專利名稱：一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殺蟲殺螨的植物提取物，尤其是涉及一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物。
背景技術(shù)：
螨病是由肉食性螨寄生于動物體表或表皮內(nèi)所引起的以皮膚劇烈瘙癢、嚴(yán)重皮膚炎癥和接觸性傳播為特征的外寄生蟲病。螨病普遍存在于世界各地，呈季節(jié)性發(fā)生，可造成患病動物消化吸收機能降低，生產(chǎn)性能及產(chǎn)品品質(zhì)下降，甚至引起動物大批死亡，同時也威脅人類健康。多年來，科學(xué)工作者一直致力于研究和尋求有效的控制方法。
目前，螨病的防治主要以化學(xué)合成類藥物為主，而由此產(chǎn)生的藥物殘留、環(huán)境危害及抗藥性等問題，已引起人們的廣泛關(guān)注。植物源藥物具有不易產(chǎn)生耐藥性、不易在畜產(chǎn)品中殘留、在環(huán)境中可自行降解、對人畜及環(huán)境相對安全等特點而受到青睞。植物源藥物為材料研制和開發(fā)殺蟲殺螨劑已成為重要的課題。
我國植物資源豐富，藥用歷史悠久，但多數(shù)藥物的活性研究相對滯后。在植物源殺蟲殺螨劑方面，魚藤、狼毒、苦楝、橘皮、苦參、丁香等少數(shù)藥物的研究較深入，有些已被開發(fā)為商業(yè)殺蟲劑。而這些藥物中，有些毒性較大，有些在原植物中含量低，生產(chǎn)成本高，極大地限制了在畜牧業(yè)生產(chǎn)實際中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決上述背景技術(shù)中的不足之處，提供一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物，其對家兔等動物的癢螨和疥螨均有良好的殺滅作用，為一種高效、低毒、環(huán)保的新型植物源殺蟲殺螨新藥。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物，其特征在于所述植物提取物為茵陳提取物。
上述茵陳提取物為茵陳工業(yè)酒精提取物。
上述茵陳提取物的活性部位為茵陳正丁醇部位提取物。
上述茵陳提取物的殺螨活性成分為4-甲基-7-羥基香豆素。
上述茵陳工業(yè)酒精提物的制備步驟為茵陳粗粉10g，置100mL圓底燒瓶內(nèi)，加工業(yè)酒精80mL，室溫浸泡30min，75℃水浴熱回流提取3次，分別提取60min、45min、30min，合并提取液，布氏漏斗抽濾，減壓回收溶劑至無醇味，用吐溫-80等助溶劑溶解，制成濃度為50％的藥液。
茵陳殺螨活性部位篩選的步驟為茵陳粗粉30g，依次用沸程30～60℃的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、蒸餾水進行水浴熱回流提取，每種溶劑提取4次，每次加溶劑60mL，提取60min，分別合并各溶劑提取液，減壓回收溶劑，得5種不同溶劑提取物，其中石油醚提取物以食用油溶解，其余溶劑提取物均用20％吐溫-80溶解，制成濃度為50％的藥液，離體殺螨試驗篩選活性部位，確定活性部位為茵陳正丁醇部位提取物。
4-甲基-7-羥基香豆素的分離純化步驟為茵陳正丁醇部位提取物在200目硅膠柱中，依次用氯仿、50∶1，20∶1，10∶1，8∶1，5∶1，3∶1的氯仿∶甲醇、甲醇洗脫，分段收集，以9∶1的乙酸乙酯∶冰醋酸為展開劑進行薄層層析檢查，依次得到A、B、C、D、E、F、G、H八分段，C段洗脫物以17∶2∶0.2的苯∶甲醇∶冰乙酸為展開劑，薄層層析檢查，顯兩個不同的斑點，經(jīng)進一步柱層析純化，得到的高效殺螨活性成分，經(jīng)理化性質(zhì)、13C-NMR、1H-NMR譜圖分析，鑒定為4-甲基-7-羥基香豆素。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下本發(fā)明從茵陳中分離純化的4-甲基-7-羥基香豆素25％濃度時，體外殺死全部供試螨蟲的時間為11.00min。4-甲基-7-羥基香豆素與原植物茵陳及其制品臨床常用于治療肝膽疾病，春季萌發(fā)的茵陳幼苗常作為蔬菜食用，對人畜安全。原植物茵陳野生植物資源豐富，也可進行人工栽培，4-甲基-7羥基香豆素化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單，容易合成。4-甲基-7-羥基香豆素為一種高效、低毒、環(huán)保的新型植物源殺蟲殺螨新藥。
四

圖1為4-甲基-7-羥基香豆素的結(jié)構(gòu)圖。
五具體實施例方式本發(fā)明為一種用于殺蟲殺螨的植物提取物，植物提取物為茵陳工業(yè)酒精提取物，茵陳活性部位為茵陳正丁醇部位提取物，茵陳提取物的殺螨活性成分為4-甲基-7-羥基香豆素。
茵陳工業(yè)酒精提物的制備步驟為茵陳粗粉10g，置100mL圓底燒瓶內(nèi)，加工業(yè)酒精80mL，室溫浸泡30min，75℃水浴熱回流提取3次，分別提取60min、45min、30min，合并提取液，布氏漏斗抽濾，減壓回收溶劑至無醇味，用吐溫-80等助溶劑溶解，制成濃度為50％的藥液。
茵陳殺螨活性部位篩選的步驟為茵陳粗粉30g，依次用石油醚(沸程30～60℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、蒸餾水進行水浴熱回流提取。每種溶劑提取4次，每次加溶劑60mL，提取60min。分別合并各溶劑提取液，減壓回收溶劑，得5種不同溶劑提取物，其中石油醚提取物以食用油溶解，其余溶劑提取物均用20％吐溫-80溶解，制成濃度為50％的藥液，離體殺螨試驗篩選活性部位，確定活性部位為茵陳正丁醇部位提取物。
4-甲基-7-羥基香豆素的分離純化步驟為茵陳正丁醇部位提取物在200目硅膠柱中，依次用氯仿、氯仿∶甲醇(50∶1，20∶1，10∶1，8∶1，5∶1，3∶1)、甲醇洗脫，分段收集，以乙酸乙酯∶冰醋酸(9∶1)為展開劑進行薄層層析(TLC)檢查，依次得到A、B、C、D、E、F、G、H八分段，C段洗脫物以苯∶甲醇∶冰乙酸(17∶2∶0.2)為展開劑，TLC檢查，顯兩個不同的斑點，經(jīng)進一步柱層析純化，得到的高效殺螨活性成分，經(jīng)理化性質(zhì)、13C-NMR、1H-NMR譜圖分析，鑒定為4-甲基-7-羥基香豆素。
本發(fā)明對茵陳、橘葉、地膚子、蓖麻粕等四味植物源性藥物的工業(yè)酒精提取物，用吐溫-80配成50％濃度的溶液，對兔癢螨(Psoroptes communis cuniculi)進行離體殺螨試驗，發(fā)現(xiàn)四味藥物均可在100min內(nèi)殺死全部供試螨蟲，其中茵陳的殺螨平均時間為44.33min，殺螨效果明顯優(yōu)于其它三味藥物。表現(xiàn)出較高的殺螨活性，進一步經(jīng)溶劑部位分離、柱層析純化及活性追蹤，得到一種高效殺蟲殺螨活性成分，鑒定為4-甲基-7-羥基香豆素。
1材料與方法1.1試驗材料1.1.1供試藥物茵陳，2006年3月采集于陜西省楊陵鎮(zhèn)，鑒定為豬毛蒿(Artemisia scopariaWaldst et Kit)，陰干粉碎。橘葉，收集于陜西省楊陵鎮(zhèn)集市，陰干粉碎。蓖麻粕，購于陜西省榆林地區(qū)。地膚子，購于楊陵藥材公司，粉碎備用。
1.1.2供試螨蟲采自自然感染的家兔耳廓內(nèi)。病兔耳廓內(nèi)多長滿血痂，靠近耳道內(nèi)側(cè)濕潤，呈團塊狀，外部相對稍干燥，呈卷紙狀，患兔瘙癢不安，用小鑷子剝?nèi)《纼?nèi)痂皮，置玻璃平皿內(nèi)，平皿邊緣涂少量螨蟲驅(qū)避劑，加熱37℃左右，用挑蟲針挑取活力強的螨蟲供試驗用。根據(jù)螨蟲形態(tài)，鑒定為兔癢螨(Psoroptes communiscuniculi)。
1.1.3主要試劑工業(yè)酒精，油醚(沸程30～60℃)，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇，食用油，硅膠G，羧甲基纖維素鈉。
1.1.4主要儀器Mercury-400核磁共振儀，DZF型電熱恒溫真空干燥箱，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，F(xiàn)W135/177型中草藥粉碎機，SHB-B95型循環(huán)水多用真空泵，2XZ型系列旋片式真空泵等。
1.2試驗方法1.2.1殺螨活性藥物的篩選1.2.1.1提取物制備藥材粉末10g，置100mL圓底燒瓶內(nèi)，加工業(yè)酒精80mL，室溫浸泡30min，75℃水浴熱回流提取3次，分別提取60min、45min、30min，合并提取液，布氏漏斗抽濾，減壓回收溶劑至無醇味，用20％吐溫-80溶解，制成濃度為50％的藥液。
1.2.1.2離體殺螨試驗在凹孔玻璃板上滴加數(shù)滴供試藥液，將活力強的螨蟲6只放入藥液，在顯微鏡下觀察，同時進行溶劑對照試驗。每隔10min觀察1次，每次持續(xù)觀察2min，直至6只螨蟲全部死亡，記錄螨蟲死亡時間，每種試驗藥物設(shè)置3個重復(fù)，計算殺死全部螨蟲的平均時間。
1.2.2茵陳殺螨活性部位篩選茵陳粗粉30g，依次用石油醚(沸程30～60℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、蒸餾水進行水浴熱回流提取。每種溶劑提取4次，每次加溶劑60mL，提取60min。分別合并各溶劑提取液，減壓回收溶劑，得5種不同溶劑提取物，其中石油醚提取物以食用油溶解，其余溶劑提取物均用20％吐溫-80溶解，制成濃度為50％的藥液，離體殺螨試驗篩選活性部位。
1.2.3茵陳殺螨活性成分分離純化1.2.3.1柱層析分離茵陳正丁醇部位提取物5g在200目硅膠柱中，依次用氯仿、氯仿∶甲醇(50∶1，20∶1，10∶1，8∶1，5∶1，3∶1)、甲醇洗脫，分段收集，減壓回收溶劑，TLC檢查，合并相同組分，離體殺螨試驗檢測活性。C段洗脫物為黃色粉末，經(jīng)TLC檢查顯2個點，柱層析進一步分離純化，得到I、II兩個化合物，離體殺螨活性試驗檢測活性。
1.2.3.2結(jié)構(gòu)鑒定化合物II，經(jīng)理化性質(zhì)檢測、13C-NMR、1H-NMR譜圖測定和分析，鑒定結(jié)構(gòu)。
2試驗結(jié)果2.1殺螨活性藥物的篩選結(jié)果茵陳、橘葉、地膚子、蓖麻粕的工業(yè)酒精提取物均可在100min內(nèi)殺死全部供試螨蟲，具有明顯殺螨活性，其中茵陳工業(yè)酒精提取物50％濃度時，殺死全部試驗螨蟲的平均時間為44.33min，殺螨活性最為突出(表2-1)。
表1茵陳、橘葉、地膚子、蓖麻粕工業(yè)酒精提取物對兔癢螨的離體殺滅效果

注對照組供試螨蟲24h內(nèi)未見死亡。
2.2茵陳殺螨活性部位篩選結(jié)果茵陳的乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物分別在74.00、42.00min可殺死全部供試螨蟲，石油醚提取物、氯仿提取物、蒸餾水提取物在120min內(nèi)不能殺死全部供試螨蟲。正丁醇提取物為茵陳的高效殺螨活性部位(表2)。
表2茵陳部位提取物對試驗螨蟲的殺滅效果

注-表示120min內(nèi)不能殺死全部供試螨蟲，對照組供試螨蟲24h內(nèi)未見死亡。
2.3茵陳殺螨活性成分分離純化結(jié)果茵陳正丁醇提取物經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，分段收集，TLC檢查，依次得到A、B、C、D、E、F、G、H八分段(表3)。C段洗脫物在25％濃度時，平均殺死全部供試螨蟲時間為13.33min(表4)。C段為茵陳正丁醇提取物殺螨活性段。
C段洗脫物以苯∶甲醇∶冰乙酸(17∶2∶0.2)為展開劑，TLC檢查，顯兩個不同的斑點，經(jīng)進一步柱層析純化，得到純化合物I、II?；衔颕在120min內(nèi)不能殺死全部供試螨蟲，化合物II的平均殺螨時間為11.00min(表5)，是茵陳的主要殺螨活性成分。
表3茵陳正丁醇部位提取物的硅膠柱層析分離結(jié)果

注TLC檢查顯色劑為1％Fecl3溶液?！?+++”表示顯色非常明顯，斑點較大且規(guī)則；“+++”表示顯色明顯，斑點較大；“++”表示顯色較明顯，斑點較小。
表4茵陳正丁醇部位提取物柱層析分離段的殺螨效果

注對照組供試螨蟲24h內(nèi)未見死亡。
表5茵陳正丁醇部位提取物柱層析C段純化合物的殺螨效果

注化合物I在120min中內(nèi)不能殺死全部供試螨蟲。
2.4化合物II的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果2.4.1化合物II的理化性質(zhì)化合物II為白色粉末狀結(jié)晶，無氣味，難溶于冷水，在丙酮中溶解性較好，熔點為186～187℃。在硅膠G薄板上，以苯∶甲醇∶冰乙酸(17∶2∶0.2)展開劑，上行法展開，0.1％FeCl3噴霧不顯色，在286nm紫外光下顯亮藍色熒光，Rf值為0.273。
2.4.2化合物II的1H-NMR、13C-NMR圖譜特征化合物II的1H-NMR譜，多數(shù)氫信號集中于δ6ppm以上的相對低場，結(jié)合化合物II的13C-NMR譜10個碳信號中有9個位于低場，δ160.2的碳信號示結(jié)構(gòu)中含有鏈接于不飽和鏈的酯羰基存在，屬香豆素類化合物；1H-NMR譜中δ6.67(1H，d，J＝1.6Hz)，δ6.76(1H，dd，J＝7.2Hz，1.6Hz)和δ7.54(1H，d，J＝7.2Hz)構(gòu)成苯環(huán)上的ABX偶合系統(tǒng)，提示A環(huán)上有6位或7位取代；δ10.48(1H，s)的氫信號為取代羥基的活潑氫信號，結(jié)合該信號的化學(xué)位移以及香豆素類化合物生源規(guī)律，認(rèn)為A環(huán)為7位羥基取代；δ2.33(3H，s)示結(jié)構(gòu)中含有連于雙鍵的甲基；δ6.08(1H，d，J＝0.4Hz)為烯氫信號。綜合以上解析，結(jié)合文獻報道，該化合物與4-甲基-7-羥基香豆素的波譜數(shù)據(jù)一致，鑒定該化合物為4-甲基-7-羥基香豆素(圖1)?；衔颕I的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)歸屬見表7。
表7茵陳柱層析純化合物II的13C-NMR、1H-NMR歸屬

3討論3.1關(guān)于植物源殺蟲殺螨劑化學(xué)殺蟲殺螨劑在過去幾十年中的廣泛使用，帶來了嚴(yán)重的藥物殘留、病原抗藥性等問題，而這些藥物在食品中的殘留和對環(huán)境的污染直接危害人類健康。植物源殺蟲殺螨劑的應(yīng)用在我國由來已久，隨著人們對生存環(huán)境質(zhì)量要求的不斷提高，研制和開發(fā)高效、低毒、環(huán)保的新型植物源殺蟲殺螨劑越來越受到人們的重視，并正在成為新藥開發(fā)的一條重要途徑。但目前臨床常用的殺蟲殺螨植物藥多以復(fù)方的形式使用，對單味藥物殺蟲殺螨活性的研究較少。本試驗對茵陳、橘葉、地膚子、蓖麻粕等的醇提取物進行離體殺螨試驗。結(jié)果表明，四味藥的工業(yè)酒精提取物均具有明顯殺螨活性，其中茵陳最為突出。
3.2茵陳的殺蟲殺螨活性茵陳味苦辛性微寒，入脾、胃、肝、膽經(jīng)，具有清熱利濕、平肝利膽的功效，常用于保肝、利膽、降血壓、降血脂和改善微循環(huán)，尤其對黃疸療效顯著。近年來研究發(fā)現(xiàn)，茵陳對南美斑潛蠅成蟲、玉米象等具有驅(qū)避或殺滅作用。從茵陳中分離出的茵陳二炔對斜紋夜蛾有光活化毒殺和生長發(fā)育抑制作用。以茵陳二炔為結(jié)構(gòu)母體人工合成的多炔類化合物對蚊幼蟲、紅蜘蛛、蘿卜蚜也具有光活化毒殺作用，對亞洲玉米螟、菜粉蝶的幼蟲具有拒食活性，對成蟲具有產(chǎn)卵忌避活性，其作用靶標(biāo)為昆蟲的味覺和嗅覺感受器。此外，6，7-二甲氧基香豆素、茵陳炔酮、丁香油酚甲酚、ar-姜黃烯和保米磷乙酸鹽可抑制甘藍蝴蝶幼蟲的進食。本試驗在藥物殺蟲殺螨活性篩選的基礎(chǔ)上，對茵陳的正丁醇部位提取物，經(jīng)溶劑分離、柱層析純化，結(jié)合殺螨活性追蹤分離得到一種高效活性成分，經(jīng)理化性質(zhì)、1H-NMR、13C-NMR圖譜特征分析，鑒定結(jié)構(gòu)為4-甲基-7-羥基香豆素，為新發(fā)現(xiàn)的茵陳殺蟲殺螨活性成分。
3.3 4-甲基-7-羥基香豆素的開發(fā)利用4-甲基-7-羥基香豆素與原植物茵陳及其制品臨床常用于治療肝膽疾病，春季萌發(fā)的茵陳幼苗常作為蔬菜食用，對人畜安全。原植物茵陳野生植物資源豐富，也可進行人工栽培，4-甲基-7羥基香豆素化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單，容易合成。因此，4-甲基-7-羥基香豆素為一種高效、低毒、環(huán)保的新型植物源殺蟲殺螨新藥，具有廣闊的開發(fā)利用前景。
權(quán)利要求
1.一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物，其特征在于所述植物提取物為茵陳提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物，其特征在于所述茵陳提取物為茵陳工業(yè)酒精提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物，其特征在于所述茵陳提取物的活性部位為茵陳正丁醇部位提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物，其特征在于所述茵陳提取物的活性成分為4-甲基-7-羥基香豆素。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物，其特征在于所述茵陳工業(yè)酒精提物的制備步驟為茵陳粗粉10g，置100mL圓底燒瓶內(nèi)，加工業(yè)酒精80mL，室溫浸泡30min，75℃水浴熱回流提取3次，分別提取60min、45min、30min，合并提取液，布氏漏斗抽濾，減壓回收溶劑至無醇味，用吐溫-80等助溶劑溶解，制成濃度為50％的藥液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物，其特征在于茵陳殺螨活性部位篩選的步驟為茵陳粗粉30g，依次用沸程30～60℃的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、蒸餾水進行水浴熱回流提取，每種溶劑提取4次，每次加溶劑60mL，提取60min，分別合并各溶劑提取液，減壓回收溶劑，得5種不同溶劑提取物，其中石油醚提取物以食用油溶解，其余溶劑提取物均用20％吐溫-80溶解，制成濃度為50％的藥液，離體殺螨試驗篩選活性部位，確定活性部位為茵陳正丁醇部位提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物，其特征在于4-甲基-7-羥基香豆素的分離純化步驟為茵陳正丁醇部位提取物在200目硅膠柱中，依次用氯仿、50∶1，20∶1，10∶1，8∶1，5∶1，3∶1的氯仿∶甲醇、甲醇洗脫，分段收集，以9∶1的乙酸乙酯∶冰醋酸為展開劑進行薄層層析檢查，依次得到A、B、C、D、E、F、G、H八分段，C段洗脫物以17∶2∶0.2的苯∶甲醇∶冰乙酸為展開劑，薄層層析檢查，顯兩個不同的斑點，經(jīng)進一步柱層析純化，得到的高效殺螨活性成分，經(jīng)理化性質(zhì)、13C-NMR、1H-NMR譜圖分析，鑒定為4-甲基-7-羥基香豆素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效、低毒、環(huán)保的植物殺蟲提取物，其對家兔等動物的癢螨和疥螨均有良好的殺滅作用，為一種高效、低毒、環(huán)保的新型植物源殺蟲殺螨新藥。本發(fā)明植物提取物為茵陳工業(yè)酒精提取物、茵陳正丁醇部位提取物，茵陳醇提取物的殺蟲殺螨活性成分為4－甲基－7－羥基香豆素。茵陳工業(yè)酒精提物的制備步驟為茵陳粗粉10g，置100mL圓底燒瓶內(nèi)，加工業(yè)酒精80mL，室溫浸泡30min，75℃水浴熱回流提取3次，分別提取60min、45min、30min，合并提取液，布氏漏斗抽濾，減壓回收溶劑至無醇味，用吐溫－80等助溶劑溶解，制成濃度為50％的藥液。
文檔編號A61P33/00GK101069702SQ20071001802
公開日2007年11月14日 申請日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日
發(fā)明者宋曉平, 豆傳娜, 程飛, 付明哲, 阮娜, 唐賢寶, 陳杰 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)