表面涂布假單胞菌菌毛蛋白肽的結(jié)構(gòu)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及方法和組合物，其中使D型或逆-倒位假單胞菌菌毛蛋白肽，任選具有共價連接到所述肽的聚乙二醇部分，結(jié)合到基底。所公開的方法和組合物可用于減少摩擦系數(shù)，抑制非假單胞菌的生物膜形成，用于減少針對材料的炎性反應，用于減少金屬腐蝕，并可用于生物傳感器應用中。
【專利說明】表面涂布假單胞菌菌毛蛋白肽的結(jié)構(gòu)
發(fā)明領域
[0001 ] 本發(fā)明涉及采用D型或逆-倒位(retro-1nverso) IV型銅綠假單胞菌(P.aeruginosa) (T4P)菌毛蛋白肽的材料涂層的領域,所述菌毛蛋白肽任選綴合到聚乙烯部分；并涉及其方法和應用。
[0002]直量
細菌的IV型菌毛是宿主群集(colonization)和毒力(對于許多革蘭氏陰性菌而言)所必需的，并且還可能在一些革蘭氏陽性菌的發(fā)病機理中起作用。IV型菌毛從細菌表面伸出并介導與生物和非生物表面的特異性附著。負責這種結(jié)合的菌毛結(jié)合結(jié)構(gòu)域在位于該蛋白的C-末端區(qū)的12-17 二硫環(huán)區(qū)(disulfide-loop)內(nèi)編碼，而僅含有該區(qū)的合成肽例如由來自銅綠假單胞菌IV型菌毛蛋白的殘基128-144組成的二硫環(huán)肽已顯示與生物和非生物表面結(jié)合。
[0003]本發(fā)明人和同事們最近已經(jīng)證明，菌毛蛋白衍生的蛋白納米管(PNT)以高親和力結(jié)合到不銹鋼，并且該結(jié)合事件顯示出是C-末端端結(jié)合的(tip-associated),通過對應于IV型菌毛蛋白肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的合成肽競爭性抑制PNT結(jié)合來進行(Yu，B.等人，J.Bionanoscience, 1:73-83 (2007)。隨后本發(fā)明人和同事們進一步證明，衍生自C-末端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的菌毛蛋白肽，當結(jié)合到非生物表面(例如不銹鋼、錫、鋁、鈦、鉻、塑料、玻璃、硅酸鹽、陶瓷及其混合物)時，能夠抑制該涂布的表面上細菌生物膜的形成(U.S.20080287367)。
[0004]最近，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)的合成菌毛蛋白肽與一些金屬的結(jié)合顯著增強金屬的某些純粹的表面性質(zhì)，即，獨立于生物膜形成的性質(zhì)，且在一些金屬中改變表面的電子性質(zhì)，以一定方式使其可用于例如生物傳感器應用中(USSN 12/899,958)。
[0005]發(fā)明概沭
一方面，本發(fā)明包括處理管道以減少流過該管道的流體的摩擦拽力的方法，即通過向所述管道引入攜帶綴合物的液體的步驟，所述綴合物是以下的綴合物:(i)含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基的D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述綴合物的量有效地通過使菌毛蛋白肽附著于管道壁而減少流過管道的流體的摩擦拽力。
[0006]所述菌毛蛋白肽綴合物可以是具有共價連接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或兩端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。所述肽綴合物中的聚乙二醇部分可具有介于0.2-500 kDal之間的分子量。所述菌毛蛋白肽可以具有確定為SEQ ID NO: 10的序列，包括確定為SEQ ID NO: 3、4或9的示例性序列。
[0007]所述菌毛蛋白肽綴合物所附著的管道內(nèi)表面可以是金屬、聚合物、陶瓷或硅酸鹽表面。示例性的金屬包括不銹鋼、碳鋼、鈦、銅、黃銅、錫、鐵、銀、和鎂及其合金。
[0008]附著于管道內(nèi)壁的菌毛蛋白肽綴合物的量或表面密度可足以降低可腐蝕的金屬例如不銹鋼的腐蝕速率，和/或足以減少流體的摩擦拽力，所述流體例如引入管道中的含砂漿液。
[0009]可通過在正常操作期間將所述肽綴合物定期加入到引入管道中的流體中，將菌毛蛋白肽綴合物引入管道中。
[0010]另一方面，本發(fā)明包括具有用綴合物涂布的一個或多個暴露的金屬、聚合物、陶瓷或硅酸鹽表面的制品，所述綴合物是以下的綴合物:(i)含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基的D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述綴合物的量足以減少所述一個或多個暴露表面的摩擦系數(shù)。示例性的菌毛蛋白肽如上所述。
[0011]所述制品的一個或多個暴露表面可以是金屬表面，例如不銹鋼、碳鋼、鈦、銅、黃銅、錫、鐵、銀、和鎂及其合金的表面，并且涂布所述表面的肽綴合物可以足以降低所述表面的腐蝕速率，和/或足以減少流過所述管道的流體的摩擦拽力的量存在。
[0012]在一個實施方案中，所述制品是寬度尺寸為100微米或更小的微流體通道，其內(nèi)壁表面用肽綴合物涂布并且涂布該表面的肽綴合物以足以減少流體流過所述通道的摩擦拽力的量存在。
[0013]在第2個實施方案中，所述制品包括砂顆粒，其外表面用足量的所述肽綴合物涂布，以減少該涂布的 顆粒漿液流過管道的摩擦拽力。
[0014]在第3個實施方案中，所述制品是具有活動件的機器，其涂布肽的表面是彼此移動接觸的。
[0015]在第4個實施方案中，所述制品是具有用所述肽綴合物涂布的暴露的金屬表面的電子器件或元件。
[0016]在第5個實施方案中，所述制品是具有不銹鋼或鈦表面的矯形植入器件，并且涂布該表面的所述肽綴合物以足以抑制該涂布表面上生物膜形成的量存在。
[0017]再一方面，本發(fā)明包括一種制品，所述制品包括(i)具有暴露的表面的元件，所述表面可在普通使用條件下被非假單胞菌細菌用作生物膜形成的基底，和(ii)與所述表面結(jié)合的D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基，和任選共價連接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制這類非假單胞菌細菌的生物膜形成。示例性的被抑制的細菌包括利斯特氏菌{Listeria、或葡萄球菌{Staphylococcus)。
[0018]再一方面，本發(fā)明包括在處理具有暴露的晶粒邊界區(qū)的表面的金屬材料的方法中為了降低所述材料的腐蝕速率的改進。所述改進包括:使所述材料中的暴露的表面邊界區(qū)與D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽接觸，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基，和任選共價連接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制所述材料的腐蝕速率。示例性的金屬包括不銹鋼、碳鋼、鈦、銅、黃銅、錫、鐵、銀、和鎂及其合金。示例性的菌毛蛋白肽和菌毛蛋白肽綴合物如上所述。
[0019]結(jié)合到所述金屬的肽或肽綴合物的量可有效使暴露的晶粒邊界區(qū)的電子功函變化至少0.3 eV EFW單位并使暴露的晶粒邊界區(qū)的硬度增加至少20%，所述硬度通過用原子力顯微鏡的尖端以給定力沖擊(striking)金屬表面產(chǎn)生的納米壓痕來測定。當金屬是不銹鋼時，結(jié)合的肽或結(jié)合的肽綴合物的量可有效使涂布表面的腐蝕速率降低至少約30%，所述腐蝕速率通過穿過表面的腐蝕電流來測定。
[0020]當金屬材料是多孔或網(wǎng)狀的時，可實施接觸步驟以使菌毛蛋白肽與由所述材料內(nèi)的孔或網(wǎng)眼確定的內(nèi)表面結(jié)合。當金屬材料具有暴露的晶粒邊界區(qū)時，接觸步驟可有效使菌毛蛋白肽與所述晶粒邊界區(qū)選擇性地結(jié)合，由此通過優(yōu)先保護在其晶粒邊界區(qū)處的表面來增強金屬表面的硬度和腐蝕抗性。
[0021]還公開的是抑制對設計成植入受試者內(nèi)的醫(yī)療器件的炎性反應的方法。所述方法包括:在植入所述器件之前，用合成菌毛蛋白肽涂布所述器件的暴露的表面，所述合成菌毛蛋白肽含有(i)衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)，(?)位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩個末端側(cè)的0-10個額外殘基，和(iii)由逆-倒位(RI)型的D-氨基酸組成，和任選具有共價連接于所述肽上的聚乙二醇部分。優(yōu)選的肽和肽綴合物如上所述。
[0022]另一方面，本發(fā)明包括用于檢測分析物的生物傳感器器件。所述器件包括:(a)導電金屬基底，其具有(i)生物傳感器表面(ii)與所述基底表面結(jié)合的D型(RI)合成菌毛蛋白肽，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基，和任選具有共價連接于所述肽的聚乙二醇部分，和(iii)直接或間接地共價連接于所述菌毛蛋白肽的受體，和(b)用于檢測響應分析物相關配體與表面結(jié)合的受體的結(jié)合的穿過基底表面的電學性質(zhì)變化的檢測器。
[0023]所述生物傳感器基底可以由不銹鋼形成，并且結(jié)合在其上的菌毛蛋白肽可以是D型菌毛蛋白肽，任選綴合到聚乙二醇部分。在一個實施方案中，可以使用菌毛蛋白肽的組合，例如，使用PEG-D-菌毛蛋白肽綴合物以減少與樣品化合物的非特異性相互作用，和R1-菌毛蛋白肽(有或沒有PEG部分)以將靶配體連接到生物傳感器表面，或者直接通過配體與肽的共價連接或通過間接方式，如下所述。
[0024]所述受體可以通過卷曲螺旋E/Κ螺旋對而共價連接于菌毛蛋白肽，所述螺旋對中的一個共價連接于菌毛蛋白肽，而另一個則連接于受體上。
[0025]再一方面，本發(fā)明包括使化合物共價連接于由不銹鋼、錫、鐵或鈦形成的基底的一個或多個暴露表面的方法，所述方法通過以下步驟:(a)使所述基底的一個或多個暴露表面與D型合成菌毛蛋白肽接觸，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基，和任選具有共價連接于所述肽的聚乙二醇部分，由此使所述菌毛蛋白肽共價地結(jié)合到一個或多個暴露表面，和(b)在所述接觸和結(jié)合之前或之后，使所述化合物共價連接于所述菌毛蛋白肽，或者，連接于PEG-菌毛蛋白-肽綴合物中的PEG部分。優(yōu)選的菌毛蛋白肽和肽綴合物如上所述。
[0026] 當基底表面具有暴露的晶粒邊界區(qū)時，所述接觸步驟有效使所述化合物優(yōu)先定位在暴露的晶粒邊界區(qū)處。當所述材料是多孔或網(wǎng)狀的時，所述接觸步驟可有效使所述菌毛蛋白肽與由所述材料內(nèi)的孔或網(wǎng)眼確定的內(nèi)表面結(jié)合。[0027]還公開的是基底，其表面結(jié)合有(i) D型合成菌毛蛋白肽，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基，和任選具有共價連接于所述肽的聚乙二醇部分，和(ii)化合物，所述化合物直接或間接地共價連接于所述菌毛蛋白肽或連接于PEG-菌毛蛋白肽綴合物中的PEG部分。
[0028]所述基底可以是金屬，例如不銹鋼、碳鋼、鈦、銅、黃銅、錫、鐵、銀、和鎂及其合金，并且可以用作生物傳感器電響應元件，其中所述化合物是通過共價鍵直接連接于所述菌毛蛋白肽或通過Κ/E螺旋的/螺旋對間接連接于所述菌毛蛋白肽的分析物受體分子，其中所述螺旋中的一個共價連接于所述菌毛蛋白肽，而另一個螺旋共價連接于所述化合物。不銹鋼基底可由于與其表面結(jié)合的菌毛蛋白肽而具有改變的電子功函。
[0029]當閱讀以下詳述以及附圖時，本發(fā)明的這些和其它目標和特征將會更加顯而易見。
[0030]附圖簡沭
圖1A-1D顯示多個細菌屬/種/菌株中IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列；
圖2A和2B的圖顯示對未涂布的不銹鋼或用L型K122-4(2A)和PAO (2B)菌毛蛋白肽涂布的不銹鋼進行的粘合力(adhesive force)測量；
圖3A和3B的圖顯示未涂布的不銹鋼或用L型K122-4 (3A)和PAK (3B)菌毛蛋白肽涂布的不銹鋼的電子功函(EWF)；
圖4顯示在兩個月時期內(nèi)得到的涂布和未涂布的不銹鋼的EWF測量結(jié)果；
圖5顯示在800 nM負荷下涂布肽的和未涂布的不銹鋼的力位移(force-dispIacement)曲線；
圖6A和6B顯示在20 μΝ (6Α)和50 μΝ (6Β)負荷下進行的納米壓痕試驗的結(jié)果；
圖7Α和7Β是在增加負荷下的涂布肽的(7Α中是ΡΑ0，7Β中是Κ122-4)和未涂布的不銹鋼的位移測量圖；
圖8Α和8Β是未涂布的(8Α)和涂布Τ4Ρ17菌毛蛋白肽(8Β)的不銹鋼基底與AFM尖端之間的電流的導電率AFM表面圖；
圖9Α-9Β是涂布的和未涂布的不銹鋼表面的腐蝕特性的測量，顯示涂布菌毛蛋白的不銹鋼的腐蝕電流(Icorr)顯著小于未涂布的不銹鋼的腐蝕電流(9Α)，涂布菌毛蛋白的和未涂布的不銹鋼的腐蝕電位(Ecorr)沒有顯著區(qū)別(9Β)；
圖1OA和IOB的圖顯示涂布菌毛蛋白的不銹鋼的腐蝕速率顯著低于未涂布的不銹鋼(10Α)，與未涂布的不銹鋼相比，抗極化性顯著更高(IOB)；
圖11顯示，當菌毛蛋白肽與另一個肽(在此例子中，亮氨酸-拉鏈型E螺旋或E/Κ卷曲螺旋)綴合時，與金屬表面結(jié)合的菌毛蛋白肽的腐蝕抑制作用可逆轉(zhuǎn)；
圖12A-12C的照片顯示未涂布的(12Α)、用菌毛蛋白肽涂布的(12Β)或用具有連接于菌毛蛋白的螺旋-螺旋雙鏈體的菌毛蛋白肽涂布的不銹鋼樣品上的腐蝕的視覺效應；
圖13顯示，在采用增加量的外源肽的競爭性結(jié)合分析中，已結(jié)合的菌毛蛋白肽沒有被從不銹鋼表面置換；
圖14是未涂布的和涂布Κ-122-4菌毛蛋白肽的不銹鋼樣品的XPS圖；圖15A和15B顯示涂布L-型和D-型菌毛蛋白肽兩者的不銹鋼樣品的粘合力測量結(jié)果(15A)和涂布相同的L-型和D-型菌毛蛋白肽的不銹鋼樣品的EWF力測量結(jié)果(15B)；
圖16A和16B顯示菌毛蛋白肽(D-型)與不銹鋼支架(16A)和與玻璃表面(16B)緊密結(jié)合的能力；
圖17A和17B的柱形圖顯示與不銹鋼樣品結(jié)合的L-氨基酸和D-氨基酸菌毛蛋白對蛋白酶消化的相對抗性；
圖18A和18B的示意圖顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案構(gòu)建的生物傳感器器件的運
行；
圖19說明生物傳感器中的分析物結(jié)合步驟，其中，分析物結(jié)合試劑R通過菌毛蛋白肽直接連接于生物傳感器表面；
圖20說明生物傳感器中的分析物結(jié)合步驟，其中，分析物結(jié)合試劑R通過菌毛蛋白肽卷曲螺旋復合物連接于生物傳感器表面；
圖21顯示本發(fā)明的生物傳感器中的不同檢測構(gòu)型；
圖22A和22B是結(jié)合分析物與受體結(jié)合之前和之后在生物傳感器器件中記錄的循環(huán)伏安法圖，其中，22B是圖22A中矩形面的放大圖；
圖23A和23B說明根 據(jù)本發(fā)明的一個更一般性實施方案構(gòu)建的分析物檢測器件；
圖24A-24D是柱形圖，顯示T4P17菌毛蛋白肽與不銹鋼(24A)、冠狀支架(24B)、Foley(乳膠)導管(24C)和中央靜脈(硅酮)導管(24D)的結(jié)合；
圖25A和25B是蛋白質(zhì)印跡(25A)和柱形圖(25B)，顯示D-菌毛蛋白肽涂層對針對未涂布的和涂布菌毛蛋白的鈦或不銹鋼表面的PBMC免疫反應的影響；
圖26A和26B顯示蛋白質(zhì)印跡(26A)和柱形圖(26B)，顯示D-菌毛蛋白肽涂層對針對未涂布的和涂布菌毛蛋白的鈦或不銹鋼表面的人巨噬細胞免疫反應的影響；
圖27A-27D顯示用多種形式的K122-4菌毛蛋白肽涂布的不銹鋼的特征，K-122-4的borg sEWF，對于EWF (27A和27B)、納米壓痕(27C)和腐蝕速率(27D)；
圖28A-28C是顯示未涂布的鈦或者涂布D型、逆-倒位或D型-PEG菌毛蛋白肽的鈦的電子功函(EWF)的圖；
圖29顯示在未涂布的或者涂布D型、逆-倒位或D型-PEG菌毛蛋白肽的鈦表面上的表面顯微壓痕作用；
圖30A-30E顯示以指定的力水平在鈦板上的大塊(bulk)顯微壓痕作用；
圖31A和圖31B顯示在鈦板上測定的粘合力(圖31A)，以及在不銹鋼板上測定的腐蝕速率(31B)，這兩者是對于未涂布的或涂布PEG-D型菌毛蛋白肽的板而言；
圖32A-32E是未涂布的鈦(31A)、涂布PEG-D型菌毛蛋白肽的鈦(32B)、涂布逆-倒位型的菌毛蛋白肽的鈦(32C)、涂布D型菌毛蛋白肽的鈦(32D)、以及涂布逆-倒位和D型菌毛蛋白肽的組合的鈦(32E)的代表性的摩擦系數(shù)圖；
圖33A-33F表示比較L-菌毛蛋白肽、R1-菌毛蛋白肽和D型肽與不同材料結(jié)合的數(shù)據(jù)，所述材料包括不銹鋼(33A，部分1-9和28B)、鈦(33C，部分A和B)、聚氨酯(33D)、聚砜(33E，部分A和B)和硅酮(33F)；
圖34顯示當施加50 mA電流達10分鐘時，結(jié)合對照(bound control, Ig)肽、L型菌毛蛋白肽(L)、RI菌毛蛋白肽(RI)和D型菌毛蛋白肽從不銹鋼表面的相對損失；圖35A-3?的圖顯示無害利斯特氏菌{Listeria innocua)的不同菌株(35A)和單核細胞增生利斯特氏菌{Listeria monocytogenes)的3個菌株(35B-3OT)的細菌對涂布D型菌毛蛋白肽、RI菌毛蛋白肽或D+RI菌毛蛋白肽的不銹鋼板、或未涂布的對照的生物膜抑制程度；
圖36A-36F的圖顯示不同種的葡萄球菌{Staphylococcus')細菌對涂布D型菌毛蛋白肽、RI菌毛蛋白肽、或D+RI菌毛蛋白肽的不銹鋼板、或未涂布對照的生物膜抑制程度；和圖37A-37C顯示施加到不銹鋼的非常小一滴PEG-D-菌毛蛋白肽的細菌抑制作用。
[0031]發(fā)明詳沭 I.定義
“菌毛”是在許多細菌的表面上發(fā)現(xiàn)的毛狀附器。
[0032]菌毛蛋白是用于菌毛的蛋白亞基的通稱。
[0033]“IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白”或“T4P菌毛蛋白肽”或“菌毛蛋白肽”是指銅綠假單胞菌細菌用于產(chǎn)生能動力的菌毛結(jié)構(gòu)，通過使菌毛的末梢附著于生物的或非生物的表面并收縮菌毛以便拖動細菌向前來實現(xiàn)。所有IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛都含有C-末端受體結(jié)合區(qū)，其氧化形式含有可歸類為12-殘基環(huán)或17-殘基環(huán)的二硫環(huán)。圖1顯示其C-末端菌毛蛋白區(qū)已測序的多個細菌種的二硫環(huán)區(qū)。
[0034]“衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)”是指其氨基酸序列對應于已知的細菌二硫環(huán)氨基酸序列的二硫環(huán)，所述已知的細菌二硫環(huán)氨基酸序列例如通過SEQ ID N0:4確定的銅綠假單胞菌菌株PAK序列，或者作為兩個或更多個不同的細菌種和/或細菌菌株之間二硫環(huán)序列中的一個或多個氨基酸變化的置換形成的序列之一，例如SEQ ID NO: 10中含有的序列之一，其作為四個銅綠假單胞菌菌株PAK、PA0、PA82935和K-122-4的二硫環(huán)序列的組合形成。
[0035]“合成肽”指通過固相或重組肽合成而形成的肽。
[0036]“由不銹鋼、錫、鐵或鈦形成的基底”意指由不銹鋼、錫、鐵或鈦或這些金屬中的兩種或更多種的混合物形成的金屬基底，或用不銹鋼、錫、鐵或鈦或它們的混合物涂布的金屬或非金屬基底?；卓梢院行”壤钠渌饘伲绕涫莵碜灾芷诒淼?-6行、第9-12列的過渡金屬，包括鈷、鎳、銅、鋅、釕、銠、鈀、銀、鎘、鋨、鉬、金、鉻(存在于不銹鋼中)和汞。
[0037]“T4P菌毛蛋白肽與由不銹鋼、錫、鐵或鈦形成的金屬基底的共價連接”意指菌毛蛋白肽通過鍵連接于金屬表面，其(i)抵抗被游離的菌毛蛋白肽置換，且(ii)具有變化的電子功函(EWF)，表明材料的表面電子軌道(e-orbital)發(fā)生變化。菌毛蛋白肽與此類金屬基底的共價連接還可表征為:(i)表面粘合力的改變、(ii)表面硬度的改變、(iii)導電率的改變和/或(iv)結(jié)合能峰的改變(通過X-射線光電子光譜法(XPS)觀察到的)。
[0038]“具有共價結(jié)合的化合物的金屬基底”表示具有與基底表面共價結(jié)合的T4P菌毛蛋白肽，和與菌毛蛋白肽直接或間接共價結(jié)合的不是菌毛蛋白的蛋白質(zhì)另一部分的化合物的不銹鋼、錫、鐵或鈦基底。當化合物通過高親和力結(jié)合對(例如卷曲螺旋亮氨酸-拉鏈對、生物素-抗生物素蛋白對，等等)與菌毛蛋白肽連接時，其中，所述對的一個成員與菌毛蛋白肽共價連接，而另一個成員與化合物共價連接；化合物與T4P菌毛蛋白肽間接共價結(jié)合。
[0039]金屬基底的“暴露的晶粒邊界區(qū)”指出現(xiàn)晶粒邊界，即，形成基底的金屬原子的兩個多晶取向的界面處的基底的表面區(qū)。[0040]“使菌毛蛋白肽優(yōu)先定位于暴露的晶粒邊界區(qū)”是指，菌毛蛋白肽和共價連接于菌毛蛋白肽的任意化合物在晶粒邊界區(qū)比在晶粒邊界區(qū)之間的暴露表面區(qū)具有更大的分子濃度和/或更大的表面涂層厚度。
[0041]“L型T4P菌毛蛋白肽”或“L型菌毛蛋白肽”是指由L-對映體的氨基酸殘基(L-氨基酸殘基)組成的T4P菌毛蛋白肽。
[0042]“D型T4P菌毛蛋白肽”或“D型菌毛蛋白肽”是指主要或排他地由D-對映體的氨基酸殘基(D-氨基酸殘基)組成的T4P菌毛蛋白肽。具體地講，D型T4P菌毛蛋白肽含有大于50% D-氨基酸殘基，和優(yōu)選全為D-氨基酸，其中任何其余殘基為L-氨基酸。D型T4P菌毛蛋白肽是抗蛋白酶的，并且該肽中的任何L-對映體的氨基酸應當位于菌毛蛋白肽序列內(nèi)，使得它們不會顯著損害該蛋白酶抗性?？扇缦麓_定這些位置:通過在各個可能的位置上形成具有單個L-氨基酸取代的一系列D型菌毛蛋白肽并測試單取代肽對于各種蛋白酶的抗性。
[0043]“逆-倒位T4P菌毛蛋白肽”或“逆-倒位菌毛蛋白肽”或“RI菌毛蛋白肽”是指具有D-對映體的氨基酸殘基的倒轉(zhuǎn)序列的T4P菌毛蛋白肽，其將該氨基酸側(cè)鏈放置在正確的相對位置中，如下所述。逆-倒位T4P菌毛蛋白肽是抗蛋白酶的。
[0044]“聚乙二醇”或“PEG”是指線狀或分支的乙二醇聚合物，并且可包括少至5個單體單元和至多數(shù)千個單元，分子量范圍介于0.2 kD至500 kD之間或更高，其中所指定的大小是指PEG的平均分子量?！熬垡叶疾糠帧笔侵溉缟纤龅木鞍纂暮途垡叶嫉摹熬Y合物”的聚乙二醇部分(portion或moiety)。所述綴合物通常是共價綴合物,其中聚乙二醇部分共價連接于菌毛蛋白肽的C-末端和/或N-末端氨基酸。
[0045]I1.菌毛蛋白狀
圖1A-1D顯示序列信息可獲得的各種細菌屬/種/菌株的含二硫環(huán)的C-末端菌毛蛋白肽區(qū)的序列。給出的序列包括二硫環(huán)序列(以半胱氨酸殘基(C)開始和結(jié)束)并在一些情況下包括在所述環(huán)任意一側(cè)的至多5個或更多個殘基。單字母氨基酸命名根據(jù)標準慣例。在肽的正常氧化形式中，肽含有在半胱氨酸殘基之間的二硫橋。
[0046]本發(fā)明中采用的合成肽包括或衍生自圖1A-1D中顯示的一個或多個序列。當序列包括所顯示序列中的一個時，其可以包括單獨的二硫環(huán)，或者所述環(huán)可以另外包括在環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)中任意一側(cè)或這兩側(cè)的至多10個、優(yōu)選5個或更少的殘基，其中，附加的非環(huán)殘基典型地包括或衍生自一個或多個相鄰的非環(huán)序列。更一般地，環(huán)區(qū)和非環(huán)區(qū)的序列都可通過使這些序列(優(yōu)選地在二硫環(huán)中具有相同或幾乎相同數(shù)量的殘基的序列)排成一行而衍生自兩個或更多個序列。例如，在圖1A中，對應于銅綠假單胞菌菌株PAO (SEQID NO: 3),PAK (SEQ ID NO: 4)、PA82935 (SEQ ID NO: 7)和 K122-4 (SEQ ID NO: 9)的四個肽含有14-聚體(mer) 二硫環(huán)。通過使來自圖1A中的四種銅綠假單胞菌菌株的二硫環(huán)序列排成一行，形成了 組合的序列 K/A/S/T-C-T/K/A-S/T-D/T/N-Q/V/A-D/E-E/IP/A/N-Q/M/K-F/Y-1/T/R/L-P-K/N-G/T—C-S/D/T/Q/N-K/N/D/T (SEQ ID NO: 10)。該 17-殘基的肽(也一般稱為T4P17)包括14個二硫環(huán)殘基，單個上游(N-末端側(cè))非環(huán)殘基和兩個下游非環(huán)殘基。該序列內(nèi)的示例性序列包括衍生出SEQ ID NO: 10的實際4個不同的序列，SP，對應于 PAK (SEQ ID NO: 3)、PAO (SEQ ID NO: 4)、PA82935 (SEQ ID NO: 7)和 K-122-4(SEQ ID NO: 9)的序列。[0047]作為另一個實例，2個銅綠假單胞菌菌株G7-09 (SEQ ID NO:1)和PA110594(SEQ ID NO:2)形成復合序列 S/T-1-D-W-G/A-C-A/T-S-D/A-S-N-A-V/T-S/--S—G/A-T-D/A-R/Q-N/G-M/F-P/T-A/G-L/M-T/A-A-G-T/S-L/V-P-A/Q-R/E-F-A-P-S/A-E/Q-C-R (SEQ IDN0:21)。
[0048]一旦選擇了菌毛蛋白肽序列，其可通過標準的重組合成法或固相合成法而合成。例如，由pRLD-Ε質(zhì)粒重組表達E-螺旋(E-coil) PAK (128-144) ox，其中，利用合成的寡聚核苷酸符合讀框的剪接PAK (128-144) ox DNA序列與E-螺旋并根據(jù)已知的技術(shù)在大腸桿菌(E.Coli)菌株 BL-21 中表達(參見例如 Giltner 等人，Mol.Microbiology (2006)59 (4):1083和其中引用的參考文獻)。通過金屬親和色譜純化所表達的肽，通過質(zhì)譜法和N-末端蛋白測序證實純度和二硫橋的形成。
[0049]在本發(fā)明的一個一般性實施方案中，菌毛蛋白肽包含D-氨基酸，并且如上所述，可含有一個或多個L-氨基酸，只要L-氨基酸是少數(shù)部分(少于50%殘基)并且不會明顯損害肽的蛋白酶抗性。在菌毛蛋白肽中包括D-氨基酸的一個目的是增加肽對于由肽可能接觸到的一種或多種蛋白酶導致的蛋白水解的抗性。例如，假單胞菌屬細菌具有一系列蛋白酶，包括彈性蛋白酶、金屬蛋白酶和典型的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，在肽裂解中需要其靶向賴氨酸和/或精氨酸殘基。因此，可合成菌毛蛋白肽以含有D-賴氨酸，例如在K122-4菌毛蛋白肽中的K136和K140處。優(yōu)選地，在制備對盡可能多的蛋白酶具有抗性的肽中，菌毛蛋白肽應該完全由D-氨基酸形成。可通過常規(guī)的固相法，在合成中利用活化的D-或L-型氨基酸試劑形成全部由D-氨基酸組成或由D-和L-氨基酸的混合物組成的菌毛蛋白肽。(參見例如 Guichard, G.,等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA.第 91 卷，第 9765-9769頁，1994年10月)。
[0050]正如以下將會看到的，與L型菌毛蛋白肽相比，D型菌毛蛋白肽在作為表面涂布劑時具有重要優(yōu)勢。首先，盡管L型T4P菌毛蛋白肽有效抑制假單胞菌所導致的生物膜形成，但是D型菌毛蛋白肽對于假單胞菌所導致的生物膜形成提供更優(yōu)良的抑制，并對于非假單胞菌(例如利斯特氏菌和葡萄球菌)所致的生物膜形成提供顯著更強的抑制。其次，盡管L型T4P菌毛蛋白肽以高親和力有效結(jié)合各種材料，包括多種金屬、聚合物、硅酸鹽和陶瓷，但是當將材料暴露于蛋白酶時，和在導電材料的情況下當將電流施加到材料時，D型肽通常提供顯著更穩(wěn)定的結(jié)合。
[0051]在另一個一般性實施方案中，菌毛蛋白肽包含以逆序列方向、即羧基端至胺端方向合成的D-氨基酸，以產(chǎn)生所謂的逆-倒位(RI)菌毛蛋白肽。逆-倒位(RI)型菌毛蛋白肽還具有更強的蛋白酶抗性的優(yōu)點，并因此在本文中所述的應用中是有利的，在所述應用中涂布菌毛蛋白的材料暴露于蛋白酶，例如在生物環(huán)境中或在經(jīng)受細菌生長的環(huán)境中。合成RI型肽的方法在例如以下文獻中有詳述:Fletcher, M.D.和Campbell, Μ.Μ., PartiallyModified Retro-1nverso Peptides: Development, Synthesis, and ConformationalBehavior, Chem Rev, 1998，98:763-795，其通過引用結(jié)合到本文中。
[0052]正如以下將會看到的，與L型菌毛蛋白肽相比，逆-倒位菌毛蛋白肽作為表面涂布劑也具有重要優(yōu)勢。首先，它們對于假單胞菌所導致的生物膜形成提供更優(yōu)良的抑制，并對于非假單胞菌(例如利斯特氏菌和葡萄球菌)所致的生物膜形成提供顯著更強的抑制，盡管一般而言，與RI肽相比，D型菌毛蛋白肽對生物膜形成產(chǎn)生更強的抑制作用。其次，盡管L型T4P菌毛蛋白肽以高親和力有效結(jié)合不銹鋼(通過表征為增加的電子功函(EWF)、更大的硬度和腐蝕抗性的共價-樣鍵)，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)逆-倒位菌毛蛋白肽產(chǎn)生顯著更高的鋼EffF (高于L型肽所產(chǎn)生的)，并且還顯著增加了材料硬度，亦表明腐蝕抗性更大(相對于用L型肽所觀察到的)。
[0053]在再一個實施方案中，將菌毛蛋白肽、和優(yōu)選D型或逆-倒位型的菌毛蛋白肽，綴合到聚乙二醇聚合物線狀或分支鏈，通常通過共價連接聚乙二醇線狀或分支聚合物的末端與肽的N-末端胺和/或C-末端酸基團，使用常規(guī)的肽偶聯(lián)方法，例如用于在肽和PEG部分之間形成酰胺鍵、酯鍵、醚鍵或二硫鍵，或者含有活化基團的鍵。用于與蛋白質(zhì)綴合的PEG或具有合適反應基團的PEG是市售可得到的,例如來自PEGTech, Analytical Ventura和Thermo Scientific (分支PEG)并且活化基團可以是例如馬來酰亞胺(通常用于與以下基團反應:肽巰基、乙烯基砜、丙醛、吡啶二砜、NHS酯或碘乙酰胺)；可通過已知的偶聯(lián)反應，將具有末端胺、酸、羥基或巰基反應基團的PEG偶聯(lián)到肽的胺、酸、羥基或硫基團。PEG通常在一端具有惰性基團，例如甲氧基，在另一端具有活化基團或反應基團。聚合物試劑的典型平均分子量的選擇大小范圍介于5kDa至40kDa，相當于在聚合物中有100_1，000個重復單元，盡管更小或更大的PEG也是合適的。按照標準PEG偶聯(lián)方法，通過活化PEG試劑對蛋白質(zhì)進行PEG化。
[0054]PEG-D-菌毛蛋白肽或PEG-R1-菌毛蛋白肽的優(yōu)勢在下文將會見到。一般而言，PEG化形式的D型或RI菌毛蛋白肽提供了上文對于非PEG化形式的D-或RI型肽所提及的優(yōu)勢，但額外優(yōu)勢為顯著減少摩擦系數(shù)和更大地抑制在已涂布表面上的生物膜形成。
[0055]II1.處理金屬表面
一方面，本發(fā)明包括 處理表面具有暴露的晶粒邊界區(qū)的不銹鋼、錫、鐵或鈦金屬材料的改進方法，以降低材料的腐蝕速率。該方法可單獨地或與多種其它抗腐蝕方法中的一種(例如鈍化)組合使用。金屬材料可具有單個暴露表面(其具有晶粒邊界區(qū))或多個待處理的外表面，或含有自材料外表面可及的孔或內(nèi)部網(wǎng)眼?？梢岳斫?，該方法適合對經(jīng)受化學腐蝕的任意不銹鋼、錫、鐵或鈦金屬材料的任何處理，所述化學腐蝕例如在氧化的氣氛中或通過與腐蝕性液體(例如堿性或酸性液體)接觸。
[0056]在實施該方法中，可首先洗滌金屬材料一次或多次，例如在乙醇浴中，以除去污染物。然后，在有效使菌毛蛋白與材料的暴露表面共價結(jié)合的條件下使材料與菌毛蛋白溶液接觸。在一個典型的處理方法中，將材料放置于肽或綴合物濃度為2 yg/mL至50 μ g/mL菌毛蛋白(例如10 μ g/mL)的菌毛蛋白肽或PEG-菌毛蛋白-肽綴合物在接近中性pH (例如pH 7)的水性緩沖液(例如磷酸緩沖鹽水)中的溶液中，并使材料與該溶液接觸一段時間(例如5-120分鐘)直到合適的菌毛蛋白肽涂層已形成。
[0057]或者，可以用菌毛蛋白溶液噴霧待涂布的材料，且使其與噴霧溶液在高濕度環(huán)境中接觸需要的接觸時間(例如5-120分鐘)。
[0058]在再一個實施方案中，將菌毛蛋白涂料施加于金屬表面的所選區(qū)域，例如在微制造(microfabrication)操作中，或選擇性地將肽施加于材料上暴露的晶粒邊界區(qū)。在該實施方案中，以區(qū)域特異性方式(例如通過噴墨打印機或類似手段)將肽溶液遞送至材料的
暴露表面。
[0059]11 TA.處理方法和金屬表面性質(zhì)的改變本部分描述了處理金屬表面以增強其腐蝕抗性的示例性方法和在支持本發(fā)明而進行的研究，所述研究證明，除了增強的腐蝕抗性以外，(i)經(jīng)處理表面的粘合力降低，(ii)經(jīng)處理表面的電子功函改變，(iii)經(jīng)處理表面的硬度增加，(iv)導電率減小，和(V)在至少兩個月的時期內(nèi)涂層穩(wěn)定。除非另有說明，否則在本部分和在部分IIIB和IIIC中報告的研究是用L型菌毛蛋白肽進行的。在部分IIID中報告的研究和結(jié)果是用D型和逆-倒位菌毛蛋白肽以及D-和RI菌毛蛋白肽的PEG-綴合物進行的。
[0060]樣品制備將商品級304 2B光澤表面(finish plate) (20規(guī)格)不銹鋼板(I mm厚)切割成尺寸為I cm X I cm的樣品。樣品在1140°C、于空氣中退火I小時并在空氣中冷卻。使用120、240、320、400、600和800#粒度的砂紙拋光表面，隨后用1200#粒度砂紙進行最終拋光。
[0061]使用上述的拋光方案拋光尺寸為I cm X I cm X I cm的招和不銹鋼樣品。這些樣品在拋光之前都沒有進行退火。
[0062]用肽或單體菌毛蛋白涂布樣品使用市售洗碟皂將不銹鋼和鋁樣品洗滌I分鐘，隨后用蒸餾水沖洗。然后伴隨溫和攪拌將樣品浸入95%乙醇中15分鐘，用蒸餾水沖洗，再浸入試劑級丙酮中I分鐘。用蒸餾水沖洗樣品5次，隨后使其風干。將樣品浸入含有10μ g/mL肽或肽綴合物或單體菌毛蛋白的磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液中并伴隨溫和攪拌于室溫(RT)溫育I小時。除去溶液，用蒸餾水洗滌樣品6次并使樣品風干。
[0063]使用上述方案清潔碳鋼樣品，但在丙酮洗滌步驟之后代替地用100%甲醇沖洗樣品并立即將樣品浸入100%甲醇中以防止當暴露于水時導致的快速的空氣腐蝕。將肽或肽綴合物溶解在100%甲醇中，10 μ g/mL的最終濃度用于浸沒碳鋼樣品。伴隨溫和攪拌于RT將樣品溫育I小時。用100%甲醇洗滌樣品6次并使其風干。
[0064]粘合力測暈使用原子力顯微鏡(AFM)測量尖端半徑為50-70 nm的標準的涂布Au的AFM氮化硅尖端和涂布肽的表面之間的粘合力。為了確定AFM尖端和涂布的表面之間的粘合力，以“接觸”模式使用AFM。使尖端接近表面，使它們接觸，測量將尖端拉離表面時懸臂(cantilever)的偏轉(zhuǎn)(deflection)。通過激光束檢測偏轉(zhuǎn)的總量,其反映粘合力。如果懸臂的彈簧常數(shù)是已知的，可根據(jù)光束偏轉(zhuǎn)(beam deflection)而定量測定粘合力。在該研究中，懸臂彈簧常數(shù)是0.06 N/m。對每個實驗，每個樣品獲得20至50個粘合力測量結(jié)果O
[0065]涂布K122-4或PAO菌毛蛋白肽的不銹鋼樣品的粘合力研究的結(jié)果分別繪制在圖2A和2B中。如圖2A所示，涂布的金屬的粘合力集中在約5-40 nN(納牛頓)的范圍內(nèi)，平均值約20 nN，相較于未涂布的樣品，其粘合力集中在約40-75 nN，平均值約60 nN。用PAO菌毛蛋白涂層獲得類似的結(jié)果。由于粘合力是電子活性(例如范德華(Van de Walls)相互作用)的反映，可推斷出肽涂層起到掩蔽金屬表面電子層的作用。
[0066]對涂布肽的鋁板的類似的粘合力測量顯示，涂布的和未涂布的板之間的粘合力幾乎沒有區(qū)別。
[0067]功函測量用SKP370掃描開爾文探針(Scanning Kelvin Probe)照慣例測量涂布的和未涂布的不銹鋼樣品的電子功函(EWF)。使用振動電容探針并通過掃頻“隔板”電位(swept backing potential)操作該技術(shù)，測量掃描探針參考尖端和樣品表面之間的功函差。被研究的樣品是如同粘合研究中使用的那些，不同之處在于還檢驗了用PAK菌毛蛋白肽涂布的樣品。
[0068]研究結(jié)果繪制在圖3A中(關于未涂布的和涂布K122-4菌毛蛋白肽的樣品)和圖3B中(關于未涂布的和涂布PAO-和PAK菌毛蛋白肽的樣品)。對于所有三種涂層，菌毛蛋白肽涂層使表面EWF提高了至少約0.5 eV,達到約5eV的最終值。
[0069]對涂布肽的鋁板的類似的EWF測量顯示，涂布的和未涂布的板之間的EWF幾乎沒有區(qū)別。
[0070]肽涂層的穩(wěn)定性圖4顯示對涂布后2個月的時間期限內(nèi)獲取的涂布K122-4菌毛蛋白肽的樣品的測量結(jié)果。在這2個月的研究時期內(nèi)觀察到涂布的樣品相對于未涂布的片具有更高的EFW，表明至少兩個月的涂層穩(wěn)定性。
[0071]納米壓痕/ 硬度使用 triboscope (Hysitron, Minneapolis, USA)檢驗涂布肽的樣品的機械性能的改變。triboscope是納米機械探針和AFM的組合。該探針是金剛石錐體形維氏硬度計壓頭，具有150nm的標稱半徑、100 nN的力靈敏度(force sensitivity)和0.2nm的位移分辨率。在納米壓痕過程中，對于每次壓痕獲取力-深度曲線，從該曲線獲得尖端進入樣品表面的總深度位移。使用50至800 μ N的力進行納米壓痕試驗。對每個力負荷獲取五條力-深度曲線。
[0072]圖5中顯示涂布肽的(深色)和未涂布的(淺色)不銹鋼在50至800 μ N的負荷范圍下的力-位移曲線。在800μ N負荷下的總位移顯示在圖的頂部，對于涂布的片，該值在45-55nm范圍內(nèi)，對于未涂布的片，該值在約90_95nm?；谠撛囼?，涂布的片的硬度幾乎是未涂布的片的兩倍。更一般地，涂層有效地使不銹鋼、錫、鐵或鈦金屬表面的硬度增加至少約20%，優(yōu)選至少約30%，至多50%或更高。
[0073]圖6A和6B繪制涂布的和未涂布的片在20 μ N (6Α)和50 μ N (6Β)下產(chǎn)生的納米壓痕的位移。與來自圖5的數(shù)據(jù)一致，涂布的片的硬度比未涂布的片高約20%-100%。
[0074]相同類型的研究繪制在圖7Α和7Β中，圖(7Α)針對涂布PAO的且在50-800 μ N的力范圍內(nèi)，圖(7Β)針對涂布Κ122-4的且在50-400μΝ的力范圍內(nèi)，結(jié)果基本上相同。在這兩種情況中，涂布菌毛蛋白肽幾乎使金屬樣品的表面硬度翻倍。
[0075]對涂布肽的鋁板的類似的納米壓痕試驗顯示，涂布的和未涂布的板之間的表面硬度幾乎沒有改變。
[0076]增加的導電率導電率是材料傳導電流的能力的量度。測量表面導電率的一個標準方法使用原子力顯微鏡(AFM)來測量在規(guī)定的低電壓電位偏壓(potential bias)下從表面上的特定位置流至AFM尖端的電流。AFM將表面和尖端之間的電流(以PA計)定量顯示為特定顏色，并且對于未涂布的和涂布菌毛蛋白的不銹鋼板，分別用圖8A和SB中不同的灰色陰影表示。通常，較深至較淺的陰影表示較大至較小的電流(28.0至24.5pA)。從這兩幅圖中觀察到，圖8A中的未涂布的不銹鋼樣品的表面區(qū)在樣品表面上變化很大且具有表示較高電流的主導的深色陰影，而圖8B中涂布菌毛蛋白的樣品的表面區(qū)主要是低導電率的且導電率圖顯著更加均勻。這些結(jié)果與來自圖3A和3B的EWF數(shù)據(jù)一致，表明涂布菌毛蛋白的材料具有顯著更高的金屬功函(提取表面電子所需的功的量度)。
[0077] 腐蝕抗性有多種技術(shù)可用于研究材料表面的腐蝕抗性或易腐蝕性。一種方法是測量固定的電位下穿過金屬板的電流。測得的電流反映表面電子在氧化還原形式之間往復，更大的電流表明更大的腐蝕潛力。圖9A中的圖顯示對如上制備的304 2B光澤表面(20規(guī)格)不銹鋼板(未涂布的或涂布K-122-4菌毛蛋白肽的)測得的電流(Icorr)。結(jié)果顯示涂布的板的Icorr顯著更低,表明腐蝕抗性更高。
[0078]可能被問及，以上研究中觀察到的Icorr差異是否與電流首先開始流經(jīng)金屬表面時的電位(Ecorr)有關。通過觀察金屬中的電流首先開始流動時的電位(Ecorr)來研究這個問題。研究結(jié)果(顯示在圖9B中)表明，涂布的和未涂布的金屬樣品兩者具有類似的Ecorr值,表明圖9A中看到的Icorr值差異不是由兩個樣品之間電壓電位響應的差異造成的。
[0079]圖1OA中繪制了涂布K-122-4的和未涂布樣品的腐蝕速率測量結(jié)果(以密耳(毫英寸)/年(mpy)測量)。結(jié)果與圖9A中看到的Icorr的差異一致。具體地，當比較平均速率時，菌毛蛋白肽涂層顯示使腐蝕速率降低了超過三倍。
[0080]腐蝕監(jiān)測中另一個廣泛使用的技術(shù)是抗極化性，定義為自由腐蝕電位下的電位電流密度曲線的斜率，得到可通過已知的數(shù)學關系與腐蝕電流相關的阻抗值Rp。圖1OB繪制涂布的和未涂布的不銹鋼的Rp值，顯示肽涂層顯著提高作為腐蝕抗性的量度的Rp。
[0081]令人感興趣的是，當菌毛蛋白與具有強偶極和/或高電荷密度的另一種肽綴合時，在此例子中，所述另一種肽是亮氨酸拉鏈型E螺旋或相同的E螺旋(其已結(jié)合E螺旋/K螺旋對中的相反電荷的K螺旋)，菌毛蛋白肽在抑制腐蝕中的作用可逆轉(zhuǎn)。如圖11所示，未涂布的不銹鋼樣品的腐蝕速率顯著低于具有結(jié)合的菌毛蛋白-E或E/Κ螺旋形式的菌毛蛋白的樣品。
[0082]對以上討論的各種不銹鋼樣品的腐蝕測試的視覺效果參見圖12A-12C。在該研究中，樣品或者是未涂布的(12B)或者用菌毛蛋白肽(12A)或與E/Κ卷曲螺旋對綴合的菌毛蛋白肽涂布的。在每種情況下，樣品在稀鹽溶液中經(jīng)歷上述的腐蝕測試。與未涂布的板相t匕，涂布菌毛蛋白的板顯示極小的表面腐蝕，而菌毛蛋白-綴合物涂層看起來顯著加強腐蝕。
[0083]總之，用合成菌毛蛋白肽涂布金屬例如不銹鋼、錫、鐵或鈦，有效地增加金屬表面的硬度和腐蝕抗性，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)并含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個、優(yōu)選地0-5個額外殘基。增加的腐蝕抗性通過改變,例如金屬表面的電子功函增加至少0.2 EFW單位以及上述Icorr、腐蝕速率和Rp值的改變來證明。提高的硬度通過納米壓痕減小了至少20%來證明，所述納米壓痕通過用原子力顯微鏡的尖端以給定力沖擊金屬表面而產(chǎn)生。
[0084]所述方法中考慮的其它金屬是元素周期表第4-6行、第9-12列的過渡金屬，包括鈷、鎳、銅、鋅、釕、銠、鈀、銀、鎘、鋨、鉬、金和汞，它們的混合物和合金、準金屬硅和鍺和它們的氧化物。
_5] 減少的摩擦系數(shù)
按照已知方法，例如2007 J.Phys.: Conf Ser 61 51中所報道的，使用原子力顯微鏡(AFM)測量摩擦系數(shù)。簡而言之，以給定力(例如500 mN)將AFM的懸臂梁(cantileverbeam)施加到表面，并跨越測試表面而移動。梁的偏轉(zhuǎn)量就提供了梁所經(jīng)歷的摩擦力的度量，較低的摩擦系數(shù)產(chǎn)生較低的偏轉(zhuǎn)。梁在表面上的整個移動路線的偏轉(zhuǎn)概況就提供了摩擦系數(shù)的度量，小而更均勻的偏轉(zhuǎn)表示低系數(shù)，而更高且更不規(guī)則的概況則表示更高的梁偏轉(zhuǎn)。
[0086]IIIB.菌毛蛋白肽與經(jīng)處理金屬共價結(jié)合的額外證據(jù)
涂布的金屬的電子功函改變和腐蝕抗性增強表明，菌毛蛋白肽已改變了涂布的表面的電子性質(zhì)，暗示肽與金屬之間共價鍵的形成，其改變了金屬的自由電子軌道。這一發(fā)現(xiàn)的麵處支持來自本分部中報道的肽置換分析和X-射線光電子光譜法(XPS)研究。
[0087]肽/菌毛蛋白置換分析化合物和基底之間的共價相互作用的一個指示是在溶質(zhì)形式的化合物存在下溫育復合物時不能從基底上置換化合物。在此，研究外源性菌毛蛋白肽置換與不銹鋼表面結(jié)合的菌毛蛋白肽的能力。如上所述地清潔I mm厚的商品級304 2B光澤表面(20規(guī)格)不銹鋼板。這些板不進行退火或拋光。將這些板裝配到96孔Schleicher和Schuell Minifold TM System (Mandel Scientific)中。將五十微升含有 10μ g/mL生物素化的PAK肽或生物素化的純化的菌毛蛋直的溶液加入孔(5個平行測定)中并在RT下伴隨溫和攪拌將該集合管(manifold)溫育I小時。用Ix PBS洗滌孔六次。向平行測定孔中加入增加量(O至10 μ g/mL)的未標記的PAK肽并在RT下伴隨溫和攪拌將該鋼集合管溫育I小時。隨后用PBS洗滌孔六次。使用鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(HRP)評估結(jié)合的生物素化的肽或菌毛蛋白的置換。將鏈霉抗生物素蛋白-HRP(Sigma) 1/500稀釋，每孔加入100 μ L并在RT下將該集合管溫育I小時。每孔加入150微升顯影緩沖液(含有I mM 2，2’ -連氮基-雙-(3-乙基芐基噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) (Sigma)和0.03% (v/v)過氧化氫的0.01 M檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.2)。在RT下伴隨溫和攪拌將該集合管溫育10分鐘。將反應溶液轉(zhuǎn)移至96孔平底微量滴定板(Corning)中，使用FLUOstarOPTIMA讀板儀(BMG LABTECH)測定在405 nm處的吸光度。
[0088]如圖13中繪制的數(shù)據(jù)所示，即使在較高濃度的可溶性菌毛蛋白肽時，也沒有自金屬表面的可測量的結(jié)合菌毛蛋白肽的損失，證明結(jié)合的菌毛蛋白肽與未結(jié)合的肽相平衡，表明肽和金屬表面之間的共價鍵連接。肽與金屬表面的共價結(jié)合的其它證據(jù)由以下的腐蝕抗性研究提供。
[0089]XPS特征X-射線光電子光譜法(XPS)是測量元素組成和材料內(nèi)存在的元素的電子狀態(tài)的定量光譜學技術(shù)。通過用X-射線束照射材料同時測量從被分析材料的頂部I至10nm逃逸的電子的動能和數(shù)量來獲得XPS光譜。XPS需要超高真空(UHV)條件。
[0090]使用Axis-165光譜儀(Kratos Analytical)檢驗來自未涂布的和涂布菌毛蛋白的樣品的光發(fā)射的電子。從這兩種樣品發(fā)射的電子的光譜見圖14。如所示的，涂布菌毛蛋白的樣品含有結(jié)合能約為100和150eV的兩個獨特的峰，它們在未涂布的樣品中不存在。一個可能性是這兩個峰代表由于綴合的電子結(jié)合而顯著紅移的硫-金屬鍵。沒有N或O與金屬結(jié)合的證據(jù)，表明菌毛蛋白與金屬之間可能的共價(共享電子)鍵相互作用是與菌毛蛋白肽中兩個硫原子中的一個或兩個。
[0091]IIIC.晶粒邊界效應
晶粒邊界是多晶材料中兩個晶粒或微晶之間的界面。晶粒邊界是晶體結(jié)構(gòu)中的缺陷，且易于降低材料的電和熱傳導率。大多數(shù)晶粒邊界中的高界面能和較弱的結(jié)合經(jīng)常使它們成為腐蝕開始和從固體沉淀出新的相的優(yōu)先位點。
[0092]由于晶粒邊界可作為腐蝕的起始點，所以，確定菌毛蛋白肽與金屬表面結(jié)合是否優(yōu)先發(fā)生在晶粒邊界位點是令人感興趣的。為了研究這個問題，將使用涂布菌毛蛋白-肽的AFM尖端的上述粘合力研究進一步精細化為研究晶粒內(nèi)和晶粒邊界處的粘合力作用。該研究中的“試驗”和“對照”表面是用PAO菌毛蛋白妝或用具有亂序的(scrambled) PAO氣基酸序列的肽涂布的不銹鋼板。對于各樣品，測量晶粒內(nèi)和晶粒邊界處的粘合力。
[0093]如下表1中給出的結(jié)果所示，在晶粒邊界內(nèi)，菌毛蛋白肽的粘合力比具有亂序的序列的相同材料的粘合力小約20 nN，而在晶粒邊界處，粘合力小約43 nN。該結(jié)果表明，或者菌毛蛋白肽優(yōu)先定位于晶粒邊界處，即，肽在晶粒邊界處具有更大的涂層厚度，或者相同水平的菌毛蛋白結(jié)合 在晶粒邊界處產(chǎn)生更大的粘合力作用。在任何一種情況下，該數(shù)據(jù)可解釋通過使菌毛蛋白肽與金屬表面結(jié)合所觀察到的抗腐蝕作用的大小。
[0094]表1:晶粒邊界區(qū)對粘合力的作用
【權(quán)利要求】
1.處理管道以減少流過管道的流體的摩擦拽力的方法，所述方法包括: 向所述管道引入攜帶綴合物的液體，所述綴合物是以下的綴合物:(i)含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述綴合物的量有效通過使所述菌毛蛋白肽附著于管壁而減少流過所述管道的流體的摩擦拽力。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述菌毛蛋白肽綴合物是具有共價連接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或兩端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述肽綴合物中的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500kDal之間。
4.權(quán)利要求1-3的方法，其中引入管道的所述綴合物中的菌毛蛋白肽含有確定為SEQID NO: 10的序列。
5.權(quán)利要求4的方法，其中引入管道的所述綴合物中的菌毛蛋白肽含有確定為SEQIDNO: 3、4或9的序列。
6.權(quán)利要求1-5的方法，其中所述菌毛蛋白肽綴合物所附著的管道內(nèi)表面選自金屬、聚合物、陶瓷或硅酸鹽表面。
7.權(quán)利要求1-6的方法，其中施加菌毛蛋白肽的的管道內(nèi)表面是選自不銹鋼、碳鋼、鈦、銅、黃銅、錫、鐵 、銀、和鎂及其合金的金屬表面。
8.權(quán)利要求1-7的方法，其中所述管道具有不銹鋼內(nèi)表面并且通過所述引入而附著于管道內(nèi)表面的菌毛蛋白肽綴合物的量足以減少所述內(nèi)表面的腐蝕。
9.權(quán)利要求1-8的方法，其中通過所述引入而附著于管道內(nèi)壁的菌毛蛋白肽綴合物的量足以減少引入管道中的含砂漿液的摩擦拽力。
10.權(quán)利要求1-9的方法，其中所述引入包括在正常操作期間將所述肽綴合物定期加入到引入管道中的流體中。
11.具有用綴合物涂布的一個或多個暴露的金屬、聚合物、陶瓷或硅酸鹽表面的制品，所述綴合物是以下的綴合物:(i)含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述綴合物的量足以減少所述一個或多個暴露的表面的摩擦系數(shù)。
12.權(quán)利要求11的制品，其中所述菌毛蛋白肽綴合物是具有共價連接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或兩端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
13.權(quán)利要求11或12的制品，其中所述綴合物中的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal 之間。
14.權(quán)利要求11-13的制品，其中所述綴合物中的菌毛蛋白肽含有確定為SEQID NO:10的序列。
15.權(quán)利要求14的制品，其中引入管道的所述綴合物中的菌毛蛋白肽含有確定為SEQID NO: 3、4或9的序列。
16.權(quán)利要求11-15的制品，其中所述制品的一個或多個暴露的表面是金屬表面。
17.權(quán)利要求11-16的制品，其中所述制品的一個或多個暴露的表面是不銹鋼表面，并且涂布所述表面的所述肽綴合物以足以降低所述表面的腐蝕速率的量存在。
18.權(quán)利要求11-17的制品，所述制品是其內(nèi)壁表面用所述肽綴合物涂布的管道，并且涂布所述表面的所述肽綴合物以足以減少流過所述管道的流體的摩擦拽力的量存在。
19.權(quán)利要求11-17的制品，所述制品是寬度尺寸為100微米或更小的微流體通道，其內(nèi)壁表面用所述肽綴合物涂布并且涂布所述表面的所述肽綴合物以足以減少流體流過所述通道的摩擦拽力的量存在。
20.權(quán)利要求11-17的制品，所述制品包括砂顆粒，其外表面用足量的所述肽綴合物涂布，以減少所述涂布的顆粒漿液流過管道的摩擦拽力。
21.權(quán)利要求11-17的制品，所述制品是具有活動部件的機器，其涂布肽的表面是彼此移動接觸的。
22.權(quán)利要求11-17的制品，所述制品是具有用所述肽綴合物涂布的暴露的金屬表面的電子器件。
23.權(quán)利要求11-17的制品，所述制品是具有不銹鋼或鈦表面的矯形植入器件，并且涂布所述表面的所述肽綴合物以足以抑制涂布的表面上生物膜形成的量存在。
24.一種制品，所述制品包括: (i)具有暴露的表面的元件，其可在普通使用條件下被非假單胞菌細菌用作生物膜形成的基底，和 (ii)與所述表面結(jié)合的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基，和任選共價連接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制這類非假單胞菌細菌的生物膜形成。
25.權(quán)利要求24的制品，所述制品是旨在植入或駐留體內(nèi)的醫(yī)療器件，其中結(jié)合到所述制品表面的所述菌毛蛋白肽是綴合到聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
26.權(quán)利要求24-25的制品，其中所述肽綴合物中的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal 之間。
27.權(quán)利要求24-26的制品，其中所述菌毛蛋白肽含有確定為SEQID NO: 10的序列。
28.權(quán)利要求24-27的制品，其中所述菌毛蛋白肽含有確定為SEQID NO: 3、4或9的序列。
29.權(quán)利要求24-28的制品，與所述合成的菌毛蛋白肽結(jié)合的所述制品的表面選自金屬、聚合物、陶瓷或娃酸鹽表面。
30.權(quán)利要求24-29的制品，其中與所述合成的菌毛蛋白肽結(jié)合的所述制品的表面是選自不銹鋼、碳鋼、鈦、銅、黃銅、錫、鐵、銀、和鎂及其合金的金屬表面。
31.權(quán)利要求24-30的制品，其中與所述合成的菌毛蛋白肽結(jié)合的所述制品的表面是不銹鋼表面，和所述菌毛蛋白肽與所述表面共價結(jié)合。
32.權(quán)利要求24-30的制品，所述制品用于抑制利斯特氏菌或葡萄球菌的生物膜形成，其中所施加的菌毛蛋白肽的量分別有效地抑制利斯特氏菌或葡萄球菌的生物膜形成。
33.在處理具有暴露的晶粒邊界區(qū)的表面的金屬材料的方法中為了降低所述材料的腐蝕速率的改進，所述改進包括: 使所述材料中的暴露的表面邊界區(qū)與D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽接觸，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基，和任選共價連接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制所述材料的腐蝕速率。
34.權(quán)利要求33的改進，其中所述菌毛蛋白肽綴合物是具有共價連接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或兩端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
35.權(quán)利要求33-34的改進，其中連接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500kDal之間ο
36.權(quán)利要求33-35的改進，其中所述菌毛蛋白肽含有確定為SEQID NO: 10的序列。
37.權(quán)利要求33-36的改進，其中引入管道的所述綴合物中的菌毛蛋白肽含有確定為SEQ ID NO: 3、4 或 9 的序列。
38.權(quán)利要求33-37的改進，其中所述接觸有效地使暴露的晶粒邊界區(qū)的電子功函變化至少0.3 eV EFW單位并使暴露的晶粒邊界區(qū)的硬度增加至少20%，所述硬度通過用原子力顯微鏡的尖端以給定力沖擊金屬表面產(chǎn)生的納米壓痕來測定。
39.權(quán)利要求33-38的改進，其中所述金屬選自不銹鋼、碳鋼、鈦、銅、黃銅、錫、鐵、銀、和鎂及其合金。
40.權(quán)利要求33-39的改進，其中所述金屬材料是不銹鋼，和所述接觸步驟使涂布表面的腐蝕速率降低至少30%，所述腐蝕速率通過穿過所述表面的腐蝕電流來測定。
41.權(quán)利要求33-40的改進，其中所述金屬材料是多孔的或網(wǎng)狀的，和實施所述接觸步驟以使所述菌毛蛋白肽與由所述材料內(nèi)的孔或網(wǎng)眼確定的內(nèi)表面結(jié)合。
42.權(quán)利要求33-40的改進，其中所述金屬材料具有暴露的晶粒邊界區(qū)，和所述接觸步驟有效地使所述菌毛蛋白肽與所述晶粒邊界區(qū)選擇性地結(jié)合，由此通過優(yōu)先保護在其晶粒邊界區(qū)處的表面來增強金屬表面的硬度和腐蝕抗性。
43.一種抑制對設計成植入受試者內(nèi)的醫(yī)療器件的炎性反應的方法，所述方法包括: 在植入所述器件之前，用合成的菌毛蛋白肽涂布所述器件的暴露的表面，所述合成的菌毛蛋白肽含有(i)衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)，(?)位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩個末端側(cè)的0-10個額外殘基，和(iii)包含逆-倒位(RI)型的D-氨基酸，和任選具有共價連接于所述肽的聚乙二醇部分。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述菌毛蛋白肽是具有共價連接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或兩端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
45.權(quán)利要求43-44的方法,其中連接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500kDal之間。
46.權(quán)利要求43-45的方法，其中所述菌毛蛋白肽含有確定為SEQID NO: 10的序列。
47.權(quán)利要求43-46的方法，其中引入管道的所述綴合物中的菌毛蛋白肽含有確定為SEQ ID NO: 3、4 或 9 的序列。
48.一種用于檢測分析物的生物傳感器器件，所述器件包括: (a)導電金屬基底，其具有(i)生物傳感器表面(ii)與所述基底表面結(jié)合的D型(RI)合成的菌毛蛋白肽，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基，和任選具有共價連接于所述肽的聚乙二醇部分，和(iii)直接或間接地共價連接于所述菌毛蛋白肽的受體，和 (b)用于檢測響應分析物相關配體與表面結(jié)合的受體的結(jié)合的穿過基底表面的電學性質(zhì)變化的檢測器。
49.權(quán)利要求48的生物傳感器器件，其中所述生物傳感器基底由不銹鋼形成，并且結(jié)合在其上的菌毛蛋白肽是D型菌毛蛋白肽。
50.權(quán)利要求48-49的生物傳感器器件，其中所述受體通過卷曲螺旋E/Κ螺旋對而共價連接于菌毛蛋白肽，所述螺旋對中的一個共價連接于菌毛蛋白肽，而另一個則連接于受體上。
51.使化合物共價連接于由不銹鋼、錫、鐵或鈦形成的基底的一個或多個暴露的表面的方法，所述方法包括: 使所述基底的一個或多個暴露的表面與D型合成的菌毛蛋白肽接觸，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基，和任選具有共價連接于所述肽的聚乙二醇部分，由此使所述菌毛蛋白肽共價地結(jié)合到一個或多個暴露的表面，和 在所述接觸和結(jié)合之前或之后，使所述化合物共價連接于所述菌毛蛋白肽。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述基底表面具有暴露的晶粒邊界區(qū)，并且所述接觸步驟有效地使所述化合物優(yōu)先定位在暴露的晶粒邊界區(qū)處。
53.權(quán)利要求51-52的方法，其中所述菌毛蛋白肽是具有共價連接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或兩端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
54.權(quán)利要求51-53的方法,其中連接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500kDal之間。
55.權(quán)利要求51-54的方法，其中所述菌毛蛋白肽含有確定為SEQID NO: 10的序列。
56.權(quán)利要求51-55的方法，其中所述化合物選自肽、寡糖、脂質(zhì)、核酸和有機小分子。
57.權(quán)利要求51-56的方法，其中所述材料是多孔的或網(wǎng)狀的，并且所述接觸有效地使所述菌毛蛋白肽與由所述材料內(nèi)的孔或網(wǎng)眼確定的內(nèi)表面結(jié)合。
58.一種基底，其表面結(jié)合有(i) D型合成的菌毛蛋白肽，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型銅綠假單胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受體結(jié)合蛋白的二硫環(huán)和含有位于所述環(huán)的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或這兩末端側(cè)的0-10個額外殘基，和任選具有共價連接于所述肽的聚乙二醇部分，和(ii)化合物，所述化合物直接或間接地共價連接于所述菌毛蛋白肽。
59.權(quán)利要求58的基底，所述基底由選自不銹鋼、碳鋼、鈦、銅、黃銅、錫、鐵、銀、和鎂及其合金的金屬形成，并且所述基底用作生物傳感器電響應元件，其中所述化合物是通過共價鍵直接連接于所述菌毛蛋白肽或通過Κ/E螺旋的/螺旋對間接連接于所述菌毛蛋白肽的分析物受體分子，其中所述螺旋中的一個共價連接于所述菌毛蛋白肽，而另一個螺旋共價連接于所述化合物。
60.權(quán)利要求58-59的基底，其中所述菌毛蛋白肽是具有共價連接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或兩端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
61.權(quán)利要求58-60的基底,其中連接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500kDal之間.
62.權(quán)利要求58-61的基底，其中所述菌毛蛋白肽含有確定為SEQID NO: 10的序列。
63.權(quán)利要求58-62的基底，其中引入管道的所述綴合物中的菌毛蛋白肽含有確定為SEQ ID NO: 3、4 或 9 的序列。
64.權(quán)利要求58-63的基底，所述基底由不銹鋼形成，并且所述基底可因所述菌毛蛋白肽結(jié)合在其表面而具有改變的電子功函。
【文檔編號】C07K14/195GK103930446SQ201280029572
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月14日
【發(fā)明者】R.T.歐文, E.M.戴維斯, D.李, D.A.馬魯夫 申請人:凱旋門生物物理學公司