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肽的游離方法及回收方法、以及肽游離劑及試劑盒與流程

文檔序號(hào):12162277閱讀:461來源:國(guó)知局
本發(fā)明涉及被摻入白蛋白自身聚集體的肽的游離方法及回收方法。另外,本發(fā)明涉及肽游離劑及試劑盒。
背景技術(shù)
:在血液中,大量地存在白蛋白。已知的是,由于血液中的白蛋白與血液中所含的肽結(jié)合而形成復(fù)合物,因此在檢測(cè)血液中的肽時(shí),白蛋白成為檢測(cè)的障礙。所以,要求分離白蛋白和肽,即,自白蛋白與肽的復(fù)合物使該肽游離。例如,在美國(guó)專利申請(qǐng)公開2012/277407中記載,通過對(duì)含肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品進(jìn)行加熱處理而使白蛋白自身聚集體形成,自該復(fù)合物使肽游離。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2012/277407所示,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過對(duì)含肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品進(jìn)行加熱處理,形成白蛋白自身聚集體,伴隨其而肽自該復(fù)合物游離(美國(guó)專利申請(qǐng)公開2012/277407通過引用并入本說明書)。認(rèn)為此白蛋白自身聚集體由熱變性而高級(jí)結(jié)構(gòu)變化,幾乎失與肽結(jié)合的能力。但是,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),一部分的肽即使加熱處理也不游離,而是被摻入自身聚集體。從而,期望使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離的手段的開發(fā)。【解決課題的技術(shù)方案】本發(fā)明的第1實(shí)施方式是肽的游離方法。從而,本發(fā)明提供肽的游離方法,其包括如下工序:使摻入有肽的白蛋白自身聚集體和以80mM以上1000mM以下的濃度含有以下的式(I)或(II)所表示的化合物的溶液接觸,使上述肽自上述白蛋白自身聚集體游離到上述溶液中【化1】式中,m是0~4的整數(shù),n是0~4的整數(shù),其中,m+n≤4;R是-H或-OH,或【化2】本發(fā)明的第2實(shí)施方式是利用上述的游離方法的肽的回收方法。從而,本發(fā)明提供肽的回收方法,其包括:使摻入有肽的白蛋白自身聚集體和以80mM以上1000mM以下的濃度含有上述的式(I)或(II)所表示的化合物的溶液接觸,使上述肽自上述白蛋白自身聚集體游離到上述溶液中的工序;及回收游離到此溶液中的肽的工序。本發(fā)明的第3實(shí)施方式是利用上述的游離方法的肽的回收方法。從而,本發(fā)明提供肽的回收方法,其包括:通過對(duì)含肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品進(jìn)行加熱處理而使不溶性白蛋白自身聚集體形成,由此使肽自上述復(fù)合物游離到溶液中的工序;回收含自上述復(fù)合物游離的肽的溶液的工序;使由上述加熱處理形成的上述白蛋白自身聚集體與以80mM以上1000mM以下的濃度含有以下的式(I)或(II)所表示的化合物的溶液接觸,使被摻入上述白蛋白自身聚集體的肽游離到溶液中的工序;回收含自上述白蛋白自身聚集體游離的肽的溶液的工序。本發(fā)明的第4實(shí)施方式是在上述的游離方法及回收方法中使用的肽游離劑。從而,本發(fā)明提供肽游離劑,其是自對(duì)含肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品進(jìn)行加熱處理而形成的白蛋白自身聚集體使肽游離的肽游離劑,其特征在于以80mM以上1000mM以下的濃度含有上述的式(I)或(II)所表示的化合物。本發(fā)明的第5實(shí)施方式是用于調(diào)制上述的肽游離劑的試劑盒。從而,本發(fā)明提供試劑盒,其是用于調(diào)制自摻入有肽的白蛋白自身聚集體使肽游離的肽游離劑的試劑盒,其特征在于,含上述的式(I)或(II)所表示的化合物和用于溶解此化合物的溶劑,肽游離劑被調(diào)制成在化合物和溶劑混合時(shí),化合物的濃度達(dá)80mM以上1000mM以下。【發(fā)明效果】由本發(fā)明可使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離。另外,由本發(fā)明可回收自該自身聚集體游離的肽?!靖綀D說明】【圖1】是對(duì)于對(duì)用CAPS等各種添加劑使不溶性級(jí)分均化而得到的樣品進(jìn)行電泳的凝膠進(jìn)行熒光成像及銀染色的照片。【圖2】是對(duì)于對(duì)用不同的濃度的添加劑(CAPS)使不溶性級(jí)分均化而得到的樣品進(jìn)行電泳的凝膠進(jìn)行熒光成像及銀染色的照片?!緢D3】是對(duì)于對(duì)用不同的pH的添加劑(CAPS)使不溶性級(jí)分均化而得到的樣品進(jìn)行電泳的凝膠進(jìn)行熒光成像及銀染色的照片?!緢D4】是對(duì)于對(duì)用不同的濃度的添加劑(CHES)使不溶性級(jí)分均化而得到的樣品進(jìn)行電泳的凝膠進(jìn)行熒光成像及銀染色的照片?!緢D5】是對(duì)于對(duì)用不同的濃度的添加劑(CAPSO)使不溶性級(jí)分均化而得到的樣品進(jìn)行電泳的凝膠進(jìn)行熒光成像及銀染色的照片。【圖6】是對(duì)于對(duì)用不同的濃度的添加劑(CABS)使不溶性級(jí)分均化而得到的樣品進(jìn)行電泳的凝膠進(jìn)行熒光成像及銀染色的照片?!緢D7】是對(duì)于對(duì)用二羥乙基甘氨酸(Bicine)等各種添加劑使不溶性級(jí)分均化而得到的樣品進(jìn)行電泳的凝膠進(jìn)行熒光成像及銀染色的照片?!緢D8】是對(duì)于對(duì)用N-環(huán)己基氨基磺酸等各種添加劑使不溶性級(jí)分均化而得到的樣品進(jìn)行電泳的凝膠進(jìn)行熒光成像及銀染色的照片?!緢D9A】是在與各種添加劑接觸的狀態(tài)下靜置2天的不溶性級(jí)分的照片。【圖9B】是對(duì)于對(duì)在使各種添加劑和不溶性級(jí)分接觸的狀態(tài)下靜置2天而得到的樣品進(jìn)行電泳的凝膠進(jìn)行熒光成像及銀染色的照片?!緢D10】是顯示本實(shí)施方式的肽游離劑的一例的概略圖?!緢D11】是顯示本實(shí)施方式的試劑盒的一例的概略圖。【實(shí)施方式】[1.肽的游離方法]就本實(shí)施方式涉及的肽的游離方法(以下,也簡(jiǎn)稱為“游離方法”)而言,在與白蛋白結(jié)合而形成復(fù)合物的肽之中,由加熱處理也不游離,使由該加熱處理發(fā)生的被摻入白蛋白自身聚集體的狀態(tài)的肽游離。從而,本實(shí)施方式的游離方法是使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離的方法。再者,在本實(shí)施方式的游離方法中進(jìn)行的各種工序及作業(yè)全部在體外進(jìn)行。在本實(shí)施方式中,白蛋白自身聚集體是通過對(duì)含肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品進(jìn)行加熱處理而形成的變性白蛋白的凝集物。其中,“白蛋白”有與生物學(xué)的領(lǐng)域中通常所知的用語相同的含意,是動(dòng)物及植物的細(xì)胞或體液中所含的一組可溶性蛋白質(zhì)的總稱。在本實(shí)施方式中,構(gòu)成上述的“肽與白蛋白的復(fù)合物”的白蛋白只要是未變性的白蛋白,就不特別限定。作為動(dòng)物起源的白蛋白,例如,可舉出血清白蛋白、卵清蛋白、乳白蛋白等。作為植物起源的白蛋白,例如,可舉出麥白蛋白、豆白蛋白、賴氨酸等。液體樣品只要含肽與白蛋白的復(fù)合物,就不特別限定。再者,在現(xiàn)有技術(shù)中知未變性的白蛋白原本有與肽結(jié)合而形成復(fù)合物的傾向。從而,在液體樣品中存在任何的肽和未變性的白蛋白時(shí),該液體樣品可成為適用本實(shí)施方式的游離方法的對(duì)象。液體樣品可為自生物體采集的生物體樣品。這樣的生物體樣品是含白蛋白的體液即可,例如,可舉出血液、血漿及血清。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,液體樣品是血液、血漿或血清。另外,也可將用適宜的溶劑稀釋的血液、血漿或血清作為液體樣品使用。作為這樣的溶劑,優(yōu)選為水性溶劑,例如,可舉出水、生理鹽水、緩沖液等。存在于液體樣品的肽不特別限定,可為天然起源的肽,可為合成肽。作為肽的長(zhǎng)度,優(yōu)選為8~100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選為8~60個(gè)氨基酸、再優(yōu)選為8~40個(gè)氨基酸。肽的等電點(diǎn)不特別限定,肽可為堿性肽、酸性肽及中性肽的任一者。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),在由加熱處理形成的白蛋白自身聚集體中,容易摻入含半胱氨酸殘基(以下也稱為“Cys”)的肽、及酸性肽。從而,本實(shí)施方式的游離方法適宜于含Cys的肽、及酸性肽的游離。在液體樣品是自生物體采集的生物體樣品時(shí),自白蛋白自身聚集體游離的肽可為存在于該生物體樣品中的肽。作為這樣的肽,例如,可舉出血液、血漿及血清等的自生物體采集的生物體樣品中所含的生物體來源的肽。存在于自生物體采集的生物體樣品中的肽優(yōu)選為存在于血液中的生物標(biāo)志物。作為這樣的肽,例如,可舉出縮宮素、C-肽、胰島素、胃泌素、胰高血糖素、胃促生長(zhǎng)素、心房性鈉利尿肽(ANP)、腦性鈉利尿肽(BNP)、腎上腺皮質(zhì)刺激激素(ACTH)、緩激肽、α-內(nèi)啡肽、C3f或C4a等的補(bǔ)體片段、ITIH4片段、β淀粉樣肽(Aβ)、激肽原、纖維蛋白原、纖維蛋白肽、強(qiáng)啡肽、降鈣素、促乳素、血液凝固第XIII因子(FactorXIII)等,但不限于這些。即,在本實(shí)施方式中,自白蛋白自身聚集體游離的肽可為有此前未鑒定的新穎的氨基酸序列的肽。如上所述,白蛋白自身聚集體可通過加熱處理含上述的肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品來形成。在加熱處理中,通常,以140℃以上260℃以下的溫度加熱液體樣品5分鐘以上19小時(shí)以下之間即可。加熱溫度140℃以上且不足155℃時(shí),加熱時(shí)間優(yōu)選為至少90分鐘,特別優(yōu)選為至少120分鐘。另外,加熱溫度155℃以上且不足170℃時(shí),加熱時(shí)間優(yōu)選為至少20分鐘,加熱溫度是170℃以上時(shí),加熱時(shí)間優(yōu)選為至少5分鐘。加熱處理的方法只要是可將液體樣品以上述的溫度加熱的方法,就不特別限定,自現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法選擇。作為這樣的方法,例如,可舉出利用來自外部的熱傳導(dǎo)的加熱、由微波的加熱等。在加熱處理中使用的裝置只要是可一邊調(diào)節(jié)液體樣品的溫度一邊加熱的裝置,就不特別限定,例如,可舉出水熱反應(yīng)器、微波照射裝置等。如果對(duì)含肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品進(jìn)行加熱處理,則產(chǎn)生含游離的肽的上清和含白蛋白自身聚集體的不溶性級(jí)分。在本實(shí)施方式中,優(yōu)選通過回收由加熱處理產(chǎn)生的上清而將不溶性級(jí)分留在容器內(nèi)、或者回收不溶性級(jí)分而移到別的容器,由此將白蛋白自身聚集體,與上清分離而取得。在本實(shí)施方式的游離方法中,通過使白蛋白自身聚集體與以指定的濃度含以下的式(I)或(II)所表示的化合物的溶液接觸,使被摻入該白蛋白自身聚集體的肽游離【化3】式中,m是0~4的整數(shù),n是0~4的整數(shù),其中,m+n≤4;R是-H或-OH,或【化4】作為式(I)所表示的化合物,例如,可舉出3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸(CHES)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基丙磺酸(CAPSO)、4-(環(huán)己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)及N-環(huán)己基氨基磺酸。接下來,顯示這些化合物的結(jié)構(gòu)式【化5】N-環(huán)己基氨基磺酸。式(II)所表示的化合物是N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸,在現(xiàn)有技術(shù)中也稱為“二羥乙基甘氨酸”。這些化合物在現(xiàn)有技術(shù)中公知,可一般地得到。在本實(shí)施方式中,也可自上述的化合物之中組合1種或2種以上使用。這些化合物之中,從自白蛋白自身聚集體使肽游離的效果及游離的肽的純度的觀點(diǎn)來看,優(yōu)選為CAPS及CHES。溶液中的式(I)或(II)所表示的化合物的濃度的下限通常是80mM,優(yōu)選為100mM、更優(yōu)選為500mM。該濃度的上限通常是1000mM,優(yōu)選為800mM。濃度只要是1000mM以下,就也可使用化合物的飽和溶液。再者,對(duì)于CAPS、CHES、CAPSO及CABS,調(diào)制高于1000mM的濃度的溶液是困難的,所以1000mM可與這些化合物飽和的濃度相當(dāng)。從而,通常自80mM以上1000mM以下的范圍確定濃度即可。當(dāng)組合2種以上的化合物而使用時(shí),溶液中的各化合物的濃度的合計(jì)在上述的范圍內(nèi)即可。在本實(shí)施方式中,含上述的化合物的溶液可通過將該化合物溶解于適宜的溶劑中以達(dá)上述的濃度來獲得。這樣的溶劑只要可溶解上述的化合物,就不特別限定,但優(yōu)選為水性溶劑,更優(yōu)選為水、生理鹽水或磷酸緩沖液?;蛘?,含上述的化合物的溶液也可通過向加熱處理前的液體樣品、或者加熱處理后的液體樣品中產(chǎn)生的上清溶解該化合物至成為上述的濃度而得到。上述化合物的溶液的pH不特別限定,但優(yōu)選為堿性的pH。例如,pH7.7以上11.1以下,更優(yōu)選為pH8.4以上10.4以下。溶液的pH可通過添加NaOH等的堿或HCl等的酸而調(diào)整。在被摻入白蛋白自身聚集體的肽含Cys時(shí),可有該肽在Cys和鋅離子之間鰲合結(jié)合的情況。從而,向上述的化合物的溶液,根據(jù)需要,也可添加氯化鋅(ZnCl2)等的產(chǎn)生鋅離子的鹽。另外,除了鋅離子以外,也可添加產(chǎn)生能代替上述的鰲合結(jié)合的金屬離子的金屬鹽。這樣的金屬離子,例如,可舉出銅離子、鎘離子、鉛離子、銀離子、汞離子、鉍離子等。另外,也可向上述的化合物的溶液添加能還原二硫鍵的還原劑。作為這樣的還原劑,可舉出二硫蘇糖醇(DTT)等。上述的化合物的溶液與白蛋白自身聚集體的接觸可通過在適宜的容器內(nèi)向白蛋白自身聚集體添加該溶液來進(jìn)行。此時(shí),可在使兩者接觸的狀態(tài)下靜置,也可攪拌。對(duì)于攪拌,可例示均化、超聲波破碎、抽吸攪拌等。接觸時(shí)間不特別限定,但靜置時(shí)是1小時(shí)以上72小時(shí)以下即可,攪拌時(shí)是1分鐘以上10分鐘以下即可。使上述的化合物的溶液和白蛋白自身聚集體接觸時(shí)的溫度條件不特別限定。溶液的溫度是可檢測(cè)自白蛋白自身聚集體游離的肽的程度的溫度即可,例如,是0℃以上250℃以下,優(yōu)選為10℃以上100℃以下,更優(yōu)選為15℃以上65℃以下。另外,混合時(shí)的周圍溫度通常是15℃以上37℃以下,優(yōu)選為20℃以上28℃以下。上述化合物的溶液的量不特別限定,例如,是白蛋白自身聚集體的體積的等倍以上10倍以下的量即可。在本實(shí)施方式中,通過將上述化合物的溶液和白蛋白自身聚集體混合,被摻入該自身聚集體的肽游離到溶液中。這些肽游離到溶液中可通過用在現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法解析來確認(rèn)。作為這樣的方法,例如,可舉出電泳法、質(zhì)譜分析法等。[2.肽的回收方法]在本實(shí)施方式的游離方法中,也可還包括回收游離的肽的工序。即,在本發(fā)明的范圍內(nèi),也包括使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離而回收的方法(以下,也簡(jiǎn)稱為“回收方法”)。再者,在本實(shí)施方式的回收方法中進(jìn)行的各種工序及作業(yè)全部在體外進(jìn)行。另外,在本發(fā)明的范圍內(nèi),還包括通過對(duì)含肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品進(jìn)行加熱處理而使白蛋白自身聚集體形成,自該復(fù)合物使一部分的肽游離,回收含自該復(fù)合物游離的肽的上清后,使利用加熱處理也不游離且被摻入自身聚集體的肽游離,回收含自自身聚集體游離的肽的上清的方法。例如,在由加熱處理無法自肽與白蛋白的復(fù)合物回收充分的量的肽時(shí),也可使上述指定的溶液接觸由加熱處理形成的白蛋白自身聚集體而回收含自自身聚集體游離的肽的上清。對(duì)于自肽與白蛋白的復(fù)合物回收的肽,對(duì)于自自身聚集體回收的肽,均也可使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)等的公知的方法進(jìn)行分析,自回收的肽之中檢測(cè)特定的肽。再者,有與自肽與白蛋白的復(fù)合物游離的一部分的肽相同種類的肽自自身聚集體游離的情況,也有不同種類的肽自自身聚集體游離的情況。在本實(shí)施方式的回收方法中,首先,使白蛋白自身聚集體與以80mM以上1000mM以下的濃度含有上述的式(I)或(II)所表示的化合物的溶液接觸,使被摻入上述白蛋白自身聚集體的肽游離到上述溶液中。在本實(shí)施方式的回收方法中,對(duì)于含肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品、白蛋白自身聚集體的形成、上述的化合物、及被摻入白蛋白自身聚集體的肽的游離等的細(xì)節(jié)而言,與對(duì)于上述的本實(shí)施方式的游離方法所述的同樣。在本實(shí)施方式的回收方法中,回收游離到溶液中的肽?;厥盏氖侄尾惶貏e限定。例如,由于白蛋白自身聚集體在與上述的化合物的溶液接觸后也作為不溶性級(jí)分殘留,因此也可分離此不溶性級(jí)分和溶液而僅回收含游離的肽的溶液。不溶性級(jí)分與溶液的分離可用離心分離或過濾等的在現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法進(jìn)行。另外,也可由在現(xiàn)有技術(shù)中公知的肽的純化方法自含游離的肽的溶液純化該肽。[3.肽游離劑]在本發(fā)明的范圍內(nèi),還包括在上述的肽的游離方法及回收方法中使用的肽游離劑(以下也稱為“游離劑”)。即,本實(shí)施方式的游離劑是用于使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離的游離劑。本實(shí)施方式的游離劑的特征在于,以80mM以上1000mM以下的濃度含有上述的式(I)或(II)所表示的化合物。對(duì)于該化合物的細(xì)節(jié)而言,與對(duì)于上述的本實(shí)施方式的游離方法所述的同樣。作為肽游離劑中的化合物的濃度的下限,通常是80mM,優(yōu)選為100mM、更優(yōu)選為500mM。作為該濃度的上限,通常是1000mM、優(yōu)選為800mM。通常而言,自80mM以上1000mM以下的范圍確定濃度即可。在含2種以上的化合物時(shí),游離劑中的各化合物的濃度的合計(jì)在上述的范圍內(nèi)即可。在本實(shí)施方式中,游離劑優(yōu)選處于液體的形態(tài)。此時(shí),游離劑可通過將上述的化合物溶解于適宜的溶劑至成上述的濃度而得到。作為這樣的溶劑,優(yōu)選為水性溶劑,特別優(yōu)選為水、生理鹽水及磷酸緩沖液?;蛘撸坞x劑也可使用含處于粉末或結(jié)晶等的固體的形態(tài)的上述的化合物和用于溶解該化合物的適宜的溶劑的試劑盒調(diào)制。此時(shí),處于固體的形態(tài)的化合物的量及溶劑的量是使該化合物溶解于溶劑時(shí)的濃度達(dá)上述的范圍內(nèi)的量即可。游離劑可還含ZnCl2等的產(chǎn)生鋅離子的鹽、或者也可含產(chǎn)生能代替肽中的Cys和鋅離子之間的鰲合結(jié)合的金屬離子的金屬鹽。對(duì)于這樣的金屬離子而言,與對(duì)于上述的本實(shí)施方式的游離方法所述的同樣。另外,游離劑也可還含能還原二硫鍵的還原劑(例如DTT等)。使用本實(shí)施方式的游離劑,使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離時(shí),使游離劑和該白蛋白自身聚集體接觸即可。對(duì)此接觸的細(xì)節(jié)與對(duì)于上述的本實(shí)施方式的游離方法所述的同樣。圖10顯示本實(shí)施方式的游離劑的外觀的一例。圖中,11表示收容處于溶液的形態(tài)的游離劑的容器。收容本實(shí)施方式的游離劑的容器也可收容到箱中而提供給使用者。在此箱中也可同裝有記載游離劑的使用方法等的附帶文書、用于使白蛋白自身聚集體均化的微研杵等。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括:使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離的肽游離劑的用途,其特征在于,是以80mM以上1000mM以下的濃度含有以下的式(I)或(II)所表示的化合物的肽游離劑的用途。另外,在本發(fā)明的范圍內(nèi),還包括用于制造自白蛋白自身聚集體使肽游離的肽游離劑的、以下的式(I)或(II)所表示的化合物的用途【化6】式中,m是0~4的整數(shù),n是0~4的整數(shù),其中,m+n≤4;R是-H或-OH,或【化7】[4.試劑盒]在本發(fā)明的范圍內(nèi),也包括用于調(diào)制使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離的肽游離劑的試劑盒(以下也稱為“試劑盒”)。本實(shí)施方式的試劑盒含上述的式(I)或(II)所表示的化合物和用于溶解該化合物的溶劑。該化合物優(yōu)選處于粉末或結(jié)晶等的固體的形態(tài)。再者,對(duì)于式(I)或(II)所表示的化合物及用于溶解該化合物的溶劑的細(xì)節(jié)而言,與對(duì)于上述的本實(shí)施方式的游離方法所述的同樣。本實(shí)施方式的試劑盒的特征在于,肽游離劑被調(diào)制成上述的化合物和溶劑混合時(shí)該化合物的濃度達(dá)80mM以上1000mM以下。作為調(diào)制的肽游離劑中的化合物的濃度的下限,通常是80mM,優(yōu)選為100mM、更優(yōu)選為500mM。作為該濃度的上限,通常是1000mM,優(yōu)選為800mM。通常而言,自80mM以上1000mM以下的范圍確定濃度即可。含2種以上的化合物時(shí),游離劑中的各化合物的濃度的合計(jì)在上述的范圍內(nèi)即可。處于固體的形態(tài)的化合物的量及溶劑的量均不特別限定。處于固體的形態(tài)的化合物及溶劑以使該化合物溶解于溶劑時(shí)的濃度達(dá)上述的范圍內(nèi)的量含在試劑盒中即可。在本實(shí)施方式的試劑盒中,化合物和溶劑優(yōu)選收容到各自不同的容器中或個(gè)別地包裝。圖11顯示本實(shí)施方式的試劑盒的外觀的一例。圖中,22表示收容式(I)或(II)所表示的化合物的容器,33表示收容用于溶解該化合物的溶劑的容器。這些容器也可收容到箱中而提供給使用者。在此箱中也可同裝有記載游離劑的調(diào)制方法及使用方法等的附帶文書、用于使白蛋白自身聚集體均化的微研杵等。試劑盒還可含ZnCl2等的產(chǎn)生鋅離子的鹽、或者產(chǎn)生能代替肽中的Cys和鋅離子之間的鰲合物結(jié)合的金屬離子的金屬鹽。對(duì)于這樣的金屬離子而言,與對(duì)于上述的本實(shí)施方式的游離方法所述的同樣。上述的金屬鹽可含在收容式(I)或(II)所表示的化合物的容器中,也可含在收容溶劑的容器中。或者,上述的金屬鹽可收容到與該化合物及溶劑不同的容器中或也可個(gè)別地包裝。試劑盒可還含能還原二硫鍵的還原劑(例如DTT等)。這樣的還原劑可含在收容式(I)或(II)所表示的化合物的容器中,也可含在收容溶劑的容器中?;蛘撸€原劑可收容到與該化合物及溶劑不同的容器中或也可個(gè)別地包裝。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括用于調(diào)制使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離的肽游離劑的試劑盒的用途,其特征在于,含以下的式(I)或(II)所表示的化合物和用于溶解上述化合物的溶劑,上述肽游離劑被調(diào)制成在上述化合物和上述溶劑混合時(shí)上述化合物的濃度達(dá)80mM以上1000mM以下的試劑盒的用途【化8】式中,m是0~4的整數(shù),n是0~4的整數(shù),其中,m+n≤4;R是-H或-OH,或【化9】接下來,由實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明,但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例?!緦?shí)施例】【實(shí)施例1:自白蛋白自身聚集體的肽的游離及回收】在實(shí)施例1中,探索可作為用于使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離的游離劑而使用的化合物。具體而言,探討是否能使用含各種化合物的添加劑使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離而回收。作為易被摻入白蛋白自身聚集體的肽,使用2種酸性肽。(1.1)材料-添加劑作為添加劑,使用100mMCAPS水溶液(pH11.0)、超純水(18MΩ·cm)(以下也稱為“DW”)、及三-磷酸混合緩沖液(以下也稱為“TBPB”)。再者,CAPS水溶液是將CAPS(制品No.343-00484:同仁化學(xué)研究所制)溶解于水至最終濃度成100mM,使用NaOH將pH調(diào)整到11.0而得到。DW由ELGAPURELABultra(ORGANO公司制)調(diào)制。TBPB的組成是Tris·HCl(pH7.0、最終濃度100mM)、磷酸鈉(最終濃度0.4mM)及NaCl(最終濃度6mM)。另外,也通過向CAPS水溶液、DW及TBPB的各自添加二硫蘇糖醇(DTT)至最終濃度成0.1mM而調(diào)制含有DTT的添加劑?!る淖鳛殡?,使用將酸性肽的縮宮素及C-肽用四甲基若丹明(TMR)熒光標(biāo)記的TMR-縮宮素(pI=5.51、Cys殘基2個(gè):株式會(huì)社Scrum)、及TMR-C-肽(pI=3.45、無Cys殘基:株式會(huì)社BIOLOGICA)。再者,縮宮素及C-肽的氨基酸序列如下所述?!たs宮素:CYIQNCPLG(SEQIDNO:1)·C-肽:EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ(SEQIDNO:2)·液體樣品將健康者來源的全血(自ProMedDx公司購入)0.3ml,用CAPS水溶液(pH11.0)稀釋5倍。向得到的稀釋液添加TMR-縮宮素或TMR-C-肽至最終濃度成2μM,調(diào)制含肽與血中蛋白質(zhì)(白蛋白)的復(fù)合物的液體樣品。(1.2)白蛋白自身聚集體的生成向含上述的肽與血中蛋白質(zhì)的復(fù)合物的液體樣品添加ZnCl2(NACALAITESQUE株式會(huì)社)至最終濃度成100mM。取得到的混合物的一部分,作為對(duì)照樣品保存。將其余的混合物移到10mL容積的玻璃試管,接下來用特氟隆(注冊(cè)商標(biāo))制的試管用耐壓密封座(MilestoneGeneral株式會(huì)社)封住后,通過使用微波照射裝置(MultiSYNTH型、MilestoneGeneral株式會(huì)社)自室溫(25℃)升溫30秒鐘至100℃,其后從100℃至160℃升溫1分鐘來進(jìn)行加熱處理。加熱處理后的冷卻通過自與上述的微波照射裝置連接的空氣壓縮機(jī)(YC-3R型、株式會(huì)社八重崎空壓)將壓縮空氣吹向上述的耐壓密封座進(jìn)行。在加熱處理后的液體樣品中,產(chǎn)生含白蛋白自身聚集體的不溶性級(jí)分(以下,也簡(jiǎn)稱為“不溶性級(jí)分”)。(1.3)自白蛋白自身聚集體的肽的游離及回收自加熱處理后的液體樣品回收上清,作為對(duì)照樣品保存。將不溶性級(jí)分使用藥刀移到2mL容積的微管(eppendorf公司制)。向微管添加100mMCAPS水溶液、超純水或TBPB,使用微研杵對(duì)不溶性級(jí)分均化1分鐘。將均化的不溶性級(jí)分以15,000rpm離心5分鐘,得到上清。將得到的上清作為樣品保存。(1.4)肽的檢測(cè)對(duì)于上述的各樣品,由SDS-PAGE及隨之的熒光成像及銀染色進(jìn)行分析。具體的操作如下。首先,將60%(w/w)甘油溶液和樣品混合,使用NuPAGE4-12%Bis-Tris凝膠及NuPAGEMESSDS電泳緩沖液(均為L(zhǎng)ifeTechnologies日本株式會(huì)社)以200V(定電壓)進(jìn)行電泳30分鐘。作為電泳槽使用EXELSURE-LOCKMINICELL(LifeTechnologies日本株式會(huì)社),作為電源裝置使用PowerStation1000×P(ATTO株式會(huì)社)。將電泳后的凝膠由熒光成像儀(PharosFXMolecularImager型、Bio-RadLaboratories株式會(huì)社)分析,檢測(cè)TMR-縮宮素及TMR-C-肽。接下來,將自熒光成像儀取出的凝膠,使用EzStainsilver(制品No.AE-1360、ATTO株式會(huì)社制)銀染色,進(jìn)行樣品中所含的混雜蛋白的檢測(cè)。結(jié)果示于圖1。(1.5)結(jié)果在圖1所示的凝膠的照片中,向各泳道應(yīng)用的樣品如下所述?!癕”是應(yīng)用尺寸標(biāo)志物的泳道。泳道1:對(duì)未加熱處理的含TMR-縮宮素與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品離心分離而得到的上清。泳道2:加熱處理含TMR-縮宮素與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品而得到的上清。泳道3:使摻入TMR-縮宮素的白蛋白自身聚集體和CAPS水溶液接觸,均化而得到的上清。泳道4:使摻入TMR-縮宮素的白蛋白自身聚集體和含有DTT的CAPS水溶液接觸,均化而得到的上清。泳道5:對(duì)未加熱處理的、含TMR-C-肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品進(jìn)行離心分離而得到的上清。泳道6:加熱處理含TMR-C-肽與白蛋白的復(fù)合物的液體樣品而得到的上清。泳道7:使摻入TMR-C-肽的白蛋白自身聚集體和CAPS水溶液接觸,均化而得到的上清。泳道8:使摻入TMR-C-肽的白蛋白自身聚集體和含有DTT的CAPS水溶液接觸,均化而得到的上清。泳道9:TMR-縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品。泳道10:TMR-C-肽標(biāo)準(zhǔn)品。泳道11:使摻入TMR-縮宮素的白蛋白自身聚集體和DW接觸,均化而得到的上清。泳道12:使摻入TMR-縮宮素的白蛋白自身聚集體和含有DTT的DW接觸,均化而得到的上清。泳道13:使摻入TMR-縮宮素的白蛋白自身聚集體和TBPB接觸,均化而得到的上清。泳道14:使摻入TMR-縮宮素的白蛋白自身聚集體和含有DTT的TBPB接觸,均化而得到的上清。泳道15:使摻入TMR-C-肽的白蛋白自身聚集體和DW接觸,均化而得到的上清。泳道16:使摻入TMR-C-肽的白蛋白自身聚集體和含有DTT的DW接觸,均化而得到的上清。泳道17:使摻入TMR-C-肽的白蛋白自身聚集體和TBPB接觸,均化而得到的上清。泳道18:使摻入TMR-C-肽的白蛋白自身聚集體和含有DTT的TBPB接觸,均化而得到的上清。泳道19:TMR-縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品和TMR-C-肽標(biāo)準(zhǔn)品的混合物。圖1中,熒光成像的凝膠的泳道9及10的附有“*”的條帶各自表示TMR-縮宮素及TMR-C-肽的條帶。另外,熒光成像的凝膠的泳道19的附有“*”的2個(gè)條帶表示TMR-縮宮素及TMR-C-肽的條帶。在圖1中,熒光成像的凝膠的照片由于顯示用TMR標(biāo)記的肽的存在及其量,所以可評(píng)價(jià)得到的肽的收率。另外,銀染色的凝膠的照片由于顯示樣品中的混雜物的存在及其量,所以可評(píng)價(jià)得到的肽的純度。參照?qǐng)D1,在熒光成像的凝膠的泳道1中,TMR-縮宮素幾乎無法確認(rèn)。從而得知,在未加熱處理的液體樣品中,TMR-縮宮素未游離。在泳道2中,可由熒光成像確認(rèn)少量的TMR-縮宮素。從而得知,由加熱處理使得被白蛋白等血中蛋白質(zhì)捕獲的TMR-縮宮素少量游離到上清。在泳道3中,由熒光成像確認(rèn)到TMR-縮宮素。從而顯示,通過使由液體樣品的加熱處理而產(chǎn)生的不溶性級(jí)分與CAPS水溶液接觸而均化,被摻入白蛋白自身聚集體的TMR-縮宮素游離到CAPS水溶液中。即得知,CAPS水溶液可作為用于使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離的游離劑使用。再者,在泳道3中也確認(rèn)了比TMR-縮宮素更高分子量的條帶,但這被認(rèn)為是縮宮素肽中的Cys殘基導(dǎo)致的TMR-縮宮素的多聚體的條帶。另一方面,在銀染色的凝膠的泳道3中,確認(rèn)不到混雜物,由此得知TMR-縮宮素選擇性地游離。另外,在泳道4中也顯示與泳道3同樣的結(jié)果,由此得知也可向作為游離劑的CAPS水溶液添加還原劑的DTT。參照?qǐng)D1,在熒光成像的凝膠的泳道5及6中,TMR-C-肽幾乎無法確認(rèn)。從而得知,在未加熱處理的液體樣品中,TMR-C-肽未游離,另外,即使加熱處理該液體樣品,被白蛋白等血中蛋白質(zhì)捕獲的TMR-C-肽也幾乎不游離。在泳道7中,由熒光成像確認(rèn)TMR-C-肽。從而顯示,通過使由液體樣品的加熱處理產(chǎn)生的不溶性級(jí)分與CAPS水溶液接觸而均化,被摻入白蛋白自身聚集體的TMR-C-肽游離到CAPS水溶液中。另一方面,在銀染色的凝膠的泳道7中,確認(rèn)不到混雜物,因此得知TMR-C-肽選擇性游離。另外,應(yīng)用用含有DTT的CAPS水溶液處理的樣品的泳道8也顯示與泳道7同樣的結(jié)果。參照?qǐng)D1,如熒光成像的凝膠的泳道11~14所示,即使使不溶性級(jí)分與DW或TBPB接觸而均化,被摻入白蛋白自身聚集體的TMR-縮宮素也僅微少被提取。另外,如泳道15~18所示,即使使不溶性級(jí)分與DW或TBPB接觸而均化,也無法提取被摻入白蛋白自身聚集體的TMR-C-肽。從而顯示,DW及TBPB對(duì)于被摻入白蛋白自身聚集體的肽的游離不適宜?!緦?shí)施例2:游離劑(CAPS)的濃度】在實(shí)施例2中,探討是否能使用以各種濃度含CAPS的添加劑,使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離而回收,確定作為游離劑適宜的CAPS濃度的范圍。(2.1)材料-添加劑作為添加劑,使用CAPS濃度是0.1、1、10、20、50、80、100、500及1000mM的CAPS水溶液(pH11.0)。這些CAPS水溶液通過將3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(制品No.343-00484:同仁化學(xué)研究所制)溶解于水中至成上述的濃度,使用NaOH將pH調(diào)整到11.0而得到。另外,向這些CAPS水溶液添加DTT至最終濃度成0.1mM,也調(diào)制含有DTT的CAPS水溶液(pH11.0)。再者,調(diào)制100mMCAPS水溶液(pH5.7)。·肽作為肽,使用將合成肽SA21用TMR標(biāo)記的TMR-SA21(株式會(huì)社BIOLOGICA)。SA21是自身的氨基酸序列內(nèi)有2個(gè)Cys殘基的酸性肽(pI=4.11)。再者,已知SA21與白蛋白以最高的親和性結(jié)合,形成強(qiáng)固且穩(wěn)定的復(fù)合物(參照USPatentApplicationPublication2012/277407)。SA21的氨基酸序列是DDEWLCGWRPLCIDEILR(SEQIDNO:3)?!ひ后w樣品將健康者來源的全血(自ProMedDx公司購入)0.3ml用CAPS水溶液(pH11.0)稀釋5倍。向得到的稀釋液添加TMR-SA21至最終濃度成2μM,調(diào)制含肽與血中蛋白質(zhì)(白蛋白)的復(fù)合物的液體樣品。(2.2)白蛋白自身聚集體的生成向含上述的肽與血中蛋白質(zhì)的復(fù)合物的液體樣品添加ZnCl2(NACALAITESQUE株式會(huì)社)至最終濃度成100mM。將得到的混合物移到10mL容積的玻璃試管,與實(shí)施例1同樣進(jìn)行加熱處理及冷卻處理。在加熱處理后的液體樣品中產(chǎn)生作為白蛋白自身聚集體的不溶性級(jí)分。(2.3)自白蛋白自身聚集體的肽的游離及回收自加熱處理后的液體樣品,將不溶性級(jí)分使用藥刀移到2mL容積的微管(eppendorf公司制)。向微管添加上述的CAPS水溶液,使用微研杵對(duì)不溶性級(jí)分均化1分鐘。將均化的不溶性級(jí)分以15,000rpm離心5分鐘,得到上清。將得到的上清作為樣品保存。(2.4)肽的檢測(cè)將上述的各樣品,與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行SDS-PAGE及隨之的熒光成像及銀染色。電泳后的凝膠的熒光成像及銀染色的結(jié)果示于圖2及圖3。圖2中,熒光成像的凝膠的泳道11及20的附有“*”的條帶表示TMR-SA21的單體的條帶,附有“**”的條帶表示TMR-SA21的多聚體的條帶。在熒光成像中,對(duì)于凝膠中的各泳道及各條帶,使用熒光成像儀定量TMR-SA21。基于此熒光成像的結(jié)果,使用圖像處理軟件ImageJ1.46r(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所制)求出肽或蛋白質(zhì)殘?jiān)臈l帶的光學(xué)濃淡密度(以下也稱為“光密度測(cè)定值”),根據(jù)下述式1算出收率的相對(duì)值(Y)。此時(shí),由W(寬度)=1.0、及H(高度)=2.6的縫隙寬度求出光密度測(cè)定值。收率的相對(duì)值(Y)=[(S3/W3)-(S1/W1)]/[(S2/W2))-(S1/W1)]…式1(式中,S1是背景的光密度測(cè)定值、S2是TMR-SA21標(biāo)準(zhǔn)品的光密度測(cè)定值、S3是目的泳道的光密度測(cè)定值、W1是背景的光密度測(cè)定法定量時(shí)的縫隙寬度、W2是TMR-SA21標(biāo)準(zhǔn)品的光密度測(cè)定法定量時(shí)的縫隙寬度、W3是目的泳道的光密度測(cè)定法定量時(shí)的縫隙寬度。)接下來,對(duì)于銀染色的凝膠的圖像,使用圖像處理軟件ImageJ1.46r(NIH)求出肽或蛋白質(zhì)殘?jiān)墓饷芏葴y(cè)定值,根據(jù)下述式2算出雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)。此時(shí),與收率的算出同樣地,由W(寬度)=1.0、及H(高度)=2.6的縫隙寬度制成光密度圖。求出得到的光密度圖中的、尺寸標(biāo)志物(SharpPre-stainedProteinStandard:Novex公司制)的10kDa的峰~60kDa的峰之間的光密度測(cè)定值。雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)=[(S3/W3)-(S1/W1)]/[(S2/W2))-(S1/W1)]…式2(式中,S1是背景的光密度測(cè)定值、S2是標(biāo)志物的光密度測(cè)定值、S3是目的泳道的光密度測(cè)定值、W1是背景的光密度測(cè)定法定量時(shí)的縫隙寬度、W2是標(biāo)志物的光密度測(cè)定法定量時(shí)的縫隙的寬度、W3是目的泳道的光密度測(cè)定法定量時(shí)的縫隙寬度。)由算出的收率的相對(duì)值及雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值,根據(jù)下述的式3計(jì)算肽的回收效率?;厥招剩绞章实南鄬?duì)值(Y)/雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)…式3算出的回收率的相對(duì)值(Y)、雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)及回收效率的值示于表1?!颈?】(2.5)結(jié)果如圖2及表1所示,在CAPS濃度是0.1mM~50mM的范圍內(nèi),SA21肽不從不溶性級(jí)分游離。另外,如圖2所示,CAPS濃度是0.1mM~50mM時(shí),即使向添加劑進(jìn)一步加還原劑的DTT,SA21肽也不從不溶性級(jí)分游離。與此相對(duì),在CAPS濃度是80mM~1000mM的范圍內(nèi)可從不溶性級(jí)分游離SA21肽。另一方面,由于混雜物幾乎不游離,認(rèn)為回收的SA21肽的純度高。從而顯示,作為游離劑適宜的CAPS濃度的范圍是80mM~1000mM。另外,如圖2所示,CAPS濃度是80mM~1000mM時(shí),即使向添加劑進(jìn)一步加DTT,也可從不溶性級(jí)分游離及回收SA21肽。另一方面,如圖3所示,CAPS水溶液的pH是5.7時(shí),即使CAPS濃度為100mM,SA21肽也幾乎無法從不溶性級(jí)分游離。這提示,在pH低于中性時(shí),肽的回收效率降低?!緦?shí)施例3:由CHES的肽的游離及回收】探討是否能使用以各種濃度含有與CAPS類似的結(jié)構(gòu)的CHES的添加劑,使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離而回收。另外,確定作為游離劑適宜的CHES濃度的范圍。(3.1)材料-添加劑作為添加劑,使用CHES濃度是0.1、1、10、50、80、100、500及1000mM的CHES水溶液(pH10.0)。這些CHES水溶液通過將2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸(制品No.340-08331:同仁化學(xué)研究所制)溶解于水至成上述的濃度,使用NaOH將pH調(diào)整到10.0而得到。另外,也向這些CHES水溶液添加DTT至最終濃度成0.1mM而調(diào)制含有DTT的CHES水溶液(pH10.0)。·肽使用與實(shí)施例2相同的TMR-SA21(株式會(huì)社BIOLOGICA)?!ひ后w樣品與實(shí)施例2同樣地,向健康者來源的全血的稀釋液添加TMR-SA21至以最終濃度2μM含TMR-SA21而調(diào)制液體樣品。(3.2)白蛋白自身聚集體的生成和肽的游離及回收與實(shí)施例2同樣地,進(jìn)行液體樣品的加熱處理及冷卻處理,在液體樣品中使作為白蛋白自身聚集體的不溶性級(jí)分生成。進(jìn)而,除了作為添加劑使用上述的CHES水溶液以外,與實(shí)施例2同樣地,使不溶性級(jí)分均化而得到上清。將得到的上清作為樣品保存。(3.3)肽的檢測(cè)對(duì)上述的各樣品與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行SDS-PAGE及隨之的熒光成像及銀染色。電泳后的凝膠的熒光成像及銀染色的結(jié)果示于圖4。圖4中,熒光成像的凝膠的泳道11及18的附有“*”的條帶表示TMR-SA21的單體的條帶,附有“**”的條帶表示TMR-SA21的多聚體的條帶。另外,與實(shí)施例2同樣地,自熒光成像及銀染色的結(jié)果算出收率的相對(duì)值(Y)、雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)、及回收效率。算出的值示于表2。【表2】添加劑濃度(mM)收率的相對(duì)值(Y)雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)回收效率(Y/D)CHES10.010.890.01CHES100.010.260.04CHES500.000.040.00CHES800.020.040.56CHES1000.13±0.170.16±0.251.18±0.39CHES5000.540.0415.33CHES10000.770.352.21(3.4)結(jié)果如圖4及表2所示,得知在CHES濃度是0.1mM~50mM的范圍內(nèi),SA21肽不從不溶性級(jí)分游離。另外,如圖4所示,CHES濃度是0.1mM~50mM時(shí),即使向添加劑進(jìn)一步加還原劑的DTT,SA21肽也不從不溶性級(jí)分游離。與此相對(duì),在CHES濃度是80mM~1000mM的范圍內(nèi)可從不溶性級(jí)分游離及回收SA21肽。從而顯示,作為游離劑適宜的CHES濃度的范圍是80mM~1000mM。另外,如圖4所示,CHES濃度是80mM~1000mM時(shí),即使向添加劑進(jìn)一步加DTT,也可從不溶性級(jí)分有效游離及回收SA21肽?!緦?shí)施例4:由CAPSO的肽的游離及回收】探討是否能使用以各種濃度含有與CAPS類似的結(jié)構(gòu)的CAPSO的添加劑,使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離而回收。另外,確定作為游離劑適宜的CAPSO濃度的范圍。(4.1)材料-添加劑作為添加劑,使用CAPSO濃度是50、80、100、500及1000mM的CAPSO水溶液(pH10.2)。這些CAPSO水溶液通過將3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基丙磺酸(制品No.C2278-100G、Sigma-Aldrich公司制)溶解于水至成上述的濃度,使用NaOH將pH調(diào)整到10.2而得到?!る氖褂门c實(shí)施例2相同的TMR-SA21(株式會(huì)社BIOLOGICA)?!ひ后w樣品與實(shí)施例2同樣地,向健康者來源的全血的稀釋液添加TMR-SA21至以最終濃度2μM含TMR-SA21而調(diào)制液體樣品。(4.2)白蛋白自身聚集體的生成和肽的游離及回收與實(shí)施例2同樣地,進(jìn)行液體樣品的加熱處理及冷卻處理,使液體樣品中生成作為白蛋白自身聚集體的不溶性級(jí)分。進(jìn)而,除了作為添加劑使用上述的CAPSO水溶液以外,與實(shí)施例2同樣地,使不溶性級(jí)分均化而得到上清。將得到的上清作為樣品保存。(4.3)肽的檢測(cè)對(duì)上述的各樣品與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行SDS-PAGE及隨之的熒光成像及銀染色。電泳后的凝膠的熒光成像及銀染色的結(jié)果示于圖5。圖5中,熒光成像的凝膠的泳道5的附有“*”的條帶表示TMR-SA21的單體的條帶,附有“**”的條帶表示TMR-SA21的多聚體的條帶。另外,與實(shí)施例2同樣地,自熒光成像及銀染色的結(jié)果算出收率的相對(duì)值(Y)、雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)、及回收效率。算出的值示于表3?!颈?】添加劑濃度(mM)收率的相對(duì)值(Y)雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)回收效率(Y/D)CAPSO500.010.040.33CAPSO800.020.040.67CAPSO1000.06±0.030.02±0.023.86±3.86CAPSO5000.360.0410.08CAPSO10001.340.472.87(4.4)結(jié)果如圖5及表3所示,在CAPSO濃度是50mM的情況中,SA21肽幾乎不從不溶性級(jí)分游離。與此相對(duì),在CAPSO濃度是80mM~1000mM的范圍內(nèi)可從不溶性級(jí)分游離及回收SA21肽。從而顯示,作為游離劑適宜的CAPSO濃度的范圍是80mM~1000mM?!緦?shí)施例5:由CABS的肽的游離及回收】探討是否能使用以各種濃度含有與CAPS類似的結(jié)構(gòu)的CABS的添加劑,使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離而回收。另外,確定作為游離劑適宜的CABS濃度的范圍。(5.1)材料-添加劑作為添加劑,使用CABS濃度是10、80、100、500及1000mM的CABS水溶液(pH11.5)。這些CABS水溶液通過將4-(環(huán)己基氨基)-1-丁磺酸(制品No.C5580-25G、Sigma-Aldrich公司制)溶解于水至成上述的濃度,使用NaOH將pH調(diào)整到11.5而得到?!る氖褂门c實(shí)施例2相同的TMR-SA21(株式會(huì)社BIOLOGICA)?!ひ后w樣品與實(shí)施例2同樣地,向健康者來源的全血的稀釋液添加TMR-SA21至以最終濃度2μM含TMR-SA21而調(diào)制液體樣品。(5.2)白蛋白自身聚集體的生成和肽的游離及回收與實(shí)施例2同樣地,進(jìn)行液體樣品的加熱處理及冷卻處理,使液體樣品中生成作為白蛋白自身聚集體的不溶性級(jí)分。進(jìn)而,除了作為添加劑使用上述的CABS水溶液以外,與實(shí)施例2同樣地,使不溶性級(jí)分均化而得到上清。將得到的上清作為樣品保存。(5.3)肽的檢測(cè)對(duì)上述的各樣品與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行SDS-PAGE及隨之的熒光成像及銀染色。電泳后的凝膠的熒光成像及銀染色的結(jié)果示于圖6。圖6中,熒光成像的凝膠的泳道7的附有“*”的條帶表示TMR-SA21的條帶。再者,在泳道1,應(yīng)用對(duì)未加熱處理的液體樣品進(jìn)行離心分離而得到的上清,在泳道2,應(yīng)用加熱處理液體樣品而得到的上清。與實(shí)施例2同樣地,自熒光成像及銀染色的結(jié)果算出收率的相對(duì)值(Y)、雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)、及回收效率。算出的值示于表4?!颈?】添加劑濃度(mM)收率的相對(duì)值(Y)雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)回收效率(Y/D)CABS100.000.040.00CABS800.170.044.84CABS1000.42±0.370.28±0.322.08±1.03CABS5001.290.1111.92CABS10000.330.790.41(5.4)結(jié)果如圖6及表4所示,在CABS濃度是10mM的情況中,SA21肽不從不溶性級(jí)分游離。與此相對(duì),在CABS濃度是80mM~1000mM的范圍內(nèi)可從不溶性級(jí)分游離及回收SA21肽。從而顯示,作為游離劑適宜的CABS濃度的范圍是80mM~1000mM?!緦?shí)施例6:游離劑的種類(1)】在實(shí)施例6中,探討是否能使用含有與CAPS不同的結(jié)構(gòu)的化合物的添加劑,使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離而回收。(6.1)材料-添加劑作為添加劑,使用100mMCHAPS水溶液(pH7.6或10.8)、DW(18MΩ·cm)、TBPB(pH7.0或11.2)、100mMADA水溶液(pH7.4或10.5)、100mM二羥乙基甘氨酸水溶液(pH9.0或10.3)及5mM氫氧化鈉水溶液。另外,作為對(duì)照,使用100mMCAPS水溶液(pH11.0)及100mMCHES水溶液(pH10.0)。再者,CHAPS水溶液是通過將3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨基]丙磺酸鹽(制品No.C008、同仁化學(xué)研究所制)溶解于水至最終濃度成100mM,使用NaOH將pH調(diào)整到7.6或10.8而得到。ADA水溶液是,將N-(2-乙酰胺)亞胺基二醋酸(制品No.349-08281、同仁化學(xué)研究所制)溶解于水至最終濃度成100mM,使用NaOH將pH調(diào)整到7.4或10.5而得到。二羥乙基甘氨酸水溶液是通過將N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(制品No.349-08301、同仁化學(xué)研究所制)溶解于水至最終濃度成100mM,使用NaOH將pH調(diào)整到9.0或10.3而得到。另外,也向上述的各添加劑添加DTT至最終濃度成0.1mM而調(diào)制含有DTT的添加劑?!る氖褂门c實(shí)施例2相同的TMR-SA21(株式會(huì)社BIOLOGICA)?!ひ后w樣品與實(shí)施例2同樣地,向健康者來源的全血的稀釋液添加TMR-SA21至以最終濃度2μM含TMR-SA21而調(diào)制液體樣品。(6.2)白蛋白自身聚集體的生成和肽的游離及回收與實(shí)施例2同樣地,進(jìn)行液體樣品的加熱處理及冷卻處理,使液體樣品中生成作為白蛋白自身聚集體的不溶性級(jí)分。進(jìn)而,除了使用上述的添加劑以外,與實(shí)施例2同樣地,使不溶性級(jí)分均化而得到上清。將得到的上清作為樣品保存。(6.3)肽的檢測(cè)對(duì)上述的各樣品與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行SDS-PAGE及隨之的熒光成像及銀染色。電泳后的凝膠的熒光成像及銀染色的結(jié)果示于圖7。再者,圖7是對(duì)使用100mMCHAPS水溶液(pH7.6)、DW、TBPB(pH7.0)、100mMADA水溶液(pH7.4)、100mM二羥乙基甘氨酸水溶液(pH9.0)、100mMCAPS水溶液(pH11.0)及100mMCHES水溶液(pH10.0)處理的樣品進(jìn)行電泳的凝膠的照片。圖7中,熒光成像的凝膠的泳道7及16的附有“*”的條帶表示TMR-SA21的單體的條帶,附有“**”的條帶表示TMR-SA21的多聚體的條帶。與實(shí)施例2同樣地,自熒光成像及銀染色的結(jié)果算出收率的相對(duì)值(Y)、雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)、及回收效率。算出的值示于表5。【表5】(6.4)結(jié)果如圖7及表5所示,作為添加劑使用CHAPS、TBPB及DW時(shí),無法從不溶性級(jí)分游離SA21肽。另外,即使使用氫氧化鈉水溶液、以及將pH調(diào)制到10以上的CHAPS及TBPB也無法游離SA21肽。從而提示,在從不溶性級(jí)分的肽的游離中,不是pH,而是游離劑的結(jié)構(gòu)重要。作為添加劑使用ADA時(shí),可從不溶性級(jí)分游離SA21肽,但混雜物也大量地游離。從而認(rèn)為,由ADA水溶液游離的肽純度低。另一方面,作為添加劑使用二羥乙基甘氨酸水溶液時(shí),可從不溶性級(jí)分游離及回收SA21肽。另外,二羥乙基甘氨酸水溶液pH越高,混雜物的游離越少,SA21肽的回收效率進(jìn)一步升高。從而得知,100mM二羥乙基甘氨酸水溶液(pH9.0或10.3)可作為用于使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離的游離劑使用。【實(shí)施例7:游離劑的種類(2)】在實(shí)施例7中,探討是否能使用含有與CAPS類似的結(jié)構(gòu)的N-環(huán)己基氨基磺酸、及與CAPS同樣地有氨基及磺酸基的?;撬岬奶砑觿?,使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離而回收。(7.1)材料-添加劑作為添加劑,使用100mMN-環(huán)己基氨基磺酸水溶液(pH12.5)及100mM?;撬崴芤?pH9.5)。另外,作為對(duì)照,使用100mMCAPS水溶液(pH11.0)及100mMADA水溶液(pH7.4)。再者,N-環(huán)己基氨基磺酸水溶液是通過將N-環(huán)己基氨基磺酸溶解于水至最終濃度成100mM,用NaOH將pH調(diào)整到12.5而得到。?;撬崴芤菏峭ㄟ^將2-氨基乙烷氨基磺酸(制品No.A12403、AlfaAesar公司制)溶解于水至最終濃度成100mM,用NaOH將pH調(diào)整到9.5而得到?!る氖褂门c實(shí)施例2相同的TMR-SA21(株式會(huì)社BIOLOGICA)?!ひ后w樣品與實(shí)施例2同樣地,向健康者來源的全血的稀釋液添加TMR-SA21至以最終濃度2μM含TMR-SA21而調(diào)制液體樣品。(7.2)白蛋白自身聚集體的生成和肽的游離及回收與實(shí)施例2同樣地,進(jìn)行液體樣品的加熱處理及冷卻處理,使液體樣品中生成作為白蛋白自身聚集體的不溶性級(jí)分。進(jìn)而,除了使用上述的添加劑以外,與實(shí)施例2同樣地,使不溶性級(jí)分均化而得到上清。將得到的上清作為樣品保存。(7.3)肽的檢測(cè)對(duì)上述的各樣品與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行SDS-PAGE及隨之的熒光成像及銀染色。電泳后的凝膠的熒光成像及銀染色的結(jié)果示于圖8。圖8中,熒光成像的凝膠的泳道7的附有“*”的條帶表示TMR-SA21的條帶。再者,在泳道1,應(yīng)用對(duì)未加熱處理的液體樣品進(jìn)行離心分離而得到的上清,在泳道2,應(yīng)用加熱處理液體樣品而得到的上清。與實(shí)施例2同樣地,自熒光成像及銀染色的結(jié)果算出收率的相對(duì)值(Y)、雜質(zhì)的相對(duì)量的相對(duì)值(D)、及回收效率。算出的值示于表6。【表6】(7.4)結(jié)果如圖8及表6所示,作為添加劑使用牛磺酸時(shí),無法從不溶性級(jí)分游離SA21肽。一方面,作為添加劑使用N-環(huán)己基氨基磺酸時(shí),可從不溶性級(jí)分游離及回收SA21肽。從而得知,100mMN-環(huán)己基氨基磺酸水溶液(pH12.5)可作為用于使被摻入白蛋白自身聚集體的肽游離的游離劑使用?!緦?shí)施例8:不伴隨物理處理的肽的游離】在實(shí)施例8中,在摻入有肽的白蛋白自身聚集體與游離劑的接觸中不進(jìn)行均化,嘗試自該自身聚集體的肽的游離及回收。(8.1)材料-添加劑作為添加劑,使用100mMCAPS水溶液(pH11.0)、100mMADA水溶液(pH7.4)、100mM二羥乙基甘氨酸水溶液(pH9.0)及TBPB(pH7.0)?!る氖褂门c實(shí)施例2相同的TMR-SA21(株式會(huì)社BIOLOGICA)?!ひ后w樣品與實(shí)施例2同樣地,向健康者來源的全血的稀釋液添加TMR-SA21至以最終濃度2μM含TMR-SA21而調(diào)制液體樣品。(8.2)白蛋白自身聚集體的生成和肽的游離及回收與實(shí)施例2同樣地,進(jìn)行液體樣品的加熱處理及冷卻處理,使液體樣品中生成作為白蛋白自身聚集體的不溶性級(jí)分。自加熱處理后的液體樣品,將不溶性級(jí)分使用藥刀移到2mL容積的微管(eppendorf公司制)。向微管加上述的添加劑,于室溫靜置2天。2天后,將不溶性級(jí)分以15,000rpm離心5分鐘,攝影分離的沉淀物及上清。照片示于圖9A。進(jìn)而,將得到的上清作為樣品保存。(8.3)肽的檢測(cè)對(duì)上述的各樣品與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行SDS-PAGE及隨之的熒光成像及銀染色。電泳后的凝膠的熒光成像及銀染色的結(jié)果示于圖9B。圖9B中,“FL”表示熒光成像,“Ag”表示銀染色。另外,附有“*”的條帶表示TMR-SA21的條帶。(8.4)結(jié)果如圖9A所示,使CAPS、二羥乙基甘氨酸或TBPB和不溶性級(jí)分接觸時(shí),得到的上清是清澄的。一方面,如圖9A所示,使用ADA時(shí),得到的上清相當(dāng)渾濁。參照?qǐng)D9B,則在使用CAPS時(shí),在上清中,SA21游離,但幾乎見不到混雜物(參照泳道1及2)。在使用ADA時(shí),在上清中,SA21游離,但也大量地含混雜物(參照泳道3及4)。在使用二羥乙基甘氨酸時(shí),在上清中,SA21游離,但也確認(rèn)到少量的混雜物(參照泳道5及6)。在使用TBPB時(shí),在上清中見不到SA21也見不到混雜物(參照泳道7及8)。這些顯示,作為游離劑使用CAPS或二羥乙基甘氨酸時(shí),即使不進(jìn)行均化或攪拌等的物理的處理,也可自白蛋白自身聚集體游離肽。另一方面顯示,TBPB無法從不溶性級(jí)分游離SA21肽,另外,ADA溶解不溶性級(jí)分。【符號(hào)的說明】11:收容肽游離劑的容器22:收容式(I)或(II)所表示的化合物的容器33:收容用于溶解式(I)或(II)所表示的化合物的溶劑的容器。當(dāng)前第1頁1 2 3 
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