本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及PP1γ截短體及其載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤又稱癌癥，已成為危害人類健康的主要疾病，據(jù)統(tǒng)計2008年全世界約有1270萬癌癥新增患者，760萬死于癌癥，尤其在發(fā)展中國家，癌癥新增例數(shù)達56％。惡性腫瘤的發(fā)病機制復雜，眾多的分子和信號通路參與其中，而對其分子機制的詳盡了解對肝癌的預(yù)防、臨床診斷和治療均具有重要的意義。因此，探究惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制具有十分重要的意義，并據(jù)此可作為潛在的分子藥物開發(fā)的靶點及個體化治療的依據(jù)。

在惡性腫瘤進展過程中，某些基因的表達發(fā)生變化，是肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，成為癌癥治療的潛在靶點。很多研究表明，PP1γ具有促進細胞存活和增殖的能力。在有絲分裂后期，PP1γ可直接被募集到染色體上，并在染色體的正常分離和有絲分裂中發(fā)揮重要作用，干擾PP1γ可導致有絲分裂的失敗和細胞凋亡。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種PP1γ截短體，具有抗腫瘤的應(yīng)用價值。本發(fā)明的另一目的是提供上述PP1γ截短體的表達載體。本發(fā)明還有一目的是提供上述PP1γ截短體的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

PP1γ截短體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用；所述的PP1γ截短體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

編碼所述的PP1γ截短體的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的PP1γ截短體的編碼基因的DNA序列的載體。

所述的載體，將PP1γ截短體的DNA序列連接進PCMV-HA真核表達載體，構(gòu)建出重組表達質(zhì)粒。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用生物工程技術(shù)，基因重組一段多肽對應(yīng)的DNA序列到pcDNA3.1真核表達載體。經(jīng)酶切和序列分析證明重組成功后，將此真核表達重組多肽轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞，免疫印跡證明多肽的蛋白表達，實現(xiàn)了多肽的重組。接著對多肽的抗腫瘤功能進行了研究，細胞學實驗表明此多肽具有抑制腫瘤細胞存活和增殖的重要抗癌功能。為腫瘤治療開發(fā)新的靶點提供實驗依據(jù)，對于應(yīng)用于腫瘤的臨床治療具有十分重要的開發(fā)應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是檢測多肽的表達結(jié)果圖，大小為19KD；

圖2是CCK-8實驗檢測多肽抑制Huh7細胞增殖結(jié)果圖；

圖3是EDU摻入實驗測多肽阻滯HepG2細胞增殖結(jié)果圖；

圖4是EDU摻入實驗柱狀統(tǒng)計圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

實施例1 PP1γ多肽重組

提取人的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計相應(yīng)上下游引物(5'-GCA AGC ATG TTA TAG CAG CCA TCG TGG A-3'和5'-CTA TTT CTT TGC TTG CTT TGT GGA GCT CGC-3')，應(yīng)用PCR技術(shù)成功擴增出對應(yīng)的cDNA編碼序列，如SEQ ID NO.2所示，該序列所表達的PP1γ截短體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。將擴增得到的片段與載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在含Amp⁺瓊脂平板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質(zhì)粒后，以ECOR1酶切鑒定。

將含有多肽核酸片段的質(zhì)粒經(jīng)ECOR1酶切后，利用回收試劑盒獲得該片段，同時用相同的酶處理質(zhì)粒pcDNA3.1(約5kbp)，然后將回收多肽核酸片段和經(jīng)酶切的載體pcDNA3.1在T4DNA連接酶作用下于16℃連接過夜。

將正確連接的多肽真核表達載體轉(zhuǎn)染HepG2細胞，48小時后搜集樣品，RIPA細胞裂解液裂解，免疫印跡結(jié)果證明了此多肽的表達，如圖1所示。

實施例2 多肽抗腫瘤功能的檢測

1)CCK-8實驗證明多肽細胞水平的抗腫瘤效應(yīng)

將肝癌細胞Huh7分別以20000個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，利用Lipofectamin 2000kit將35aa多肽真核表達載體和其它對照組瞬時轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7細胞，分別在0h、12h、24h、48h、72h后每孔加入10ul CCK-8溶液，2小時后，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定不同時間點各孔光吸收值，記錄結(jié)果。吸收值大小反映了細胞活性，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，以時間為橫坐標，吸收值為縱坐標做圖。CCK-8結(jié)果顯示與空載對照相比，多肽真核表達實驗組顯著抑制了Huh7細胞的增殖，如圖2，說明多肽的過表達能有效地抑制細胞的增殖活性。

2)EDU摻入實驗證明重組肽細胞水平的抗腫瘤效應(yīng)

將HepG2分別以每孔4×10³～1×10⁵細胞接種于96孔板中，利用Lipofectamin 2000kit將多肽真核表達載體和其它對照組瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞，48h后進行EDU孵育(50nM)，2小時后棄培養(yǎng)基，而后通過細胞固定、Apollo染色、DNA染色后，進行觀測統(tǒng)計，結(jié)果顯示多肽真核表達實驗組EdU陽性率明顯降低，如圖3、4，說明多肽的過表達能有效地抑制細胞的增殖活性，從而達到抗腫瘤效應(yīng)。