用作治療劑的可溶性蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用作藥物的、特別地用于預防或治療自身免疫病和炎性疾病例如過敏性哮喘和炎性腸病的改進的結(jié)合蛋白。本發(fā)明更具體地涉及包含兩個異源二聚體的復合物的可溶性蛋白，其中每個異源二聚體基本上由以下組成：(i)第一單鏈多肽，其包含：(a)具有VH區(qū)、CH1區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和(b)與VH區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；和(ii)第二單鏈多肽，其包含：(c)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和(d)與VL區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；特征在于每對VH和VL?CDR序列具有針對抗原的特異性，從而所述可溶性蛋白的總價態(tài)是六。本發(fā)明還涉及如圖1所示的可溶性結(jié)合SIRPα的抗體樣蛋白。
【專利說明】用作治療劑的可溶性蛋白
[0001]本發(fā)明涉及用作藥物的、特別地用于預防或治療自身免疫病和炎性疾病(例如過敏性哮喘和炎性腸病)的可溶解性、多特異性、多價結(jié)合蛋白。本發(fā)明的可溶性蛋白包含兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0002](i)第一單鏈多肽，其包含:
[0003](a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和
[0004](b)與VH區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；
[0005]和
[0006](ii)第二單鏈多肽，其包含:
[0007](c)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和
[0008](d)與VL區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；特征在于每對VH和VL CDR序列具有針對抗原的特異性，從而所述可溶性蛋白的總價態(tài)是六。
[0009]本發(fā)明更具體地涉及對SIRPa具有特異性的可溶性結(jié)合蛋白。本發(fā)明的一個具體實施方案進一步由圖1所示說明。
[0010]SIRPa (CD172 a )是由包括巨噬細胞、粒細胞和常規(guī)樹狀細胞(DC)的髓系細胞表達以及在神經(jīng)元細胞上的免疫受體(van den Berg等人，2008, Trends inImmunol.，29(5):203-6)。SIRPa 是 CD47 的低親和力配體(Rebres 等人，2001，J.Biol.Chem.;276(37):34607-16 ;Hatherley 等人，2007 J.Biol.Chem.;282 (19):14567-75 ;Hatherley 等人，2008 ；Mol.Cell ;31 (2) 266-77)，并且 SIRPa 與 CD47 的相互作用組成了基于黏附和雙向信號傳導控制的細胞通訊體系，所述細胞通訊體系調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和神經(jīng)元系統(tǒng)中的多種細胞功能。這些功能包括移行、細胞成熟、巨噬細吞噬噬和髓樣樹狀細胞的細胞因子產(chǎn)生(van den Berg 等人，2008Trends in Immunol.29 (5): 203-6 ;Sarfati2009, Current Drug Targets, 9(10):852-50)。
[0011]來自動物模型的數(shù)據(jù)表明SIRPa /⑶47相互作用可以有助于或甚至控制幾種病癥的發(fā)病機理，所述病癥包括自身免疫病、炎性疾病(Okuzawa等人,2008, BBRC ；371 (3):561-6 ；Tomizawa 等人，2007，J.1mmunol ; 179 (2):869-877)；局部缺血性疾病(Isenberg 等人，2008，Arter.Thromb Vase.Biol., 28 (4):615-21 ；Isenberg2008, Am.J.Pathol., 173(4):1100-12)或腫瘤學相關疾病(Chan 等人,2009, PNAS, 106(33):14016-14021 ；Majeti 等人,2009, Cell, 138(2): 286-99)。調(diào)節(jié)SIRPa /⑶47途徑因此可以是用于多種疾病的有希望的治療性選項。
[0012]已經(jīng)建議使用針對⑶47、SIRP α或⑶47衍生的結(jié)合SIRP α的多肽的抗體作為治療手段(例如見 W01998/40940、W02004/108923、W02007/133811 和 W02009/046541)。此外，結(jié)合SIRP α的CD47衍生的融合蛋白在疾病(如TNBS-結(jié)腸炎(Fortin等人，2009，JExp Med.，206(9): 1995-2011)、朗格漢斯細胞移行(J.1mmunol.2004，172:4091-4099)和關節(jié)炎(VlST Inc, 2008, Exp.0pin.Therap.Pat., 18 (5): 555-561))的動物模型中是有效的。
[0013]此外，提出 SIRP a/CD47 參與控制吞曬(van den Berg 等人，2008，Trends inImmunol.，29(5):203-6)，并且聲稱通過SIRP α結(jié)合多肽進行干涉來增進NOD小鼠系中的人干細胞植入(W02009/046541)，表明含有CD47胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的治療劑用于人干細胞移植中的潛在益處。 [0014]本發(fā)明提供了可溶性結(jié)合蛋白，它們包含第一和第二多肽鏈的異源二聚體，每種鏈包含與抗體重鏈或輕鏈序列融合的結(jié)合部分。所述可溶性蛋白可以對抗原、靶或結(jié)合配偶體具有單、雙、三或四特異性，并且與現(xiàn)有技術的分子相比具有增加的價態(tài)。與現(xiàn)有技術的分子相比，本發(fā)明的可溶性蛋白具有提供增加數(shù)量的針對結(jié)合配偶體的特異性和增加的價態(tài)。這具有重要的優(yōu)點，如下文所述。這些可溶性蛋白用作治療劑。
[0015]本發(fā)明還提供用作治療劑的改進的可溶性SIRPa結(jié)合蛋白。與現(xiàn)有技術的⑶47蛋白融合物相比，如本發(fā)明中所定義的結(jié)合SIRPa的抗體樣蛋白可以提供增加針對靶向的表達SIRPa的細胞的親合力，同時維持優(yōu)異的可發(fā)展性特征的手段。另外，不受任何理論約束，預期較高的親合力導致較長的藥物動力學半壽期，從而提供增強的治療功效。這些新的研究結(jié)果提供了靶向表達SIRPa的細胞的新治療工具并且代表治療性前景，特別地對于多種自身免疫病和炎性疾病、癌癥或干細胞移植而言是如此。
[0016]因此，在一個方面，本發(fā)明提供一種可溶性蛋白，它包含兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0017]⑴第一單鏈多肽，其包含:
[0018](a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和
[0019](b)與VH區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；
[0020]和
[0021](ii)第二單鏈多肽，其包含:
[0022](c)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和
[0023](d)與VL區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；特征在于每對VH和VL CDR序列具有針對抗原的特異性，從而所述可溶性蛋白的總價態(tài)是六。
[0024] 申請人:先前已經(jīng)開發(fā)了抗體樣分子，稱作“Fusobodies”，其中抗體的兩條臂的可變區(qū)由哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域，例如SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域替換，從而提供多價可溶性蛋白。本發(fā)明的可溶性蛋白與 申請人:的Fusobodies相似，因為這些分子也包含抗體序列。但是就本發(fā)明的分子而言，抗體序列的VH區(qū)和VL區(qū)一以及相關價態(tài)和抗原特異性一已經(jīng)保留，這些區(qū)域與哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域融合。本發(fā)明的分子因此具有由雙價抗體序列提供的一種或多種結(jié)合特異性，和由哺乳動物結(jié)合分子的4個單價區(qū)域提供的其他特異性。為區(qū)分本發(fā)明的可溶性蛋白與 申請人:先前開發(fā)的那些蛋白，術語“延伸型Fusobody”將在下文中使用。 申請人:先前開發(fā)的分子將繼續(xù)稱作“Fusobodies”或“非延伸型Fusobodies”。
[0025]在圖1中顯示延伸型Fusobody的一個實例，該圖也描述了 申請人:先前開發(fā)的Fusobody,以及參照Q)47-Fc分子。
[0026]與現(xiàn)有技術的分子相比，本發(fā)明的可溶性蛋白具有增加的價態(tài)。基于每條多肽鏈的單價以及每對VH和VL區(qū)還提供了單價的抗原結(jié)合特異性，本發(fā)明的異源二聚體優(yōu)選地具有三價態(tài)。本發(fā)明的可溶性蛋白因此基于由4條多肽鏈上的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域貢獻的四價和由抗體VH區(qū)和VL區(qū)貢獻的二價，具有六價態(tài)(六價)。在優(yōu)選的實施方案中，每一單鏈多肽是單價的，每一異源二聚體是三價的，并且每一可溶性蛋白(基于兩個異源二聚體的復合物)是六價的。通過在每種第一和第二單鏈多肽中并入單價的結(jié)合分子和由每對VH區(qū)和VL區(qū)提供的單價抗原結(jié)合特異性，每個異源二聚體的價態(tài)是三價，即，每個異源二聚體可以結(jié)合多達三個獨立的結(jié)合配偶體，或在相同的結(jié)合配偶體上結(jié)合多達3次。這與其中第一和第二多肽鏈的異源二聚體的價態(tài)是I價(即，同時需要兩條鏈結(jié)合這種結(jié)合配偶體)的現(xiàn)有技術分子(例如W001/46261中披露的那些)形成對比至這樣的程度:兩個異源二聚體的復合物具有2價態(tài)。本發(fā)明的兩個三價異源二聚體的復合物具有六價態(tài)，即，該蛋白質(zhì)可以結(jié)合多達六個結(jié)合配偶體，或?qū)ο嗤慕Y(jié)合配偶體結(jié)合多達六次。本發(fā)明的異源二聚體是三價的，并且異源二聚體的復合物具有價態(tài)η χ3，其中η是該復合物內(nèi)部所包含的異源二聚體的數(shù)目。在優(yōu)選的實施方案中，該復合物包含兩個異源二聚體并且具有6價態(tài)。包含多于兩個異源二聚體的復合物具有大于6的價態(tài)(例如9、12、15或18的價態(tài))。本發(fā)明可溶性蛋白的增加的價態(tài)導致較高的親合力，有利地影響半壽期和功效。除了這些作用之外，(與具有較低親合力的治療性分子比較)具有高親合力的治療性分子的另一個優(yōu)點是，可以用于例如多達10倍的給藥劑量減少。
[0027]W02010/127284中公開了具有與抗體恒定區(qū)融合的雙可變域的抗體樣分子。公開的分子是雙特異性的并且具有價態(tài)4，這源自該分子的每條臂上的兩對VH區(qū)和VL區(qū)。在本發(fā)明的可溶性蛋白或延伸型Fusobody和W02010/127284中所公開的雙可變域分子之間的關鍵差異之一是在本發(fā)明的可溶性蛋白/延伸型Fusobody的每條臂上僅使用一個可變域(即VH和VL)。通過使用哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域一例如細胞表面受體(如CD47)的胞外結(jié)構(gòu)域一而不使用第二可變域，仍可以獲得針對第二(或第三抗原)的特異性。使用天然受體結(jié)構(gòu)域的優(yōu)點之一是與其相關結(jié)合配偶體的相互作用是更可預測的、天然的、特異的，并且在治療情形中，與可能包含免疫原性區(qū)域和/或突變以改善特異性、親和力和親合力的治療性抗體或雙可變域分子相比，哺乳動物結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)域不具有預期的免疫原性。與雙可變域分子相比，使用與抗體可變域融合的單價哺乳動物結(jié)合區(qū)的另一個優(yōu)點是以構(gòu)象方式緊鄰于抗體可變域布置哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域(并且仍保留所需的結(jié)合特異性)的問題遠比其中總是要求精確且最佳地使用接頭來布置具有不同特異性的兩個可變域更簡單。因而，采用現(xiàn)有分子實現(xiàn)的多特異性可以用本發(fā)明的可溶性蛋白更容易地實現(xiàn)，并且因而所述分子提供增加的價態(tài)和其他優(yōu)點。
[0028]在一個方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的兩個或多個可溶性蛋白的多價可溶性蛋白復合物，其中如果所述蛋白質(zhì)復合物包含N個可溶性蛋白，則價態(tài)是Nx6。
[0029]因此，在一個方面，本發(fā)明提供一種具有至少六價(或至少是六價)的可溶性蛋白，它包含至少兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0030](i)第一單鏈多肽，其包含:
[0031 ] (a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和
[0032](b)與VH區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域；
[0033]和
[0034](ii)第二單鏈多肽，其包含:
[0035](C)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和
[0036](d)與VL區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域；特征在于每對VH和VLCDR序列具有針對抗原的特異性(即是單價的)，并且哺乳動物結(jié)合分子的每個區(qū)域具有單價，從而所述可溶性蛋白的總價態(tài)是六。[0037]在另一個方面，本發(fā)明提供可溶性蛋白的復合物，每個可溶性蛋白具有至少六價(或至少是六價的)，包含至少兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0038](i)第一單鏈多肽，其包含:
[0039](a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和
[0040](b)與VH區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域；
[0041]和
[0042](ii)第二單鏈多肽，其包含:
[0043](c)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和
[0044](d)與VL區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域；特征在于每對VH和VLCDR序列具有針對抗原的特異性(即是單價的)，并且哺乳動物結(jié)合分子的每個區(qū)域具有單價，從而所述可溶性蛋白的總價態(tài)是六，并且其中如果該 蛋白質(zhì)復合物包含N個可溶性蛋白，則價態(tài)是Nx60
[0045]在另一個方面，本發(fā)明提供一種可溶性蛋白，它包含兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0046](i)第一單鏈多肽，其包含:
[0047](a)修飾的抗體重鏈序列，其以CH1-CH1-CH2-CH3順序具有兩個CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)；和
[0048](b)與第一 CHl區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；和
[0049](ii)第二單鏈多肽，其包含:
[0050](c)修飾的抗體輕鏈序列，其具有兩個融合的CL區(qū)；和
[0051](d)與第一 VL區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；特征在于所述可溶性蛋白的總價態(tài)是四。
[0052]在這個方面，可溶性蛋白的價態(tài)是4，然而，該分子保留延伸型Fusobody樣結(jié)構(gòu)，因為VH序列和VL序列分別被替換為CHl和CL序列。
[0053]在另一個方面，本發(fā)明提供一種可溶性蛋白，它包含兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體包含:
[0054](i)第一單鏈多肽，其包含:
[0055](a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和
[0056](b)與VH區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的至少一個單價區(qū)域；和
[0057](ii)第二單鏈多肽，其包含:
[0058](c)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和
[0059](d)與VL區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的至少一個單價區(qū)域；特征在于每對VH和VL CDR序列具有針對抗原的特異性，從而所述可溶性蛋白的總價態(tài)至少是六。
[0060]在一個優(yōu)選的方面，可溶性蛋白針對1、2或3種抗原具有結(jié)合特異性。該結(jié)合特異性源自(i)抗體序列的VH區(qū)和VL區(qū)的抗原結(jié)合特異性，和(ii)哺乳動物結(jié)合分子的每個區(qū)域的結(jié)合特異性。
[0061]在一個優(yōu)選的方面，每個異源二聚體內(nèi)部的Vh和VL區(qū)是對相同抗原、優(yōu)選地對該抗原上的相同表位特異的。[0062]在一個優(yōu)選的方面，包含于所述第一和第二單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子是相同的。在一個更優(yōu)選的方面，包含于所述第一和第二單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域是相同的。
[0063]因此，本發(fā)明提供一種可溶性蛋白，它包含兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0064](i)第一單鏈多肽，其包含:
[0065](a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和
[0066](b)與VH區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；
[0067]和
[0068](ii)第二單鏈多肽，其包含:
[0069](c)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和
[0070](d)與VL區(qū)融合的相同哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；特征在于每對VH和VLCDR序列具有針對抗原的特異性，從而所述可溶性蛋白的總價態(tài)是六。
[0071]本發(fā)明還提供一種可溶性蛋白，它包含兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0072](i)第一單鏈多肽，其包含:
[0073](a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和
[0074](b)與VH區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；
[0075]和
[0076](ii)第二單鏈多肽，其包含:
[0077](c)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和
[0078](d)與VL區(qū)融合的相同哺乳動物結(jié)合分子的相同區(qū)域；特征在于每對VH和VLCDR序列具有針對抗原的特異性，從而所述可溶性蛋白的總價態(tài)是六。
[0079]在一個實施方案中，哺乳動物結(jié)合分子的每個區(qū)域和每對VH和VL CDR序列對相同的單一抗原具有結(jié)合特異性。在一個實施方案中，哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域可以結(jié)合抗原上的第一表位，并且每對 VH和VL⑶R序列可以結(jié)合相同抗原上的第二表位。在另一個實施方案中，哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域和每對VH和VL CDR序列可以結(jié)合相同抗原上的相同表位。
[0080]在一個實施方案中，本發(fā)明的可溶性蛋白或延伸型Fusobody對兩種抗原具有結(jié)合特異性，其中哺乳動物結(jié)合分子的每個區(qū)域?qū)Φ谝豢乖哂薪Y(jié)合特異性，并且每對VH和VL CDR序列對第二抗原具有結(jié)合特異性。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的SIRPa結(jié)合蛋白對SIRP α具有特異性(基于包含于每種多肽序列內(nèi)部的CD47胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域)并且基于VH/VL和相關⑶R序列的特異性，對TNF α或環(huán)孢菌素A具有特異性。
[0081]在另一個實施方案中，包含于所述第一和第二單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子是不同的。因此，本發(fā)明提供一種可溶性蛋白，它包含兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0082](i)第一單鏈多肽，其包含:
[0083](a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和
[0084](b)與VH區(qū)融合的第一哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；[0085]和
[0086](ii)第二單鏈多肽，其包含:
[0087](c)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和 [0088](d)與VL區(qū)融合的第二哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；特征在于所述第一和第二哺乳動物結(jié)合分子對第一和第二抗原具有結(jié)合特異性，并且每對VH和VL CDR序列對所述第一或所述第二抗原具有特異性，因而可溶性蛋白是雙特異性的，具有總價態(tài)六。
[0089]在一個備選實施方案中，VH區(qū)和VL區(qū)可以使不同的抗原結(jié)合至被哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域結(jié)合的一種或兩種抗原。這種延伸型Fusobody是三特異性的，即可以結(jié)合三種不同抗原，其中包含于第一單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域?qū)Φ谝豢乖哂薪Y(jié)合特異性，包含于第二單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域?qū)Φ诙乖哂薪Y(jié)合特異性，并且每對VH和VL CDR序列對第三抗原具有結(jié)合特異性。因此，本發(fā)明提供一種可溶性蛋白，它包含兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0090](i)第一單鏈多肽，其包含:
[0091](a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和
[0092](b)與VH區(qū)融合的第一哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；
[0093]和
[0094](ii)第二單鏈多肽，其包含:
[0095](C)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和
[0096](d)與VL區(qū)融合的第二哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；特征在于所述第一和第二哺乳動物結(jié)合分子對第一和第二抗原具有結(jié)合特異性，并且每對VH和VL CDR序列對第三種第二抗原具有特異性，因而可溶性蛋白是三特異性的，具有總價態(tài)六。
[0097]在特定的實施方案中，VH和VL⑶R序列對TNF α、環(huán)孢菌素A或衍生自它們的表位具有結(jié)合特異性。
[0098]在一個優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域與抗體序列的N端部分(即，與定區(qū)和'恒定區(qū))融合。因而，哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域的C端與抗體序列的N端融合。在一些實施方案中，這些序列直接連接，在一些實施方案中，可以使用接頭序列。
[0099]在一個實施方案中，結(jié)合分子是細胞因子、生長因子、激素、信號傳導蛋白、低分子量化合物(藥物)、配體或細胞表面受體。優(yōu)選地，該結(jié)合分子是哺乳動物單體的或同型聚合的細胞表面受體。結(jié)合分子的區(qū)域可以是完整分子或其可以保留該結(jié)合分子的生物活性的部分或片段。結(jié)合分子的區(qū)域可以是胞外區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述哺乳動物單體的或同型聚合的細胞表面受體包含免疫球蛋白超家族(IgSF)結(jié)構(gòu)域，例如它包含SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是⑶47的胞外結(jié)構(gòu)域。
[0100]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及分離的可溶性SIRPa結(jié)合蛋白或結(jié)合SIRP α的延伸型Fusobody，其包含兩個三價異源二聚體的六價復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0101](i)第一單鏈多肽，其包含在抗體的VH區(qū)的N端部分處融合的第一 SIRP α結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和，
[0102](ii)第二單鏈多肽，其包含在抗體的VL區(qū)的N端部分處融合的第二 SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域。[0103]在一個優(yōu)選實施方案中，ChI區(qū)、Ch2區(qū)和Ch3區(qū)可以衍生自人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4相應區(qū)域的野生型或突變變體，其具有沉默的效應子功能和/或減少的細胞殺傷性ADCC或CDC效應子功能，例如減少的ADCC效應子功能。
[0104]在一個實施方案中，所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的延伸型Fusobody以0.05[I/S]或更小的kfGidl)從結(jié)合的人SIRP α解離，如采用雙價動力學擬合模型，通過表面等離子體共振如BiaCORE測定法所測量。
[0105]在另一個實施方案中，所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRP α的Fusobody抑制體外產(chǎn)生的單核細胞衍生性樹狀細胞中金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cowan菌株粒子刺激的促炎細胞因子釋放。
[0106]例如，所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的Fusobody以2nM或更小、InM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小例如在IOpM和2nM、或20pM和InM、或30pM和0.2nM之間的IC50抑制體外產(chǎn)生的單核細胞衍生性樹狀細胞中金黃色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎細胞因子釋放，如樹狀細胞細胞因子釋放測定法中所測量。
[0107]在另一個相關的實施方案中，每個異源二聚體的所述第一和第二單鏈多肽由二硫鍵共價地結(jié)合，例如使用相應ChI和Q區(qū)的半胱氨酸殘基之間的天然二硫鍵。
[0108]在一個實施方案中，所述哺乳動物結(jié)合分子的每個區(qū)域在肽接頭不存在下與其相應的VH序列或VL序列融合。在另一個實施方案中，所述哺乳動物結(jié)合分子的每個區(qū)域通過肽接頭與其相應的VH序列或VL序列融合。肽接頭可以包含5至20個氨基酸，例如，它可以是甘氨酸和絲氨酸氨基酸的聚合 物、優(yōu)選地是(GGGGS)n，其中是I和4之間的任何整數(shù)，優(yōu)選地是2。
[0109]在一個優(yōu)選實施方案中，所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的延伸型Fusobody基本上由兩個異源二聚體組成，其中每個異源二聚體的所述第一單鏈多肽包含免疫球蛋白恒定部分的鉸鏈區(qū)，并且這兩個異源二聚體彼此通過在它們鉸鏈區(qū)處的半胱氨酸之間的二硫鍵
穩(wěn)定締合。
[0110]在一個實施方案中，本發(fā)明的可溶性蛋白包含選自以下的至少一個SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域:
[0111](i)人細胞表面受體CD47的胞外結(jié)構(gòu)域；
[0112](ii)衍生自SEQ ID NO:2的胞外結(jié)構(gòu)域；
[0113](iii) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:57 多肽或其保留SIRPa結(jié)合特性的片段；和，
[0114](iv) SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 57 的或所述片段的變體多肽，所述變體多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性并保留SIRPa
結(jié)合特性。
[0115]在一個優(yōu)選實施方案中，CD47的胞外結(jié)構(gòu)域的區(qū)域是SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO:57。
[0116]在一個具體的實施方案中，包含于所述第一和第二單鏈多肽內(nèi)部的兩個或多個SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域彼此共有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或99.5%序列同一性百分數(shù)。在一個具體實施方案中，兩個或多個SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有相同的氨基酸序列。
[0117]在一個具體的實施方案中，在結(jié)合SIRP α的延伸型Fusobody內(nèi)部的全部SIRP a結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有相同的氨基酸序列。例如，全部SIRP結(jié)合結(jié)構(gòu)域由SEQ ID N0:3或SEQ IDNO:4 或 SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:57 組成。
[0118]在一個具體實施方案中，本發(fā)明的所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的延伸型Fusobody包含兩個異源二聚體,其中每個異源二聚體基本上由以下組成:
[0119](i)SEQ ID NO:20的第一單條重鏈多肽和SEQ ID NO:21的第二單條輕鏈多肽；
[0120](ii)SEQ ID NO:22的第一單條重鏈多肽和SEQ ID NO: 23的第二單條輕鏈多肽；或
[0121](iii) SEQ ID NO: 40的第一單條重鏈多肽和SEQ ID NO: 41的第二單條輕鏈多肽。
[0122]與抗體的重鏈和輕鏈相似，所述第一和第二單鏈多肽至少經(jīng)一個二硫鍵穩(wěn)定締
八
口 ο
[0123]在一個相關的實施方案中，可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的Fusobody包含兩個異源二聚體，其中每個異源二聚體的第一和第二單鏈多肽分別與(i)SEQ ID N0:20和SEQ IDN0:21、(ii)SEQ ID N0:22 和 SEQ ID N0:23 或(iii)SEQ ID N0:40 和 SEQ ID N0:41 的相應第一和第二單鏈多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性。優(yōu)選地，這些分子保留如上文所述的結(jié)合SIRP α的延伸型Fusobody的有利功能特征。
[0124]在一個具體實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合SIRP α的延伸型Fusobody的四個SIRP a結(jié)合結(jié)構(gòu)域是在序列上相同的。
[0125]本發(fā)明還涉及包含兩個或多個延伸型Fusobody或結(jié)合SIRP α的延伸型Fusobody的這類多價可溶性蛋白復合物，其中如果該蛋白質(zhì)復合物包含N個可溶性蛋白，則價態(tài)是Nx6。
[0126]本發(fā)明還涉及用作藥物或診斷工具，例如用于自身免疫病以及急性和慢性炎性病癥的治療或診斷中的此類可溶性蛋白或延伸型Fusobody、特別地是SIRP α結(jié)合蛋白或延伸型Fusobody。具體而言，SIRP α結(jié)合蛋白或延伸型Fusobody是用于治療選自Th2介導的氣道炎癥、過敏性病癥、哮喘、炎性腸病和關節(jié)炎的病癥。
[0127]本發(fā)明的可溶性蛋白或Fusobody也可以在有需求的受試者中用于治療或診斷局部缺血性病癥、白血病或其他癌癥或用于增加造血干細胞植入。
[0128]定義
[0129]為了可以更輕易地理解本發(fā)明，首先定義某些術語。額外的定義在詳細描述中給出。
[0130]術語SIRPa指顯示與⑶47 (整聯(lián)蛋白締合蛋白)黏附的人信號調(diào)節(jié)蛋白α (也稱為⑶172 α或SHPS-1)。 人SIRP α包括SEQ ID NO:1，但是還包括但不限于任何天然多態(tài)性變體，例如，包括人SIRP α的單核苷酸多態(tài)性(SNP)或剪接變體。表1中描述了人類中在SIRP α核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的剪接變體或SNP的實例。
[0131]表1:SIRPa蛋白的變體
[0132]
【權(quán)利要求】
1.一種可溶性蛋白，其包含兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成: (i)第一單鏈多肽，其包含: (a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和 (b)與VH區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域； 和 (?)第二單鏈多肽，其包含: (c)具有VL區(qū) 和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和 (d)與VL區(qū)融合的哺乳動物結(jié)合分子的單價區(qū)域；特征在于每對VH和VLCDR序列具有針對抗原的特異性，從而所述可溶性蛋白的總價態(tài)是六。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性蛋白，其中蛋白質(zhì)針對1、2或3種結(jié)合配偶體具有結(jié)合特異性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域是相同的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的可溶性蛋白，其中哺乳動物結(jié)合分子的每個單價區(qū)域和每對VH和VL CDR序列對相同的單一抗原具有結(jié)合特異性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的可溶性蛋白，其中哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域能結(jié)合抗原上的第一表位，并且每對VH和VL⑶R序列能結(jié)合相同抗原上的第二表位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的可溶性蛋白，其中哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域和每對VH和VL CDR序列能結(jié)合相同抗原上的相同表位。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的可溶性蛋白，所述蛋白質(zhì)對兩種抗原具有結(jié)合特異性，其中哺乳動物結(jié)合分子的每個區(qū)域?qū)Φ谝豢乖哂薪Y(jié)合特異性，并且每對VH和VLCDR序列對第二抗原具有結(jié)合特異性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子是不同的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的可溶性蛋白，所述蛋白質(zhì)對兩種抗原具有結(jié)合特異性，其中包含于第一單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域?qū)Φ谝豢乖哂薪Y(jié)合特異性，并且包含于第二單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域?qū)Φ诙乖哂薪Y(jié)合特異性，并且每對VH和VL⑶R序列對第一抗原或第二抗原具有結(jié)合特異性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的可溶性蛋白，所述蛋白質(zhì)對三種抗原具有結(jié)合特異性，其中包含于第一單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域?qū)Φ谝豢乖哂薪Y(jié)合特異性，包含于第二單鏈多肽內(nèi)部的哺乳動物結(jié)合分子的區(qū)域?qū)Φ诙乖哂薪Y(jié)合特異性，并且每對VH和VL CDR序列對第三抗原具有結(jié)合特異性。
11.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳動物結(jié)合分子是蛋白質(zhì)、細胞因子、生長因子、激素、信號傳導蛋白、炎性介質(zhì)、低分子量化合物、配體、細胞表面受體、或其片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳動物結(jié)合分子是單體的或同聚的細胞表面受體的胞外結(jié)構(gòu)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳動物單體的或同聚的細胞表面受體包含IgSF結(jié)構(gòu)域。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳動物結(jié)合分子包含SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的可溶性蛋白，其中所述SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自: (i)人細胞表面受體CD47的胞外結(jié)構(gòu)域； (ii)SEQID NO:2的衍生的胞外結(jié)構(gòu)域；
(iii)SEQID NO: 3,SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 57 的多肽或其保留 SIRP a結(jié)合特性的片段；和，
(iv)SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 57 的或所述片段的變體多肽，所述變體多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性并保留SIRP a結(jié)合特性。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二單鏈多肽內(nèi)部的兩個或多個SIRP a結(jié)合結(jié)構(gòu)域彼此共有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或99.5%序列同一性百分數(shù)。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任一項所述的可溶性蛋白，其中兩個或多個SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有相同的氨基酸序列。
18.如權(quán)利要求14至17中任一項所述的可溶性蛋白，其中每個異源二聚體內(nèi)部的SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有相同的氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求14至18中任一項所述的可溶性蛋白，其中SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5和SEQ IDNO:57的氨基酸序列的人細胞表面受體CD47的胞外結(jié)構(gòu)域。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的可溶性蛋白，其包含兩個異源二聚體的復合物，其中每個異源二聚體基本上由以下組成: α)第一單鏈多肽，其包含: (a)具有VH區(qū)、CHl區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的抗體重鏈序列；和 (b)CD47的胞外結(jié)構(gòu)域的單價區(qū)域，所述CD47區(qū)域的羧基端與VH區(qū)的N末端融合；和 (?)第二單鏈多肽，其包含: (c)具有VL區(qū)和CL區(qū)的抗體輕鏈序列；和 (d)CD47的胞外結(jié)構(gòu)域的單價區(qū)域，所述CD47區(qū)域的羧基端與VL區(qū)的N末端融合。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的可溶性蛋白，其中CD47的胞外結(jié)構(gòu)域的所述區(qū)域是SEQIDNO:3 或 SEQ ID NO:57。
22.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白，其中VH和VLCDR序列對TNF α、環(huán)孢菌素A或衍生自它們的表位具有結(jié)合特異性。
23.根據(jù)權(quán)利要求14至22中任一項所述的可溶性蛋白，其以0.05[l/s]或更小的koff(kdl)從結(jié)合的人SIRPa解離，如采用雙價動力學擬合模型，在BiaCORE測定法中所測量。
24.根據(jù)權(quán)利要求14至23中任一項所述的可溶性蛋白，其抑制體外產(chǎn)生的單核細胞衍生的樹狀細胞中金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cowan菌株粒子刺激的促炎細胞因子釋放。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的可溶性蛋白，其以0.1nM或更小的IC5tl抑制體外產(chǎn)生的單核細胞衍生的樹狀細胞中金黃色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎細胞因子釋放，如在樹狀細胞細胞因子釋放測定法中所測量。
26.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白，其中每個異源二聚體的所述第一和第二單鏈多肽由二硫鍵共價地連接。
27.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白，其中每個異源二聚體的所述第一單鏈多肽包含免疫球蛋白恒定部分的鉸鏈區(qū)，并且所述兩個異源二聚體彼此通過所述鉸鏈區(qū)處的~ 硫鍵穩(wěn)定締合。
28.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳動物結(jié)合分子的每個區(qū)域在肽接頭不存在下與其相應的VH序列或VL序列融合。
29.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳動物結(jié)合分子的每個區(qū)域通過肽接頭與其相應的VH序列或VL序列融合。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的可溶性蛋白，其中所述肽接頭包含5至20個氨基酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或權(quán)利要求30所述的可溶性蛋白，其中所述肽接頭是甘氨酸和絲氨酸氨基酸的聚合物，優(yōu)選地是(GGGGS)n，其中η是I和4之間的任何整數(shù)，優(yōu)選地是2。
32.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白，其中抗體的ChI區(qū)、Ch2區(qū)和Ch3區(qū)衍生自人IgGl、IgG2或IgG4相應區(qū)域的沉默突變體，其具有降低的ADCC效應子功能。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項所述的可溶性蛋白，其中所述異源二聚體包含: (i)SEQID NO:`20的第一單鏈多肽和SEQ ID NO:21的第二單鏈多肽； (ii)SEQID NO:22的第一單鏈多肽和SEQ ID NO:23的第二單鏈多肽；或 (iii)SEQID NO:40的第一單鏈多肽和SEQ ID NO:41的第二單鏈多肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項所述的可溶性蛋白，其中所述第一單鏈多肽和所述第二單鏈多肽具有與以下的相應第一單鏈多肽和第二單鏈多肽至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性:
(i)SEQID NO:20 和 SEQ ID NO:21;
(ii)SEQID NO:22 和 SEQ ID NO:23;或
(iii)SEQID NO:40 和 SEQ ID NO:41。
35.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項所述的可溶性蛋白，其包含: (i)由SEQ ID NO:77的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID N0:78的核苷酸序列編碼的輕鏈；或 (?)由SEQ ID NO:79的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO:80的核苷酸序列編碼的輕鏈；或 (iii)由SEQ ID NO:97的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO:98的核苷酸序列編碼的輕鏈。
36.包含兩個或多個根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白的多價可溶性蛋白復合物，其中如果所述蛋白質(zhì)復合物包含N個可溶性蛋白，則價態(tài)是N x6。
37.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白或蛋白質(zhì)復合物，用作藥物或診斷工具。
38.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白或蛋白質(zhì)復合物，用于治療或診斷自身免疫病和/或急性和慢性炎性疾病。
39.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白或蛋白質(zhì)復合物，用于治療選自Th2介導的氣道炎癥、過敏性疾病、哮喘、炎性腸病和關節(jié)炎的疾病。
40.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白或蛋白質(zhì)復合物，用于治療缺血性疾病、白血病或其他癌癥。
41.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的可溶性蛋白或蛋白質(zhì)復合物，用于在有需求的受試者中增加造血干細胞植入。
42.藥物組合物，其包含與一種或多種可藥用載體組合的權(quán)利要求1至36中任一項所述的可溶性蛋白或蛋白質(zhì)復合物。
43.根據(jù)權(quán)利要求42中所述的藥物組合物，其額外地包含至少一種其他有效成分。
44.分離的核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至36中任一項所述的可溶性蛋白的一個異源二聚體的至少一條單鏈多肽。
45.根據(jù)權(quán)利要求44中所述的分離的核酸，或克隆載體或表達載體，其包含選自SEQID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:97 和 SEQ ID NO:98 的至少一種核酸。
46.適用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至36中任一項所述的可溶性蛋白或蛋白質(zhì)復合物的重組宿主細胞，其包含編碼所述蛋白質(zhì)的所述異源二聚體的所述第一和第二單鏈多肽和任選地分泌信號的核酸。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的重組宿主細胞，其包含穩(wěn)定整合于基因組中的SEQIDNO:77 和 SEQ ID NO:78 ;或 SEQ ID NO:79 和 SEQ ID NO:80;或 SEQ ID NO:97 和 SEQ IDNO:98的核酸。
48.根據(jù)權(quán)利要求46或權(quán)利要求47所述的重組宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞系。
49.用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至36中任一項所述的可溶性蛋白或蛋白質(zhì)復合物的方法，包括在產(chǎn)生所述可溶性蛋白或蛋白質(zhì)復合物的適宜條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求46至48中任一項所述的宿主細胞和分離所述蛋白質(zhì)。
【文檔編號】C07K19/00GK103635490SQ201280029556
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月16日
【發(fā)明者】T·胡貝爾, F·科爾賓格, K·韋爾岑巴赫 申請人:諾瓦提斯公司