專(zhuān)利名稱(chēng)：人抗HBsAg單鏈抗體/人抗體輕鏈恒定區(qū)/魚(yú)精蛋白截短體重組基因、編碼蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的基因治療，具體涉及基因工程方法構(gòu)建的一 種由人抗HBsAg單鏈抗體、人抗體輕鏈恒定區(qū)和魚(yú)精蛋白截短體的編碼序列 組成的重組基因ScFv-Ck-tP，還涉及這種基因編碼的ScFv-Ck-tP融合蛋白， 以及由該融合蛋白介導(dǎo)的siRNA、 siRNA表達(dá)組件(siRNA expression cassettes, SECs)或siMA表達(dá)質(zhì)粒的靶向輸送在抗HBV感染及相關(guān)疾病治 療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)所引起的乙型肝炎是一種 傳播廣泛、危害嚴(yán)重的傳染性疾病，也是導(dǎo)致慢性肝病，如肝硬化、肝癌的 最常見(jiàn)原因。但是目前的抗HBV及其相關(guān)疾病的治療并不讓人滿(mǎn)意，常用的抗 HBV的制劑主要有兩大類(lèi)cc-干擾素和核苷類(lèi)似物如拉米呋啶(Lamivudine) 和阿德福韋(Adefovir)。但是oc干擾素的長(zhǎng)期有效率僅為30% ~ 40%，而核苷 類(lèi)似物在治療過(guò)程中也存在著抗病毒作用短暫、易于誘發(fā)DNA多聚酶突變而形 成耐藥以及病毒復(fù)制水平快速反跳等缺點(diǎn)，因此需要研究和發(fā)展高效、特異 的抗乙肝病毒藥物。同時(shí)，由乙肝病人轉(zhuǎn)變來(lái)的肝硬化、肝癌的治療也非常 困難，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康，也需要開(kāi)發(fā)出高效、特異的治療藥物。
RNA干涉(RNA interference, RNAi)是雙鏈RNA介導(dǎo)的、序列特異的
轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。由于它能夠高效特異地關(guān)閉或降低特定基因的表達(dá)， RNA干涉技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的基因治療研究中，并取得了顯著的
結(jié)果，在乙型肝炎的治療研究中更是取得了令人矚目的結(jié)果體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都 證實(shí)了針對(duì)HBV的siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒都可以高效抑制HBV的基因表達(dá) 和復(fù)制。RNA干涉技術(shù)的出現(xiàn)為乙型肝炎的抗病毒治療提供了新的契機(jī)，但 是，將RNA干涉技術(shù)應(yīng)用于臨床還面臨許多問(wèn)題，如siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)
粒在體內(nèi)不穩(wěn)定、細(xì)胞攝取率低、無(wú)法靶向輸送等。而如何安全有效地將siRNA 傳遞至體內(nèi)靶部位是RNAi應(yīng)用過(guò)程中最關(guān)鍵的一個(gè)問(wèn)題。
siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒的靶向輸送將為上述問(wèn)題的解決提供新的手段， 特異性地將siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入靶細(xì)胞，而避免對(duì)正常細(xì)胞的副作 用，及大量應(yīng)用siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒時(shí)所引起的非特異性免疫反應(yīng)。目 前關(guān)于siRNA靶向輸送的研究還處于起步階段，抗體引導(dǎo)的siRNA的耙向輸 送是其中最有前景的策略之一。目前基于這一策略的研究報(bào)道不多，就所用 的抗體分子而言，已有報(bào)道的是抗HIV gP120的Fab抗體和抗HER2分子的單 鏈抗體兩種，它們分別針對(duì)HIV感染細(xì)胞表面的胞膜糖蛋白和腫瘤細(xì)胞特異 性高表達(dá)的HER2分子，它們分別與魚(yú)精蛋白形成的融合蛋白可以有效地將 siRNA特異性輸送到相應(yīng)的抗原陽(yáng)性細(xì)胞。其中，由Fab抗體融合蛋白介導(dǎo) 的siRNA的輸送效率約為40%，而單鏈抗體融合蛋白的輸送效率為32%。
噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)分子生物學(xué)新技術(shù)。它是指利 用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增出抗體的全套可變區(qū)基因，通過(guò)噬菌體表面展示 技術(shù)，把Fab段或單鏈抗體(ScFv)呈現(xiàn)在噬菌體的表面，經(jīng)過(guò)"吸附-洗脫-擴(kuò)增"過(guò)程篩選并富集特異性抗體。該技術(shù)為人源性抗體的制備提供了良好 的技術(shù)平臺(tái)，并且逐漸成為目前獲得人源性抗體的主要手段之一。目前，已 成功地從這種抗體庫(kù)中篩選出針對(duì)多種抗原(如病毒和毒素等)的人源性抗 體分子。這些抗體分子對(duì)于感染性疾病以及腫瘤的診斷和治療具有極為重要 的實(shí)驗(yàn)價(jià)值，也為新藥的開(kāi)發(fā)和疫苗的研制帶來(lái)非常廣闊的前景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種將具有抗原識(shí)別功能的抗體與具有核酸結(jié)合 功能的魚(yú)精蛋白或其截短體融合，構(gòu)建成同時(shí)具有抗原和核酸結(jié)合活性的融 合蛋白，siRNA與這種融合蛋白結(jié)合后，可以在抗體的引導(dǎo)下被特異性地輸 送到靶細(xì)胞，并隨抗體內(nèi)化入細(xì)胞漿，進(jìn)入RNAi通路，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)乾基因 的高效抑制。
我們構(gòu)建了 一個(gè)人源性抗HBsAg的Fab段噬菌體抗體庫(kù)，并從中篩選獲 得了五株與HBsAg有較高親和力的Fab抗體，我們將其改造成單鏈抗體基因， 克隆入原核表達(dá)載體pET32a，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)后用Ni2+-NTA螯合層析
介質(zhì)成功純化了五株單鏈抗體，間接ELISA檢測(cè)證實(shí)這五株單鏈抗體均具有 與HBsAg結(jié)合的活性，將它們與HBsAg陽(yáng)性細(xì)胞孵育，經(jīng)間接免疫熒光及共 聚焦顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)其中一株單鏈抗體(ScFvl5)具有良好的內(nèi)化活性，由 于抗體的內(nèi)化活性對(duì)于siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒的靶向輸送非常關(guān)鍵，因此 我們選擇該單鏈抗體作為siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒輸送的導(dǎo)向分子。有關(guān) ScFvl5的基因序列可參考GenBank (包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)序列的基 因登錄號(hào)分別為U91942和AF455924 )。此外，我們已根據(jù)HBV的基因序列 選擇了五個(gè)s iRNA干涉位點(diǎn)，構(gòu)建了五種s iRNA表達(dá)質(zhì)粒(pSUPER-HBVl ~ 5 ), 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)HBV基因的HepG2.2.15細(xì)胞后，經(jīng)比較分析，其中抑制效果最 明顯的針對(duì)HBV X基因的siRNA序列(siRNA-H2)被選擇用于進(jìn)行靶向抑制 的研究。
本發(fā)明的內(nèi)容包括由人抗HBsAg的單鏈抗體、人抗體輕鏈恒定區(qū)和魚(yú) 精蛋白截短體的編碼序列構(gòu)成的人抗HBsAg單鏈抗體/人抗體輕鏈恒定區(qū)/魚(yú) 精蛋白截短體重組基因ScFv-Ck-tP,其具有序列表〈400〉 1的序列。 上述基因編碼的蛋白，其具有序列表〈400 > 2的序列。 上述重組基因在制備抗HBV感染及其相關(guān)疾病的治療藥物中的應(yīng)用。 上述重組基因編碼的蛋白在制備抗HBV感染及其相關(guān)疾病的治療藥物中 的應(yīng)用。
本發(fā)明將能夠特異性識(shí)別并結(jié)合HBV感染細(xì)胞表面HBsAg分子的單鏈抗 體ScFvl5基因與人魚(yú)精蛋白截短體(truncated protamine, tP, 8-29位氨基 酸)的編碼序列(基因序列可參考GenBank,登錄號(hào)為BT006746 )連接，同 時(shí)，為了避免兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間空間結(jié)構(gòu)的影響，又在兩個(gè)基因之間插入了一 段人抗體輕鏈恒定區(qū)的編碼序列(基因序列可參考GenBank,登錄號(hào)為 U91942 ),構(gòu)建成重組基因ScFv-Ck-tP，該基因編碼的ScFv-Ck-tP融合蛋白 將同時(shí)具有抗原(HBsAg)結(jié)合活性和核酸結(jié)合活性，s iRNA或siRNA表達(dá)質(zhì) 粒與該融合蛋白結(jié)合后，被靶向輸送至HBV感染細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果表明所獲 得的ScFv-Ck-tP融合蛋白可以實(shí)現(xiàn)55。/。左右的siRNA輸送效率，優(yōu)于目前的
報(bào)道，提示我們所設(shè)計(jì)的融合蛋白結(jié)構(gòu)合理，活性更強(qiáng)。同時(shí)，通過(guò)體內(nèi)外 實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)由該蛋白靶向輸送的針對(duì)HBV的siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒能
夠高效特異地抑制HBV的基因表達(dá)和復(fù)制。利用該融合蛋白可以在不損傷肝 細(xì)胞的情況下持續(xù)高效地抑制HBV的基因表達(dá)和復(fù)制，這一策略將為RNAi技 術(shù)用于乙型肝炎及其相關(guān)疾病的靶向治療提供新的思路。
本發(fā)明所形成的siRM的靶向輸送策略具有以下特點(diǎn)①特異性一一由 人抗HBsAg單鏈抗體、人抗體輕鏈恒定區(qū)和魚(yú)精蛋白截短體構(gòu)成的ScFv-Ck-tP 融合蛋白同時(shí)抗原結(jié)合活性和核酸結(jié)合活性，siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒與之結(jié) 合后，被特異性地輸送至HBV感染的靶細(xì)胞，而避免了對(duì)正常細(xì)胞的副作用。 ②高效性一一siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒與ScFv-Ck-tP融合蛋白結(jié)合后，在抗 體的引導(dǎo)下到達(dá)靶部位，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)化途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)吞體，并被釋 放到細(xì)胞漿中，進(jìn)入RNAi通路，從而高效的發(fā)揮抑制作用，由于有了抗體的 引導(dǎo)，在低濃度siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒的情況下，也可以實(shí)現(xiàn)特異性輸送。 另外，我們所構(gòu)建的ScFv-Ck-tP融合蛋白對(duì)siRNA的靶向輸送效率達(dá)到了 55%，優(yōu)于目前報(bào)道的結(jié)果。③持續(xù)性一一ScFv-Ck-tP融合蛋白中tP帶有正 電荷，與siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒結(jié)合后可以保護(hù)它們避免被核酸酶降解，
從而提高它們的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了在血液循環(huán)系統(tǒng)中的存留時(shí)間，也就延長(zhǎng)了 siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒的干涉效果。④安全性一一由于構(gòu)建的融合蛋白中的 抗HBsAg單鏈抗體、輕鏈恒定區(qū)及魚(yú)精蛋白截短體均為人源性蛋白，不會(huì)引 起體內(nèi)的強(qiáng)烈排異；由靶向輸送的針對(duì)HBV的siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒將在 不損傷肝細(xì)胞的情況下持續(xù)高效地抑制HBV的基因表達(dá)和復(fù)制，而并不引起 炎癥反應(yīng)，所以治療的毒副作用較小。
本發(fā)明可望為HBV感染及相關(guān)疾病的靶向干涉提供一種新的手段。
圖1為ScFv-tP和Ck基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖。圖中 1代表DL2000標(biāo)記物；2、 3代表ScFv-tP基因PCR產(chǎn)物；4代表Ck的PCR產(chǎn)物。
圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a/ScFv-tP和pET28a/ScFv-Ck-tP的酶切鑒 定結(jié)果圖。
圖3為ScFv ， ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白的表達(dá)及純化的SDS-PAGE 分析圖。
圖4為間接ELISA檢測(cè)ScFv、 ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白的抗原結(jié)
合活性分析結(jié)果圖。
圖5為間接免疫熒光檢測(cè)ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白的內(nèi)化情況圖 (x 400 )。
圖6為共聚焦顯微鏡檢測(cè)驗(yàn)證ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋 白的共定位圖(x 660 )。
圖7為遷移阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白與質(zhì)粒DNA 的結(jié)合圖。
圖8為遷移阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白與DNA片段的 結(jié)合圖。
圖9為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白對(duì)siRNA的靶向
輸送圖。
圖10為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ScFv-Ck-tP融合蛋白對(duì)siRNA表達(dá)框或質(zhì)粒的 靶向輸送圖。
圖11為ScFv-Ck-tP輸送的siRNA， siRNA表達(dá)框及siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì) HepG2. 2. 15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用圖。
圖12為ScFv-Ck-tP輸送的siRNA, siRNA表達(dá)框及siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì) H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用圖。
圖13為ScFv-Ck-tP輸送的siRNA， siRNA表達(dá)框及siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì) H印G2. 2. 15細(xì)胞上清中HBV DNA的抑制圖。
圖14為SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)證實(shí)ScFv-Ck-tP輸送的siRNA, siRNA表達(dá)框及siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞中HBsAg表達(dá)的抑制圖。
圖15為肝腎組織切片的熒光顯微鏡觀察ScFv-Ck-tP在體內(nèi)對(duì)siRNA的 靶向輸送圖。
圖16為Northern blot檢測(cè)ScFv-Ck-tP輸送的siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì) 粒對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織內(nèi)HBV mRNA水平的抑制圖。
圖17為ScFv-Ck-tP輸送的siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒抑制轉(zhuǎn)基因小鼠血 清中HBsAg水平圖。
圖18為免疫組化染色檢測(cè)ScFv-Ck-tP輸送的siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒 對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中HBsAg表達(dá)的抑制圖。
圖19為用ScFv-Ck-tP輸送siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠血清 中ALT水平的影響圖。
具體實(shí)施例方式
1. ScFv-Ck-tP重組基因的構(gòu)建、表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的活性鑒定
本發(fā)明構(gòu)建的ScFv-Ck-tP基因包括三個(gè)部分，分別為抗HBV感染細(xì)胞表
面HBsAg抗原的單鏈抗體(ScFv15)、人抗體輕鏈恒定區(qū)和具有核酸結(jié)合活性
的人魚(yú)精蛋白截短體的編碼序列。 (1)引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)已知的單鏈抗體ScFv 15的序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物，引物序列為
SP5 : 5 , -TTTGAATTCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3 ， ； SP3 : 5 ， —TGTCTC
TGGCGGTAATATCTGCTCCGGCTCTGGCTGCGCTCGAGTCGATTGATTTCCACCTTGG-3
SP3L : 5 ' -TTTGCGGCCGCGCTCCGCCTCCTTCGTCTGCGA
CTTCTTTGTCTCTGGCGGTAATATCTG-3，。在3，端引物中引入了人的魚(yú)精蛋白截 短體的編碼序列(即其中橫線標(biāo)出的部分)，同時(shí)在兩端引物中分別引入&dl I與vVWl的酶切位點(diǎn)，在3，端引物中同時(shí)引入了一個(gè)的酶切位點(diǎn)(三 個(gè)酶切位點(diǎn)即其中框出的部分)，擴(kuò)增后該位點(diǎn)位于單鏈抗體和魚(yú)精蛋白截短 體的編碼序列之間，以便于輕鏈恒定區(qū)序列的插入；擴(kuò)增輕鏈恒定區(qū)的弓
序列為Ck5: 5 ' -TTTCTCGAGACTGTGGCTGCACCATCTGT-3 ' ， Ck3: 5 ，
-TTT|CTCGAG|TCTAGACTAACACTCTCC CCTGTTGA-3'，在兩端引物中均引入J力o I
的酶切位點(diǎn)(即其中框出的部分)。 (2) ScFv-Ck-tP基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
在前期抗體庫(kù)的構(gòu)建所使用的質(zhì)粒為pComb3H,我們以含有所選用Fab 抗體序列的質(zhì)粒pComb3H-Fab15為模板，以Ck5和Ck3為引物擴(kuò)增Ck片斷， 克隆入pUC19質(zhì)粒，并進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pUC19-Ck。以 質(zhì)粒pEGFP-N3-ScFvl5為模板，以SP5和SP3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再以純 化的擴(kuò)增片段為模板，以SP5和SP3L為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化第二輪擴(kuò)增 產(chǎn)物，然后用I和#W I雙酶切，連接入表達(dá)載體pET-28a中，并進(jìn)行 酶切鑒定和序列測(cè)定。鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET28a/ScFv-tP,將pUC19-Ck 質(zhì)粒用X力o I酶切后，電泳回收小片斷并連入經(jīng)Xho I酶切并純化的
pET28a/ScFv-tP質(zhì)粒，構(gòu)建pET28a/ScFv-Ck-tP質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定。 ScFv-tP基因及所編碼的蛋白在實(shí)驗(yàn)中作為一種對(duì)照。附圖1， 2提供了 ScFv-tP、 Ck的PCR擴(kuò)增結(jié)果及pET28a/ScFv-tP和pET28a/ScFv-Ck-tP質(zhì)粒 的酶切鑒定結(jié)果。
(3) ScFv-Ck-tP重組基因的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET28a/ScFv 、 pET28a/ScFv-tP和 pET28a/ScFv-Ck-tP分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,挑取單克隆接種于含有卡那霉 素的LB培養(yǎng)基中，3rC過(guò)夜培養(yǎng)，次日以1 : 100接種，3rC培養(yǎng)至A副nm 達(dá)0. 6左右時(shí)，按照確定的最佳誘導(dǎo)條件(IPTG終濃度0. 1 m mol/L,誘導(dǎo) 時(shí)間為3h)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物加以純化，純化前后的蛋白樣品 SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)附圖3。
(4 ) ScFv-Ck-tP融合蛋白的抗原結(jié)合活性及內(nèi)化活性分析
I. 間接ELISA檢測(cè)抗原結(jié)合活性
用間接ELISA方法檢測(cè)ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白的抗原結(jié)合活 性，用ScFvl5作為對(duì)照，結(jié)果提示隨著稀釋度的增加，ScFv-tP和ScFv-Ck-tP 融合蛋白與HBsAg抗原的結(jié)合降低，提示它們都具有HBsAg結(jié)合活性，且與 ScFv相比，ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白與HBsAg的結(jié)合活性無(wú)明顯差別 (附圖4)。提示Ck和tP的融合不影響ScFv的抗原結(jié)合活性。
II. 間接免疫熒光染色分析內(nèi)化活性
將ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白分別與HBsAg陽(yáng)性的H印G2. 2. 15細(xì) 胞或HBsAg陰性的HeLa細(xì)胞孵育后，進(jìn)行間接免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀 察發(fā)現(xiàn)它們均可以?xún)?nèi)化入HBsAg陽(yáng)性細(xì)胞，而都不能內(nèi)化入HBsAg陰性的HeLa 細(xì)胞(附圖5)。利用共聚焦顯微鏡進(jìn)行共定位分析，發(fā)現(xiàn)ScFv-tP和 ScFv-Ck-tP融合蛋白均與Texas Red標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白存在共定位現(xiàn)象，因此 ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白均保持了良好的內(nèi)化活性，并且其內(nèi)化是通 過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑實(shí)現(xiàn)的(附圖6)。 (5 ) ScFv-Ck-tP融合蛋白的DNA結(jié)合活性檢測(cè)
I.質(zhì)粒的遷移阻滯實(shí)驗(yàn)
各取1 ju g質(zhì)粒，分別與lmg,4iig，10pg純化的ScFv-tP和ScFv-Ck-tP
融合蛋白于0. 2mol/L NaCl溶液中室溫孵育30min后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電 泳分析發(fā)現(xiàn)ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白都可以抑制質(zhì)粒DNA的遷移(附 圖7)。
II. DNA片斷的凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)
將10ng同位素標(biāo)記的DNA探針?lè)謩e與ljag, 4jig， 10 ju gScFv-tP或 ScFv-Ck-tP融合蛋白孵育后，非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳分離后，制備干膠， 壓X光片放射性自顯影，結(jié)果提示ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白均可以 使DNA片段的遷移速度變慢，并且隨著蛋白含量的增加，DNA片段的遷移明 顯滯后，而單獨(dú)用ScFv與DNA片段孵育卻不影響DM片段的遷移(附圖8 )。 這兩項(xiàng)結(jié)果提示ScFv-Ck-tP融合蛋白都具有DNA結(jié)合活性，并且其結(jié)合 活性?xún)?yōu)于ScFv-tP。
2. 利用ScFv-Ck-tP融合蛋白可以在細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)siRNA的靶向輸送 (1) ScFv-Ck-tP融合蛋白對(duì)siRNA的靶向輸送
取5 jug FITC-siRNA分別與5jug純化的ScFv-tP或ScFv-Ck-tP融合蛋白在 0. 2mol/L NaCl溶液中室溫孵育30min后，加入六孔板中培養(yǎng)的HepG2. 2. 15或 HeLa細(xì)胞，24h后消化細(xì)胞，洗滌并固定后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ScFv-Ck-tP融合蛋白可以能將FITC-siRNA特異性地?cái)y帶入HepG2.2. 15細(xì)胞， 其FITC陽(yáng)性細(xì)胞率分別達(dá)到55。/。，其輸送效率比ScFv-tP (45%)更高一些(附
圖9),因此被選擇用于后續(xù)的靶向抑制實(shí)驗(yàn)。 (2 ) ScFv-Ck-tP融合蛋白對(duì)siRNA表達(dá)組件和質(zhì)粒的乾向輸送
取5 jug FITC-SECs或pEGFP-N3分別與5 |i g ScFv-Ck-tP融合蛋白在 0. 2mol/LNaCl溶液中室溫孵育30min后，加入培養(yǎng)于六孔板中的HepG2. 2. 15 或HeLa細(xì)胞，24h后消化細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ScFv-Ck-tP 融合蛋白可以能將FITC-SECs或pEGFP-N3特異性地?cái)y帶入H印G2. 2. 15細(xì)胞， 其FITC/EGFP陽(yáng)性細(xì)胞率分別為38%和15°/。，但和FITC-siRNA相比， ScFv-Ck-tP融合蛋白對(duì)siRNA表達(dá)組件和質(zhì)粒的輸送效率相對(duì)較低(附圖 10)。
3. ScFv-Ck-tP耙向輸送的針對(duì)HBV的siRNA、 siRNA表達(dá)組件或siRNA表達(dá)質(zhì)粒 可以高效抑制HepG2. 2. 15細(xì)胞中HBV的基因表達(dá)和復(fù)制
根據(jù)前期獲得針對(duì)HBV的最佳干涉序列，化學(xué)合成針對(duì)該序列的siRNA (siRNA-H2),制備相應(yīng)的siRNA表達(dá)組件(SECs-H2)，并利用前期所構(gòu)建的針 對(duì)該序列的質(zhì)粒pSUPER-H2，我們比較了利用ScFv-Ck-tP融合蛋白靶向輸送針 對(duì)HBV的siRNA, siRNA表達(dá)組件及siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)于H印G2. 2. 15細(xì)胞中HBV
基因表達(dá)和復(fù)制的抑制作用。 (1)對(duì)HepG2. 2. 15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制
分別用5 |ig ScFv-Ck-tP融合蛋白與5 jug siRNA-H2、 SECS-H2或pSUPER-H2 的混合物處理后第l、 2、 3、 4天收集HepG2. 2. 15細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測(cè)HBsAg 和HBeAg的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBsAg和HBeAg的分泌在處理后第l天就受到顯著 抑制，其中，siRNA-H2組在前3天的抑制作用較好，但到第4天卻是pSUPER-H2 和SECS-H2組抑制效果更好。提示siRNA的抑制效果出現(xiàn)較快，而siRNA表達(dá) 質(zhì)粒和siRNA表達(dá)組件在后期卻顯示出比siRNA更強(qiáng)的抑制效果(附圖ll, 12 )。
(2 )對(duì)HepG2. 2. 15細(xì)胞上清中HBV DNA的抑制
分別收集上述處理后第l、 2、 3、 4天的H印G2.2. 15細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測(cè)HBV DNA含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未處理的對(duì)照組相比，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均檢測(cè)到HBV DNA 拷貝數(shù)的下降，其中，siRNA的抑制作用出現(xiàn)較快，而siRNA表達(dá)質(zhì)粒和siRNA 表達(dá)組件的抑制作用雖然早期不如s iRNA效果好，但它們的抑制作用更持續(xù) (附圖13)。
(3) SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBsAg的表達(dá)抑制
HepG2.2. 15細(xì)胞經(jīng)過(guò)上述處理后第2天，收集細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE和 Western blot檢測(cè)，SDS-PAGE結(jié)果顯示三個(gè)處理組中HBsAg表達(dá)水平均明 顯下降，而Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了由輸送的針對(duì)HBV的siRNA、 siRNA表達(dá)組件或siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制(附圖14)。 4.利用ScFv-Ck-tP融合蛋白可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)siRNA的靶向輸送
將40 ja g純化的ScFv-Ck-tP融合蛋白與40 m g FITC-siRNA于生理鹽水溶 液中混合，蛋白與siRNA的摩爾比約為l : 6,終體積確定為小鼠體重的1%，室 溫孵育30min后，經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，24h后處死小鼠，取出各組織制作 冰凍切片，并置于熒光顯微鏡下直接觀察。發(fā)現(xiàn)在給予ScFv-Ck-tP融合蛋
白與FITC-siRNA混合物的小鼠肝臟和腎臟內(nèi)(HBsAg陽(yáng)性)可觀察到較強(qiáng)的綠
色熒光，而單獨(dú)注射FITC-siRNA的對(duì)照組小鼠肝腎組織的熒光強(qiáng)度較弱(附
圖15),提示ScFv-Ck-tP融合蛋白可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)siRNA的耙向輸送。
5. ScFv-Ck-tP靶向輸送的針對(duì)HBV的siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)?？梢栽隗w內(nèi)持續(xù)
高效地抑制HBV的基因表達(dá)和復(fù)制
(1) 各治療組的處理、取材及標(biāo)本收集 將40jag純化的ScFv-Ck-tP融合蛋白分別與40iig siRM-H2或pSUPER-H2
在生理鹽水溶液中混合，蛋白與siRNA的摩爾比約為l : 6,終體積確定為小鼠 體重的1%,室溫孵育30min后，經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，水壓轉(zhuǎn)染法單獨(dú)注射 siRNA-H2或pSUPER-H2作為對(duì)照，另外，同時(shí)單獨(dú)給予ScFv-Ck-tP融合蛋白作
為對(duì)照。
各組分別于注射后第l、 4、 7、 ll天選擇兩只小鼠通過(guò)眼球摘除術(shù)處死， 取血，靜置20min后離心，取上清用于HBsAg或HBVDNA的測(cè)定。隨后打開(kāi)腹腔， 各取少量肝臟組織，留作RNA提取及Northern blot檢測(cè)；另取各組織于4%多 聚甲醛中固定24h后，石蠟包埋，常規(guī)制片，做HE或免疫組織化學(xué)染色。
(2) 對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV mRNA水平的抑制 取各組處理后第4天的肝臟組織，提取總RNA，進(jìn)行Northern blot檢測(cè)，
結(jié)果可見(jiàn)未處理組HBV的3. 5kb、 2. 4kb、 2. lkb轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物條帶清晰，而 siRNA-H2組、pSUPER-H2組及它們與ScFv-Ck-tP混合后處理組的相應(yīng)條帶明顯 減弱，表明在這些處理組中HBV RNA得到有效降解，以siRNA-H2+ScFv-Ck-tP 組和pSUPER-H2組抑制效果尤其明顯。而單獨(dú)用ScFv-Ck-tP融合蛋白處理組的 mRNA水平與對(duì)照無(wú)明顯差別(附圖16)。
(3) 對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中HBsAg水平的抑制
各組分別于處理后第l、 4、 7、 ll天選擇兩只小鼠處死，收集血清，測(cè)定 HBsAg水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA-H2組、pSUPER-H2組以及它們與ScFv-Ck-tP混 合后的處理組均檢測(cè)到HBsAg水平的下降，其中以siRNA-H2+ScFv-Ck-tP組、 pSUPER-H2+ScFv-Ck-tP組和pSUPER-H2組效果更明顯；siRNA-H2組早期的抑制 效果也很明顯，但其抑制作用持續(xù)時(shí)間短；在ScFv-Ck-tP處理組也檢測(cè)到 HBsAg水平的下降，這可能是通過(guò)抗體的中和作用實(shí)現(xiàn)的(附圖17)。
(4) 對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)HBsAg表達(dá)的抑制 各組分別于處理后第l、 4、 7、 ll天選擇兩只小鼠處死，取出肝臟組織，
福爾馬林固定后，石蠟包埋，切片經(jīng)脫蠟水化后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)未處理組小鼠肝細(xì)胞漿內(nèi)有大量棕褐色顆粒(HBsAg),而siRNA-H2 組、pSUPER-H2組及它們與ScFv-Ck-tP混合后的處理組的肝組織內(nèi)棕褐色顆 粒明顯減少減弱，其中以siRNA-H2+ScFv-Ck-tP組和pSUPER-H2+ScFv-Ck-tP 組效果更明顯。ScFv-Ck-tP組的肝組織和對(duì)照差別不大，提示單獨(dú)用 ScFv-Ck-tP處理不會(huì)抑制HBsAg的表達(dá)，附圖18提供了處理后第7天的免 疫組化染色結(jié)果。
(5) 治療對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中ALT的影響 取各組不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠血清，測(cè)定ALT水平發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，
siRNA-H2組、pSUPER-H2組治療后血清ALT水平?jīng)]有升高，用ScFv-Ck-tP及它 與siRNA-H2或pSUPER-H2的混合物治療后第l， 4天ALT水平有輕微上升，但到 第7天基本恢復(fù)到正常水平(附圖19)。說(shuō)明體內(nèi)應(yīng)用ScFv-Ck-tP輸送siRNA 或s iRNA表達(dá)質(zhì)粒不會(huì)造成明顯的肝臟損害。
序列表
<110>楊安鋼
<120>人抗HBsAg單鏈抗體/人抗體輕鏈恒定區(qū)/魚(yú)精蛋白截短體重組基 因、編碼蛋白及應(yīng)用
<160> 2
<210> 1 <211〉 1149 <212>腿
<213>人(homo sp.)
<220〉
<221> CDS
<222> (1)... (1149)
<400〉 1
atggaattcg aggtgcagct ggtggagtcg gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc60 ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gctatgccatgagctgggtc120 cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcaggta taagtgctcg tggtggtagc180 acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac240 acgctgtatc tccaaatgaa cagcttgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg300 aaagataggg gcaggatagc agcagctcac tttgactact ggggccaggg aaccctggtc360 accgtctcct caggtggagg cggUcaggc ggaggtggca gcggcggtgg cggatcggga420 attgtgttga cccagtctcc aggcaccctg tctttgtctt caggggaagg agccaccctc480 tcctgcaggg ccagtcagag tgttagcaac ggccaattaa cctggtacca gcagaagcct540 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccagca gggccactgg catcccagac600
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac Ucactctca ccatcagcag actggagcct660 gaagattttg cagtgtatU ctgtcaccag tatgatggct ccccggagac gttcggccaa720 gggaccaagg tggaaatcaa tcgactcgag actgtggctg caccatctgt cttcatcttc780 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac840 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac則 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc960 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat1020 cagggcctga gatcgcccgt cacaaagagc Ucaacaggg gagagtgttc tagactcgag1080 cgcagccaga gccggagcag atattaccgc cagagacaaa gaagtcgcag acgaaggagg1140 cggagctga1149
<210〉 2 <211> 382 <212> PRT
<213>人(homo sp.) <400> 2
Met Glu Phe Glu Val Gin Leu Val
1 5 Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
20
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
35
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly
50
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
65
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
80
15
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
10 15 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
25 30 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly
40 45 lie Ser Ala Arg Gly Gly Ser
55 60 Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg
70 75 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Trp
lie Ala Ala Ala
Thr Val Ser Ser
Phe
Gly
Gly Gly Gly Ser Gly lie Val Leu Thr Gin Ser
Ser Leu Ser Ser Gly Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
Gin Ser Val Ser Asn Gly Gin Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys
Ala Lys Val Gin
Ala 95 His 110 Gly 125 Gly 140 Gly 155 Asn 170 Arg 185 Asp 200 lie 215 Gin 230 Glu 245 Phe 260 Val 275
Trp Lys 290
Asp Tyr Gly Gly
Ser
Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly
Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
Tyr Tyr Cys His Gin Tyr Asp Gly Ser Pro Glu Thr Phe Gly
Gly Thr Lys Val Glu lie Asn Arg Leu Glu Thr Val Ala Ala
Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
Ala 100 Gly 115 Gly 130 Gin 145 Leu 160 Trp 175 Gly 190 Ser 205 Pro 220 Pro 235 Glu 250 Glu 265 Asn 280 Ala 295
Lys
Gin
Gly
Asp Arg Gly Thr Gly Gly Pro Gly
Gly
Leu
Ser
Thr
Ala Ser Ser Arg
Gly Ser Gly Thr
Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly
Arg 105 Val 120 Gly 135 Leu 150 Ser 165 Pro 180 Ala 195 Asp 210 Val 225 Gin 240 Pro 255 Gly 270 Glu 285 Asn 300 Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
305 310 315
Ser Eeu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
320 325 330
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Arg Ser
335 340 345
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Arg Leu Glu
350 355 360
Arg Ser Gin Ser Arg Ser Arg Tyr Tyr Arg Gin Arg Gin Arg Ser
365 370 375
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser
380 38權(quán)利要求
1、由人抗HBsAg的單鏈抗體、人抗體輕鏈恒定區(qū)和魚(yú)精蛋白截短體的編碼序列構(gòu)成的人抗HBsAg單鏈抗體/人抗體輕鏈恒定區(qū)/魚(yú)精蛋白截短體重組基因ScFv-Ck-tP，其具有序列表<400>1的序列。
2、 由權(quán)利要求1的基因編碼的蛋白，其具有序列表〈400〉 2的序列。
3、 如權(quán)利要求1所述的基因在制備抗HBV感染及其相關(guān)疾病的治療藥物中的應(yīng)用。
4、 如權(quán)利要求2所述的蛋白在制備抗HBV感染及其相關(guān)疾病的治療藥物 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人抗HBsAg單鏈抗體/人抗體輕鏈恒定區(qū)/魚(yú)精蛋白截短體重組基因、編碼蛋白及應(yīng)用，該蛋白同時(shí)具有抗原結(jié)合活性和核酸結(jié)合活性，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)針對(duì)HBV的siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒與之結(jié)合后，可以被特異性地輸送到HBV感染細(xì)胞，并且在不損傷肝細(xì)胞的情況下持續(xù)高效地抑制HBV的基因表達(dá)和復(fù)制。本發(fā)明中由ScFv-Ck-tP融合蛋白實(shí)現(xiàn)的siRNA或siRNA表達(dá)質(zhì)粒的靶向輸送具有以下特點(diǎn)高度的特異性、高效性、持續(xù)性和安全性，本發(fā)明可為RNAi用于HBV感染及其相關(guān)疾病的靶向治療提供一種新手段。
文檔編號(hào)A61P1/16GK101100671SQ200710018088
公開(kāi)日2008年1月9日 申請(qǐng)日期2007年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月19日
發(fā)明者劉家云, 孟艷玲, 楊安鋼, 溫偉紅, 濤 王, 許彥鳴, 賈林濤, 晶 趙 申請(qǐng)人:楊安鋼