專利名稱：促胰島素分泌肽生物活性測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性測(cè)定方法，更具體地說涉及促胰島素分泌肽的生物活性測(cè)定方法。
Exendin4和GLP-1是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的典型的促胰島素分泌肽。GLP-1(Glucagon Like Peptide-1，胰高血糖素樣肽)是人體自身分泌的多肽。Exendin4是從毒蜥蜴唾液分泌物中得到的多肽。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)兩者的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾或微小改變(比如兩者的衍生物，或者對(duì)兩者氨基酸序列中的少數(shù)幾個(gè)氨基酸進(jìn)行改變，或者增減少數(shù)幾個(gè)氨基酸)，得到的多肽可能仍保持有促進(jìn)胰島素分泌的能力。因此，本發(fā)明所涉及的促胰島素分泌肽系指一切能夠促進(jìn)胰島素分泌的活性多肽。
本發(fā)明采用健康C57/BL/6J小鼠作為模型動(dòng)物，觀察促胰島素分泌肽的促胰島素分泌和降血糖作用。
C57/BL/6J小鼠的背景C57/BL/6J別名B6；BLACK 6；C57BLACK外觀黑色基因型α/α Ahl/AhlH2 haplotype(單型)h應(yīng)用1.心血管研究食物引起動(dòng)脈硬化癥(高發(fā)癥)2.神經(jīng)生物學(xué)研究前庭及聽覺失缺(老年性聽覺失缺；12-18月)3.感覺神經(jīng)研究前庭及聽覺失缺本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明提供的促胰島素分泌肽生物活性測(cè)定方法，用C57/BL/6J小鼠作為模型動(dòng)物，將促胰島素分泌肽給入小鼠體內(nèi)，以觀察促胰島素分泌肽的促胰島素分泌以及降血糖作用。
本發(fā)明提供的促胰島素分泌肽生物活性測(cè)定方法，優(yōu)選的將促胰島素分泌肽給入C57/BL/6J小鼠體內(nèi)的途徑為腹腔注射。
本發(fā)明提供的促胰島素分泌肽生物活性測(cè)定方法，優(yōu)選的促胰島素分泌肽為GLP-1或Exendin4。
本發(fā)明提供的促胰島素分泌肽的促胰島素分泌作用測(cè)定方法為取健康C57/BL/6J小鼠，注射促胰島素分泌肽，于不同時(shí)刻取血測(cè)定胰島素和C肽濃度。對(duì)照組注射生理鹽水。對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果以觀察促胰島素分泌肽的促胰島素分泌作用。
本發(fā)明提供的促胰島素分泌肽的降血糖作用測(cè)定方法為取健康C57/BL/6J小鼠，注射葡萄糖和促胰島素分泌肽，于不同時(shí)刻取血測(cè)定血糖濃度。對(duì)照組只注射葡萄糖，不給促胰島素分泌肽。對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果以觀察促胰島素分泌肽的降血糖作用。
C57/BL/6J小鼠容易獲取，容易飼養(yǎng)，對(duì)葡萄糖耐受時(shí)間長(zhǎng)，給藥后促胰島素分泌和降血糖作用比其它幾種模型動(dòng)物更為明顯。因此，本發(fā)明提供的促胰島素分泌肽活性測(cè)定方法比目前廣泛使用的方法成本更低廉、實(shí)施更方便、效果更明顯。
圖2為GLP-1的促C肽分泌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖3為Exendin4的促胰島素分泌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖4為Exendin4的促C肽分泌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖5為GLP-1的降血糖作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖6為Exendin4的降血糖作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但對(duì)本發(fā)明不作任何限制。
實(shí)施例1以C57/BL/6J小鼠為模型動(dòng)物測(cè)定GLP-1的促胰島素分泌作用實(shí)驗(yàn)材料與方法
●健康C57/BL/6J小鼠禁食2小時(shí)后備用(中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心提供)●40％葡萄糖溶液●0.9％NaCl溶液●放射免疫胰島素測(cè)定試劑盒(國(guó)家衛(wèi)生部上海生物制品所出品)●放射免疫C-肽測(cè)定試劑盒(國(guó)家衛(wèi)生部上海生物制品所出品)●GLP-1Peninsula Laboratories，code 7168，(1996/1997 Catalog)健康C57/BL/6J小鼠禁食2小時(shí)后，腹腔注射10微克GLP-1，立刻用刻度毛細(xì)管(先以1mg/mL肝素潤(rùn)洗毛細(xì)管內(nèi)壁)從眼竇取血30微升，置入300微升生理鹽水中混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心除去紅血球，血清用于測(cè)定胰島素和C-肽濃度。分別于5，15，30，60分鐘按同樣操作取血，分離血清。對(duì)照組注射生理鹽水，按相同時(shí)間間隔取血。兩組血樣均應(yīng)用放射免疫試劑盒方法測(cè)定胰島素和C-肽濃度，以檢驗(yàn)GLP-1的促胰島素分泌作用。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如

圖1和圖2所示。
對(duì)照組血液中胰島素和C肽濃度保持不變；而給藥組血液中胰島素和C肽濃度都明顯增加。由此可證明GLP-1的促胰島素分泌作用。
實(shí)施例2以C57/BL/6J小鼠為模型動(dòng)物測(cè)定Exendin4的促胰島素分泌作用實(shí)驗(yàn)材料、方法與例1操作相同，注射1微克Exendin4代替GLP-1，測(cè)定促胰島素分泌作用。
結(jié)果如圖3和圖4所示。
對(duì)照組血液中胰島素和C肽濃度保持不變；而給藥組血液中胰島素和C肽濃度都明顯增加。由此可證明Exendin4的促胰島素分泌作用。
實(shí)施例3以C57/BL/6J小鼠為模型動(dòng)物測(cè)定GLP-1的降血糖作用實(shí)驗(yàn)材料與方法●健康C57/BL/6J小鼠禁食2小時(shí)后備用(中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心提供)●40％葡萄糖溶液●0.9％NaCl溶液●血糖測(cè)定試劑盒(國(guó)家衛(wèi)生部上海生物制品所出品)健康C57/BL/6J小鼠禁食2小時(shí)后，腹腔注射200微升40％葡萄糖和10微克GLP-1，立刻用刻度毛細(xì)管(注射前以肝素處理)從眼竇取血30微升，置入300微升生理鹽水中混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心除去紅血球，血清用于血糖濃度測(cè)定。分別于30，60，120分鐘按同樣操作取血，分離血清。對(duì)照組只注射葡萄糖，不給GLP-1，按相同時(shí)間間隔取血。兩組血樣按照試劑盒所述方法測(cè)定血糖濃度，以檢驗(yàn)GLP-1的降血糖作用。
結(jié)果如圖5所示。
對(duì)照組血糖濃度大幅度升高后，逐漸回落到正常水平；而給藥組血糖濃度未出現(xiàn)顯著升高，一直保持在正常水平附近。這是由于給藥后促進(jìn)了胰島素分泌，從而避免了血糖濃度的大幅波動(dòng)。由此可證明促GLP-1的降血糖作用。
實(shí)施例4以C57/BL/6J小鼠為模型動(dòng)物測(cè)定Exendin4的降血糖作用實(shí)驗(yàn)材料與方法●健康C57/BL/6J小鼠禁食2小時(shí)后備用(中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心提供)●40％葡萄糖溶液●0.9％NaCl溶液●血糖測(cè)定試劑盒(國(guó)家衛(wèi)生部上海生物制品所出品)●Exendin-4Peninsula Laboratories，code 7089，(1996/1997 Catalog)
取健康C57/BL/6J小鼠禁食2小時(shí)后，按表1所述五種方式腹腔注射葡萄糖和Exendin4，立刻用刻度毛細(xì)管(注射前以肝素處理)從眼竇取血30微升，置入300微升生理鹽水中混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心除去紅血球，血清用于測(cè)定血糖濃度。分別于30，60，120分鐘按同樣操作取血，分離血清。五組血樣均按照試劑盒方法測(cè)定血糖濃度，以檢驗(yàn)Exendin4的降血糖作用。
表1

結(jié)果如圖6所示。
第一組小鼠血糖濃度大幅度升高后，逐漸回落到正常水平；第2-5組血糖濃度均出現(xiàn)了不同程度的降低，但血糖濃度降低幅度不大。這是由于促胰島素分泌肽僅在血糖濃度高時(shí)促進(jìn)胰島素分泌，降低血糖，而血糖濃度恢復(fù)到正常濃度時(shí)，就停止作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)不僅證明Exendin4具有降血糖作用，還證明Exendin4不會(huì)導(dǎo)致低血糖。
權(quán)利要求
1.一種促胰島素分泌肽生物活性測(cè)定方法，其特征在于用C57/BL/6J小鼠作為模型動(dòng)物，將促胰島素分泌肽給入小鼠體內(nèi)，測(cè)定促胰島素分泌肽的促胰島素分泌以及降血糖作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促胰島素分泌肽生物活性測(cè)定方法，其特征在于將促胰島素分泌肽給入C57/BL/6J小鼠體內(nèi)的途徑為腹腔注射。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促胰島素分泌肽生物活性測(cè)定方法，其特征在于所述促胰島素分泌肽為GLP-1或Exendin4。
全文摘要
本發(fā)明涉及促胰島素分泌肽的生物活性測(cè)定方法。本發(fā)明提供的促胰島素分泌肽生物活性測(cè)定方法采用對(duì)C
文檔編號(hào)A61K38/22GK1363838SQ0112669
公開日2002年8月14日 申請(qǐng)日期2001年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月7日
發(fā)明者孫玉昆, 伍登熙, 余剛, 周加祥 申請(qǐng)人:上海華誼生物技術(shù)有限公司