專利名稱：人源化ctla－4單鏈抗體與人穿孔素通道形成肽p34的重組免疫毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型重組免疫毒素，具體地說涉及基于細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4，CTLA-4)的抗原結(jié)合分子與膜活性毒素的通道形成活性小分子片段，通過基因重組構(gòu)建的融合蛋白hS83-P34。
本發(fā)明還涉及該免疫毒素的核苷酸序列和氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及包含該重組免疫毒素的藥物組合物。
背景技術(shù)：
根據(jù)抗原與抗體，細(xì)胞因子、生長因子和激素與受體等相互識(shí)別原理，將對(duì)細(xì)胞有殺傷作用的分子與抗體等導(dǎo)向分子連接，構(gòu)建成免疫毒素，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向治療。
人源化細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4，CTLA-4)是一種僅表達(dá)于活化T細(xì)胞而靜止T細(xì)胞不表達(dá)的分子，在一些與T細(xì)胞相關(guān)的腫瘤細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn)CTLA-4的表達(dá)(Tazzari PL et al.，The Journalof Immunology，2001，1674222-9)。因此，CTLA-4的抗原結(jié)合分子成為目前理想的導(dǎo)向分子之一，由之產(chǎn)生的免疫毒素只對(duì)活化T細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，避免了對(duì)正常靜息T細(xì)胞的非特異性損傷，不會(huì)使機(jī)體免疫力全面下降。
目前，免疫毒素中的毒素分子大多為細(xì)菌毒素和植物毒素功能片段。目前使用的細(xì)菌毒素包括白喉?xiàng)U菌毒素(Diphtheria Toxin，DT)N端388個(gè)氨基酸、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin，PE)C端334個(gè)氨基酸(KreitmanRJ，Current Opinion in immunology，2001，11570-8)；植物毒素主要是蓖麻毒素A鏈(Ricin A Chain，RTA)，約291個(gè)氨基酸(Vitetta ES，Princess Takamatsu Symp，1988，19333-40)?；谶@些毒素片段的免疫毒素在腫瘤、移植排斥等的治療方面取得了一定效果，其中一種命名為ONTAK的分子，經(jīng)臨床驗(yàn)證后已通過美國FDA(食品與藥品監(jiān)督管理局)批準(zhǔn)上市(Frankel AE et al.，Clinical CancerResearch，2000，6326-34)。但這些毒素存在以下缺點(diǎn)1、毒副作用大這些毒素本身對(duì)正常細(xì)胞有害，往往造成非特異損傷，即便經(jīng)過分子修飾，毒性仍然存在(Onda M.et al.，The Journal of Immunology，2000，1657150-6)；2、作用效率低這些毒素都必須經(jīng)過分子的內(nèi)化，即穿透細(xì)胞膜，輸送至細(xì)胞內(nèi)才能啟動(dòng)一系列酶學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而內(nèi)化步驟往往不高，較大地影響了免疫毒素效用的發(fā)揮(Panchal RG.，Biochemical Phamacology，1998，55247-52)；3、免疫原性強(qiáng)這些毒素的分子量仍很大，有很強(qiáng)的抗原性，易產(chǎn)生抗體。而且人體內(nèi)往往存在病原性細(xì)菌毒素的天然抗體，對(duì)天然毒素和修飾后的毒素都存在一定的中和效應(yīng)，這必然使靶向分子的殺傷效率大大降低(Hall PD.et al.，Clinical Immunology，2001，100191-7)。
4、易產(chǎn)生耐藥性目前殺傷分子主要通過抑制胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的機(jī)制殺滅靶細(xì)胞，容易產(chǎn)生耐藥性。
除上述毒素外，還存在另一類不需內(nèi)化、通過在細(xì)胞膜上形成通道而殺傷細(xì)胞的膜活性毒素，但對(duì)其結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)的不足一直制約著它們的應(yīng)用。隨著研究的發(fā)展，越來越多膜活性毒素的結(jié)構(gòu)和功能已被了解。研究發(fā)現(xiàn)，殺傷性T細(xì)胞用于清除非自身細(xì)胞或病變細(xì)胞的一種通道形成蛋白——穿孔素(Perforin)，僅由N端前34個(gè)氨基酸構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域(簡稱P34)也具有通道形成能力(Ojcius DM.et al.，PNAS，1991，884621-5)。如果選擇人穿孔素的通道形成活性小分子片段則可避免以往毒素帶來的缺點(diǎn)。
中國專利申請(qǐng)98113025.9公開了—種新的免疫毒素，該免疫毒素利用人源性毒素穿孔素(Perforin)的活性片段作為毒素分子，通過基因工程技術(shù)將毒素分子與載體分子的基因重組在大腸桿菌中表達(dá)出來。其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)人體不具有免疫原性，有嚴(yán)格靶向性，可直接激發(fā)細(xì)胞損傷過程，殺滅靶細(xì)胞，不需要內(nèi)化及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。其可用于治療某些腫瘤和自身免疫性疾病，特別是適合用于抑制器官移植時(shí)的免疫排斥反應(yīng)。在該發(fā)明中，與穿孔素的活性片段連接的分子為IL-2的基因片段。
目前，尚沒有相關(guān)文獻(xiàn)涉及基于CTLA-4單鏈抗體和小分子通道形成肽的重組免疫毒素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組免疫毒素，其含有由人源化細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4的抗原結(jié)合分子與人穿孔素的通道形成活性分子P34組成的融合蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該重組免疫毒素的核苷酸序列和氨基酸序列。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供包含該重組免疫毒素的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的重組免疫毒素為一種采用基因工程方法構(gòu)建的重組融合蛋白，由細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4(Cytotoxic T LymphocyteAntigen 4，CTLA-4)的抗原結(jié)合分子與膜活性毒素的通道形成活性小分子片段通過基因重組構(gòu)建。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，該抗原結(jié)合分子為人源化細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4的單鏈抗體，膜活性毒素的通道形成活性小分子片段可以是包括人穿孔素N端前34個(gè)氨基酸組成的通道形成結(jié)構(gòu)域。該重組免疫毒素的構(gòu)建利用人源化細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4的單鏈抗體作為導(dǎo)向片段，人穿孔素N端前34個(gè)氨基酸組成的通道形成結(jié)構(gòu)域作為殺傷片段。
在本發(fā)明中，將本發(fā)明提供的重組免疫毒素蛋白簡稱為hS83-P34；將人源化細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4的單鏈抗體蛋白簡稱為hS83；將人穿孔素N端前34個(gè)氨基酸組成的通道形成結(jié)構(gòu)域蛋白簡稱為P34。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼該重組免疫毒素的核苷酸序列及其氨基酸序列，根據(jù)已知的Anti-CTLA-4-hS83和Perforin序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物，以人源性CTLA-4噬菌體抗體庫中的陽性克隆Anti-CTLA-4-hS83為模板，分別擴(kuò)增編碼hS83基因的導(dǎo)向片段基因和編碼P34基因的殺傷片段基因，并引入限制性內(nèi)切酶(HindIII)酶切位點(diǎn)，將制備的編碼hS83基因和編碼P34基因連接，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列并編碼SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。將連接后的基因克隆進(jìn)入質(zhì)粒pQE30，篩選獲得含有編碼hS83-P34基因的質(zhì)粒載體pQE30-hS83-P34，再將獲得的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物即為本發(fā)明的重組免疫毒素。
本發(fā)明中使用的質(zhì)粒載體pQE30中含有一段Met Arg Gly Ser His His HisHis His His Gly Ser Ala Cys Glu Leu氨基酸序列，相應(yīng)地通過本發(fā)明構(gòu)建的含融合基因的載體pQE30-hS83-P34所表達(dá)的蛋白中也含有這段氨基酸序列，如SEQ ID NO.3所示。Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys GluLeu序列的引入，一方面可以使所述重組免疫毒素因?yàn)楦淖兞溯d體而高表達(dá)，另一方面也有利于純化和檢測。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該組合物包含治療有效量的上述重組免疫毒素，以及藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)制備的新型重組免疫毒素對(duì)以CTLA-4表達(dá)為特征的活化T細(xì)胞及白血病細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，可用于預(yù)防和/或治療移植排斥，以及治療某些T細(xì)胞淋巴瘤疾病。
本發(fā)明優(yōu)于傳統(tǒng)免疫毒素之處在于1、本發(fā)明使用的毒素是人體固有蛋白，毒性小，且不會(huì)受到預(yù)存抗體的中和，效價(jià)高；2、傳統(tǒng)毒素必經(jīng)的內(nèi)化過程效率低，本發(fā)明所用毒素只需插入細(xì)胞膜就起作用，不需分子內(nèi)化，因而效率高；3、本發(fā)明中所用毒素為34個(gè)氨基酸，為傳統(tǒng)毒素的1/10，抗原性弱；4、本發(fā)明使用的毒素為新型作用機(jī)制，其通過在細(xì)胞膜上形成通道導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄露而死亡，細(xì)胞不容易通過改變細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層組成和結(jié)構(gòu)來產(chǎn)生耐藥性。
經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的重組免疫毒素對(duì)以CTLA-4表達(dá)為特征的活化T細(xì)胞及白血病細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性。
為了更好地理解本發(fā)明的本質(zhì)，下面結(jié)合附圖，通過對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述，詳細(xì)說明但不限制本發(fā)明。
附圖的簡要說明

圖1為pQE30-hS83-P34質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖；圖2為本發(fā)明的hS83-P34制備過程中各PCR產(chǎn)物和克隆質(zhì)粒的酶切圖譜；圖中M、DL2000；1、hS83fPCR；2、pBS-hS83f；3、pBS-hS83f，SacI/HindIII雙酶切；4、P34PCR；5、pBS-P34HS；6、pBS-P34HS，HindIII/SalI雙酶切；7、pQE30-hS83-P34；8、pQE30-hS83-P34SacI/SalI雙酶切；9、pQE30-hS83-P34SacI/PstI雙酶切圖3為hS83-P34蛋白SDS-PAGE電泳和Western印跡圖；A SDS-PAGE M、marker；1、hS83-P34誘導(dǎo)前；2、hS83-P34誘導(dǎo)后；3、hS83-P34破菌上清；4、hS83-P34破菌沉淀B western 1、hS83-P34誘導(dǎo)前；2、hS83-P34誘導(dǎo)后；3、hS83-P34破菌上清；4、hS83-P34破菌沉淀圖4為對(duì)照分子hS83制備過程中各PCR產(chǎn)物和克隆質(zhì)粒的酶切圖譜；圖中M、DL2000；1、hS83PCR；2、pBS-hS83；3、pBS-hS83SacI/SalI雙酶切；4、pQE30-hS83；5、pQE30-hS83SacI/SalI雙酶切；6、pQE30-hS83SacI/PstI雙酶切；圖5為hS83-P34蛋白對(duì)活化T和非活化T細(xì)胞殺傷作用的比較；圖6為hS83-P34蛋白對(duì)抗原陽性和陰性細(xì)胞殺傷作用的比較；圖7為不同濃度hS83-P34蛋白對(duì)相同數(shù)量活化T細(xì)胞作用的比較；圖8為不同濃度hS83-P34蛋白對(duì)相同數(shù)量6T-CEM作用的比較；圖9為不同濃度hS83-P34蛋白對(duì)相同數(shù)量Raji作用的比較；圖10為相同濃度hS83-P34對(duì)不同量活化T細(xì)胞的作用；圖11為相同濃度hS83-P34對(duì)不同量白血病細(xì)胞的作用；圖12為hS83-P34對(duì)活化T細(xì)胞的作用時(shí)效曲線；圖13為hS83-P34對(duì)CEM和Raji的作用時(shí)效曲線。
發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所用的試驗(yàn)材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品。
重組免疫毒素hS83-P34的獲得實(shí)施例11、導(dǎo)向片段基因的克隆擴(kuò)增的模板為裝載了Anti-CTLA-4-hS83基因的pCANTAB 5E質(zhì)粒(GE公司)，也可以按照Pistillo等描述的方法制備擴(kuò)增模板(Pistillo MP et al，Molecular characterization and applications of recombinant scFv Abs to CTLA-4co-stimulatory molecule.Tissue Antigens，2000，55229-38)。
根據(jù)Anti-CTLA-4-hS83的基因序列設(shè)計(jì)引物P1 5’-CAGTGAGCTCATGGCCGAGGTGCAGCTGG-3’
P2 5’-AGTCAAGCTTACCTAGGACGGTCAGCTTGG-3’用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件如下94℃10min后，94℃45sec，50℃1min，68℃2min，共30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增獲得了約750bp的導(dǎo)向片段基因，并引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)小量膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司提供)純化后，以SacI/HindIII雙酶切，然后克隆于pBlueselect(BBI公司)。用SacI/HindIII雙酶切鑒定，鑒定的陽性克隆再測序(Gene Tech(上海)有限公司，LI-COR 4300系統(tǒng))驗(yàn)證，測序正確的質(zhì)粒命名為pBS-hS83f。
2、殺傷片段基因的克隆以質(zhì)粒pGT60-hPFN(InvivoGen，USA)為模板，根據(jù)人穿孔素(perforin)的N端前34個(gè)氨基酸(序列如SEQ ID NO.6所示)的基因序列設(shè)計(jì)引物P3 5’-AGTCAAGCTTCCGTGCCACACAGCCGCACGCTCAGA-3’P4 5’-CACTGTCGACTCAGCGGCGGAGGCTGGT-3’用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件如下94℃10min后，94℃45sec，50℃1min，68℃2min，共30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增獲得了約120bp的殺傷片段基因，并引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)小量膠回收試劑盒純化后，以HindIII/SalI雙酶切，然后克隆于pBlueselect。用HindIII/SalI雙酶切鑒定，鑒定的陽性克隆再測序驗(yàn)證，測序正確的質(zhì)粒命名為pBS-P34HS。
3、重組免疫毒素HS83-P34表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)以SacI/HindIII雙酶切pBS-hS83f，回收約750bp的DNA片段，然后連接到經(jīng)同樣酶切的pBS-P34HS中，SacI/SalI雙酶切鑒定的陽性克隆命名為pBS-hS83-P34。
用SacI/SalI雙酶切pBS-hS83-P34，回收約870bp的DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。再克隆到pQE30(QIAGEN公司)，SacI/SalI以及SacI/PstI雙酶切鑒定的陽性克隆命名為pQE30-hS83-P34，其質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖見圖1。
上述PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒陽性克隆的酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。
提取pQE30-hS83-P34質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株大腸桿菌M15(QIAGEN公司)中，表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQ ID NO.3。挑取單菌落，接種后過夜培養(yǎng)。次日按1∶100轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)至OD550約為0.5時(shí)，加IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至終濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)5h。SDS-PAGE和western分析，結(jié)果見圖3，可見經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了高表達(dá)，表達(dá)量約占總菌量的30％(通過Quantity One軟件分析)。
4℃下8000rpm離心10min收獲細(xì)菌。用50mM Tris-HCl按10ml/g重懸菌體，以功率300W、工作2秒、間隙2秒、總時(shí)間3分鐘為一循環(huán)，共6次進(jìn)行超聲破碎。8000g，30分鐘離心，上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE和western，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物主要以不溶性包涵體存在。
4、重組免疫毒素hS83-P34的分離純化和復(fù)性將包涵體先用2mol/L尿素(溶于50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含2％TritonX-100及1mmol/L EDTA)緩沖液洗滌(30℃，1小時(shí))，然后5000g，30分鐘離心，重復(fù)該操作1次；再用Tris-HCl緩沖液重懸沉淀，5000g，30分鐘離心洗滌共兩次。然后用變性液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/Lβ-巰基乙醇)按約12ml/g 4℃過夜溶解包涵體。
變性蛋白經(jīng)金屬鰲和親和介質(zhì)Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmacia公司)結(jié)合后，用清洗緩沖液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/Lβ-巰基乙醇，20mmol/L咪唑)除去非特異性結(jié)合的蛋白，用洗脫緩沖液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/Lβ-巰基乙醇，250mmol/L咪唑)洗脫，可獲得除去了大部分雜質(zhì)的蛋白。然后用DEAE-Sephedex Fast Flow(Pharmacia公司)進(jìn)一步純化，該介質(zhì)可吸附雜蛋白，在穿透峰中獲得的即是純度大于90％的重組免疫毒素hS83-P34。
純化后的蛋白用復(fù)性緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含0.15mmol/LNaCl，及1mmol/L氧化型谷胱甘肽3mmol/L還原型谷胱甘肽，0.01％SDS)透析48h，即獲得復(fù)性蛋白。再用緩沖液(含50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含0.15mmol/L NaCl)進(jìn)行透析過夜，再用PBS(20mmol/L，pH 7.4，0.9％NaCl)透析，使蛋白處于PBS體系，即可進(jìn)行功能測定。
對(duì)照分子hS83的制備實(shí)施例21、hS83基因的克隆以Anti-CTLA-4-hS83質(zhì)粒為模板，根據(jù)其基因序列設(shè)計(jì)引物P5 5’-CAGTGAGCTCATGGCCGAGGTGCAGCTGG-3’P6 5’-CAGTGTCGACTCAACCTAGGACGGTCAGCTTGG-3’用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶進(jìn)行PCR，PCR條件如下94℃10min后，94℃ 45sec，50℃ 1min，68℃ 2min，共30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增獲得了約750bp的導(dǎo)向片段基因，并引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)小量膠回收試劑盒純化后，以SacI/SalI雙酶切，然后克隆于pBlueselect。用SacI/SalI雙酶切鑒定，鑒定的陽性克隆再測序驗(yàn)證，測序正確的質(zhì)粒命名為pBS-hS83。酶切圖譜見圖4。
2、hS83表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)以SacI/SalI雙酶切pBS-hS83，回收約750bp的DNA片段，然后克隆到pQE30，SacI/SalI以及SacI/PstI雙酶切鑒定的陽性克隆命名為pQE30-hS83。
提取pQE30-hS83質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株大腸桿菌M15中，其表達(dá)產(chǎn)物的DNA序列如SEQ ID NO.4，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.5。
挑取單菌落，接種后過夜培養(yǎng)。次日按1∶100轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)至OD550約為0.5時(shí)，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)5h。SDS-PAGE和western分析，可見經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了高表達(dá)，表達(dá)量約占總菌量的50％。
4℃下8000rpm離心10min收獲細(xì)菌。用50mM Tris-HCl按10ml/g重懸菌體，以功率300W、工作2秒、間隙2秒、總時(shí)間3分鐘為一循環(huán)，共6次進(jìn)行超聲破碎。8000g，30分鐘離心，上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE和western，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物主要以不溶性包涵體存在。
將包涵體先用2mol/L尿素(溶于50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含2％TritonX-100及1mM EDTA)緩沖液洗滌(30℃，1小時(shí))，然后5000g，30分鐘離心，重復(fù)該操作1次；再用Tris-HCl緩沖液重懸沉淀，5000g，30分鐘離心洗滌共兩次。然后用變性液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，10mMDTT)按約12ml/g 4℃過夜溶解包涵體。
變性蛋白經(jīng)金屬鰲和親和介質(zhì)Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmacia公司)結(jié)合后，用清洗緩沖液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/Lβ-巰基乙醇，20mmol/L咪唑)除去非特異性結(jié)合的蛋白，用洗脫緩沖液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/Lβ-巰基乙醇，250mmol/L咪唑)洗脫，可獲得除去了大部分雜質(zhì)的蛋白。然后用DEAE-Sephedex Fast Flow(Pharmacia公司)進(jìn)一步純化，該介質(zhì)可吸附雜蛋白，在穿透峰中獲得的即是純度大于90％的hS83。
純化后的蛋白用復(fù)性緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含0.15mmol/LNaCl，及1mmol/L氧化型谷胱甘肽，3mmol/L還原型谷胱甘肽，0.01％SDS)透析48h，即獲得復(fù)性蛋白。再用buffer(含50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含0.15mmol/L NaCl)進(jìn)行透析過夜，再用PBS(20mmol/L，pH7.4，0.9％NaCl)透析，使蛋白處于PBS體系，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
重組免疫毒素的體外功能檢測實(shí)施例3在下述試驗(yàn)中所用的細(xì)胞株均購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，它們的產(chǎn)品編號(hào)和全稱如下Raji編號(hào)TcHu44，人Burkitt’s淋巴瘤的瘤細(xì)胞株；6T-CEM編號(hào)TcHu2，人T細(xì)胞白血病細(xì)胞株；(上述兩種細(xì)胞株均組成型表達(dá)CTLA-4。)ECV-304編號(hào)GNHu3，正常人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
一、細(xì)胞殺傷特異性分析1、對(duì)活化與非活化T細(xì)胞殺傷作用的比較收集活化的T細(xì)胞(Ta)、非活化T細(xì)胞(To)，按1.5×105/孔接種于96孔板，再加入hS83-P34，終濃度為1.5μmol/L，24小時(shí)后，MTS法490nm測定存活細(xì)胞的量，以hS83為對(duì)照。以PBS空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率作為100％計(jì)算基準(zhǔn)，分析hS83-P34對(duì)不同細(xì)胞的影響。
結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，1.5μmol/L hS83-P34對(duì)活化T細(xì)胞作用，細(xì)胞存活率僅約為33％；而對(duì)非活化T細(xì)胞作用，細(xì)胞存活率約為83％。hS83對(duì)活化與非活化T細(xì)胞作用后，細(xì)胞存活率均為80％左右。以上結(jié)果說明，hS83-P34對(duì)活化后表達(dá)CTLA-4抗原的T細(xì)胞有顯著的特異性殺傷作用。
2、對(duì)抗原陽性和陰性細(xì)胞殺傷作用的比較抗原陽性細(xì)胞6T-CEM、Raji按3×104/孔，陰性細(xì)胞ECV304按1×104/孔接種于96孔板，再加入hS83-P34，終濃度為1.5μmol/L，24小時(shí)后，MTS法490nm測定存活細(xì)胞的量，以hS83為對(duì)照。以PBS空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率作為100％計(jì)算基準(zhǔn)，分析hS83-P34對(duì)不同細(xì)胞的影響。
結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，1.5μmol/L hS83-P34對(duì)抗原陽性細(xì)胞6T-CEM、Raji作用后，細(xì)胞存活率僅為30％左右；而對(duì)陰性細(xì)胞作用時(shí)，細(xì)胞存活率約為89％；hS83對(duì)抗原陽性和陰性細(xì)胞作用后，細(xì)胞存活率均為85％以上。
以上結(jié)果說明，hS83-P34對(duì)活化后表達(dá)CTLA-4的細(xì)胞株有顯著的特異性殺傷作用。
二、殺傷效果1、量效關(guān)系1.1不同濃度hS83-P34對(duì)相同數(shù)量靶細(xì)胞的作用情況1.1.1對(duì)活化T細(xì)胞的作用收集Con A(伴刀豆球蛋白A，Sigma公司)活化的T細(xì)胞，按1.5×105/孔接種于96孔板，再與不同濃度的hS83-P34作用，24小時(shí)后，MTS法490nm測定存活細(xì)胞的量，以hS83為對(duì)照。以PBS空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率作為100％計(jì)算基準(zhǔn)，分析不同濃度的hS83-P34對(duì)細(xì)胞的影響。
結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，hS83-P34對(duì)活化T細(xì)胞作用后，細(xì)胞存活率顯著下降，當(dāng)hS83-P34為0.2μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降低至約50％，當(dāng)hS83-P34進(jìn)一步增加到1.5μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率僅約10％。
1.1.2對(duì)白血病細(xì)胞株的作用收集6T-CEM、Raji細(xì)胞，按3×104/孔接種于96孔板，再與不同濃度的hS83-P34作用，24小時(shí)后，MTS法490nm測定存活細(xì)胞的量，以hS83為對(duì)照。以PBS(磷酸鹽緩沖液)空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率作為100％計(jì)算基準(zhǔn)，分析不同濃度的hS83-P34對(duì)白血病細(xì)胞的影響。
結(jié)果見圖8和圖9。結(jié)果表明hS83-P34對(duì)6T-CEM、Raji作用后，細(xì)胞存活率均有明顯的降低。對(duì)6T-CEM，隨著hS83-P34濃度的增加，細(xì)胞存活率相應(yīng)降低，當(dāng)hS83-P34為1.5μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降低至45.38％，當(dāng)hS83-P34進(jìn)一步增加到2.5μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降低至29.21％。相同濃度的hS83對(duì)照組細(xì)胞存活率也有降低，但降低幅度明顯低于實(shí)驗(yàn)組。對(duì)Raji也顯示了相似的結(jié)果，當(dāng)hS83-P34為1.0μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降低至42.9％，當(dāng)hS83-P34進(jìn)一步增加到2.5μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降低至17.52％。
以上結(jié)果說明，在細(xì)胞量為3×104/孔時(shí)，hS83-P34對(duì)6T-CEM、Raji具有明顯的殺傷作用；hS83-P34濃度在1.0μmol/L左右，即可達(dá)到50％的殺傷效果。
1.2同一濃度hS83-P34對(duì)不同數(shù)量細(xì)胞的作用情況。
1.2.1對(duì)活化T細(xì)胞的作用收集Con A活化的T細(xì)胞，按1×105/孔、2×105/孔、3×105/孔、4×105/孔、5×105/孔和6×105/孔的細(xì)胞量接種于96孔板，再加入20μl的hS83-P34，終濃度為1.0μmol/L，24小時(shí)后，MTS法490nm測定存活細(xì)胞的量。以PBS空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率作為100％計(jì)算基準(zhǔn)，分析hS83-P34對(duì)不同數(shù)量細(xì)胞的影響。
結(jié)果見圖10。結(jié)果表明，隨著細(xì)胞量的增加，細(xì)胞存活率逐漸增加。當(dāng)細(xì)胞量為1×105時(shí)，細(xì)胞存活率約為40％；細(xì)胞量增加到4×105～6×105時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)71％～73％左右。
1.2.2對(duì)白血病細(xì)胞株的作用收集6T-CEM、Raji細(xì)胞，按1×104/孔、3×104/孔、5×104/孔、7×104/孔、9×104/孔、12×104/孔和15×104/孔的細(xì)胞量接種于96孔板，體積為180μl，再加入20μl的hS83-P34，終濃度為1.5μmol/L，24小時(shí)后，MTS法490nm測定存活細(xì)胞的量。以PBS空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率作為100％計(jì)算基準(zhǔn)，分析hS83-P34對(duì)不同數(shù)量細(xì)胞的影響。
結(jié)果見圖11。結(jié)果表明，隨著細(xì)胞量的增加，細(xì)胞存活率逐漸增加。當(dāng)細(xì)胞量為1×104時(shí)，細(xì)胞全部死亡；細(xì)胞量為9×104時(shí)，細(xì)胞存活率約為51％；細(xì)胞量增加到15×104時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到約75％。
2、時(shí)效關(guān)系一定濃度hS83-P34對(duì)一定數(shù)量細(xì)胞作用不同時(shí)間的情況。
2.1對(duì)活化T細(xì)胞的作用收集Con A活化的T細(xì)胞，按1.5×105/孔接種于96孔板，再加入20μl的hS83-P34，終濃度為1.0μmol/L，分別在4、8、12、18、24、36、48、72小時(shí)用MTS法490nm測定存活細(xì)胞的量，以hS83為對(duì)照。以PBS空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率作為100％計(jì)算基準(zhǔn)，分析不同濃度的hS83-P34對(duì)細(xì)胞的影響。
結(jié)果見圖12。結(jié)果顯示，在蛋白作用的前8hr，細(xì)胞存活率在86％以上；隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞的存活率降低，在18hr時(shí)達(dá)最低，細(xì)胞存活率約為41％；繼續(xù)延長作用時(shí)間，在18～36hr，細(xì)胞存活率未見明顯變化，在50％左右；36hr以后，細(xì)胞存活率有所升高；72hr時(shí)檢測，細(xì)胞存活率達(dá)到約63％。
該結(jié)果提示，hS83-P34對(duì)細(xì)胞的殺傷作用發(fā)生較早，在12～24小時(shí)；之后，hS83-P34蛋白的作用減弱。
2.2對(duì)白血病細(xì)胞株的作用收集6T-CEM、Raji細(xì)胞，按3×104/孔接種于96孔板，再加入20μl的hS83-P34，終濃度為1.0μmol/L，分別在4、8、12、18、24、36、48、72小時(shí)用MTS法490nm測定存活細(xì)胞的量，以hS83為對(duì)照。以PBS空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率作為100％計(jì)算基準(zhǔn)，分析不同濃度的hS83-P34對(duì)細(xì)胞的影響。
結(jié)果見圖13。結(jié)果表明，蛋白作用于6T-CEM細(xì)胞，在蛋白作用的前12hr，細(xì)胞存活率在88％以上；隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞的存活率降低，在18hr時(shí)達(dá)最低，細(xì)胞存活率為47.88％；繼續(xù)延長作用時(shí)間，在18～36hr，細(xì)胞存活率未見明顯變化，在50％左右；36hr以后，細(xì)胞存活率有所升高；72hr時(shí)檢測，細(xì)胞存活率達(dá)到約70％。作用于Raji細(xì)胞，蛋白作用12hr時(shí)，細(xì)胞存活率約為92％；而在18hr時(shí)，細(xì)胞存活率僅有約56％；18～72hr時(shí)，細(xì)胞的存活率穩(wěn)定在60％～65％左右。
該結(jié)果提示，hS83-P34對(duì)細(xì)胞的殺傷作用發(fā)揮較早，在12～24小時(shí)；之后，蛋白的作用減弱。
以上對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>四川人學(xué)華西醫(yī)院<120>人源化CTLA-4單鏈抗體與人穿孔素通道形成肽P34的重組免疫毒素<130>CD92-04P100168<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>837<212>DNA<213>Artificial<220>
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<400>6Pro Cys His Thr Ala Ala Arg Ser Glu Cys Lys Arg Ser His Lys Phe1 5 10 15Val Pro Gly Ala Trp Leu Ala Gly Glu Gly Val Asp Val Thr Ser Leu20 25 30Arg Arg
權(quán)利要求
1.一種人源化CTLA-4單鏈抗體與人穿孔素通道形成肽P34的重組免疫毒素，其特征在于該免疫毒素含有由人源化細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4的抗原結(jié)合分子與人穿孔素的通道形成活性分子組成的融合蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的重組免疫毒素，其特征在于所述人源化細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4的抗原結(jié)合分子為細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4的單鏈抗體；所述人穿孔素的通道形成活性分子包括人穿孔素N端前34個(gè)氨基酸。
3.權(quán)利要求2所述的重組免疫毒素，其特征在于其包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的重組免疫毒素，其特征在于所述氨基酸序列的N端進(jìn)一步連接Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys Glu Leu序列，如SEQ ID NO.3所示。
5.編碼權(quán)利要求1所述人源化CTLA-4單鏈抗體與人穿孔素通道形成肽P34的重組免疫毒素的核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列含有編碼人源化細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4的單鏈抗體的基因，以及編碼人穿孔素N端前34個(gè)氨基酸組成的通道形成結(jié)構(gòu)域的基因。
6.權(quán)利要求5所述的核苷酸序列，其特征在于其含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
7.含有權(quán)利要求5所述核苷酸序列的重組質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求7所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒的質(zhì)粒載體為pQE30，所述重組質(zhì)粒中含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
9.由權(quán)利要求7所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
10.含有權(quán)利要求1所述的人源化CTLA-4單鏈抗體與人穿孔素通道形成肽P34的重組免疫毒素的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型的重組人源化免疫毒素hS83－P34，該免疫毒素含有由人源化細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4的抗原結(jié)合分子與人穿孔素的通道形成活性分子組成的融合蛋白。本發(fā)明的免疫毒素具有嚴(yán)格的靶向性，能避免對(duì)正常細(xì)胞的傷害，毒副作用小；不需經(jīng)過內(nèi)化及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，作用效率高；不易產(chǎn)生相應(yīng)抗體，免疫原性弱；不易產(chǎn)生耐藥性?？捎糜谥委熌承┠[瘤和自身免疫性疾病，以及用于抑制器官移植時(shí)的免疫排斥反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P37/06GK1900117SQ20051008431
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2005年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月18日
發(fā)明者盧曉風(fēng), 程驚秋, 曾令宇, 萬琳, 丘小慶, 陸燕蓉, 李勝富, 陳利弘, 李幼平, 步宏 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院