專利名稱：增效蛋白在原核生物中的表達及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在原核生物中表達昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白，含有昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的表達載體，用這種載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，在大腸桿菌中產(chǎn)生昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白的方法，以及表達的昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白在農(nóng)林業(yè)中的應(yīng)用。
現(xiàn)在已知，昆蟲病毒增效蛋白(enhancin)是由昆蟲病毒基因編碼能顯著提高病毒殺蟲活性的一種功能性蛋白質(zhì)。1998年，美國學(xué)者(Zhong J.and R.R.Grandos1998.VIIth International Colloguium on Invertebrate Pathology and Microbial ControlIVth Internatiol Conference on Bacillus thuringensis.Ausgust 23-2865)已將粉紋夜蛾顆粒體病毒(Trichoplusia ni granulosis virus簡稱TnGV)增效蛋白基因克隆于核型多角體病毒AcNPV，構(gòu)建了重組病毒工程毒株，并用該毒株與野生型病毒混合使用，可顯著提高粉紋夜蛾的殺蟲效果。然而，這種工程病毒受到其宿主范圍及其毒力的影響，因此在應(yīng)用上有著局限。
本發(fā)明的目的是提供一種新型的含有粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的工程菌株，該菌株的構(gòu)建方法、用途以及由該菌株生產(chǎn)增效蛋白的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下一種新型的含有昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的工程菌株，含有昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的表達載體，并能在原核生物體內(nèi)復(fù)制和高效表達，該菌種命名為E.coliM15(pQE-TnGVEnCp96)，已于2000年5月17日保藏于湖北省武漢市武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記入冊號為CCTCCM20007，該載體由下列DNA元件組成(1)粉紋夜蛾昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因；(2)大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點；(3)氨芐青霉素抗性基因；本發(fā)明用于構(gòu)造粉紋夜蛾增效蛋白重組載體的原始材料有如下幾種(1)粉紋夜蛾顆粒體病毒(TnGV)，由美國湯姆·杰弗遜大學(xué)贈送。
(2)受體大腸桿菌E.coliM15菌株，購自QIA-GEN公司。
(3)pQE載體，購自Promega公司。
(4)六個連續(xù)組氨酸編碼區(qū)。
用來表達粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白N端截短蛋白基因的載體通過基因工程方法獲得，其構(gòu)建方法是用SphI/PstI分別雙酶切質(zhì)粒pQE和重組質(zhì)粒pGEM-T/En，并經(jīng)0.7％低熔點瓊脂糖凝膠電脈純化回疏目的基因片段，用T4DNA連接酶于16℃水浴連接過夜，；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli M15(pREP4)，經(jīng)Amp(氨芐青霉素)和Kan(卡那霉素)雙抗平板篩選得到E.coli M15(pQE-TnGVEnCp96)。該工程菌株于2000年5月17日保藏于中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號為CCTCC M20007。該工程茵株攜帶粉紋夜蛾昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的表達載體。
其中的重組質(zhì)粒pGEM-T/En由下面方法構(gòu)建根據(jù)已報道的粉紋夜蛾病毒(TnGV)增效蛋白基因序列[Hashimoto，Y.et.al1991，J.Gen.Virol72(11)2645-2651]，以TnGV基因組DNA作模板，設(shè)計引物P15’TCCTCCAATGTTGCACGATT，P25’AACTGACTGTTGAACGTTAT，PCR法擴增增效蛋白基因，得到全長約2.9Kb的片段，與pGEM-T載體用T4DNA酶連接后，得到重組質(zhì)粒pGEM-T/En。
將重組獲得的攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白N末端截短蛋白的工程菌株CCTCC M99102單菌落挑到內(nèi)含100μg/ml的Amp(氨芐青霉素)和25μg/ml Kan(卡那霉素)的LB培養(yǎng)基中(25ml)，37℃，200rpm/min過夜培養(yǎng)，以1∶4比例接種到含上述雙抗500ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達到OD600＝0.7-0.9時，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，常用誘導(dǎo)劑)到終濃度1mM，于37℃，200rpm誘導(dǎo)表達5hr，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規(guī)方法即可獲得昆蟲病毒增效蛋白質(zhì)N末端截短蛋白。
利用攜帶昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的增效蛋白可作為有效成份提高病毒殺蟲劑，BT殺蟲劑，阿維菌素等生物殺蟲劑的殺蟲效果或單獨用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
本發(fā)明提供了一種增效蛋白工程菌株E.coli M15(pQE-TnGV-EnCP96，該菌株的用途和構(gòu)建方法，以及由此工程菌株生產(chǎn)昆蟲病毒增效蛋白，該菌株含有顆粒體病毒增效蛋白N端截短基因。該增效蛋白可作為有效成份提高病毒殺蟲劑，BT殺蟲劑，阿維菌素等生物殺蟲劑的殺蟲效果，可使害蟲死亡率明顯提高，半數(shù)致死時間也明顯減少。這種昆蟲病毒增效蛋白也可單獨以乳劑方式用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。


圖1為構(gòu)建本發(fā)明的含TnGV增效蛋白的N端截短蛋白基因的表達載體pQE-TnGVEnCp96示意圖；圖2為構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T/En示意圖。
以下結(jié)合附圖和具體的實施方案對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，這些實施方案無意于以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求所要求的范圍。
(一)En-TnGV基因的PCR擴增1.TnGV-DNA的提取取TnGV懸液100μL，加等體積0.04mol/L NaOH堿解液及終濃度為1％的SDS，56℃水浴處理10分鐘，待懸液半透明后，用堿性酚，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1V∶V)混合液，氯仿∶異戊醇(24∶1 V∶V)混合液抽提TnGV-DNA各一次，無水乙醇沉淀DNA，-20℃放置過夜，離心后用75％乙醇洗滌DNA沉淀，自然干燥，將DNA溶于TE(Tris·HCl 10mM，EDTA 1mM pH8.0)緩沖液，于4℃保存。
2.En-TnGV基因的PCR擴增取TnGV-DNA 10μL，作10倍稀釋，取2μl，100℃煮6min立即冰浴，按B.M.公司TaqDNA Polymerase試劑(從棲熱水生菌YT-1中提純得到的耐熱的DNA多聚酶)操作手冊，并參見Sambrook等在“分子克隆”(實驗室手冊，冷泉港，1989)的方法，加入(1)10×PCR反應(yīng)緩沖液10μl，(2)兩種引物各2μl，(3)10mmol/LdNTPs2μl，(4)Taq DNA polymerase(5U/μl)1μl，(5)補去離子水至100μl反應(yīng)體積，(6)加石蠟油覆蓋液面，進行PCR擴增。反應(yīng)條件93.5℃變性60s，50℃退火90s，72.5℃延伸180s，循環(huán)30次，最后一次循環(huán)在72.5℃延伸7min，經(jīng)電泳檢測，得到單一的長約2.9kb的En-TnGV基因全長DNA片段。
(二)En-TnGV基因DNA片段的克隆1.En-TnGV基因PCR產(chǎn)物的磷酸化按Promega公司的T4噬菌體多核苷酸激酶操作手冊并參見Sambrook等在“分子克隆”實驗室手冊，冷泉港，1989，在滅菌的0.5ml離心管中(1)加入En-TnGV基因PCR產(chǎn)物1μg，(2)激酶10×緩沖液4μl，(3)0.1mM的ATP2μl(4)T4多核苷酸激酶10U，(5)補加去離子水至40μl，37℃水浴30min，加入2μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。加40μl苯酚∶氯仿∶異戊醇振蕩1min，8,000rpm離心2min，再用氯仿∶異戊醇抽提1次，轉(zhuǎn)移上清水相至一干凈離心管，加入1/10體積3M乙酸鈉，2倍體積無水乙醇，混勻，置于-20℃過夜，12,000rpm離心20min，棄上清，自然干燥，重懸DNA于20μL TE緩沖液。
2.連接En-TnGV基因PCR產(chǎn)物到pGEM-T質(zhì)粒按Promega公司的pGEM-T載體操作手冊并參見Sambrook等在“分子克隆”，實驗窒手冊，(冷泉港，1989)，在已滅菌干凈的0.5ml離心管中，加入(1)10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，(2)50ng/μl的pGEM-T載體，1μl，(3)約50ng的上述處理樣品DNA，(4)3Weiss units/μl T4 DNA連接酶1μl，(5)補加去離子水至10μl，混勻后置4℃連接過夜。
3.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli TG1，通過Sal I或BamHI或Kpn I單酶切鑒定其中的重組質(zhì)粒DNA的正確結(jié)構(gòu)，確定該工程菌株E.Coli TG1(pGEM-T/En)正確建立。
(三)En-TnGV N端截短基因～2.5Kb片段的克隆使用常規(guī)技術(shù)(參見Sambrook等在“分子克隆”，實驗窒手冊，冷泉港，1989)，分離提純質(zhì)粒pQE和pGEM-T/En。用PstI和SphI雙酶切pGEM-T/En，獲得～2.5Kb片段，通過低熔點瓊脂糖回收該片段。將該片段連接到PstI和SphI雙酶切的表達載體pQE中，轉(zhuǎn)化E.ColiTG1，方法如下(1)大腸桿菌M15菌株感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化從37℃培養(yǎng)16-20hr的新鮮LB平板中挑取E.coli M15單菌落，置3mlLB液體培養(yǎng)基試管中，37℃，200rpm培養(yǎng)過夜，再將菌液按1∶100比例接種于適量LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)約3hr(OD600＝0.3-0.4)，將菌液轉(zhuǎn)入1.5ml無菌離心管，置冰上10min，待培養(yǎng)物預(yù)冷至0℃時，4,000rpm離心10min，收集菌體，倒出培養(yǎng)液以0.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2重懸細胞，置冰上半小時后，4,000rpm離心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重懸細胞。所制成感受態(tài)細胞置4℃，并在12～24hr內(nèi)使用。
在100μl E.coli M15菌株感受態(tài)細胞中加入8uL待轉(zhuǎn)化的連接產(chǎn)物DNA(DNA≤50ng)，輕旋以混勻內(nèi)容物，置冰上30min，于42℃水浴中熱休克90s后，迅速移至冰浴中，待細胞冷卻1-2min后，每管加入900μl SOC培養(yǎng)液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl 10ml，5MnaOH調(diào)pH值至7.0，15磅20分鐘高壓滅菌。臨用前加入5ml已滅菌的2MMgCl2，20ml已滅菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm溫育45min，將轉(zhuǎn)化細胞涂布至含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時后觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果。
(2)重組質(zhì)粒pQE-TnGVCp96的酶切鑒定將小量提取的重組質(zhì)粒pQE-TnGVCp96用限制性內(nèi)切酶PstI，EcoRI雙酶切和SalI或PstI單酶切消化，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后觀察，通過與分子量比較DNA片段大小的方法進一步鑒定。
(四)SDS-PAGE電泳分析表達質(zhì)粒中外源基因的表達1.凝膠的灌制參照參見Sambrook等在“分子克隆”(實驗室手冊，冷泉港，1989)的方法，配制8％的分離膠溶液15ml，依次混合各成分后加入催化劑TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混勻并灌膠，封一層0.1％SDS覆蓋液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排凈凝膠上的液體，以同樣方法灌濃縮膠，插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡。
2.蛋白質(zhì)樣品的制備挑含待表達質(zhì)粒的細菌M15(pREP4)單菌落在100μg/mlAmp，25μg/mlKan的LB培養(yǎng)基中37℃過夜活化，然后以1∶20稀釋接種到含100μg/ml Amp，25μg/ml Kan的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達到OD600＝0.7～0.9時，取出未經(jīng)誘導(dǎo)的細菌對照。加入IPTG至終濃度1mM，于42℃，200rpm培養(yǎng)30min后，降至37℃繼續(xù)搖床培養(yǎng)5hr后收獲細菌，4,000rpm離心10min，收集菌體沉淀，加入適量去離子水重懸菌體，置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.上樣及電泳在樣品中加等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，于100℃加熱3-5min變性，按順序加樣，最后在所有不用的加樣孔中加上等體積的加樣緩沖液，以100V電泳至溴酚蘭進入分離膠，提高電壓至150V，當(dāng)溴酚蘭到達底部前約1cm處結(jié)束電泳(約需4hr)。
4.固定，染色和脫色剝膠后以5倍體積染液固定并染色過夜(至少4小時以上)，將凝膠浸泡于脫色液中平緩搖動4hr以上，其間更換脫色液3次，脫色完全后即可進行觀察和照相。
(五)純化表達質(zhì)粒中目的基因表達產(chǎn)物1.目的基因的表達挑含待表達質(zhì)粒的細菌M15[pREP4]單菌落在100μg/ml的Amp和25μg/mlKan的25mlLB培養(yǎng)基中37℃，200rpm過夜活化，然后以1∶20比例接種到含100μg/ml Amp和25μg/ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達到OD600＝0.7-0.9時，加入IPTG至終濃度1mM，于42℃，200rpm誘導(dǎo)表達30min后，降至37℃，繼續(xù)培養(yǎng)5hr，收獲菌液，4,000rpm離心10min，收集菌體沉淀，保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.確定目的基因表達產(chǎn)物的形式在細菌沉淀中加入2-5倍體積的聲波處理液，反復(fù)凍融3次，置于冰中用超聲波破碎細菌。置于光學(xué)顯微鏡高倍物鏡觀察，有大量晶體，然后置于電子顯微鏡下觀察，進一步確定目的基因表達產(chǎn)物以包涵體形式存在。
3.不溶性蛋白的變性純化把上述處理后的表達產(chǎn)物經(jīng)30％-60％蔗糖梯度離心，取出包涵體帶，洗糖三次，8,000rpm離心10min收集沉淀。每克沉淀重懸于5mlBufferB(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris·Cl，pH8.0)，在室溫中攪拌沉淀1hr，10,000rpm離心15min，收集上清，加入8ml 50％Ni-NTA樹脂(已在Buffer B中預(yù)平衡)，在室溫中攪45min，然后小心加到直徑為1.6柱中，用120mlBufferB沖洗，至流液A280＜0.01，再用Buffer C(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris·Cl，pH63)沖洗至A280＜0.01，然后用10-20ml BufferD(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris·Cl，pH5.9)洗脫重組蛋白質(zhì)，最后用10-20ml BufferE(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01MTris·Cl，pH4.5)洗脫，每3ml收集一管洗脫液，進行SDS-PAGE電泳分析。
(六)表達產(chǎn)物的生物活性測定1.將HaNPV(簡稱Ha)和初步純化的表達產(chǎn)物(簡稱P96)作10倍系列稀釋并用血球計數(shù)板計數(shù)，設(shè)計①Ha3即HaNPV1.6×103PIBs/ml(多角體)，②Ha4即HaNPV1.6×104PIBs/ml，③Ha3P96即HaNPV1.6×103PIBs/ml＋P961.6×1060Bs/ml(包涵體)，④Ha4P96即HaNPV1.6×104PIBs/ml＋P961.6×1060Bs/ml四個處理液，另設(shè)計單蒸水對照和P961.6×1060Bs/ml對照。室溫下將棉鈴蟲3齡幼蟲單頭飼養(yǎng)于6孔Costar細胞培養(yǎng)皿中，每孔加適量人工飼料，并加10μl上述各種處理液于人工飼料表面，使其充分吸收，幼蟲取食48小時后補加足量新鮮的人工飼料，統(tǒng)計死亡和存活蟲數(shù)(見下表)P96對HaNPV感染棉鈴蟲幼蟲的增效活性

結(jié)果表明盡管P96自身未對幼蟲產(chǎn)生致死效應(yīng)，但可以提高HaNPV對棉鈴蟲3齡幼蟲感染死亡率27.40-34.50％，縮短LT501.9天以上。
2.對Bt增效實施例將Bt菌粉(16000IU/mg)作1∶1000，1∶2000，1∶4000倍比稀釋成三個不同濃度，人工飼料添食感染2齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復(fù)，同時設(shè)立正常對照。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，求得Bt對2齡棉鈴蟲幼蟲致死中濃度為LC50為0.652g/l，取致死中濃度Bt稀釋液與1×102IB/ml(pQE-TnGVEnCp96)復(fù)配，人工飼料添食感染2齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復(fù)，同時設(shè)立單獨Bt對照，結(jié)果試驗對照組提高Bt對棉鈴蟲幼蟲死亡率為34.5％。
3.對阿維菌素實施例將阿維菌素(1.8％乳油)作1∶3000，1∶6000，1∶12000倍比稀釋成三個不同濃度，人工飼料添食感染4齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復(fù)，同時設(shè)立正常對照。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，求得阿維菌素(1.8％乳油)對老齡棉鈴蟲幼蟲致死中濃度為LC50為1∶5800，取致死中濃度阿維菌素稀釋液與1×102IB/ml(pQE-TnGVEnCp96)復(fù)配，人工飼料添食喂養(yǎng)4齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復(fù)，同時設(shè)立單獨阿維菌素對照，結(jié)果試驗對照組提高阿維菌素對棉鈴蟲幼蟲死亡率為25.6％。
權(quán)利要求
1.一種工程茵株，E.coli M15(pQE-TnGVEnCp96)，該工程菌株已提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號為CCTCC M20007。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌株，其特征在于該工程菌株攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因，并能夠在原核生物中表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌株，其特征在于所含的重組表達載體由下列DNA元件構(gòu)成(1).粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因；(2).大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點；(3).氨芐青霉素抗性基因。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3所述的工程菌株的方法，其特征在于用SphI/PstI分別雙酶切質(zhì)粒pQE和重組質(zhì)粒pGEM-T/En，并經(jīng)0.7％低熔點瓊脂糖凝膠電泳純化回收目的基因～2.5KbDNA帶片段，用T4DNA連接酶于16℃水浴連接過夜，；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli M15，經(jīng)氨芐青霉素和卡那霉素雙抗平板篩選得到E.coli M15(pQE-TnGVEnCp96)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的重組質(zhì)粒pGEM-T/En由下面方法構(gòu)建所得以TnGV基因組DNA作模板，設(shè)計引物P15’TCCTCCAATGTTGCACGATF，P25’AACTGACTGTTGAACGTTAT，PCR法擴增增效蛋白基因，得到全長約2.9Kb的片段，與pGEM-T載體用T4DNA酶連接后，得到重組質(zhì)粒pGEM-T/En。
6.一種用權(quán)利要求1-3所述的工程菌株生產(chǎn)粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白的方法，其特征在于將重組獲得的攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白N末端截短蛋白的工程菌株CCTCC M99102單菌落挑到內(nèi)含100μg/ml的氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm/min過夜培養(yǎng)，以1∶4比例接種到含上述雙抗500ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達到OD600＝0.7-0.9時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度1mM，于37℃，200rpm誘導(dǎo)表達5hr，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規(guī)方法即可獲得粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白N末端截短蛋白。
7.權(quán)利要求1-3所述的工程菌株與昆蟲病毒、蘇蕓金芽胞桿菌、阿維菌素或其它生物殺蟲劑制備成復(fù)合生物殺蟲劑在農(nóng)林業(yè)用于病蟲的生物防治，或單獨使用增效工程蛋白用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉防治棉鈴蟲。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過基因工程手段構(gòu)建工程菌株:CTCC M20007 E.Coli M15(pQE－TnGVEnCp96)、工程菌株的構(gòu)建方法和工程菌株的用途。該菌株是以TnGV為模板,PCR法產(chǎn)生TnGV增效蛋白基因,并構(gòu)建含TnGV增效蛋白的N端截短蛋白基因的表達載體,轉(zhuǎn)化E.Coli M15菌體所得。該菌株攜帶粉紋夜蛾昆蟲病毒增效蛋白N端截短蛋白基因,并能夠在原核生物中表達,從而獲得昆蟲病毒增效蛋白,該蛋白可作為有效成份提高病毒殺蟲劑,BT殺蟲劑,阿維菌素等生物殺蟲劑的殺蟲效果或單獨用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
文檔編號C12N15/33GK1331287SQ0011466
公開日2002年1月16日 申請日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月30日
發(fā)明者孟小林, 徐進平 申請人:武漢大學(xué)