專利名稱：6－糠氨基嘌呤用于制備治療心肌組織氧化損傷藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物6-糠氨基嘌呤(6-Furfurylaminopurine)的新藥物用途，特別涉及化合物6-糠氨基嘌呤用于制備治療心肌組織氧化損傷藥物的應(yīng)用，根據(jù)申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)研究證明，化合物6-糠氨基嘌呤能夠提高動(dòng)物機(jī)體在氧化損傷狀態(tài)下的抗氧化能力，能夠用于制備治療心肌組織氧化損傷藥物。
背景技術(shù)：
心臟是機(jī)體的“動(dòng)力泵”，它推動(dòng)血液流動(dòng)，向器官、組織提供充足的血流量，以供應(yīng)氧和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并帶走代謝的終產(chǎn)物，使其他器官、組織細(xì)胞維持正常的代謝和功能。體內(nèi)各種內(nèi)分泌激素和一些體液因子，也要通過血液循環(huán)運(yùn)送到靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)機(jī)體的體液調(diào)節(jié)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)恒定。此外，血液防衛(wèi)機(jī)能的實(shí)現(xiàn)，以及體溫相對(duì)恒定的調(diào)節(jié)，也都要依賴血液在血管內(nèi)不斷循環(huán)流動(dòng)，而血液的循環(huán)流動(dòng)是由于心臟“泵”的作用實(shí)現(xiàn)的。
心臟“泵”的生理功能是由心肌細(xì)胞收縮來完成的，心肌細(xì)胞富含線粒體，線粒體是自由基的主要的來源，線粒體的雙層膜和細(xì)胞膜中都含有大量的不飽和脂肪酸，心肌組織的這些特性決定了它易于受到脂質(zhì)過氧化作用的損傷。研究表明，自由基損傷心肌組織所誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可以參與心肌病的發(fā)生心肌病患者體內(nèi)抗氧化酶活性降低，對(duì)自由基清除能力下降，自由基生成大量增多，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，破壞心肌細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)生物大分子，導(dǎo)致心肌收縮能力的降低，從而加速疾病的進(jìn)程。因此，保持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)心肌細(xì)胞收縮功能及心臟實(shí)行其正常生理功能有著至關(guān)重要的意義。
氧化損傷的積累是引起動(dòng)物體衰老及疾病的主要原因。氧的毒性不是由于氧分子本身的反應(yīng)能力，而是由于氧分子還原成水過程中產(chǎn)生的許多中間產(chǎn)物，包括超氧陰離子、過氧化氫分子、羥自由基、氫過氧基、氫過氧化物、烷氧基、烷過氧基和單線態(tài)氧。這些中間產(chǎn)物包括自由基和分子，統(tǒng)稱為活性氧，但習(xí)慣把它們稱為自由基。機(jī)體內(nèi)活性氧自由基主要來源于黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)和線粒體，黃嘌呤氧化酶通常以黃嘌呤脫氫酶形式存在于體內(nèi)，其催化反應(yīng)不形成自由基。但在ATP耗竭或氧化應(yīng)激時(shí)，黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，催化ATP代謝產(chǎn)生的黃嘌呤氧化成尿酸并生成O2-，O2-在水介質(zhì)中反應(yīng)性差，彌散快，很快由酶的岐化作用轉(zhuǎn)化為O2，經(jīng)還原反應(yīng)生成OH-。線粒體呼吸鏈在正常情況下只產(chǎn)生少量氧自由基，線粒體功能受損時(shí)致使大量氧自由基生成，對(duì)機(jī)體造成更嚴(yán)重的損傷。
在正常情況下，心肌組織內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是處于動(dòng)態(tài)平衡的，動(dòng)物體內(nèi)有一套完整的抗氧化酶體系來保護(hù)心肌不受自由基的氧化損傷。但在病態(tài)和衰老的情況下，由于心肌組織內(nèi)抗氧化酶活性的降低，多余的氧自由基不能被及時(shí)、有效清除，使得心肌細(xì)胞受到氧化損傷，尤其是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對(duì)線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)的損傷將會(huì)導(dǎo)致自由基代謝紊亂而產(chǎn)生大量自由基，后者更進(jìn)一步的損傷心肌組織，影響其正常生理功能。
因此，心肌組織氧化損傷是動(dòng)物和人體所面臨的一個(gè)非常常見和嚴(yán)重的損傷，可引起動(dòng)物和人體的衰老和其他疾病的發(fā)生，加重機(jī)體的衰老和病變。目前，市場(chǎng)上抗心肌氧化損傷的藥物少，且不易提取獲得，存在純度不高，有效成分不明確，價(jià)格高等缺點(diǎn)，給應(yīng)用帶來了很大的麻煩。因此，開發(fā)一種來源廣，純度高，成分明確，效果好，安全無毒無害的抗心肌氧化損傷的藥物非常的迫切且具有重大的意義。
6-糠基氨基嘌呤是1956年Mliller在加熱滅菌過的鯡魚精子DNA提取物中發(fā)現(xiàn)的一種具有促進(jìn)細(xì)胞分裂活性的小分子化合物。它是一種非天然的細(xì)胞分裂素，俗稱激動(dòng)素(kinetin，KT)，分子式C10H9N5O。純品為白色固體，熔點(diǎn)是265-266℃，系兩性化合物。易溶于稀鹽酸或稀堿溶液；難溶于水、乙醇、乙醚和丙酮。其6-糠氨基嘌呤的分子結(jié)構(gòu)式如下 6-糠基氨基嘌呤是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有細(xì)胞分裂素作用的物質(zhì)。在植物中，除具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、分化和生長(zhǎng)的作用外，還具有延緩器官衰老，誘導(dǎo)芽分化，增加氣孔開度，誘導(dǎo)愈傷組織長(zhǎng)芽，解除頂端優(yōu)勢(shì)，打破側(cè)芽休眠和促進(jìn)種子發(fā)芽，延緩蛋白質(zhì)和葉綠素的降解作用。目前，6-糠基氨基嘌呤主要用于植物組織培養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞分裂和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，延緩衰老，果蔬保鮮，調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸，促進(jìn)結(jié)實(shí)等方面。
6-糠氨基嘌呤在植物方面的抗氧化和抗衰老的作用是非常明顯的，在動(dòng)物和人體上還沒有嘗試過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供6-糠氨基嘌呤提高動(dòng)物和人體心肌抗氧化能力的新用途，申請(qǐng)人經(jīng)過大量的試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)6-糠氨基嘌呤對(duì)心肌具有抗氧化損傷的作用，證明了6-糠氨基嘌呤在動(dòng)物和人體中同樣具有抗氧化損傷作用，可應(yīng)用于提高心肌抗氧化損傷能力藥物的開發(fā)，也可被應(yīng)用于抗衰老保健品的開發(fā)?？梢杂糜谀壳八袆┬偷拈_發(fā)應(yīng)用，如粉劑、丸劑、片劑、針劑、沖劑、膏劑、納米乳劑、膠囊或口服液等，給藥方式為口服、注射或透皮給藥，用量限定在450mg/kg·b·w以內(nèi)。


圖1是6-糠氨基嘌呤對(duì)衰老小鼠心肌中肌原纖維、Z線和線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響；其中，圖(A)為I組(TEM×15,000)Z線、肌原纖維排列和線粒體都正常。II組(TEM×15,000)Z線變寬、模糊；肌原纖維斷裂、溶解、凝集；線粒體腫脹、空泡化、嵴消失。圖(C)為IV組(TEM×17,000)Z線清晰；肌原纖維排列整齊，溶解、凝集輕微；線粒體腫脹、空泡化減少。圖(D)為IV組(TEM×40,000)Z線、M線清晰；肌原纖維排列整齊；典型肌節(jié)結(jié)構(gòu)。
下面結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的具體試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所述的心肌氧化損傷包括生理性、病理性或藥物性心肌氧化損傷。
所述的生理性心肌氧化損傷是機(jī)體衰老損傷、劇烈運(yùn)動(dòng)損傷或心肌長(zhǎng)期負(fù)荷引起的心肌氧化損傷。
所述的病理性心肌氧化損傷是心肌梗死、心肌缺血-再灌注引起的心肌氧化損傷或糖尿病伴隨自由基氧化損傷的疾病所引起的心肌氧化損傷。
所述的藥物性心肌損傷是由D-半乳糖、過氧化氫、連二亞硫酸鈉、柔紅霉素、阿霉素、鵝膏蕈毒素或異丙腎上腺素直接或間接引起自由基大量產(chǎn)生的化學(xué)藥品引起的心肌氧化損傷。
以下是發(fā)明人給出的具體試驗(yàn)，用于驗(yàn)證6-糠氨基嘌呤能夠用于制備提高心肌抗氧化損傷能力的藥物應(yīng)用。
1材料與方法1.1主要試劑6-糠氨基嘌呤購于廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司，由美國Sanland公司生產(chǎn)；用0.06mol·L-1的鹽酸配制成儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆茫褂们坝?mol·L-1NaOH滴定至近中性。D-gal國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為F20050711，生理鹽水配成5g·L-1溶液，4℃保存?zhèn)溆?。SOD檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為20060322；CAT檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為20060325；GSH-Px檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為20060523；MDA檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為20060320；考馬斯亮蘭蛋白檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為20060323；NO檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為20060325；均購自南京建成生物工程研究所。其余所用試劑均為分析純。
1.2主要儀器H-600透射電子顯微鏡，日本日立公司；UV 1102紫外可見分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；BS224S萬分之一電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HS10268型10～100μl移液器DRAGONMED公司生產(chǎn)。
1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)ICR小鼠(Mus muscculus)，雄性，體重(20.0±2.0)g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)陜動(dòng)證字08-004號(hào)。
1.4動(dòng)物分組及處理將45只小鼠隨機(jī)分為5組，每組9只I組(對(duì)照組)、II組(衰老模型組)、III組～V組(6-糠氨基嘌呤保護(hù)組)。III組～V組每天分別灌胃10mg·kg-1、20mg·kg-1、40mg·kg-1的6-糠氨基嘌呤，并同時(shí)頸背部皮下注射125mg·kg-1D-gal；II組每天灌胃等量的鹽酸，頸背部皮下注射125mg·kg-1的D-gal；I組每天灌胃等量的鹽酸，頸背部皮下注射等量的生理鹽水；連續(xù)處理6周，每周稱重，調(diào)節(jié)給藥劑量。
1.56-糠氨基嘌呤對(duì)衰老小鼠心肌自由基代謝的影響于43d從各組中隨機(jī)抽取4只小鼠處死，取心臟并按質(zhì)量∶體積＝1∶9的比例加入4℃生理鹽水制成10％的組織勻漿，離心取上清待測(cè)。按試劑盒說明書要求，以考馬斯亮蘭法測(cè)定總蛋白含量；黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力；紫外分光法測(cè)定CAT活性；DTNB法測(cè)定GSH-Px活性；TBA法測(cè)定MDA含量；化學(xué)法測(cè)定NO含量。
1.66-糠氨基嘌呤對(duì)衰老小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響于43d處死各組剩余小鼠，取其心肌組織，于冰上快速切成約1mm3的小塊，4％戊二醛4℃下固定，乙醇逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制作電鏡切片，H-600透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
1.7數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)處理使用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件SPLM 3.0(Statistical Program for LinearModeling)進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。
2結(jié)果2.16-糠氨基嘌呤對(duì)衰老小鼠心肌自由基代謝的影響表16-糠氨基嘌呤對(duì)衰老小鼠心肌自由基代謝的影響(n＝4，X±SD)

注同列數(shù)據(jù)后標(biāo)小寫字母的表示差異顯著(P＜0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)，a、A表示與I組比較，b、B示與II組比較，c、C表示與IV組比較，d、D表示與V組比較。
由表1可知與I組(空白對(duì)照組)比較，II組(衰老模型組)小鼠心肌組織的抗氧化酶SOD(73.439±1.712，-21.9％，P＜0.01)、CAT(34.696±4.183，-36.0％，P＜0.01)和GSH-Px(20.380±0.852，-37.0％，P＜0.01)活性極顯著降低；MDA(17.292±2.085，+74.0％，P＜0.01)和NO(12.159±1.425，+165.9％，P＜0.01)含量極顯著升高，這表明D-半乳糖能通過擾亂自由基代謝而消耗心肌內(nèi)抗氧化酶；與II組比較，6-糠氨基嘌呤保護(hù)組中，各項(xiàng)指標(biāo)均有一定改善，以IV組最為明顯SOD+18.8％，P＜0.01；CAT+36.4％，P＜0.01；GSH-Px+37.6％，P＜0.01；MDA-34.7％，P＜0.01；NO-47.1％，P＜0.01；與I組比較SOD、CAT、GSH-Px和NO間差異顯著(P＜0.05)，MDA無顯著性差異，說明20mg·kg-1的6-糠氨基嘌呤能極顯著的提高D-半乳糖致衰老小鼠心肌組織中的抗氧化酶活性，降低自由基含量。
2.26-糠氨基嘌呤對(duì)衰老小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響由圖1-A可知I組肌節(jié)分布均勻，各帶清楚，Z線清晰；肌原纖維排列整齊，走向一致，無肌絲斷裂扭曲；線粒體大小較一致，嵴排列規(guī)則，基質(zhì)均勻，中等電子密度。由圖1-B可知II組Z線增粗扭曲，明暗帶模糊；肌原纖維排列紊亂，部分?jǐn)嗔?，局部肌絲消失；彌漫性線粒體腫大、嵴溶解，部分膜斷裂，基質(zhì)電子密度降低，說明D-半乳糖引起細(xì)胞代謝紊亂而產(chǎn)生的大量自由基對(duì)心肌超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了氧化損傷作用。由圖1-C、1-D可知，與模型組相比，IV組的Z線、M線清晰；肌原纖維排列整齊，溶解、凝集減少；線粒體輕微腫脹、空泡化減少，嵴排列規(guī)則，基質(zhì)中等電子密度；高倍鏡下可見典型肌節(jié)結(jié)構(gòu)。說明20mg·kg-1的6-糠氨基嘌呤能明顯對(duì)抗D-半乳糖引起的自由基對(duì)心肌超微結(jié)構(gòu)的氧化損傷，對(duì)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)起到很好的保護(hù)作用。
3結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6-糠氨基嘌呤對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠心肌組織SOD、CAT和GSH-Px活性降低以及NO和MDA含量升高具有顯著的抑制作用，6-糠氨基嘌呤組各項(xiàng)指標(biāo)同衰老模型組相比差異均極顯著；同時(shí)透射電鏡觀察到6-糠氨基嘌呤能維持心肌細(xì)胞正常超微結(jié)構(gòu)，保護(hù)肌原纖維、肌節(jié)結(jié)構(gòu)和線粒體免受自由基的氧化損傷，維持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。通過該實(shí)驗(yàn)可以證明6-糠氨基嘌呤具有提高小鼠心肌組織抗氧化損傷能力的作用。
權(quán)利要求
1.化合物6-糠氨基嘌呤用于制備治療心肌組織氧化損傷藥物的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的心肌氧化損傷包括生理性、病理性或藥物性心肌氧化損傷。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的生理性心肌氧化損傷是機(jī)體衰老損傷、劇烈運(yùn)動(dòng)損傷或心肌長(zhǎng)期負(fù)荷引起的心肌氧化損傷。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的病理性心肌氧化損傷是心肌梗死、心肌缺血-再灌注引起的心肌氧化損傷或糖尿病伴隨自由基氧化損傷的疾病所引起的心肌氧化損傷。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物性心肌損傷是由D-半乳糖、過氧化氫、連二亞硫酸鈉、柔紅霉素、阿霉素、鵝膏蕈毒素或異丙腎上腺素直接或間接引起自由基大量產(chǎn)生的化學(xué)藥品引起的心肌氧化損傷。
6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的治療心肌氧化損傷藥物為強(qiáng)心藥物、增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力藥物、延緩心肌衰老藥物、術(shù)前保護(hù)藥物或增強(qiáng)心肌抗氧化損傷能力的藥物。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物的給藥方式為口服、注射或透皮給藥，用量限定在450mg/kg·b·w以內(nèi)。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物制成粉劑、丸劑、片劑、針劑、沖劑、膏劑、納米乳劑、膠囊或口服液。
全文摘要
本發(fā)明公開了6－糠氨基嘌呤(6－Furfurylaminopurine)用于制備治療心肌氧化損傷藥物的應(yīng)用。6－糠氨基嘌呤作為外源性嘌呤類物質(zhì)，能提高心肌組織抗氧化酶SOD、CAT和GSH－Px的活性，直接捕獲、清除自由基，阻止或抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞膜、心肌線粒體和細(xì)胞內(nèi)生物大分子的破壞，提高心肌抵抗外源性和內(nèi)源性氧化損傷的能力，從而保護(hù)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，維持心肌的正常生理學(xué)功能。
文檔編號(hào)A61P9/00GK101066272SQ20071001798
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月4日
發(fā)明者歐陽五慶, 楊戈 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)