飼料添加劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還一種利用所述三聯(lián)肽Cec Md3js制備抗菌肽Cec Md的方法，具體包括以下步驟：

步驟a，用pH 8.0，0.01mol/L的PB緩沖液為溶劑，配制濃度為1mg/mL的三聯(lián)肽Cec Md3js溶液；然后配制體積分?jǐn)?shù)為50％的甲酸溶液，將三聯(lián)肽Cec Md3js溶液與甲酸溶液按照1000:12的體積比例混合，50℃水浴36h，得到切割溶液；

步驟b，用蒸餾水將切割溶液稀釋3倍，真空冷凍干燥，得到固體抗菌肽；

步驟c，用蒸餾水將固體抗菌肽復(fù)溶，再經(jīng)真空冷凍干燥，得到抗菌肽Cec Md粗品；

步驟d，抗菌肽Cec Md的純化

將抗菌肽Cec Md粗品經(jīng)5000kDa膜分離，得到的分離液經(jīng)G50層析柱純化，得到抗菌肽Cec Md。

本發(fā)明提供的一種三聯(lián)肽Cec Md3js，并應(yīng)用基因工程技術(shù)在畢赤酵母中高效表達(dá)了該三聯(lián)肽Cec Md3js，經(jīng)驗證，利用該三聯(lián)肽Cec Md3js制備的抗菌肽Cec Md溶血性低、對多種細(xì)菌具有抗菌活性、熱穩(wěn)定性好，表達(dá)量高，且分離純化簡單、易操作，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，該三聯(lián)肽Cec Md3js在醫(yī)藥(抗菌藥物)、食品(抗菌劑)、飼料添加劑等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的PCR產(chǎn)物鑒定電泳圖；

圖2為重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的雙酶切產(chǎn)物鑒定電泳圖；

圖3為重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的線性化產(chǎn)物鑒定電泳圖；

圖4為酵母轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定電泳圖；

圖5為三聯(lián)肽Cec Md3js的Tricine-SDS-PAGE分析圖譜；

圖6為三聯(lián)肽Cec Md3js的高效液相色譜分析結(jié)果；

圖7為三聯(lián)肽Cec Md3js的質(zhì)譜分析結(jié)果。

其中，圖1中M泳道為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Maker)，1、2號泳道均為重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的PCR產(chǎn)物(704bp)；圖2中M泳道為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Maker)，1、2號泳道均為重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的雙酶切產(chǎn)物(396bp)；圖3中M泳道為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Maker)，1號泳道為重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的線性化產(chǎn)物(3543bp)；圖4中M泳道為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Maker)，1號泳道為酵母轉(zhuǎn)化子的菌落PCR產(chǎn)物(783bp)；圖5中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，1號泳道為三聯(lián)肽Cec Md3cs(13.91kDa)，2號泳道為三聯(lián)肽Cec Md3js(13.36kDa)，3號泳道為Cec Md2cs(9.08kDa)，4號泳道為Cec Md2js(8.79kDa)，5號泳道為二聯(lián)肽Cec Md2ys(8.77kDa)，6號泳道為抗菌肽Cec Md(4.26kDa)，7號泳道為Cec Md3jn樣品上清液，8號泳道為Cec Md3cn樣品上清液，9號泳道為空白對照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

本發(fā)明提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3js，用于編碼所述三聯(lián)肽Cec Md3js的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三聯(lián)肽Cec Md3js的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于同一種發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3js的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的目的基因。

需要說明的是，為了提高抗菌肽的表達(dá)量，采用串聯(lián)設(shè)計，遵循畢赤酵母偏愛性原則，設(shè)計如SEQ ID NO.1所示的用于編碼三聯(lián)肽Cec Md3js的核苷酸序列，并在該序列的5’端添加KpnⅠ的限制性酶切位點(diǎn)GGTACC和起始密碼子ATG；并在該序列3’端添加XbaⅠ的限制性酶切位點(diǎn)TCTAGA和終止密碼子TAA，得到如SEQ ID NO.3所示的目的基因。

步驟2，以限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切載體pGAPZαA，并回收得到3147bp的載體片段；將所述目的基因和所述載體片段連接，得到含有重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的連接液。具體包括以下步驟：

步驟2.1，以限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切載體pGAPZαA，載體pGAPZαA的雙酶切體系如表1所示，得到載體雙酶切溶液；

取5μL載體雙酶切溶液與1μL的6×Loading Buffer混合均勻，在含有EB的1％瓊脂糖電泳檢測，電泳檢測正確后，將剩下15μL的載體雙酶切溶液按照DNA凝膠回收試劑盒方法進(jìn)行膠回收，得到3147bp的載體片段。

表1載體pGAPZαA的雙酶切體系

其中，雙酶切的條件為：將表1所示雙酶切體系中的各物質(zhì)加入PCR管中混勻，于37℃水浴3h。

步驟2.2，將所述目的基因和所述載體片段連接，其連接體系如表2所示，連接的條件為16℃水浴2h，得到含有重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的連接液。

表2目的基因和載體片段的連接體系

步驟3，將步驟2.2的連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中(該步驟主要是為了將連接液中的重組載體pGAPZαA/Cec Md2ys轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中)，37℃振蕩培養(yǎng)1h，涂布在含有25μg/mL Zeocin^TM(博萊霉素)的低鹽LB平板培養(yǎng)基上，倒置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)(12-16h)直至形成單菌落，挑取單菌落進(jìn)行PCR產(chǎn)物(704bp)鑒定，篩選出含有重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的陽性克隆子，并提取陽性克隆子中的重組載體pGAPZαA/Cec Md3js，得到重組載體pGAPZαA/Cec Md3js。所述低鹽LB平板培養(yǎng)基的配方為：10g/L胰胨、5g/L酵母提取物、15g/L瓊脂、5g/L氯化鈉、余量為水，pH 7.5。所述PCR產(chǎn)物鑒定體系如表3所示。

表3重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的PCR產(chǎn)物鑒定體系

其中，步驟3的PCR產(chǎn)物(704bp)鑒定采用的引物序列是：

Forward Primer：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’

3’AOX1 Primer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果如圖1，704bp處有條帶，說明重組載體pGAPZαA/Cec Md3js構(gòu)建成功；重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切產(chǎn)物鑒定結(jié)果如圖2所示，396bp處有條帶，說明重組載體pGAPZαA/Cec Md3js構(gòu)建成功。

步驟4，將重組載體pGAPZαA/Cec Md3js轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞(畢赤酵母GS115)中，得到表達(dá)工程菌。

步驟4.1，畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備

步驟4.1.1，活化：取-80℃凍存的畢赤酵母GS115，采用YPD平板劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28-30℃(約2天)，得到第一單克隆細(xì)胞的單菌落；

挑取第一單克隆細(xì)胞的單菌落，采用YPD平板劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28-30℃(約2天)，得到第二單克隆細(xì)胞的單菌落；

挑取第二單克隆細(xì)胞的單菌落采用YPD平板劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28-30℃(約2天)，得到畢赤酵母GS115的單菌落。

其中，步驟4.1.1所述采用YPD平板劃線培養(yǎng)時可用保鮮膜包裹YPD平板。

步驟4.1.2，小量培養(yǎng)：挑取畢赤酵母GS115的單菌落接種到5mL YPD液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200r/min搖瓶培養(yǎng)16-18h(OD₆₀₀值2.0左右)，得到畢赤酵母GS115菌懸液。

需要說明的是，步驟4.1.2中搖瓶培養(yǎng)一般過夜即可，不需測OD₆₀₀值。

步驟4.1.3，放大培養(yǎng)：將5mL畢赤酵母GS115菌懸液接種到500mL YPD液體培養(yǎng)基中，并按1:100～200的體積比例接種，培養(yǎng)瓶采用2L的培養(yǎng)瓶，其中每1L培養(yǎng)瓶內(nèi)裝250mL YPD液體，以便于讓畢赤酵母GS115充分吸收吸氧氣，28-30℃，200r/min搖瓶培養(yǎng)16-18h(OD₆₀₀值2.0左右)，得到畢赤酵母GS115培養(yǎng)菌液。

需要說明的是，步驟4.1.3中搖瓶培養(yǎng)一般過夜即可，不需測OD₆₀₀值。

步驟4.1.4，將畢赤酵母GS115培養(yǎng)菌液冰浴10min，移入4℃預(yù)冷的離心管，然后4℃1500×g離心5min，去上清，收集沉淀；并用500mL 4℃預(yù)冷的無菌水重懸沉淀，得到第一酵母菌重懸液。

步驟4.1.5，將第一酵母菌重懸液于4℃1500×g離心5min，去上清，收集第一酵母菌沉淀；并用250mL 4℃預(yù)冷的無菌水重懸酵母菌沉淀，得到第二酵母菌重懸液。

步驟4.1.6，將第二酵母菌重懸液于4℃1500×g離心5min，去上清，收集第二酵母菌沉淀；并用20mL 4℃預(yù)冷的無菌1mol/L山梨醇重懸第二酵母菌沉淀，得到第一山梨醇重懸液。

步驟4.1.7，將第一山梨醇重懸液于4℃1500×g離心5min，去上清，收集第三酵母菌沉淀；并用1mL 4℃預(yù)冷的無菌1mol/L山梨醇重懸第三酵母菌沉淀，得到畢赤酵母GS115細(xì)胞。

步驟4.1.8，制備畢赤酵母GS115細(xì)胞的感受態(tài)，得到畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，冰浴保存，且當(dāng)天制備當(dāng)天使用，不可凍存。

步驟4.2，重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的線性化

將步驟3的重組載體pGAPZαA/Cec Md3js用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ進(jìn)行線性化酶切，得到線性化產(chǎn)物溶液，其中線性化酶切的反應(yīng)體系如表4所示，反應(yīng)條件為37℃水浴3h；

取5μL線性化產(chǎn)物溶液與1μL的6×Loading Buffer混合均勻，在含有EB的1％瓊脂糖電泳檢測，電泳檢測正確后，將剩下15μL的線性化產(chǎn)物溶液按照DNA凝膠回收試劑盒方法進(jìn)行膠回收，得到線性化重組載體pGAPZαA/Cec Md3js。

其中，試劑盒方法進(jìn)行膠回收的步驟如下：向線性化產(chǎn)物溶液中加入相當(dāng)于線性化產(chǎn)物溶液1/10倍體積的NaAC(3mol/L)、相當(dāng)于線性化產(chǎn)物溶液2.5倍體積無水乙醇，-80℃放置0.5h以上；12 000r/min離心10min后棄上清；70％無水乙醇洗滌沉淀，真空干燥，得到線性化重組載體pGAPZαA/Cec Md3js，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

其中，線性化產(chǎn)物溶液中的重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的線性化產(chǎn)物的鑒定結(jié)果如圖3所示，3543bp處有條帶，則說明重組載體pGAPZαA/Cec Md3js的線性化成功。

表4線性化酶切處理的反應(yīng)體系

步驟4.3，將步驟4.2的線性化重組載體pGAPZαA/Cec Md3js電轉(zhuǎn)化到步驟4.1.8的畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，得到表達(dá)工程菌，具體包括:

將80μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞與5-10μg或者5-10μL線性化重組載體pGAPZαA/Cec Md3js冰浴混勻，轉(zhuǎn)入冰浴預(yù)冷的2mm電轉(zhuǎn)杯中；繼續(xù)冰浴5min；電擊轉(zhuǎn)化，其中電擊轉(zhuǎn)化條件與電擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的條件相同，為：電壓為1500V或2000V；電容為25μF；電阻為200歐，溫度為0℃。

電擊轉(zhuǎn)化后，立即往2mm電轉(zhuǎn)杯中加入1mL冰浴冷的1mol/L山梨醇，并將電擊產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至一個15mL Conical無菌管中，然后將15mL Conical無菌管中的電擊產(chǎn)物于30℃靜置培養(yǎng)1-2h，得到電轉(zhuǎn)化酵母。

取10μL、25μL、50μL、100μL、200μL的電轉(zhuǎn)化酵母，分別涂布在5個不同的YPDS培養(yǎng)基平板(含100μg/mL Zeocin^TM)上(小密度的電轉(zhuǎn)化酵母涂布更有利于Zeocin^TM抗性選擇)；于30℃培養(yǎng)3-10天，直至酵母單克隆菌落出現(xiàn)；挑取10-20個酵母單克隆菌落在YPDS培養(yǎng)基平板(含100μg/mL的博萊霉素Zeocin^TM)上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，得到酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落。

步驟4.4，篩選步驟4.3的酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落中的陽性轉(zhuǎn)化子。

步驟4.4.1，PCR鑒定：

挑取步驟4.3的酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落接種于5mL含25μg/mL Zeocin^TM的YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃200r/min搖床培養(yǎng)15-16h(過夜)，得到酵母轉(zhuǎn)化子菌懸液。

取500μL酵母轉(zhuǎn)化子菌懸液離心，棄上清，開蓋，在500W微波加熱至煮沸，于液氮中放置5min，然后加入50μL無菌水，在500W微波加熱至煮沸，離心，收集上清，并將上清作為PCR的酵母基因組DNA模板。

采用引物對Forward Primer：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’和3’AOX1Primer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’進(jìn)行菌落PCR，鑒定重組載體pGAPZαA/Cec Md3js是否整合入畢赤酵母基因組中，其中菌落PCR的反應(yīng)體系如表5所示，菌落PCR的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；54.8℃退火30s；72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃終延伸7min。

待菌落PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3μL PCR產(chǎn)物在含有EB的2％瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示，783bp處有條帶，說明該酵母轉(zhuǎn)化子為陽性克隆，該酵母轉(zhuǎn)化子的菌液為陽性克隆菌液。

表5菌落PCR的反應(yīng)體系

步驟4.4.2，測序鑒定

將步驟4.4.1的陽性克隆菌液與甘油按照5:1的體積比例混合均勻，送哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNAMAN與所設(shè)計的目的基因進(jìn)行對比，若陽性克隆中確實(shí)含有所設(shè)計的目的基因，則該陽性克隆為表達(dá)工程菌，且該表達(dá)工程菌用于表達(dá)重組載體pGAPZαA/Cec Md3js中含有的目的基因片段。

步驟5，培養(yǎng)步驟4.4.2的表達(dá)工程菌，進(jìn)行三聯(lián)肽Cec Md3js的表達(dá)，并提取三聯(lián)肽Cec Md3js，得到三聯(lián)肽Cec Md3js。

步驟5.1，三聯(lián)肽Cec Md3js的表達(dá)

在100μg/mL Zeocin^TM篩選下穩(wěn)定性較好的表達(dá)工程菌，-80℃保存。

將表達(dá)工程菌接種至裝有20mL YPD液體培養(yǎng)基的50mL錐形瓶中，于30℃、200r/min培養(yǎng)72h，得到表達(dá)工程菌菌懸液；

取1mL的表達(dá)工程菌菌懸液于已滅菌的100mL YPD液體培養(yǎng)基中，用8層滅菌脫脂紗布封口，于30℃、200r/min培養(yǎng)2-4d，得到菌液樣品；

步驟5.2，三聯(lián)肽Cec Md3js的提取

取步驟5.1的菌液樣品4mL，12000r/min離心5min，收集上清，然后將收集的上清進(jìn)行濃縮，得到三聯(lián)肽Cec Md3js濃縮液，將三聯(lián)肽Cec Md3js濃縮液用20％乙醇洗脫除雜，然后用3kD的超速離心管超速離心，冷凍干燥，得到三聯(lián)肽Cec Md3js。

需要說明的是，步驟5.1和步驟5.2也可以采用下列處理方式過濾濃縮：將表達(dá)工程菌接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、240r/min培養(yǎng)72h，4000r/min離心20min，取上清液，0.45μm膜過濾，濾液采用TCA方法濃縮，冷凍干燥，得到三聯(lián)肽Cec Md3js；

步驟5.3，利用三聯(lián)肽Cec Md3js制備抗菌肽Cec Md(所述抗菌肽Cec Md的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示)。

步驟5.3.1，用pH 8.0，0.01mol/L的PB緩沖液為溶劑，配制濃度為1mg/mL的三聯(lián)肽Cec Md3js溶液，然后配制體積分?jǐn)?shù)為50％(v/v)的甲酸溶液，將三聯(lián)肽Cec Md3js溶液與甲酸溶液按照1000:12的體積比例混合，50℃水浴36h，得到切割溶液。

需要說明的是，上述PB緩沖液為本領(lǐng)域常見的磷酸鹽緩沖液，可采用NaH₂PO₄和Na₂HPO₄制備。

步驟5.3.2，用蒸餾水將切割溶液稀釋3倍，真空冷凍干燥，得到固體抗菌肽。

步驟5.3.3，用蒸餾水將固體抗菌肽復(fù)溶，再經(jīng)真空冷凍干燥，以徹底去除甲酸，得到抗菌肽Cec Md粗品。

步驟5.3.4，抗菌肽Cec Md的純化

將三聯(lián)肽Cec Md3js的水解產(chǎn)物(抗菌肽Cec Md粗品)通過Mini超濾系統(tǒng)5000kDa膜分離，分離液過G50層析柱后上液相純化，得到純化的抗菌肽Cec Md，該純化的抗菌肽Cec Md可用于制備治療革蘭氏陰性菌疾病藥物或者治療革蘭氏陽性菌疾病藥物中的應(yīng)用，或者用于制備動物飼料添加劑。

圖5為二聯(lián)肽Cec Md2ys(8.77kDa)的Tricine-SDS-PAGE分析圖譜，其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，1號泳道為三聯(lián)肽Cec Md3cs(13.91kDa)，2號泳道為三聯(lián)肽Cec Md3js(13.36kDa)，3號泳道為Cec Md2cs(9.08kDa)，4號泳道為Cec Md2js(8.79kDa)，5號泳道為二聯(lián)肽Cec Md2ys(8.77kDa)，6號泳道為抗菌肽Cec Md(4.26kDa)，7號泳道為Cec Md3jn樣品上清液，8號泳道為Cec Md3cn樣品上清液，9號泳道為空白對照，其中1、3、4、5、7、8號泳道是為了使不同樣品電泳圖譜區(qū)分開來的輔助樣品，是為了方便觀察三聯(lián)肽Cec Md3js和抗菌肽Cec Md條帶位置，并不涉及發(fā)明內(nèi)容。

下面采用HPLC法檢測三聯(lián)肽Cec Md3js制備而成的抗菌肽Cec Md的純度，具體包括：

取3μL分析級HPLC分析，流動相是水和乙腈，進(jìn)行30min的梯度洗脫。首先將HPLC用含95％的水和5％的乙腈的起始梯度平衡10min。然后注入準(zhǔn)備好的樣品，反應(yīng)時間為40min，收集從檢測器中出來的樣品。最后用25％的水和75％的乙腈混合液清洗30min，檢測結(jié)果見圖6和圖7，結(jié)果表明，抗菌肽Cec Md具有較高的純度。

將三聯(lián)肽Cec Md3js制備而成的抗菌肽Cec Md進(jìn)行活性檢測，具體包括：

最小殺菌濃度(MIC)采用96孔板法測定。將短乳桿菌、德氏乳桿菌、雙歧桿菌、畢赤酵母GS115和停乳鏈球桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌于平板劃線培養(yǎng)，并挑取單菌落與相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其中停乳鏈球桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌37℃，200r/min空氣震蕩培養(yǎng)過夜；短乳桿菌、德氏乳桿菌、雙歧桿菌厭氧37℃，200r/min震蕩培養(yǎng)過夜；畢赤酵母GS115于30℃，200r/min空氣震蕩培養(yǎng)48h。

將抗菌肽Cec Md用1×PBS分別稀釋成2000μmol/L、1500μmol/L、750μmol/L、500μmol/L、375μmol/L、250μmol/L、187.5μmol/L、125μmol/L、93.75μmol/L、62.5μmol/L、46.875μmol/L、31.25μmol/L、23.475μmol/L和15.625μmol/L共計16個梯度。將培養(yǎng)后的菌液稀釋至2×10⁵-7×10⁵CFU/mL，將稀釋好的測試菌液分別滴加到3個96孔培養(yǎng)板中，每行的1-12孔，每孔60μL，然后每孔滴加20μL的抗菌肽，每孔加120μL培養(yǎng)基。每個樣品設(shè)定3個重復(fù)，同時以不含測試菌作為陰性對照，培養(yǎng)48h。用肉眼觀察有無渾濁，即為受試菌的最小抑菌濃度。

最低殺菌濃度采(MBC)用96孔板法測定。將MIC前所有孔的混合液取5μL移入相應(yīng)新鮮培養(yǎng)基96孔板中，然后進(jìn)行培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果，沒有混濁可以當(dāng)做99.5％的原始種入的細(xì)菌被殺死，即為該菌的最低殺菌濃度。結(jié)果如表6所示。

表6抗菌肽Cec Md的MIC和MBC

注：“-”表示無明顯抑菌濃度

通過SWISS-MODEL軟件對串聯(lián)肽水解產(chǎn)物預(yù)測，發(fā)現(xiàn)三聯(lián)肽Cec Md3js含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，三聯(lián)肽Cec Md3js所用連接序列為腸激酶甲酸(DPP)肽鏈的連接中心中出現(xiàn)Pro會有較好的細(xì)胞的選擇性毒性，其溶血活性降低，細(xì)胞的選擇的有較大程度的降低。

通過測定血紅素的釋放量來探索抗菌肽的溶血活性。采取濃度為2％的新鮮綿羊血紅細(xì)胞懸浮液，與0.1mL測試抗菌肽混合均勻。測試抗菌肽混勻后的濃度為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL，混合均勻后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育1h，2000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移至96孔板，使用酶標(biāo)儀在570nm下測定吸光值。使用無菌的生理鹽水和0.1％(v/v)的Triton-100作為溶血百分比0％和100％的標(biāo)準(zhǔn)。陰性對照用PBS緩沖液，陽性對照用0.1％TritonX-100。每個樣品設(shè)定3個平行，結(jié)果取其平均值。溶血率(％)＝(試驗管吸光度-陰性對照管吸光度)/(陽性對照管吸光度-陰性對照管吸光度)×100％。不同多肽對綿羊紅細(xì)胞溶血活性影響結(jié)果如表7所示，濃度為100μg/mL、50μg/mL和25μg/mL時，三聯(lián)肽Cec Md3js和抗菌肽Cec Md的溶血活性顯著低于家蠅天蠶素抗菌肽；濃度為12.5μg/mL時，三聯(lián)肽Cec Md3js的溶血活性為1.22，抗菌肽Cec Md的溶血活性為1.47，均較低。

表7不同多肽對綿羊紅細(xì)胞溶血活性的影響

注：不同字母表示相同濃度不同抗菌肽之間有顯著差異(P<0.05)；“—”代表未檢測出結(jié)果。

畢赤酵母在發(fā)酵生產(chǎn)的過程中能夠縮短菌種的培養(yǎng)周期、簡化操作步驟、減少了資料的耗費(fèi)且降低了發(fā)酵成本，具備真核細(xì)胞蛋白合成通路。乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因啟動子是畢赤酵母用來嚴(yán)格并啟動調(diào)控源蛋白的表達(dá)的有力工具，在此基礎(chǔ)上，對于外源蛋白的誘導(dǎo)、糖基化修飾、二硫鍵的修飾以及加工都具有一定的生物學(xué)功能。雖然酵母菌所需的培養(yǎng)基組成單一，但卻是能在簡單的培養(yǎng)條件下快速的高密度生長，對于重組質(zhì)粒重組于畢赤酵母菌中遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，可較少地分泌自身蛋白，但整體細(xì)胞干重可達(dá)130g/L，由此可見酵母菌即是表達(dá)外源蛋白的最佳菌種。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。