專利名稱：：包含截短的hbc核心蛋白和基于皂苷的佐劑的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及組合物、該組合物的生產(chǎn)方法、可以通過(guò)該方法獲得的組合物、藥物制劑、該組合物或該藥物制劑在治療和/或預(yù)防乙型肝炎病毒(HBV)感染和HBV介導(dǎo)的疾病中的用途、該組合物或該藥物制劑在生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途以及治療和/或預(yù)防HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病的方法。
背景技術(shù)：
：據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的估計(jì)，現(xiàn)今超過(guò)20億人感染或已經(jīng)感染乙型肝炎病毒(HBV)。因此，HBV屬于對(duì)人類健康產(chǎn)生巨大影響的最為重要的人類病原體。HBV感染可經(jīng)由血液、受污染血液制品及通過(guò)性交而發(fā)生，其中所述經(jīng)由血液的感染特別是由受感染母親在^L過(guò)程中或者在分娩以后不久傳給新生兒。HBV是一種嗜肝性病毒，能夠?qū)е侣院图毙愿腥尽１M管在出生時(shí)或者在出生后第1個(gè)月內(nèi)的感染在90%的病例中導(dǎo)致慢性感染，但這僅在大約10%的成年感染病例中被觀察到。在受感染成人中，有大約2%的人可發(fā)生與高死亡率相關(guān)聯(lián)的暴發(fā)性肝炎(急性肝衰竭)。慢性感染最初沒(méi)有臨床癥狀，但由于HBV的持續(xù)存在以及受感染肝細(xì)胞與免疫系統(tǒng)的病理相互作用，在10到30年的潛伏期后會(huì)t艮為急性肝疾病(慢性活動(dòng)性乙型肝炎)。大約25。/。的慢性HBV攜帶者將;^成為慢性乙型肝炎。慢性乙型肝炎最終將導(dǎo)致肝硬化和/或原發(fā)性肝細(xì)胞癌。兩種疾病都具有高死亡率。據(jù)估計(jì)目前全世界大約3.5億人為慢性感染的HBV攜帶者。每年大約1百萬(wàn)人死于慢性HBV感染所造成的不良后果。幸運(yùn)地是，HBV感染可通過(guò)預(yù)防性乙肝疫苗進(jìn)行預(yù)防。20世紀(jì)80年代開始，首次可以獲得基于從慢性攜帶者的血漿中純化的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的這種疫苗。之后，其被重組生產(chǎn)的HBsAg取代。然而，由于目前疫苗并未被常規(guī)地引入所有的國(guó)家中，HBV將仍然威脅著人類的健康。在本上下文中，有意義的是，慢性HBV攜帶者4皮認(rèn)為具有傳染性并能夠傳播該病毒。慢性乙型肝炎是一種具有多種表現(xiàn)形式的十分動(dòng)態(tài)的疾病。在慢性感染的早期階段，可以提及免疫耐受期，其特征是血清中存在病毒標(biāo)記(HBV-DNA,HBsAg，HBeAg)并且無(wú)肝臟問(wèn)題。大約25%的HBV攜帶者轉(zhuǎn)入免疫激活期，在其過(guò)程中出現(xiàn)最初的肝臟癥狀并且治療成為必需的。在免疫激活期，血清中的HBV-DNA—般會(huì)減少，而血清轉(zhuǎn)氨酶分批升高。盡管HBsAg在血清中持續(xù)存在，但有小百分比的患者(大約1%)會(huì)自發(fā)地經(jīng)歷由HBeAg陽(yáng)性轉(zhuǎn)為HBeAg陰性的血清轉(zhuǎn)換。這種血清轉(zhuǎn)換是進(jìn)入非活動(dòng)性攜帶期的征兆，其特征為病毒活性低。極少數(shù)情況下，也發(fā)現(xiàn)血清由HBsAg陽(yáng)性轉(zhuǎn)為抗HBsAg陽(yáng)性，這被認(rèn)為是感染疾愈的征兆。慢性活動(dòng)性乙型肝炎的特征在于肝組織的壞死性炎癥和纖維化，這最終將導(dǎo)致肝硬化和失代償性肝臟疾病。作為其它的并發(fā)癥，肝硬化可導(dǎo)致原發(fā)性肝細(xì)胞癌，由此一些慢性HBV攜帶者也可t艮成為肝癌，但無(wú)肝硬化的征候。用于活動(dòng)性'隄性乙型肝炎的治療可能方案是非常有限的。目前，治療可以通過(guò)采用a-干擾素(例如IntronA⑥或者RoferonA)或抗病毒物質(zhì)(Lamivudine，Adefovir，Entecavir)進(jìn)行。a-干擾素優(yōu)選用于HBeAg陽(yáng)性患者，有約30。/?；颊哂纱税l(fā)生與非活動(dòng)性攜帶狀態(tài)有關(guān)的HBeAg血清轉(zhuǎn)換反應(yīng)。因此，少數(shù)患者(約3%)也顯示出標(biāo)志著全面疾愈的HBsAg血清轉(zhuǎn)換。但采用a-干擾素進(jìn)行治療會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，往往需要提早停止該治療。與HBeAg陽(yáng)性的患者相比，a-干擾素在HBeAg陰性患者中顯示^^應(yīng)率。作為替代品，屬于核苷/核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑一類的抗病毒物質(zhì)可以在此使用。這些抗病毒物質(zhì)可抑制病毒的復(fù)制，并因此可阻止該肝病的t艮。HBeAg陽(yáng)性患者的該血清轉(zhuǎn)換率相對(duì)a-干擾素而言是較低的，并且不比自發(fā)的康復(fù)高。因此，該抗病毒療法的目標(biāo)是通過(guò)降低病毒活性從而無(wú)限期地延遲該疾病。然而抗病毒物質(zhì)的長(zhǎng)期使用受到抗性病毒突變體出現(xiàn)的危及。就最常用的藥物L(fēng)amivudine而言，已觀察到在四年中高達(dá)68%的耐藥率。最近推出的Adefovir似乎以較低的頻率引起耐藥性。即使抗病毒物質(zhì)可聯(lián)合使用，但病毒耐藥性這個(gè)基本問(wèn)題對(duì)于長(zhǎng)期治療仍是一個(gè)內(nèi)在的隱患。因此，迫切需要另外的治療手段來(lái)治療慢性乙型肝炎，尤其期望的是幾乎無(wú)副作用且有望對(duì)患者進(jìn)行短期治療的免疫調(diào)節(jié)劑。此類可選方案是治療性疫苗形式的特異性免疫治療。治療性疫苗的概念是特異地刺激慢性乙型肝炎患者的免疫系統(tǒng)以引發(fā)充足的抗病毒免疫應(yīng)答，該應(yīng)答最終導(dǎo)致對(duì)病毒的控制以及對(duì)該肝臟疾病;Ol的遏制。治療性疫苗必須顯示出的一個(gè)明顯效果是打破在大量病毒抗原存在時(shí)出現(xiàn)的免疫耐受。該治療尤其應(yīng)當(dāng)引起抗多種HBV抗原的病毒特異性T-細(xì)胞應(yīng)答，尤其是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。與急性、疾愈中的感染相比，在慢性乙型肝炎患者中確切地僅能夠顯示出極小程度的這些免疫應(yīng)答，或者根本不顯示這些免疫應(yīng)答。強(qiáng)病毒特異性CTL應(yīng)答通常被認(rèn)為代表著對(duì)病毒感染的控制。因此，治療性疫苗的開發(fā)以誘導(dǎo)強(qiáng)抗病毒CTL應(yīng)答作為首要目的。通常重組型亞單位疫苗不能引發(fā)CTL應(yīng)答。在動(dòng)物才莫型(小鼠)中，DNA疫苗，尤其是基于編碼乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的質(zhì)粒載體的DNA疫苗能夠?qū)崿F(xiàn)顯著的CTL應(yīng)答，但目前的疫苗至今全部在人體中僅顯示極微弱的免疫應(yīng)答并且不刺激任何有效的CTL應(yīng)答。由于這些困難，目前所謂的"致敏-加強(qiáng)疫苗，，正在研制中，藉此交替地采用DNA疫苗(如編碼HBsAg)及重組病毒載體(如，修飾后的痘苗病毒AnkaraStem),如表達(dá)HBsAg的載體進(jìn)行免疫(見(jiàn)McConkeyS.J.，SchneiderJ.，MendyM.，CavenaughJ.S.，BertolettiA.，WhittleH.，HillA.V.S."—種新型的針對(duì)乙型肝炎病毒的"致敏-加強(qiáng)"治療性免疫策略的安全性和免疫原性"，會(huì)議摘要"乙型肝炎病毒的分子生物學(xué)"，貝加莫，意大利，9月7日至10曰，2003年)。WO-A-01/98333描述了一種HBc抗原特別是用于HBV治療的用途，在該HBc抗原中C末端的一個(gè)或多個(gè)4精氨酸重復(fù)單位被去除，但C末端的半胱氨酸殘基被保留。去除的精氨酸重復(fù)單位可由能夠被輔助型T細(xì)胞、B-細(xì)胞或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所識(shí)別的、來(lái)源于細(xì)菌或病毒病原體、寄生蟲、過(guò)敏原或癌癥相關(guān)抗原的表位序列替代。WO-A-2005/023297描述了用于治療HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病的一種組合物，其包含至少兩種乙型肝炎表面抗原(HBsAg，s)，其片段和/或編碼它們的核酸，其中所述HBsAg在S-區(qū)和/或前Sl區(qū)具有不同的HBV基因型，并且所述組合物不包含HBcAg或編碼它的核酸。WO-A-2005/056051公開了尤其是用于治療或預(yù)防乙型肝炎感染的重組多肽組合物，其中該組合物包含多個(gè)組分，優(yōu)選地選自下列中的至少3個(gè)或全部4個(gè)a)核心-多肽元件，其包含HBV核心蛋白的免疫原性區(qū)的序列；b)表面抗原-多肽元件，其包含HBV表面抗原蛋白(S,M或L)的免疫原性區(qū)的序列；c)X-多肽元件，其包含HBV-X蛋白質(zhì)的免疫原性區(qū)的序列；和d)聚合酶-多肽元件，其包含HBV聚合酶蛋白的免疫原性區(qū)的序列，其中所述元件中至少有一個(gè)包含相應(yīng)的HBV蛋白的至少100個(gè)氨基酸。EP-A-1136077揭示了一種鼻用的疫苗組合物，包括HBsAg和任選地HBcAg，其也可以例如用作治療性疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于在人體中治療或預(yù)防乙型肝炎感染的疫苗的缺陷。具體地，本發(fā)明的目的是提供適用于治療人的組合物，該組合物與現(xiàn)有技術(shù)已知的組合物相比可以在慢性HBV感染患者中導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，特別是針對(duì)HBcAg的強(qiáng)烈的CTL應(yīng)答。該組合物將在盡可能多的慢性HBV感染患者中打破免疫耐受，而不管患者的HLA類型。根據(jù)本發(fā)明的組合物將能夠打破免疫耐受，而不管慢性患者的HBV基因型，并因此導(dǎo)致可以控制病毒的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。本發(fā)明的再一目的是提供一種可以以盡可能小的制備復(fù)雜度獲得具有上述優(yōu)點(diǎn)的組合物的方法。如下組合物有助于解決上述目的，該組合物包含i)HBcAgl-x(HBcAg=HBV核心抗原)、該抗原的片段、該抗原或者該抗原的片段的變體、或者其至少兩種的混合物，其中x是100到160的整數(shù)，優(yōu)選120到150的整數(shù)，尤其優(yōu)選140到149的整數(shù)，更優(yōu)選144到146的整數(shù)，最優(yōu)選等于145，ii)包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少兩種的混合物的佐劑，和任選地，iii)HBsAg、該抗原的片段、該抗原或該抗原的片段的變體、或者其至少兩種的;昆合物。盡管完全出乎意料，但是仍有利地發(fā)現(xiàn)，使用上述原則上適用于人的組合物，在動(dòng)物模型中可獲得強(qiáng)烈的核心特異性CTL應(yīng)答，該應(yīng)答與在同一動(dòng)物模型中采用編碼HBcAg的質(zhì)粒載體(DNA免疫)獲得的CTL應(yīng)答大致相當(dāng)。在如下詳述中使用的術(shù)語(yǔ)"多肽"是指氨基酸聚合物，并且無(wú)具體的最少Jl&酸數(shù)目限制。因此其同樣包括肽、寡肽、二聚體，三聚體，低聚體，顆粒等。再者，術(shù)語(yǔ)"多肽"不僅包括在核糖體中翻譯后直接得到的純^J^酸聚合物，還包括翻譯后通過(guò)糖基化、乙?；?、磷酸化等獲得的多肽。才艮據(jù)本發(fā)明，"HBcAgh"應(yīng)理解為是一種多肽，其包括天然HBcAg的第l位至第X位^IL基酸，優(yōu)選由天然HBcAg的第1位至第X位氛基酸組成，由此術(shù)語(yǔ)"HBcAgk"應(yīng)理解為指所有可以想到的、具有目前已知8種標(biāo)準(zhǔn)基因型A，B，C，D，E，F(xiàn)，G和H的HBcAg的第1位至第X位^J^酸的多肽(第一位氨基酸(=氨基酸1)是位于多肽的N末端的氨基酸)。這8種標(biāo)準(zhǔn)基因型在大約8%的核苷酸序列上互不相同(見(jiàn)Bartholomeusz，Rev.Med.Virol.13(2003)，l-14)，其中這些變異主要與HBsAg基因有關(guān)。HBV基因型A優(yōu)選包含參考核酸序列GenbankX02763或者相應(yīng)地HBV基因型Aafr包含根據(jù)GenbankAF297621的參考核絲列。對(duì)于HBV基因型Ba，參考核酸序列是GenbankD00330;對(duì)于基因型BP參考核*列是AB073858。對(duì)于HBV基因型C，參考核酸序列是GenbankAY206389;對(duì)于基因型Caus,參考核^列是GenbankAB048704。對(duì)于基因型D，參考核酸序列是GenbankX02496;對(duì)于基因型E，是GenbankX75657;對(duì)于基因型F，是GenbankX69798;對(duì)于基因型G，是GenbankAF160501;對(duì)于基因型H，是GenbankAY090454。術(shù)語(yǔ)HBcAgk的"片段"優(yōu)選理解為這樣的多肽，在該多肽中至少25個(gè)，優(yōu)選至少50個(gè)，尤其優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸的一段序列與HBcAgk中的對(duì)應(yīng)片段是一致的。術(shù)語(yǔ)HBcAgk或HBcAgk的片段的"變體"優(yōu)選理解為這樣的多肽，在該多肽中相對(duì)于HBcAgM或HBcAgn的片段有至多10個(gè)，優(yōu)選至多5個(gè)氨基酸，尤其優(yōu)選至多2個(gè)氨基酸，最優(yōu)選至多l(xiāng)個(gè)氨基酸已經(jīng)發(fā)生缺失、插入、替換或附加在C-或N-末端，優(yōu)選替換。術(shù)語(yǔ)"變體，，也包括包含HBcAgh的融合多肽，尤其是與HBsAg的融合。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)"佐劑"應(yīng)理解為指使得免疫應(yīng)答，優(yōu)選是針對(duì)抗原的CTL應(yīng)答能夠被i秀導(dǎo)的化合物。包含在根據(jù)本發(fā)明的組合物中的HBcAgm與天然的HBcAg相比截短的HBcAgk、缺少C-末端核酸結(jié)合區(qū)的至少一個(gè)部分，優(yōu)選整個(gè)C-末端核酸結(jié)合區(qū)的HBcAg",可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)已知的重組方法獲得。一種可能的方法是從病毒分離林中采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增核心或前核心閱讀框。也可以考慮合成制備相應(yīng)的DNA序列，然后采用PCR擴(kuò)增。然后將獲得的PCR片段克隆到質(zhì)粒載體上。然后，通過(guò)進(jìn)一步的PCR-克隆，可以將相應(yīng)縮短的形式插入到表達(dá)載體中，如插入到大腸桿菌表達(dá)載體中。在此，插入優(yōu)選以使編碼HBcAgk或片段或變體的基因分別受控于活性啟動(dòng)子下的方式進(jìn)行。表達(dá)載體可同時(shí)包括用于增加表達(dá)率的誘導(dǎo)元件。在將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中后，可獲得分別表達(dá)HBcAgk或片段或變體的單克隆。為了獲得可作為抗原的多肽，將單克隆轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中37'C搖瓶過(guò)夜培養(yǎng)。然后首先離心收集大腸桿菌培養(yǎng)物。緩沖液重懸細(xì)菌沉淀，之后超聲處理破碎或高壓勻漿破碎。將相應(yīng)地處于勻漿液中的HBcAg或者HBcAg變體，經(jīng)硫酸銨沉淀而濃縮，然后通過(guò)凝膠過(guò)濾除去細(xì)菌宿主成分進(jìn)行純化。形成顆粒的HBcAg變體可通過(guò)速率區(qū)帶離心進(jìn)一步純化。顆粒缺陷型HBcAgl_x理想地采用N端組氨酸標(biāo)簽親和標(biāo)記進(jìn)行工程化，并通過(guò)Ni-NTA-親和層析和隨后的凝膠過(guò)濾進(jìn)行純化。對(duì)由此產(chǎn)生的HBcAgh進(jìn)行除菌級(jí)過(guò)濾，并就此用于配制才艮據(jù)本發(fā)明的組合物。原則上才艮據(jù)本發(fā)明的組合物中的HBcAgl_x或其片段或變體也可人工合成獲得。有關(guān)重組或合成制備多肽的技術(shù)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可見(jiàn)于-Sambrook，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版(1989);-"DNA克隆"，巻I和II(D.N.Glover，編"1985);國(guó)"寡核苷酸合成"(M.J.Gait，編，1986);陽(yáng)"核酸雜交"(B.D.Hames&S.J.Higgins，編，1984);-"轉(zhuǎn)錄和翻譯"(B.D.Hames&S.J.Higgins，編，1984);-"動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)"(R.I.Freshney,編，1986);-，，固定化的細(xì)胞和酶"(IRLPress,1986);-B.Perbal，"分子克隆實(shí)踐指導(dǎo)"(1984);誦"TheMethodsinEnzymologyseries"(AcademicPress,Inc.),尤其是巻154和155;-"哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體"(J.H.Miller和M.P.Calos，編，1987，ColdSpringHarborLaboratory);陽(yáng)MayerundWalker,編，(1987)，"細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法"(AcademicPress,London);-Scopes,(1987)，"蛋白質(zhì)純化原理和操作"，第二版(Springer-Verlag，N.Y.)和-實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)"，巻I-IV(D.M.Weir和C.CBlackwell，編，1986)。原則上，包含于根據(jù)本發(fā)明的組合物中的HBcAgl_x可以是形成顆粒的或不形成顆粒的，其中優(yōu)選形成顆粒的HBcAgk。形成顆粒的HBcAgk可締合形成直徑約27nm的衣殼。180或240個(gè)二聚體締合形成大分子結(jié)構(gòu)。因此，根據(jù)一個(gè)尤其優(yōu)選的本發(fā)明的組合物的實(shí)施方案，HBcAgh以上述顆粒的形式存在。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的抗原尤其是HBcAgw24,HBcAgl_127，HBcAgl_144，HBcAgw45，HBcAgw拍，HBcAgw^,HBcAgM他HBcAgw"(即，包含天然HBcAg的頭127，144，145，146，147，148或149個(gè)氨基酸，優(yōu)選地由天然HBcAg的頭127，144，145，146，147，148或149個(gè)氨基酸組成的多肽)以及HBcAgsw33(HBcAg的片段，它包含天然HBcAg的81位至133位氨基酸，且優(yōu)選由天然HBcAg的81位至133位氨基酸組成)。再一優(yōu)選的抗原是HBcAgl.144+As,即，一種包含天然HBcAg的頭144個(gè)氮基酸并且包含氨基酸AS作為第145個(gè)氨基酸的多肽，其中所述AS與天然HBcAg第145位的谷氨酸不同，該不同于谷氨酸的AS氨基酸優(yōu)選為異亮氨酸。在根據(jù)本發(fā)明的組合物中，尤其優(yōu)選的抗原包括HBcAgl-145和HBcAg!-144+1。此外，根據(jù)本發(fā)明還優(yōu)選，HBcAgl-x不包含任何非HBcAg內(nèi)的表位，尤其是無(wú)HBsAg的表位。最優(yōu)選的是HBcAgl_x不包含前SI表位，尤其是不包含前SI抗原的第3至55位的氨基酸。基于本發(fā)明也優(yōu)選HBcAgl—x在C-末端X位，只要X不等于48，61或107，就不含半胱氨酸殘基。根據(jù)本發(fā)明的組合物的一個(gè)特定實(shí)施方案，它包含至少兩種HBcAgl_x或其片段或變體，其中所述HBcAgl_x具有不同的HBV基因型。根據(jù)本發(fā)明的組合物包括佐劑，所述佐劑包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少兩種的混合物。優(yōu)選地，該佐劑是皂苷復(fù)合物、皂苷衍生物的復(fù)合物或者其至少兩種的混合物。尤其優(yōu)選地，皂苷復(fù)合物或皂苷衍生物的復(fù)合物^J旨質(zhì)體皂苷復(fù)合物或脂質(zhì)體皂苷衍生物復(fù)合物。本發(fā)明中尤其優(yōu)選皂苷復(fù)合物、皂苷衍生物的復(fù)合物或者其至少兩種的混合物包含不同于水或鹽水溶液的組分(al)0至95wt.%，尤其優(yōu)選10至50wt,。/。，最優(yōu)選15至25wt.%的磷脂，(a2)0至95wt.%，尤其優(yōu)選IO至50wt.。/。，及最優(yōu)選15至25wt,%的類固醇，(a3)5至100wt.%,尤其優(yōu)選15至90wt.%，及最優(yōu)選30至80wt.%的皂苷或皂苷衍生物，以及(a4)0至20wt.%，尤其優(yōu)選1至15wt.%，及最優(yōu)選5至10wt.%的其它添加劑，例如不同于磷脂和類固醇脂質(zhì)的其它脂質(zhì)或者不同于水的溶劑，其中，所述以重量計(jì)的量分別基于皂苷復(fù)合物的總重量或皂苦f汙生物的復(fù)合物的總重量，所述總重量不包括復(fù)合物的水部分或其鹽水溶液部分，并且(al)至(a4)組分的總和為100wt.%。該類型的皂苷復(fù)合物在文獻(xiàn)中也有提及，尤其是"ISCO-基質(zhì)"。如果組合物除了包括(al)到(a4)組分，還包括蛋白質(zhì)作為抗原，則該復(fù)合物稱為"ISCOM⑧"磷脂(al)優(yōu)選是選自由磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酰膽堿組成的組的磷脂。類固醇(a2)優(yōu)選是選自由膽固醇，羊毛甾醇，光固醇，豆甾醇及谷甾醇組成的組的、來(lái)源于動(dòng)物或植物的類固醇。根據(jù)本發(fā)明，皂苷優(yōu)選理解為糖和類固醇、類固醇生物堿或三薛之間的化學(xué)化合物或這些化合物的混合物。這些化合物也可稱為類固醇皂苷，類固醇生物堿皂苷和三辟皂苦。這些皂苦為表面活性糖苷并可從植物中獲得，其中來(lái)源于南美皂皮樹(Quillajasapoimria)的皂苷作為佐劑最有效，優(yōu)選來(lái)源于該樹的樹皮。從皂皮樹中分離皂苷時(shí)，可獲得部分純化形式的被稱為"QuilA"的提取物(該部分純化的皂苷提取物具有確定的三萜皂苷含量，它比粗皂苷提取物的毒性低)其它合適的皂苷由R.Tschesche和Wulf在"ChemieundBiologiederSaponineinFortschrittederChemieOrganischerNaturstqffe"(H.Herz，H.Grisebach，G.W.Kirby出版，Vol.30(1973))中進(jìn)行了敘述。尤其是強(qiáng)極性皂苷如極性三辟皂普，特別是極性乙酸雙糖鏈皂普(aceticbisdesmosides),例如來(lái)自Quillaja樹皮的鬼普提取物AralosidA，ChikosetsusaponinIV，Calendula-GlycosideC,ChikosetsusaponinV，Achyrran-thes-SaponinB,Calendula-GlycosideA，AralosidB，AralosidC，Putranji-SaponinIII，Bersamasaponisid,Putrajia-SaponinIV，TrichosidA,TrichosidB,SaponasidA，TrichosidC，Gypsosid，Nutanosid,DianthosidC，SaponasidD,優(yōu)選從Aesculushippocastanum獲得的Aescin(T.PattandW.Winkler:"Dasthera-peutischwirksamePrinzipderRosskastanie(Aesculushippocastanum)"，Arzneimittelforschung10(4)，273-275(I960)).皂苷(a3)優(yōu)選為稱為"QuilA"的從皂皮樹的樹皮中部分純化的皂苷提取物(其由至少22種不同的皂苷級(jí)分組成)、該勻質(zhì)的QuilA級(jí)分的亞級(jí)分，如QS7，QS17，QS18或QS21，或者從勻質(zhì)的QuilA獲得的亞級(jí)分中的至少兩種的混合物，優(yōu)選WO-A-96/11711中所描述的亞級(jí)分A和C的混合物。該混合物優(yōu)選由50至90wt.%的級(jí)分A和10至50wt.%的級(jí)分C組成,其中參照WO-A-96/11711的實(shí)施例1獲得級(jí)分A和C。該類型混合物通過(guò)商業(yè)途徑可獲得，如可以提及"18<:01^@703"。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方案，該皂苷也可由100wt。/。的級(jí)分C組成。除了由QuilA來(lái)源的皂苷外，例如US6,262,029中所描述的皂苷^t生物也可包含于所述復(fù)合物中。根據(jù)本發(fā)明，適宜的皂苷復(fù)合物尤其是通過(guò)商業(yè)途徑可獲得的AblSCO⑧國(guó)100，AbISCO-200，AblSCO⑧曙300(ISCONOVA，Uppsala，Sweden)或StimulonQS-21(ANTIGENICS，Woburn，USA)產(chǎn)品。上述皂苷復(fù)合物(ISCO-基質(zhì))的生產(chǎn)可通過(guò)任何為技術(shù)人員已知的生產(chǎn)這些復(fù)合物的方法進(jìn)^f于。這些類型的皂苷復(fù)合物的優(yōu)選的生產(chǎn)方法，例如已在EP-A-0231039(脂質(zhì)體皂苷復(fù)合物)中或在WO-A-90/03184(非脂質(zhì)體皂苷復(fù)合物)中進(jìn)行了描述，它們關(guān)于ISCO-基質(zhì)生產(chǎn)的公開在此《1入作為參考文獻(xiàn)并且形成本發(fā)明公開的一部分。根據(jù)本發(fā)明的組合物如果包含ISCO-基質(zhì)作為佐劑，那么，根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步優(yōu)選所述抗原(一種或多種)不位于ISCO-基質(zhì)內(nèi)部，這與已知的ISCOM的情況不同。本發(fā)明組合物的一個(gè)特定實(shí)施方案，除了皂苷復(fù)合物或皂普衍生物復(fù)合物或者其至少兩種的混合物外，本發(fā)明組合物還可包含共佐劑(co-adjuvant)，不包含皂苷或皂苷衍生物的其它佐劑，其中這些共佐劑可以與復(fù)合物分開存在或整合到該復(fù)合物中。作為共佐劑，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的、在疫苗中常用的佐劑均可使用。優(yōu)選的佐劑選自顆粒佐劑，如亞微水包油乳劑(屬于其的有如MF59(5%角蓋烯，0.5%吐溫80和0.5%Span85)，SAF(10%角篁烯，0.4%吐溫80，5%Pluron嵌段聚合物))和thr-胞壁酰二肽(thr-MDP)，無(wú)機(jī)化合物(如，氫氧化鋁，硫酸鋁或磷酸鋁)，不完全弗氏佐劑，脂多糖，N-乙酰基葡糖胺基-N-乙?；邗?L-丙氨酰-二肽(GMDP)或胞壁酰二肽(MDP)，GAL-神經(jīng)酰胺，溴化二甲基雙十八烷基銨(DDAB)，脂質(zhì)體(優(yōu)選包含磷脂和膽固醇)，可生物降解的聚合物微球如聚乳酸一羥基乙酸共聚物(PLGA)，有或無(wú)CpG-基序的寡脫氧核糖核苷酸，N，N-二-(p-硬脂酰基乙基)-N，N-二曱基銨氯化物(EQl)，糖肽，分枝桿菌的細(xì)胞壁組分，季胺類化合物如，氯化十六烷基吡咬錯(cuò)和勤L氯銨，兼性離子胺類化合物如CHAPS(3-(3-膽酰氯基丙基)-二甲基-銨基)-l-丙磺酸鹽)，硫酸葡聚糖，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)，嵌段共聚物如P1205或Poloxamer401，雙十四碳酰磷脂酰膽堿(DMPC)，3卩-羥基-5-雄甾烯-17-酮(011￡厶),雙十四碳酰磷脂酰甘油(0]\^)，脫氧膽酸鈉鹽，咪會(huì)莫特(zmiquimod)，DTP-GDP，7-烯丙基畫8-氧代鳥苷，MontanideISA51，MontanideISA720，murametide，murapalmitin，二鯨蠟基磷酸酯，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯如聚山梨醇酯20或80(吐溫⑧20，80)，來(lái)自細(xì)菌ADP核糖化毒素如霍亂毒素或百曰咳毒素的去毒突變體，這些佐劑中的至少兩種的混合物。尤其優(yōu)選作為共佐劑的是脂多糖，氫氧化鋁，磷酸鋁，GAL-神經(jīng)酰胺，具有CpG-基序的寡脫氧核糖核苷酸，以及聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯。有關(guān)作為共佐劑的合適的化合物在Cox，J.C.andCoulter,A.R."佐劑-分類和作用模式的綜述，，，Vaccine,15:248-256(Feb.1997)—文中進(jìn)行了綜述。該文中有關(guān)疫苗組合物中的可能佐劑的描述在此引入作為參考并且形成本發(fā)明公開的一部分。依據(jù)本發(fā)明組合物的再一優(yōu)選實(shí)施方案，除了包括抗原HBcAg^和佐劑外，其還包含至少一種HBsAg、來(lái)自該抗原的片段、該抗原或該抗原的片段的變體或其至少兩種的混合物。在本上下文中，尤其優(yōu)選的是不僅HBcAg^而且HBsAg在根據(jù)本發(fā)明的組合物中都以顆粒形式存在。HBsAg是一個(gè)226個(gè)^^酸組成的蛋白質(zhì)(p24/gp27或S蛋白)，其可自組裝成20-30nm的脂蛋白顆粒，其中約100-150個(gè)亞單位通過(guò)多個(gè)分子間和分子內(nèi)二硫鍵交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的組合物任選包含的HBsAg可來(lái)源于現(xiàn)今已知的所有的8種HBV標(biāo)準(zhǔn)基因型A,B，C，D，E,F，G和H，HBcAgk亦是如此。術(shù)語(yǔ)"HBsAg"除了226個(gè)M酸的蛋白質(zhì)外，還包括M-和L-蛋白，其除了HBsAg外還包含長(zhǎng)55個(gè)氨基酸的前S2肽(M蛋白)或長(zhǎng)55個(gè)氨基酸的前S2肽和長(zhǎng)120個(gè)氨基酸的前S1-肽(L蛋白)術(shù)語(yǔ)HBsAg的"片段"優(yōu)選理解為這樣的多肽，在該多肽中具有至少50個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少150個(gè)和尤其優(yōu)選至少200個(gè)氨基酸的一段序列與HBsAg的對(duì)應(yīng)片段是一致的。術(shù)語(yǔ)HBsAg或HBsAg片段的"變體"優(yōu)選理解為這樣的多肽，在該多肽中相對(duì)于HBsAg或HBsAg片段有至多5個(gè)，優(yōu)選至多2個(gè)，尤其優(yōu)選至多l(xiāng)個(gè)氨基酸已經(jīng)發(fā)生缺失、插入、末端附加或替換，優(yōu)選替換。依據(jù)本發(fā)明組合物的其中包含至少一種HBsAg的優(yōu)選實(shí)施方案，其不僅包含HBsAg,而且正如WO-A-2005/02397所描述的包含至少兩種HBsAg或其片段或其變體，其中所述HBsAg在S區(qū)和/或前Sl區(qū)具有不同的HBV基因型。本上下文中，尤其優(yōu)選HBV基因型不同的這兩種HBsAg以均質(zhì)顆粒形式存在，正如WO-A-2005/02397所描述的一樣。均質(zhì)HBsAg顆粒理解為僅由相同HBV基因型的HBsAg組成的顆粒。HBsAg可通過(guò)技術(shù)人員所熟知的方法，從慢性乙型肝炎患者的血清獲得或是以重組多肽形式獲得。在本上下文中，參考與獲得HBcAg^有關(guān)的上述方法。除了組分i)，ii)及任選地iii)外，根據(jù)本發(fā)明的組合物也可以包含另外的添加劑iv)，如藥物載體或添加劑，尤其是當(dāng)它以藥物制劑形式存在時(shí)。優(yōu)選的藥物載體尤其是水，緩沖水溶液，優(yōu)選等滲鹽溶液如PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、葡萄糖、右旋葡萄糖，甘露醇，乳糖、淀粉，硬脂酸鎂，纖維素，碳酸鎂，0.3%甘油，透明質(zhì)酸，乙醇，聚亞烷基二醇如聚丙二醇，甘油三酯等。所用藥物載體的類型尤其依賴于根據(jù)本發(fā)明的組合物是否配制為用于口服，鼻，皮內(nèi)，皮下，肌內(nèi)或靜脈施用。才艮據(jù)本發(fā)明的組合物可包含滲漲度調(diào)節(jié)劑，濕潤(rùn)劑，乳化劑或緩沖液物質(zhì)作為添加劑?？乖煞謎)或抗原成分i)和iii)與佐劑ii)之間的相對(duì)重量比優(yōu)選是在1:20至20:1之間的范圍，尤其優(yōu)選在1:10至10:1之間，更優(yōu)選在1:5至5:1之間及最優(yōu)選在1:2至2:1之間。對(duì)相應(yīng)的應(yīng)用情況而言最佳的佐劑和抗原的重量比可由技術(shù)人員通過(guò)簡(jiǎn)單的試驗(yàn)確定，在所述試驗(yàn)中例如CTL應(yīng)答的強(qiáng)度由該重量比決定。如果才艮據(jù)本發(fā)明的組合物除HBcAgk外也包含HBsAg，那么HBcAg^和HBsAg之間的重量比優(yōu)選在1:20至20:1之間的范圍，尤其優(yōu)選在1:10至10:1之間的范圍，更優(yōu)選在1:5至5:1之間的范圍及最優(yōu)選在1:2至2:1之間的范圍。在此4支術(shù)人員通過(guò)簡(jiǎn)單的試驗(yàn)同樣也可決定最佳的重量比。在根據(jù)本發(fā)明的組合物中組分i),ii)及任選地iii)的總濃度(即，以本發(fā)明組合物的體積為基礎(chǔ)的組分i)，ii)及iii)的總量)優(yōu)選在O.l至2,000照/ml之間，尤其優(yōu)選在0.5至1，500ng/ml之間，更優(yōu)選在1至1,000ng/ml之間及最優(yōu)選在10至500照/ml之間，前提是本發(fā)明的組合物不是凍干物形式。本發(fā)明組合物的一個(gè)實(shí)施方案，其包含i)HBcAgl—145和ii)作為佐劑的皂苷復(fù)合物，優(yōu)選脂質(zhì)體皂苷復(fù)合物。本發(fā)明組合物的另一個(gè)實(shí)施方案，其包括i)HBcAgl-144+I和ii)作為佐劑的皂苷復(fù)合物，優(yōu)選脂質(zhì)體皂苷復(fù)合物。本發(fā)明組合物的再一個(gè)實(shí)施方案，其包括i)HBcAgl—145，ii)作為佐劑的皂苷復(fù)合物，優(yōu)選脂質(zhì)體皂苷復(fù)合物，和iii)HBsAg。本發(fā)明組合物的又一個(gè)實(shí)施方案，其包括i)HBcAgl.144+I,ii)作為佐劑的皂苷復(fù)合物，優(yōu)選脂質(zhì)體皂苷復(fù)合物，和iii)HBsAg。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物的特征還在于，在如下小鼠的脾臟中造成HBcAg特異性CD8+T細(xì)胞頻率為每105個(gè)CD8+T-細(xì)胞中有至少30,尤其優(yōu)選至少50,更優(yōu)選至少75，甚至更優(yōu)選至少100和最優(yōu)選至少300個(gè)CD8+IFNy+T-細(xì)胞，所述小鼠為依據(jù)本發(fā)明描述的免疫方法免疫并隨后如本文所述接受MGLKFRQL(—種合成的HBcAg片段)再刺激的C57BL/6小鼠。根據(jù)本發(fā)明的組合物的再一個(gè)優(yōu)選特征在于，如果它包含了HBsAg,在通過(guò)在此描述的免疫方法進(jìn)行免疫時(shí)，其將在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)強(qiáng)的抗HBsAg的抗體應(yīng)答?？笻Bs抗體的總量根據(jù)本文描述的AUSAB⑧-分析測(cè)定法為平均高達(dá)至少100mlU/mL,優(yōu)選至少500mlU/mL，尤其優(yōu)選至少1,000mIU/mL和最優(yōu)選至少1,500mlU/mL。對(duì)抗HBs特異性IgG同種型的測(cè)定表明IgGl-和IgG2b兩者的數(shù)值均增加，這表明Thl和Th2免疫應(yīng)答均已形成。對(duì)上述目的的另一解決方式是提供如下生產(chǎn)組合物的方法，該方法包括方法步驟I)，II)和IV)及任選地III):I)提供HBcAg^，該抗原的片段、該抗原或者該抗原的片段的變體、或者其至少兩種的混合物，其中x是100到160的整數(shù)，優(yōu)選在120至150之間，尤其優(yōu)選在140至149之間，更優(yōu)選在144至146之間和最優(yōu)選為145。II)提供包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少兩種的混合物的佐劑，III)提供HBsAg，該抗原的片段、該抗原或者該抗原的片段的變體、或者其至少兩種的混合物，及IV)使HBcAgLx，佐劑和任選地HBsAg相接觸。至于HBcAgk或其片段或其變體，至于包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少兩種的混合物的佐劑，以及至于HBsAg或其片段或其變體，優(yōu)選已經(jīng)就本發(fā)明組合物而被提及為優(yōu)選組分i)，ii)和iii)的那些化合物。關(guān)于方法步驟I)和III)，優(yōu)選HBcAg及HBsAg以抗原或抗原片段(通過(guò)從慢性乙型肝炎(僅僅就HBsAg而言)患者的血漿中、通過(guò)合成的方法或通過(guò)重組表達(dá)的方式獲得的)存在于合適藥物載體中的方式提供。此藥劑載體優(yōu)選為液體，尤其是水性液體，更優(yōu)選水性鹽溶液如PBS。在于方法步驟IV)中與其他組分接觸前，通過(guò)該方式獲得的水性抗原溶液可通過(guò)技術(shù)人員已熟知的方法進(jìn)行除菌過(guò)濾。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在方法步驟I)和III)中HBcAg及任選地HBsAg以如下方式提供為優(yōu)選，所述方式為這些抗原首先以至少兩倍，尤其優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍及最優(yōu)選至少6倍于本發(fā)明最終目的組合物中的HBcAg或HBsAg濃度的濃度存在于藥物載體中，優(yōu)選水性鹽溶液中(因此，例如，如果根據(jù)本發(fā)明的組合物中HBcAg的濃度為10ng/ml，則優(yōu)選在組合物的生產(chǎn)中首先以濃度至少20ftg/ml，尤其優(yōu)選至少30ng/ml，更優(yōu)選至少40jig/ml和最優(yōu)選至少60照/ml在水性鹽溶液中提供HBcAg)。如果本發(fā)明的組合物包含HBcAg和HBsAg，那么優(yōu)選將兩者一起在一種相同鹽溶液中以上述濃度(至少兩倍，至少3倍，至少4倍或至少6倍超濃縮的)提供。根據(jù)本發(fā)明還優(yōu)選這些超濃縮抗原溶液在于方法步驟IV)中與佐劑接觸前，在30至60X:之間，尤其優(yōu)選在35至55。C和更優(yōu)選在37至50匸的溫度孵育10分鐘至4小時(shí)，尤其優(yōu)選20分鐘至2小時(shí)及更優(yōu)選30分鐘至1小時(shí)。在抗原與佐劑接觸后，還優(yōu)選由此獲得的組合物在10至40C，尤其優(yōu)選在15至30n，更優(yōu)選在20至25。C及最優(yōu)選是在室溫孵育15分鐘至5小時(shí)，尤其優(yōu)選30分鐘至3小時(shí)及更優(yōu)選45分鐘至2小時(shí)。在方法步驟II)中提供佐劑。只要所用佐劑不是已可從商業(yè)途徑獲得的無(wú)菌形式，在此也優(yōu)選在與組分I)或III)接觸之前佐劑首先進(jìn)行除菌，如通過(guò)除菌過(guò)濾。尤其是如果將源于皂苷或皂苷衍生物、類固醇和/或磷脂的復(fù)合物作為佐劑(ISCO-基質(zhì))，則依據(jù)本發(fā)明優(yōu)選這些復(fù)合物首先以無(wú)菌形式制備或從合適的供應(yīng)商處商業(yè)獲得，然后急苷復(fù)合物或皂苷衍生物復(fù)合物與已除菌的、水性HBcAg溶液和任選地已除菌的HBsAg溶液或者這兩種溶液的混合物接觸。通過(guò)這種方式，不會(huì)形成其中抗原并入到ISCO-基質(zhì)內(nèi)部的經(jīng)典ISCOM-復(fù)合物(即所謂的ISCOMs)。取決于是否組合物將要用于口服，鼻內(nèi)，皮內(nèi)，皮下，肌內(nèi)或是靜脈內(nèi)施用，由此獲得的組合物然后可以與其它的添加劑，如另外的藥物載體和添加劑混合。至于藥物載體和添加劑，已就本發(fā)明組合物而被提及為優(yōu)選的藥物載體和優(yōu)選的添加劑的那些化合物是優(yōu)選的。如果獲得水性溶液，則可以以水性無(wú)菌狀態(tài)進(jìn)行包裝或冷凍干燥，其中該凍干組合物在施用前與無(wú)菌溶液混合。提供可以通過(guò)上述方法獲得的組合物也有助于上述目的的解決，其中這些組合物優(yōu)選具有與上述根據(jù)本發(fā)明的組合物一樣的性質(zhì)。提供包含本發(fā)明組合物以及至少一種上述添加劑iv)的藥物制劑，也有助于上述目的的解決。上述目的的另一解決方案是提供本發(fā)明組合物或本發(fā)明藥物制劑在治療和/或預(yù)防HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病中的用途。本發(fā)明的組合物或本發(fā)明的藥物制劑優(yōu)選施用于哺乳動(dòng)物，特別是用于人類。根據(jù)本發(fā)明組合物或本發(fā)明藥物制劑的優(yōu)選用途，其尤其用于治療和/或預(yù)防，優(yōu)選用于治療，急性和/或慢性HBV感染，優(yōu)選慢性HBV感染。與人體中HBV感染相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"優(yōu)選包括-對(duì)與乙肝病毒HBV尚無(wú)任何接觸的人的治療，其目的是防止乙肝病毒HBV感染的發(fā)生；-對(duì)于已接觸乙肝病毒HBV并處于免疫耐受慢性期的人的治療，其目的是防止這類人i^免疫激活慢性期；以及-對(duì)于已接觸乙肝病毒HBV并處于無(wú)活性攜帶期的人的治療，其目的是防止這類人重新iiA免疫激活期。涉;^A體HBV感染的術(shù)語(yǔ)"治療"優(yōu)選包括-對(duì)已接觸HBV并處于感染急性期的人的治療，-對(duì)已接觸HBV并處于免疫激活慢性期的人的治療。根據(jù)本發(fā)明的組合物或依據(jù)本發(fā)明的藥物制劑尤其優(yōu)選對(duì)已經(jīng)感染HBV的患者進(jìn)行施用。對(duì)于處于急性感染期、免疫耐受'lt性期、免疫激活'隄性期或無(wú)活性攜帶期的人，可4吏用本發(fā)明的組合物或者本發(fā)明藥物制劑按需要單獨(dú)或與其它療法聯(lián)合進(jìn)行治療。在治療應(yīng)用中，該組合物或藥物制劑以如下量向患者施用，所述量將足以造成有效針對(duì)HBV抗原的CTL應(yīng)答并能治愈或至少部分終止HBV相關(guān)癥狀和/或并發(fā)癥。如果使用本發(fā)明的組合物或藥物制劑(尤其優(yōu)選)用于治療慢性乙型肝炎，該療法的目的是減少或是理想地消除受病毒感染的細(xì)胞。由于人們會(huì)由于在感染的急性期中CTL應(yīng)答的不足或缺乏而t艮成為慢性乙型肝炎，故在本發(fā)明的組合物或藥物制劑中提供如下量的免疫相關(guān)病毒抗原(HBcAgl_x和任選地HBsAg)是重要的，所述量足夠有效地刺激CTL應(yīng)答。能夠達(dá)到這些目的的量被定義為"治療有效劑量，，。對(duì)于不同的應(yīng)用情況為治療有效的劑量依賴于，例如，本發(fā)明組合物或者本發(fā)明藥物制劑的確切組成、施用方法、所治療的疾病的階段和嚴(yán)重性、患者的體重及一般健康狀況以及主治醫(yī)生的判斷，但一般而言，對(duì)于一個(gè)體重70公斤的患者優(yōu)選在大約0.1至2000ng之間(佐劑、HBcAg!.x和任選地HBsAg的總量)，尤其優(yōu)選在0.5至1500嗎之間，更優(yōu)選在1至1000照之間和最優(yōu)選在10至500將之間，之后依賴于患者的CTL應(yīng)答(其可通過(guò)檢測(cè)患者外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中HBV特異性CTL活性而確定)，數(shù)周到數(shù)個(gè)月再度使用介于0.1至2000ng之間的劑量。在治療慢性乙型肝炎時(shí)，用藥應(yīng)持續(xù)一段時(shí)間直到至少臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)室指標(biāo)表明HBV感染已消除或至少處在免疫系統(tǒng)的控制下，任選地可作更長(zhǎng)時(shí)間的治療。根據(jù)本發(fā)明的組合物或者依據(jù)本發(fā)明的藥物制劑，原則上可口服，鼻內(nèi)，皮內(nèi)，皮下，肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。上述目的的再一解決方案是提供本發(fā)明組合物在生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病的藥物制劑中的用途。在本上下文中，上述目的的一個(gè)特別的解決方案是提供本發(fā)明組合物的用途，所述組合物包括i)上述的HBcAgLx，ii)上述的包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少兩種的混合物的佐劑，以及iii)上述的HBsAg，所述用途為用于生產(chǎn)藥物制劑以治療HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病，優(yōu)選治療如下HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病，其中所述HBV感染或HBV介導(dǎo)的疾病由基因型或亞型(優(yōu)選基因型)不同于包含在本發(fā)明組合物中的HBsAg的基因型或亞型(優(yōu)選基因型)的HB病毒導(dǎo)致。例如，假設(shè)HBV感染或HBV介導(dǎo)的疾病是由A基因型乙型肝炎病毒導(dǎo)致，為治療該種疾病或感染，優(yōu)選使用如下本發(fā)明的組合物，該組合物除組分i)和ii)外還利用B,C，D,E,F或G基因型的HBsAg或這些基因型的HBsAg的混合物，其中也可以包括A基因型的HBsAg。再者，有助于上述目的的解決的是用于治療和/或預(yù)防HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病的方法，在該方法中還未接觸到HBV或是已接觸過(guò)HBV的人，優(yōu)選患有慢性乙型肝炎的患者被給予根據(jù)本發(fā)明的組合物或者根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑的治療有效劑量，優(yōu)選通過(guò)上述的4支術(shù)和方式。在此也可能尤其有利的是，向那些已接觸過(guò)HBV的個(gè)體，優(yōu)選患有慢性乙型肝炎的患者施用如下組合物，這種組合物除了包括HBcAg^和佐劑外，還包括來(lái)源于如下HBV基因型或HBV亞型的HBsAg，所述HBV基因型或亞型不同于在所需治療的患者中導(dǎo)致HBV感染或HBV介導(dǎo)的疾病的乙型肝炎病毒的基因型或亞型，優(yōu)選基因型。本發(fā)明現(xiàn)通過(guò)非限定性實(shí)施例和附圖進(jìn)行更詳細(xì)的舉例說(shuō)明。圖1顯示當(dāng)應(yīng)用具有AbISCO-100作為佐劑的本發(fā)明組合物時(shí)的CTL應(yīng)答。圖2顯示當(dāng)應(yīng)用具有AbISCO-200作為佐劑的本發(fā)明組合物時(shí)的CTL應(yīng)答。圖3顯示當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明的組合物(包含HBcAg和HBsAg及以AbISCO-200作為佐劑)時(shí)的B細(xì)胞應(yīng)答，以AUSAB抗HBsAg計(jì)數(shù)進(jìn)行說(shuō)明。圖4顯示當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明的組合物(包含HBcAg和HBsAg及以AbISCO-200作為佐劑)時(shí)B細(xì)胞應(yīng)答的免疫i普，以抗-HBsAg-IgGl及抗-HBsAg-IgG2b同種型的量進(jìn)行說(shuō)明。根據(jù)本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)Thl和Th2型免疫應(yīng)答。方法C57BL/6小鼠的免疫用PBS，HBcAg,HBsAg和佐劑以表1，2所列的量分別在100jilPBS中對(duì)C57B1/6小鼠進(jìn)行免疫，其中各給出的量分別以21天的間隔進(jìn)行皮下注射兩次。對(duì)于DNA免疫，將質(zhì)粒pCI/HBVa，核心以2x50照的量分別于50nlPBS中注射于每側(cè)的脛骨前肌。脾臟中抗原特異性CD8+T細(xì)胞頻率的測(cè)定第二次免疫后兩周，從動(dòng)物中分離脾臟并從脾細(xì)胞制備細(xì)胞懸浮液。脾細(xì)胞懸液的制備見(jiàn)于SchirmbeckR.，B6hmW.,FissoloN.，Mel-berK"和ReimannJ.:"乙型肝炎表面抗原天然變體中H-2Kb限制性表位的不同免疫源性"，Europ.J.Immunol.2003,33:2429-38.—文的描述。脾細(xì)胞在含有0.25nMHBcAg特異性肽(MGLKFRQL;JeriniBioTools，Berlin,DE)和5jig/ml的BrefddinA(BFA)(目錄號(hào).15870，Sigma)的RPMI畫1640培養(yǎng)基中，37。C孵育(再刺激)4個(gè)小時(shí)。收集接受再刺激的細(xì)胞，并用抗-CD8mAb(抗鼠CD8a-PE-綴合物；目錄號(hào)55303;BDBiosciences,Heidelberg,DE)進(jìn)行表面染色，固定、透化處理和實(shí)施細(xì)胞質(zhì)干擾素y的顯色(抗小鼠干擾素y-FITC-綴合物；目錄號(hào)554411;BD-Biosciences,Heidelberg,DE)。核心特異性CD8+IFNy+CTLs的頻率測(cè)定采用FACS分析進(jìn)行。顯示CD8+IF1V/+T細(xì)胞/105CD8+T細(xì)胞的平均值?？贵w同種型的確定96孔微滴定板(Nunc，Wiesbaden，DE)以用于免疫的HBsAg(碳酸鹽緩沖液中2jig/mL)4X:包被過(guò)夜(每孔100nL)。在此ELISA方法的開始，用PBST(含有0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽溶液)洗包被的板3次。用0.2。/。凝膠37。C封閉孔1小時(shí)。以PBS分兩步稀釋待測(cè)的小鼠血漿/血清(1:250到1:32,000)并將稀釋液各100分別加入適當(dāng)孔中(一式兩份)，并于37。C孵育1小時(shí)。未免疫小鼠的血清用作對(duì)照。然后用PBST洗微量滴定板5次并與同種型特異性二抗(過(guò)氧化酶綴合的)孵育。使用gamlgl(目錄號(hào)GAM/IgGl/PO)檢測(cè)IgGl，使用gamlg2b(目錄號(hào)IgG2b/PO;北歐免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，Tilburg，荷蘭)檢測(cè)IgG2b。顯色反應(yīng)以鄰苯二胺(oPD)(Sigma;目錄號(hào)P2卯3)作為底物(1nL/mL30%H202和1mg/mloPD)(每孔100jiL)完成。反應(yīng)10-15分鐘后用1NH2S04(每孔50nL)終止顯色反應(yīng)，于分光光度計(jì)(SpectraMaxplus;MolecularDevices,Ismaning，DE)492nm效'J定光密度值?？偪笻Bs抗體數(shù)測(cè)定經(jīng)免疫的小鼠的血清中的抗HBs抗體數(shù)利用IMXAUSAB⑧檢測(cè)試劑盒(索引號(hào)2226-21，Abbott,Wiesbaden,Germany)于IMX自動(dòng)免疫分析儀(AbbottDiagnostics,Wiesbaden,Germany)中進(jìn)4亍測(cè)定。試^^依據(jù)制造商的描述進(jìn)行?？乖苽鋋)HBcAgw彬i利用BamHI-限制性，攜帶HBV全基因組的質(zhì)粒pHB320(7，543堿基對(duì))從載體pBR322(BolivarF.，RodriguezR丄"GreeneP.J.，BetlachM.C"HeynekerH.L.,BoyerH.W.:"新克隆載體的構(gòu)建和表征。II.多用途克隆系統(tǒng)，"Gene.1977;2(2):95-113)和環(huán)化的乙型肝炎病毒基因組(HBV320，3，182^J^對(duì)；BichkoV，PushkoP，DreilinaD，P腿p畫P，GrenE(1985)，"SubtypeaywvariantofhepatitisBvirus"，F(xiàn)EBS185:208-212)構(gòu)建。經(jīng)Hhal限制消化和核酸酶SI降解突出的單鏈序列后，長(zhǎng)為1000堿基對(duì)的片段通過(guò)平末端連接克隆至載體pBR322Ptrp(IkeharaM，OhtsukaE，TokunagaT.etal.(1984):人生長(zhǎng)激素基因的合成與在大腸桿菌中的表達(dá).Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:5956-5960)中，所述片段攜帶前核心/核心基因(核心開放閱讀框)的基因序列。該載體預(yù)先已用BamHI/SalI切割，并由DNA聚合酶補(bǔ)平突出端。所得質(zhì)粒pGC74(6046個(gè)堿基對(duì))以相反取向攜帶有色氨酸啟動(dòng)子和HBc-基因。該取向有利于以下為優(yōu)化HBcAg-表達(dá)盒而重構(gòu)單限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的克隆步驟。為改變HBc片段的取向，采用BamHI限制消化pGC74，DNA聚合酶補(bǔ)平突出端，Sail進(jìn)行之后的限制消化。該片段與載體pBR322Ptrp進(jìn)行連接。該載體已預(yù)先采用Aval進(jìn)行線性化，DNA聚合酶補(bǔ)齊末端和之后使用Sail進(jìn)行限制消化。由此構(gòu)建的質(zhì)粒pGC2(5,552個(gè)堿基對(duì))攜帶有色氨酸啟動(dòng)子和同方向的HBc-基因。該質(zhì)粒用Sall進(jìn)行消化，核酸酶Bal31除去突出末端，EcoRI進(jìn)行之后的消化，由此而產(chǎn)生的突出末端用DNA聚合酶補(bǔ)平并再次連接。由此產(chǎn)生質(zhì)粒pHBclO(4,825個(gè)>5^對(duì))，在色氨酸啟動(dòng)子與HBc基因間具有縮短的序列以獲得最佳的Ptrp-Shine-Dalgarno-HBc結(jié)構(gòu)或距離。為優(yōu)化基因表達(dá)，用Hhall及Sl-核酸酶消化后從pHBcl0獲得長(zhǎng)為1,044堿基對(duì)的HhaI-HBc-片段，并克隆到已修飾的pBR322質(zhì)粒即pBR322-trp-I載體中。該構(gòu)建產(chǎn)生pHBc3(7,108個(gè)4^對(duì))，其具有位于色氨酸啟動(dòng)子控制下的HBc-基因的經(jīng)優(yōu)化的表達(dá)序列。通過(guò)Kpn21消化質(zhì)粒pHBc3，將合成的EcoRV-ClaI-PvuI(5，TCCGGAGATATCGATCGTCCGGA-3，)多接頭在HBc基因的第144位M酸位點(diǎn)并入該限制性位點(diǎn)。由此形成質(zhì)粒pHBcl615(7,129個(gè)堿基對(duì))。Clal消化PHBcl615成為線性PHBcl615，并入合成的多接頭以在第144位M酸位點(diǎn)后形成終止密碼子以及在145位形成額外的異亮氨酸密碼子。由此獲得質(zhì)粒pHBc2-7。質(zhì)粒pHBc2-7轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞(BL21菌林:基因型BFdcmompThsdS(iVmOgal)，陽(yáng)性克隆于具有氨節(jié)青霉素的LB瓊脂板上37。C過(guò)夜培養(yǎng)獲得。使用一個(gè)單克隆，接種300mlM9極限培養(yǎng)基(添加1%酪蛋白氨基酸，Difco目錄號(hào)223050，Becton-Dickinson，Heidelberg)和0.2%葡萄糖。于37。C在1升-Erlenmeyer燒瓶中于圓形搖床中過(guò)夜培養(yǎng)。通常培養(yǎng)物的光密度(OD54()nm)達(dá)2到5之間。細(xì)胞離心后沉淀用裂解緩沖液(50mMTRIS/HC1pH8.0;5mMEDTA，100ng/mlPMSF，0.08%Triton-X-100)重懸。條件化的細(xì)胞在冰上超聲處理(3x15秒，22千赫)以裂解。細(xì)胞碎片離心后，以硫酸銨(33%飽和度)4。C，4-20小時(shí)沉淀上清，獲得蛋白質(zhì)沉淀。該沉淀用含有0.1%TritonX-100的PBS重懸，然后取所獲溶液的5-10毫升上SepharoseCL4B層析柱(2.5x85cm)。以無(wú)TritonX-100的PBS進(jìn)行洗脫。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳/考馬斯染色分析各級(jí)分中HBcAg-多肽的存在。利用硫酸銨沉淀法(33%飽和度)于4。C，20個(gè)小時(shí)純化和濃縮陽(yáng)性級(jí)分。用PBS重懸蛋白質(zhì)沉淀，濃度在3-20mg/ml間，然后于1000倍體積的相同緩沖液中透析過(guò)夜。HBcAgw44+!溶于PBS中除菌過(guò)濾，-20。C保存。b)HBsAgHBsAG的制備見(jiàn)BrockeP，SchaeferS.,MelberK.，JenzelewskiV.，MtillerF.，DahlemsU.，BartelsenO.,ParkK.N.,JanowiczZ.A.，GeUissenG.:重組乙型肝炎疫苗疾病表征及疫苗生產(chǎn)"(2005),GellissenG(編)重組蛋白的生產(chǎn)一新型孩i生物和真核表達(dá)系統(tǒng)，319-360頁(yè)，Wiley-VCH，Weinheim的描述，并可從RheinBiotech,Dtissddorf，Germany獲得。c)HBcAgwwHBcAgw83從DiaSorinS.r丄(Saluggia，Italy)獲得。實(shí)施例1在第一系列實(shí)驗(yàn)中，將在產(chǎn)品描述AbISCO-100(ISCONOVA，Uppsala,Sweden)下可商業(yè)獲得的皂苷復(fù)合物用作佐劑。核心質(zhì)粒DNA被用作陽(yáng)性對(duì)照，純PBS、于PBS中的純佐劑、于PBS中的純HBc^44+j以及于PBS中的HBcl-183作為陰性對(duì)照。本發(fā)明組合物包含PBS、HBcw44w及AblSCO⑧-100。各組分的量見(jiàn)表l。質(zhì)粒pCI/HBVayw核心依據(jù)Kuhr6berA.，PudollekH.P.,ReifenbergK"ChisariF.V.，SchlichtH.J.，ReimannJ"SchirmbeckR.(1996):，H-2b小鼠中DNA免疫誘導(dǎo)對(duì)乙型肝炎核心抗原的抗體及細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)"，丄Immunol.156:3687-95(本構(gòu)建體在那稱作pCMV-l/c)的描述進(jìn)行制備，其分離采用QIAGEN-tip500(目錄號(hào)12162;Qiagen，Hilden，Germany)依據(jù)生產(chǎn)廠家i兌明進(jìn)4亍。對(duì)于本發(fā)明組合物的配制，HBCl_144+I首先用PBS稀釋至最終產(chǎn)品濃度的4倍并于37。C振蕩下孵育30分鐘。AbISCO-100(由生產(chǎn)者以水性分散體形式提供)隨后加入，表l中抗原終濃度以PBS進(jìn)行調(diào)節(jié)，由此形成表中所列佐劑和抗原的濃度。由此制備的組合物于室溫(20-25X:)孵育1小時(shí)后，于2-8X:過(guò)夜保存(12-18小時(shí))并用于翌日的免疫。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>1)n.inv.表示非本發(fā)明；2)inv.表示本發(fā)明從圖l可見(jiàn)由上述組合物所獲得的CTL應(yīng)答。由該圖可見(jiàn)，利用本發(fā)明的組合物(試驗(yàn)組E)，可產(chǎn)生核心特異性CTL應(yīng)答，其甚至強(qiáng)過(guò)以核心質(zhì)粒DNA可以產(chǎn)生的CTL應(yīng)答(試驗(yàn)組A)。實(shí)施例2在之后的一系列實(shí)驗(yàn)中，在產(chǎn)品描述AbISCO-200(ISCONOVA，Uppsala,Sweden)下可商業(yè)獲得的皂苷復(fù)合物被用作佐劑。核心質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性對(duì)照；純PBS、于PBS中的純佐劑、于PBS中的純HBCw44w以及于PBS中的純HBCl.183作為陰性對(duì)照。本發(fā)明組合物包含PBS、HBCl_144+I,AblSCO⑧-200及任選地HBsAg。各單個(gè)組分的量見(jiàn)表2。對(duì)于本發(fā)明組合物的配制，HBcw"w及任選地HBsAg首先用PBS稀釋至最終產(chǎn)品濃度的4倍，并于37X:振蕩孵育30分鐘。當(dāng)使用HBsAg時(shí)，首先，HBsAg和HBcAgw44na在無(wú)菌M下混合，并同樣地用PBS稀釋至最終產(chǎn)品濃度的4倍。AbISCO-200(由生產(chǎn)者提供的水性*體形式)隨后加入，表2中的抗原終濃度以PBS進(jìn)行調(diào)節(jié)，由此形成表中所列佐劑和抗原的濃度。由此制備的組合物在室溫(20-25匸)孵育l小時(shí)后，于2-8匸過(guò)夜保存(12-18小時(shí))，并用于翌日的免疫。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>圖2表明由上述組合物所產(chǎn)生的CTL應(yīng)答。由該圖可見(jiàn)，利用本發(fā)明的組合物(試驗(yàn)組L和M),可產(chǎn)生核心特異性CTL應(yīng)答，其與可由核心質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的CTL應(yīng)答(試驗(yàn)組F)相當(dāng)。圖3表明本發(fā)明組合物，當(dāng)其還包含HBsAg時(shí)，也可導(dǎo)致針對(duì)HBsAg的強(qiáng)抗體反應(yīng)。圖4接著顯示利用本發(fā)明的組合物后，IgGl及IgG2b的量均增加，這表明Thl和Th2型免疫應(yīng)答的形成。權(quán)利要求1.一種組合物，其包含i)HBcAg1-x、該抗原的片段、該抗原或者該抗原的片段的變體、或者其至少兩種，其中x是100到160的整數(shù)，ii)包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少兩種的混合物的佐劑，以及任選地iii)HBsAg、來(lái)自該抗原的片段、該抗原或該抗原的片段的變體、或者其至少兩種。2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中x是140到149的整數(shù)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，其中x是144到146的整數(shù)。4.根據(jù)前述的任何一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物，其中佐劑是皂苷復(fù)合物或急苷衍生物復(fù)合物或者其至少兩種的混合物，并包含不同于水或水性鹽溶液的組分(al)O至95wt,o/o磷月旨，(a2)0至95wt.。/。類固醇，(a3)5至100wt.。/。所述皂普或皂普衍生物，以及(a4)0至20wt.。/。的其它添加劑，其中，按重量計(jì)算的量分別基于皂苷復(fù)合物或者皂苷衍生物復(fù)合物的總重量，所述總重量不包括復(fù)合物的7jC部分或其水性鹽溶液部分，而且組分(al)到(a4)的總和為100wt.%。5.根據(jù)前述的任何一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物，其中，佐劑是ISCO基質(zhì)。6.根據(jù)前述的任何一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物，其中，抗原組分i)或抗原組分i)和iii)與佐劑ii)之間的相對(duì)量的比在1:20至20:1的范圍內(nèi)。7.根據(jù)前述的任何一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物，其中，組分i),ii)和任選地iii)在組合物中的總濃度為0.1至2,000照/ml。8.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，包含i)HBcAgl_145及ii)皂苷復(fù)合物。9.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，包含i)HBcAgl_144+I及ii)皂苷復(fù)合物。10.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，包含i)HBcAgw45、ii)皂苷復(fù)合物及iii)HBsAg。11.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，包含i)HBcAgl-144+I、ii)皂苷復(fù)合物及iii)HBsAg。12.制備組合物的方法，包括如下方法步驟I)、II)和IV)及任選地III):I)提供HBcAgk，該抗原的片段、該抗原或者該抗原的片段的變體、或者其至少兩種的混合物，其中x是100到160的整數(shù)，II)提供包括皂苷或皂苷衍生物或者其至少兩種的混合物的佐劑，III)提供HBsAg,該抗原的片段、該抗原或該抗原的片段的變體、或者其至少兩種的混合物，以及IV)使HBcAgk、佐劑及任選地HBsAg相接觸。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中x是140到149的整數(shù)。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中x是144到146的整數(shù)。15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一權(quán)利要求所述的方法，其中，佐劑是皂苷復(fù)合物或皂苷衍生物復(fù)合物或者其至少兩種的混合物，并包括不同于水或水性鹽溶液的組分(al)O至95wt。/o磷月旨，(a2)0至95wt.。/。類固醇，(a3)20至100wt.%所述皂苷或皂苷衍生物，以及(a4)0至20wt.%的其它添加劑，其中，所述以重量計(jì)算的量分別基于皂苷復(fù)合物或者皂苷衍生物復(fù)合物的總重量，所述總重量不包括復(fù)合物的水部分或其水性鹽溶液部分，并且組分(al)到(a4)的總和為100wt.%。16.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，佐劑是ISCO基質(zhì)。17.可以通過(guò)+艮據(jù)權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)所述的方法獲得的組合物。18.藥物制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至11或17中任一項(xiàng)所述的組合物以及適宜的添加劑。19.根據(jù)權(quán)利要求1至11或17中任一項(xiàng)所述的組合物在制備用于治療和/或預(yù)防HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病的藥物制劑中的用途。20.根據(jù)權(quán)利要求1至11或17中任一權(quán)利要求所述的組合物用于制備治療性HBV感染的藥物制劑的用途。21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的用途，其中，組合物包含HBsAg，并且其中HBV感染或HBV介導(dǎo)的疾病由如下HB病毒導(dǎo)致，該病毒的基因型或亞型不同于本發(fā)明組合物中包含的HBsAg的基因型或亞型。全文摘要本發(fā)明涉及一種組合物，其包含i)HBcAg_1-x、該抗原的片段、該抗原或者該抗原的片段的變體、或者其至少兩種，其中x是100到160的整數(shù)，ii)包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少兩種的混合物的佐劑，以及任選地iii)HBsAg、來(lái)自該抗原的片段、該抗原或該抗原的片段的變體、或者其至少兩種。本發(fā)明還涉及該組合物的生產(chǎn)方法、可以通過(guò)該方法獲得的組合物、藥物制劑、該組合物或該藥物制劑在治療和/或預(yù)防HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病中的用途、組合物或藥物制劑在生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途以及治療和/或預(yù)防HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病的方法。文檔編號(hào)A61K39/39GK101309931SQ200680042757公開日2008年11月19日申請(qǐng)日期2006年9月15日優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日發(fā)明者K·梅爾貝爾,P·布基曼,Z·亞諾維奇申請(qǐng)人:萊因新生物技術(shù)工藝和產(chǎn)品有限公司