專利名稱：TRAIL截短型變異體活化NF-κB和在炎癥反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及7個(gè)截短型TRAIL變異體作為在治療炎癥反應(yīng)藥物制備中的應(yīng)用，特別涉及在細(xì)胞中活化NF-κ B和治療炎癥中的作用。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand, TRAIL)屬于腫瘤壞死因子超家族成員，其編碼基因定位于3號染色體(3q26)，共由5個(gè)外顯子組成，編碼281個(gè)氨基酸，其中第18位 38位氨基酸 為跨膜區(qū)，第39位 281位為胞外區(qū)，屬于II型跨膜蛋白。TRAIL可在許多正常組織表達(dá)，對大多數(shù)正常細(xì)胞沒有明顯的毒性，但能夠選擇性的殺傷腫瘤細(xì)胞，因此在腫瘤治療中具有巨大潛力(例如參見 Stegehuis JH. TRAIL receptor targeting therapies fornon-small cell lung cancer current status and perspectives. Drug Resist Updat2010,13 (1-2) :2_15 ;Holoch PA. TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)a new path to anti-cancer therapies. Eur J Pharmacol 2009，625(1-3) :63_72.)。目前，用于臨床應(yīng)用研究的最常用的TRAIL重組蛋白(recombinant soluble humanTRAIL，rsTRAIL)有兩種形式，分別為第95 281位、第114 281位氨基酸的TRAIL分子。目前，TRAIL共有4個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體(TRAILa/β/γ/S )報(bào)道(例如參見KriegA. TRAIL-beta and TRAIL-gamma two novel splice variants of the human TNF-relatedapoptosis-inducing ligand(TRAIL)without apoptotic potential. Br J Cancer 2003，88(6) 918-927. ；Woods DC. Cisplatin-mediated sensitivity to TRAIL-induced celldeath in human granulosa tumor cells. Gynecol Oncol 2008，108(3) :632_640.)，但其功能尚缺乏系統(tǒng)性的研究。TRAIL同其他TNF家族成員一樣，形成同源三聚體經(jīng)由死亡受體途徑介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(例如參見 Lavrik I. Death receptor signaling. J Cell Sci 2005，118 (Pt 2)265-267. ；Tansey MG. The TNF superfamily in 2009 new pathways, new indications，and new drugs. Drug Discov Today 2009，14 (23-24) : 1082-1088.)。目前已知的 TRAIL受體共有 5 種DR4，DR5，DcRl，DcR2 和 0PG。DR4(death receptor 4，又稱 TRAIL-R1)和 DR5(death receptor 4，又稱 TRAIL-R2、TRICK-2、KILLER)屬于可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能性受體，具有胞衆(zhòng)內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域，通過接頭分子FADD(Fas associated deathdomain)招募 CASPASE-8/10，形成死亡受體信號復(fù)合體(death-inducing signalingcomplex, DISC)，進(jìn)一步激活CASPASE蛋白酶解級聯(lián)反應(yīng)來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(例如參見HolochPA. TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) a new path to anti-cancertherapies. Eur J Pharmacol 2009，625 (1-3) 63-72. ；Lavrik I.Death receptorsignaling. J Cell Sci 2005，118 (Pt 2) 265-267.) ；DcRl (decoy receptor 1，又稱 LIT、TRID、TRAIL-R3)和 DcR2(decoy receptor 2，又稱 TRUNDD、TRAIL-R4)屬于誘騙受體，前者無胞內(nèi)區(qū)，后者胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域(death domain)不完整，因此與TRAIL結(jié)合后無法傳遞凋亡信號；OPG(osteoprotegerin)是一種分泌型糖蛋白，屬于可溶性受體，可通過競爭結(jié)合從而抑制TRAIL的功能。正常細(xì)胞一般廣泛表達(dá)4種膜受體DR4、DR5、DcRU DcR2，而腫瘤細(xì)胞往往高表達(dá)DR4和DR5，因此在正常細(xì)胞中誘騙受體DcRl/2可以干預(yù)TRA IL與死亡受體DR4/5的結(jié)合而免受攻擊，腫瘤細(xì)胞由于缺乏誘騙受體保護(hù)而易于被TRAIL誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡。由于TRAIL對大多數(shù)正常細(xì)胞沒有明顯的毒性，但能夠選擇性的殺傷腫瘤細(xì)胞，因此在腫瘤治療中具有巨大潛力(例如參見Stegehuis JH. TRAIL receptor targetingtherapies for non-small cell lung cancer current status and perspectives.Drug Resist Updat 2010，13 (1-2) :2_15 ;Holoch PA. TNF-related apoptosis-inducingligand (TRAIL) a new path to anti-cancer therapies. Eur J Pharmacol 2009，625(1-3) :63-72.)。但研究表明有近半數(shù)的腫瘤細(xì)胞系不同程度的對TRAIL產(chǎn)生抵抗(TRAIL resistance)，這成為限制TRAIL臨床應(yīng)用的重要原因之一。腫瘤細(xì)胞對TRAIL 產(chǎn)生抵抗的機(jī)制有多方面，如細(xì)胞膜上TRAIL死亡受體與誘騙受體表達(dá)量的不同會影響到對 TRAIL 的抵抗(例如參見 Horak P. Contribution of epigenetic silencingof tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand receptor I(DR4)to TRAIL resistance and ovarian cancer. Mol Cancer Res 2005，3 (6) 335-343.；Elias A. Epigenetic silencing of death receptor 4 mediates tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand resistance in gliomas. Clin CancerRes 2009,15 (17) :5457_5465. ；Sanlioglu AD. Surface TRAIL decoy receptor-4expression is correlated with TRAIL resistance in MCF7 breast cancer cells. BMCCancer 2005，5:54.) ;TRAIL 受體突變(例如參見 Park WS. Inactivating mutations ofKILLER/DR5 gene in gastric cancers. Gastroenterology 2001，121 (5) 1219-1225.；Lee SH. Somatic mutations of TRAIL—receptor I and TRAIL—receptor 2 genes innon-Hodgkin 1 s lymphoma. Oncogene 2001，20 (3) :399_403.);細(xì)胞內(nèi)凋亡-抗凋亡分子之間的平衡(例如參見 Wang X. Akt-mediated eminent expression of c-FLIP andMcl-I confers acquired resistance to TRAIL-induced cytotoxicity to lung cancercells. Mol Cancer Ther 2008，7 (5) 1156-1163. ；Morioka S. TAKl kinase determinesTRAIL sensitivity by modulating reactive oxygen species and cIAP.Oncogene2009,28(23) :2257_2265. ；Thakkar H. Pro-survival function of Akt/protein kinaseB in prostate cancer cells.Relationship with TRAIL resistance. J Biol Chem2001,276 (42) :38361_38369. ；Khanbolooki S. Nuclear factor-kappaB maintainsTRAIL resistance in human pancreatic cancer cells. Mol Cancer Ther 2006，5 (9)2251-2260. ；Franco AV. The role of NF-kappa B in TNF-related apoptosis-inducingligand (TRAIL)-induced apoptosis of melanoma cells.J Immunol 2001，166 (9)5337-5345. ；Lee TJ. Acquired TRAIL resistance in human breast cancer cells arecaused by the sustained cFLIP(L)and XIAP protein levels and ERK activation.Biochem Biophys Res Commun 2006，351 (4) : 1024-1030.) ;TRAIL 死亡受體的翻譯后修飾(例如參見 Wagner KW. Death-receptor 0-glycosylation controls tumor-cellsensitivity to the proapoptotic ligand Apo2L/TRAIL.Nat Med 2007，13 (9)1070-1077.)，等。為克服這些TRAIL抵抗機(jī)制，目前的策略是根據(jù)腫瘤細(xì)胞的抵抗機(jī)制有針對性的釆取用藥策略，尤其聯(lián)合用藥以提高腫瘤細(xì)胞對TRAIL的敏感性，如重組TRAIL蛋白或TRAIL死亡受體特異性的單克隆抗體(HGS-ETRl/mapatumumab和HGS-ETR2/Iexatumumab等)，聯(lián)合化學(xué)藥物一起使用，可以達(dá)到更理想的效果。這些化學(xué)藥物通過各自機(jī)制，如以P53非依賴方式上調(diào)死亡受體的表達(dá)(大多數(shù)抑制劑都可以上調(diào)TRAIL死亡受體表達(dá))，抑制NF- κ B的活性，抑制PI3K、AKT激酶活性、抑制Bcl_2家族成員抗凋亡活性，抑制組織蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)活性(可上調(diào)DR5的表達(dá))等，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對TRAIL的促凋亡效應(yīng)(例如參見Stegehuis JH. TRAIL receptor targetingtherapies for non-small cell lung cancer current status and perspectives.Drug Resist Updat 2010，13 (1-2) :2_15 ;Holoch PA. TNF-related apoptosis-inducingligand(TRAIL) a new path to anti-cancer therapies. Eur J Pharmacol 2009，625(1-3) 63-72. ；Bevis KS. Overcoming TRAIL resistance in ovarian carcinoma.Gynecol Oncol,119 (I) :157_163·)。例如，rhTRAIL 聯(lián)合 Paclitaxel，Carboplatin和Bevacizumab用于治療NSCLC (已進(jìn)入臨床II期)(例如參見Stegehuis JH. TRAILreceptor targeting therapies for non-small cell lung cancer current status and perspectives. Drug Resist Updat 2010，13 (1-2) :2_15);此外，rhTRAIL 聯(lián)合抗 CD20 的單克隆抗體rituximab用于治療非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin, s lymphoma，NHL)(例如參見Daniel D. Cooperation of the proapoptotic receptor agonist rhApo2L/TRAIL withthe CD20antibody rituximab against non-Hodgkin lymphoma xenografts. Blood 2007，110(12) 4037-4046.)。 另一策略是從TRAIL自身出發(fā)提高重組TRAIL蛋白的促凋亡效應(yīng)，如在氨基端添加適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽，如亮氨酸拉鏈(LZ-TRAIL)，可提高TRAIL的穩(wěn)定性和聚集度從而增加 TRAIL 的效應(yīng)(例如參見 Rozanov DV. Engineering a leucine zipper-TRAILhomotrimer with improved cytotoxicity in tumor cells. Mol Cancer Ther 2009，8(6) :1515-1525.)，而且標(biāo)簽也有利于重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化，但是增加標(biāo)簽可能會導(dǎo)致安全隱患，例如，LZ-TRAIL可誘導(dǎo)體內(nèi)分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes)死亡(例如參見 Walczak H. Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand in vivo. Nat Med 1999, 5 (2) : 157-163. )，His-TRAIL 可引起月干毒性(例如參見 Lawrence D. Differential hepatocyte toxicity of recombinantApo2L/TRAILversions. Nat Med 2001，7 (4) 383-385. ； Jo M. Apoptosis induced innormal human hepatocytes by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducingligand. Nat Med 2000,6(5) :564_567. )，F(xiàn)lag-TRAIL可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腦細(xì)胞死亡(例如參見 Nitsch R. Human brain-cell death induced by tumour-necrosis-factor-relatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL) · Lancet 2000,356 (9232) :827_828.)，但是無標(biāo)簽的重組TRAIL蛋白則無毒性(例如參見Lawrence D. Differential hepatocytetoxicity of recombinant Apo2L/TRAIL versions. Nat Med 2001，7 (4) 383-385. ；HaoC. Induction and intracellular regulation of tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand(TRAIL)mediated apotosis in human malignant gliomacells.Cancer Res 2001,61 (3) :1162_1170. ；Hao C. TRAIL inhibits tumor growth butis nontoxic to human hepatocytes in chimeric mice. Cancer Res 2004,64(23)8502-8506.)。此外，從TRAIL自身與受體復(fù)合物結(jié)構(gòu)出發(fā)，通過定點(diǎn)突變對TRAIL分子胞外區(qū)進(jìn)行改造，在保障其凋亡活性的基礎(chǔ)上，尋找與DR4或DR5選擇性結(jié)合的TRAIL突變體(TRAIL variant)，在選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面較為理想(例如參見KelleyRF. Receptor-selective mutants of apoptosis-inducing ligand 2/tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing Iigand reveal a greater contributionof death receptor (DR) 5 than DR4 to apoptosis signaling. J Biol Chem 2005，280(3) 2205-2212. ；Tur V.DR4-selective tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL)variants obtained by structure-based design.J Biol Chem 2008,283 (29) 20560-20568. ；van der Sloot AM. Designed tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand variants initiatingapoptosis exclusively via the DR5 receptor. Proc Natl Acad Sci USA 2006，103(23) 8634-8639. ；Duiker EW. Enhanced antitumor efficacy of a DR5_specific TRAIL variant over recombinant human TRAIL in a bioluminescent ovarian cancerxenograft model. Clin Cancer Res 2009，15 (6) 2048-2057.)。例如，將TRAIL的第269位天冬氨酸(Asp269，D)突變?yōu)榻M氨酸(His，H)的單點(diǎn)突變體D269H，以及雙位點(diǎn)突變體D269H/T214R及D269H/E195R可選擇性的結(jié)合DR5，而與其他TRAIL受體的結(jié)合力大大降低；結(jié)腸癌細(xì)胞系Colo205和ML-1 (myeloid leukaemiacell)細(xì)胞系表面的四種TRAIL受體(DR4/5及DcRl/2)表達(dá)模式近似，但是前者主要由DR5、后者主要由DR4介導(dǎo)TRAIL的促凋亡效應(yīng)；上述DR5選擇性TRAIL突變體能夠誘導(dǎo)Colo205細(xì)胞凋亡而無法誘導(dǎo)ML-I細(xì)胞凋亡，且能夠選擇性誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780(表達(dá)DR5，不表達(dá)DR4)細(xì)胞凋亡，而無法誘導(dǎo) EM-2 (chronic myeloid leukemia cell，表達(dá)DR4，不表達(dá)DR5)細(xì)胞死亡；DR5選擇性TRAIL突變體對正常細(xì)胞HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)無促凋亡效應(yīng)(例如參見 van der Sloot AM. Designed tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand variants initiating apoptosis exclusively via theDR5 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 2006,103(23) :8634_8639.)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了 D269H/E195R突變體抗腫瘤效果比野生型重組TRAIL更理想(例如參見DuikerEW. Enhanced antitumor efficacy of a DR5_specific TRAIL variant over recombinanthuman TRAIL in a bioluminescent ovarian cancer xenograft model. Clin Cancer Res2009，15 (6) 2048-2057.)。TRAIL 的 D218H 及 D218Y 突變體則可選擇性結(jié)合 DR4，誘導(dǎo) DR4介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)(例如參見 Tur V. DR4_selective tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL)variants obtained by structure-based design. JBiol Chem 2008,283(29) :20560_20568.)。除了促凋亡效應(yīng)外，TRAIL還能通過死亡受體DR4、DR5并借助接頭分子TRADD和TRAF2等夠激活NF-κ B等信號通路，由此介導(dǎo)細(xì)胞存活、增殖、迀移、侵襲以及促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放等非凋亡效應(yīng)(例如參見Belyanskaya LL. TRAIL-induced survivaland proliferation of SCLC cells is mediated by ERK and dependent on TRAIL-R2/DR5 expression in the absence of caspase-8. Lung Cancer 2008，60(3) 355-365.；Secchiero P. TRAIL promotes the survival, migration and proliferation ofvascular smooth muscle cells. Cell Mol Life Sci 2004,61 (15) 1965-1974. ；EhrhardtH. TRAIL induced survival and proliferation in cancer cells resistant towardsTRAIL-induced apoptosis mediated by NF-kappaB. Oncogene 2003,22 (25) 3842-3852.；Ishimura N. Trail induces cell migration and invasion in apoptosis—resistantcholangiocarcinoma cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006，290 (I)G129-136. ；Tang W. TRAIL receptor mediates inflammatory cytokine release inan NF-kappaB-dependent manner. Cell Res 2009，19 (6) 758-767. ；Tang W. Tumournecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced chemokinerelease in both TRAIL-resistant and TRAIL-sensitive cells via nuclear factorkappa B. Febs J 2009，276 (2) :581_593.)，是一種具有多方面效應(yīng)的細(xì)胞因子(例如參見Schaefer U. TRAIL a multifunctional cytokine. Front Biosci 2007，12 :3813_3824.)。NF-K B是個(gè)同源或異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，亞基主要包括p50(由P105加工而來，又稱NF-κ BI)，p52(由 plOO 加工而來，又稱 NF-kB2)，p65 (RelA)，c-Rel 和 RelB 等。在靜息狀態(tài)下，NF-kB以無活性形式存在細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞因子、LPS等剌激因子作用下，可通過經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑活化后進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合靶序列5’ -GGGRNYYYCC-3’(R為嘌呤，Y為 嘧唳，N為任意核苷酸)，從而激活靶基因轉(zhuǎn)錄。NF-kB的活化程度與腫瘤細(xì)胞系對TRAIL的敏感程度密切相關(guān)(例如參見 Plantivaux A. Is there a role for nuclear factorkappaB in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand resistance Ann N Y Acad Sci 2009,1171 :38_49.) JRAIL在免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的功能，參與了固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程(例如參見Schaefer U. TRAIL a multifunctional cytokine.Front Biosci 2007，12 :3813_3824. ；Anel A. Apo2L/TRAIL and immune regulation. FrontBiosci 2007，12 :2074_2084. ；Lee HO. TRAIL a mechanism of tumor surveillance in animmune privileged site. J Immunol 2002，169(9) :4739_4744.)，例如 TRAIL 在 NK 細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-γ依賴的抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移過程起重要作用；重組TRAIL蛋白能夠誘導(dǎo)TRAIL敏感性和抗性細(xì)胞系以NF- κ B依賴的方式釋放趨化因子CXCL2、CXCL8 (IL8)、CCL2、CCL4 (MIP-Ιβ)以及CCL20 (ΜΙΡ-3 α)等；重組TRAIL剌激支氣管內(nèi)皮細(xì)胞分泌CCL20，誘導(dǎo)髓性DC及CC6+的⑶4+T細(xì)胞歸巢(homing)，在過敏性哮喘的發(fā)生過程中起重要作用(例如參見 Weckmann M. Critical link between TRAIL and CCL20 for the activation ofTH2 cells and the expression of allergic airway disease. Nat Med 2007,13(11)1308-1315.)o目前，關(guān)于TRAIL轉(zhuǎn)錄變異體，除了全長形式的TRAIL，即α變異體(或稱RefSeq)之外，還有3個(gè)被報(bào)道，分別是TRAILS、Y (例如參見Krieg A. TRAIL-betaand TRAIL-gamma two novel splice variants of the human TNF-relatedapoptosis-inducing Iigand (TRAIL)without apoptotic potential. Br J Cancer 2003，88(6) :918_927.)和 δ 變異體(例如參見 Woods DC. Cisplatin-mediated sensitivityto TRAIL-induced cell death in human granulosa tumor cells. Gynecol Oncol 2008，108(3) 632-640.)。與TRAILa相比，TRAILβ缺少第3個(gè)外顯子、TRAILy缺少第2個(gè)和第3個(gè)外顯子，而TRAILS則是缺少第3個(gè)和第4個(gè)外顯子。定位分析發(fā)現(xiàn)TRAIL Y還可定位于細(xì)胞核膜(例如參見 Krieg A. TRAIL-beta and TRAIL-gamma : two novelsplice variants of the human TNF-related apoptosis-inducing Iigand(TRAIL)without apoptotic potential. Br J Cancer 2003,88(6) :918_927.)。TRAILP 和 γ無法誘導(dǎo)TRAIL敏感性細(xì)胞系HeLa凋亡，因此這種截短(truncated)形式的變異體被認(rèn)為可能是為了減少有活性的TRAIL全長而出現(xiàn)的一種被動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制(例如參見KriegA. TRAIL-beta and TRAIL-gamma :two novel splice variants of the human TNF-relatedapoptosis-inducing Iigand(TRAIL)without apoptotic potential. Br J Cancer 2003,88(6) :918-927.)。關(guān)于TRAIL變異體，后來僅有的一篇研究表明在炎癥細(xì)胞因子TNF a刺激下，通過前提mRNA的剪接導(dǎo)致TRAIL α?xí)驘o凋亡活性的TRAILP方向變化，說明在細(xì)胞因子的刺激下，可以轉(zhuǎn)換TRAIL的促凋亡潛能(proapoptotic potential)(例如參見 Kamachi M. Activation of protein phosphatase causes alternative splicingof tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) potentialeffect on immune surveillance.Biochem Biophys Res Commun 2007,360 (I)280-285.)。除此之外，關(guān)于TRAILP、y和δ的功能無其他文獻(xiàn)報(bào)道，也無報(bào)道這些截短形式的TRAIL是否具有抑制TRAIL的促凋亡作用。
本研究通過生物信息學(xué)分析，共克隆到了 7個(gè)截短型TRAIL變異體(AK，E2，E3，E4，DA, BX424和BX439)，其中DA與TRAILP編碼的蛋白質(zhì)序列完全相同，而BX424則和TRAIL δ蛋白質(zhì)序列完全相同。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有截短形式的TRAIL變異體都無法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且E4和AK的胞外區(qū)也無法抑制TRAIL促凋亡效應(yīng)。但是，這些截短型變異體中，除了 BX439之外，都有不同程度的活化NF-κ B的能力，尤其是DA，BX424和E4，它們活化即-1^8的能力甚至強(qiáng)于1 社3叫。鑒于TRAILP在胞內(nèi)有分布(例如參見Krieg
A.TRAIL-beta and TRAIL-gamma :two novel splice variants of the human TNF-relatedapoptosis-inducing Iigand(TRAIL)without apoptotic potential. Br J Cancer 2003,88 (6) =918-927.)，而最新的一篇報(bào)道提示人肥大細(xì)胞在細(xì)胞因子IFN- y、LPS刺激下上調(diào)TRAIL的表達(dá)，但TRAIL分布僅局限在胞內(nèi)，缺乏膜表面形式TRAIL (例如參見Berent-Maoz
B.Humanmast cells express intracellular TRAIL. Cell Immunol,262(2) :80_83.)。這些提示TRAIL及其變異體存在胞內(nèi)活化NF- κ B的途徑。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)DA，BX424和E4能夠顯著活化巨噬細(xì)胞炎性蛋白-I β (ΜΙΡ-1 β /CCL4)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3a (MIP-3 a /CCL20)以及白介素8 (IL8/CXCL8)啟動(dòng)子報(bào)告基因，而過表達(dá)RefSeq以及其他TRAIL變異體的活化能力相對較弱，說明TRAIL變異體在炎癥反應(yīng)過程可能扮演著重要角色。在TRAIL變異體中，BX439和BX424的區(qū)別僅在于BX439缺乏外顯子2(138個(gè)核苷酸)，但過表達(dá)時(shí)BX439活化NF- κ B的能力大大降低，說明外顯子2編碼產(chǎn)物對于活化NF- κ B至關(guān)重要。DA缺乏外顯子3 (43個(gè)核苷酸)，但過表達(dá)時(shí)能顯著活化NF- κ B,說明該外顯子編碼產(chǎn)物對于NF- κ B的活化并不必需。綜上所述，盡管截短型TRAIL變異體已經(jīng)喪失了促凋亡或抑制凋亡的能力，但是TRAIL變異體，尤其是DA，BX424和E4能夠顯著活化NF-κ B，且上調(diào)CCL4，CCL20及CXCL8 (IL-8)等趨化因子基因表達(dá)，說明TRAIL變異體能夠發(fā)揮重要的非凋亡作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人利用生物信息學(xué)分析，克隆到了 7個(gè)截短型TRAIL變異體(AK，E2，E3，E4，DA, BX424和BX439)，并且通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些截短型變異體具有同時(shí)活化NF- κ B和某些炎性蛋白的功能。這些截短型變異體具有很好的EST支持，目前還沒有相關(guān)的功能報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)證明這些截短型變異體在8種人源細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)。并且首次證實(shí)了 7個(gè)截短型TRAIL變異體在293T和HCTl 16細(xì)胞中能夠同時(shí)活化NF- κ B和某些炎性蛋白，并且這些作用不是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡引起的。因此通過這些截短型變異體的功能，可以達(dá)到影響炎癥反應(yīng)的目的，同時(shí)為研制治療炎癥反應(yīng)藥物奠定了基礎(chǔ)。


圖IA為TRAIL轉(zhuǎn)錄變異體基因結(jié)構(gòu)圖IB為TRAIL變異體蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果圖2為TRAIL變異體在細(xì)胞系中的表達(dá)情況圖3為TRAIL各變異體在細(xì)胞膜表面的表達(dá)情況圖4為TRAIL各變異體在293T細(xì)胞中激活NF- κ B的情況圖5為熒光顯微鏡下TRAIL各變異體在293T細(xì)胞激活NF- κ B的情況圖6為在共培養(yǎng)293Τ細(xì)胞的條件下TRAIL各變異體激活NF- κ B的情況圖7為TRAIL各變異體在293T細(xì)胞中活化炎性蛋白IL8，CCL4和CCL20的情況圖8A為過表達(dá)時(shí)TRAIL各變異體對293T細(xì)胞的凋亡的影響圖8B為過表達(dá)時(shí)TRAIL各變異體對HCTl 16細(xì)胞的凋亡的影響圖8C為TRAIL各變異體對293T和HCTl 16細(xì)胞凋亡的影響
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、7個(gè)截短型TRAIL變異體的結(jié)構(gòu)分析和蛋白序列比對利用EST數(shù)據(jù)庫分析，并結(jié)合UCSC基因組瀏覽器查看，我們繪制出7個(gè)截短型TRAIL變異體的基因結(jié)構(gòu)。利用DNAstar和DNAMAN等生物信息學(xué)軟件將7個(gè)截短型TRAIL變異體的蛋白序列與RefSeq的蛋白序列進(jìn)行比對。結(jié)果參見圖1，其中IA顯示所有這些變異體序列跨越的內(nèi)含子邊界均符合GT/AG規(guī)則，其中AK (編碼65個(gè)氨基酸)和DA (編碼98個(gè)氨基酸)分別在TRAIL的第I個(gè)和第2個(gè)，以及第4個(gè)和第5個(gè)外顯子之間包含有一個(gè)新的外顯子，DA缺少外顯子3。E2 (編碼88個(gè)氨基酸)，E3(編碼123個(gè)氨基酸)和E4(編碼145個(gè)氨基酸)分別是在原有的外顯子2、
3、4上進(jìn)行了延伸。BX424(編碼101個(gè)氨基酸)缺少外顯子3和4。BX439則缺少外顯子
2、3、4。黑色方塊表示已知的外顯子，而灰色方塊表示新外顯子及已知的外顯子延伸部分。全長形式的TRAIL即RefSeq，或稱TRAILa ;DA轉(zhuǎn)錄本和TRAIL β不一樣，但編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列完全相同；ΒΧ424和TRAILS —致。其中IB可以看出所有TRAIL變異體氨基端序列相同，包含有完整的跨膜結(jié)構(gòu)域，但羧基端各有不同。由于TRAIL屬于II型跨膜蛋白，羧基端位于胞外區(qū)并參與受體的結(jié)合，所以各變異體羧基端不同提示有可能喪失了與受體的結(jié)合能力或具有不同的受體結(jié)合特異性。實(shí)施例2、7個(gè)截短型TRAIL變異體在不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況將8 種細(xì)胞(Raji，Jurkat，THP-l，HCT116，BT-325，H印G2，PC12，293T，均購自美國ATCC)以30萬/孔鋪于六孔板(NEST Biotecl, 703001)中常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)。按Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增條件94°C 5分鐘，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s，30個(gè)循環(huán)。 結(jié)果如圖2所示，通過RT-PCR檢測7個(gè)截短型TRAIL變異體在不同細(xì)胞系中mRNA水平，除了 DA僅在THP-I中檢測到表達(dá)外，其它變異體均在多種細(xì)胞系中有表達(dá)。實(shí)施例3、7個(gè)截短型TRAIL變異體在細(xì)胞膜上的表達(dá)情況將HEK293T細(xì)胞(購自美國ATCC)以30萬/孔鋪于六孔板(NEST Biotecl，703001)中常規(guī)培養(yǎng)18小時(shí)，分別將3μ g pCMV-sport6(陰性對照)、7個(gè)截短型TRAIL變異體質(zhì)粒(pCMV載體)、RefSeq(pCMV載體，陽性對照)按照說明書，使用VigoFect (Vigorous公司)陽離子轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清于離心管，胰酶消化細(xì)胞，一并轉(zhuǎn)入離心管，I, 500rpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入2% FBS的FACS封閉液(含有2% FBS的PBS)，將待測細(xì)胞制成密度大約為5 X 105/ml的單細(xì)胞懸液。隨后將anti-Myc抗體(購自MBL公司)按I : 200稀釋加入單細(xì)胞懸液，充分混勻，于室溫孵育約I小時(shí)，然后用PBS洗滌2次，用100 μ I FACS封閉液重懸細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗((購自MBL公司))，繼續(xù)室溫孵育30min，然后PBS洗滌2次，最后加入2 %多聚甲醛或冷PBS 400 μ I重懸細(xì)胞進(jìn)行流式檢測。結(jié)果參見圖3，可以看出7個(gè)截短型TRAIL變異體在細(xì)胞膜表面均有表達(dá)，其中粗線條表示變異體的表達(dá)強(qiáng)度，細(xì)線條表示空載體對照。實(shí)施例4雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)的檢測HEK293T細(xì)胞(購自美國ATCC)常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10 %胎牛血清(HyClone，SH30084. 03)的 DMEM 培養(yǎng)基(HyClone, SH30022. 01B)中，37°C，5% CO2 孵箱中培養(yǎng)。按照
I.I X IO6細(xì)胞/ml的密度，接種于96孔板，每孔100 μ 1，置于孵箱培養(yǎng)18小時(shí) 24小時(shí)，使細(xì)胞密度達(dá)到40% 60%，以備轉(zhuǎn)染。按照說明書，使用VigoFect陽離子轉(zhuǎn)染試劑(威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司)分別將50ng pNF-κ B-Luc、pIL8(-162)-Luc、pCCL4-Luc、pCCL20-Luc、5ngpRL-TK-Luc和50ng待篩基因或者對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染pCMV-sport6空載體的細(xì)胞作為空白對照。轉(zhuǎn)染pCMV-RefSeq基因的細(xì)胞作為陽性對照。每種待篩質(zhì)粒設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后檢測螢光素酶活性。按照雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Promega，E1960)的說明書裂解細(xì)胞后，利用多功能微孔板檢測系統(tǒng)GENios Pro (Tecan)檢測螢光素酶強(qiáng)度。轉(zhuǎn)染空載體對照pCMV_sport6的細(xì)胞的相對螢光值設(shè)為100%。結(jié)果取3個(gè)復(fù)孔的平均值。結(jié)果參見圖4和7，由圖4可以看出除了 BX439之外，都有不同程度的活化NF-κ B的能力，尤其是DA，BX424和E4，它們活化NF- κ B的能力甚至強(qiáng)于RefSeq ;由圖7可以看出7個(gè)截短型變異體均不同程度的活化巨噬細(xì)胞炎性蛋白-I β (ΜΙΡ-1 β /CCL4)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白_3α (MIP-3 a /CCL20)以及白介素8 (IL8/CXCL8)啟動(dòng)子報(bào)告基因，其中以DA，ΒΧ424和E4活化效果顯著，RefSeq和其它TRAIL變異體的活化能力相對較弱。實(shí)施例5熒光顯微鏡觀察7個(gè)截短型變異體對NF- κ B的影響
借助于熒光顯微鏡，利用NF- κ B-GFP可以很方便地觀察到7個(gè)截短型變異體在細(xì)胞對NF- κ B的影響。實(shí)驗(yàn)中使用pCMV-sport6空載體作為陰性對照，以轉(zhuǎn)染了 RefSeq后為陽性對照。293T細(xì)胞(購自美國ATCC)常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10 %胎牛血清(HyClone，SH30084. 03)的 DMEM 培養(yǎng)基(HyClone, SH30022. 01B)中，37°C，5% CO2 孵箱中培養(yǎng)。按照
1.I X IO6細(xì)胞/ml的密度，接種于96孔板，每孔100 μ 1，置于孵箱培養(yǎng)18小時(shí) 24小時(shí)，使細(xì)胞密度達(dá)到40% -60%，以備轉(zhuǎn)染。按照說明書，使用VigoFect陽離子轉(zhuǎn)染試劑(威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司)分別將200ng pCMV-sport6 (陰性對照)和NF- κ B-GFP,7個(gè)截短型變異體質(zhì)粒(pCMV載體)轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)24h后利用熒光顯微鏡觀測。結(jié)果如圖5，可以看出7個(gè)截短型TRAIL變異體能夠不同程度的活化NF-κ B-GFP，使其熒光增強(qiáng)，其中BX424、DA、E4和RefSeq活化能力最強(qiáng)。 實(shí)施例6用共培養(yǎng)的方法檢測7個(gè)截短型變異體NF- κ B的激活情況將ΗΕΚ293Τ細(xì)胞(購自美國ATCC)和HCTl 16細(xì)胞(購自美國ATCC)常規(guī)傳代培養(yǎng)于含 10%胎牛血清(HyClone, SH30084. 03)的 DMEM 培養(yǎng)基(HyClone, SH30022. 01B)中，37°C,5% CO2孵箱中培養(yǎng)。按照I. I X IO6細(xì)胞/ml的密度，接種于96孔板，每孔100 μ 1，置于孵箱培養(yǎng)。共培養(yǎng)時(shí)，293Τ細(xì)胞分為兩個(gè)轉(zhuǎn)染組(I)單獨(dú)轉(zhuǎn)染TRAIL各變異體重組質(zhì)粒；
(2)共轉(zhuǎn)pCMV-sport6 (陰性對照)，pNF- κ B-Luc以及pRL-TK-Luc基因質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，將上述(I)組細(xì)胞消化處理后加入到上述(2)組細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行測定。結(jié)果參見圖6，從圖中可以看出只有RefSeq在共培養(yǎng)的模式下能夠活化NF-κ B。實(shí)施例7流式技術(shù)檢測7個(gè)截短型變異體對細(xì)胞凋亡影響細(xì)胞凋亡的主要生化指標(biāo)是細(xì)胞膜脂酰絲氨酸(PS)外翻和線粒體膜電位的下降，碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。將HEK293T細(xì)胞(購自美國ATCC)和HCT116細(xì)胞(購自美國ATCC)以30萬/孔鋪于六孔板(NEST Biotecl, 703001)中常規(guī)培養(yǎng)18小時(shí)，分別將3 μ gpCMV-sport6 (陰性對照)、7個(gè)截短型變異體質(zhì)粒(pCMV載體)、RefSeq (pCMV載體，陽性對照)按照說明書，使用VigoFect (Vigorous公司)陽離子轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞和HCT116細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24小時(shí)后和48小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清于離心管，胰酶消化細(xì)胞，一并轉(zhuǎn)入離心管，I, 500rpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞 2 次，重懸于 200 μ I 結(jié)合緩沖液(IOmM HEPES，pH 7. 4,140mM NaCl, ImM MgCl2, 5mM KCl，
2.5mMCaCl2)，加入終濃度為 0. 5 μ g/ml 的 FITC-Annexin-V(購自美國 BD 公司 556547)，室溫避光反應(yīng)20分鐘后加入終濃度為I μ g/ml的PI (購自美國BD公司556547)，根據(jù)細(xì)胞濃度補(bǔ)上200-400 μ I結(jié)合緩沖液，立即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果如圖8所示，可以看出，7個(gè)截短型變異體質(zhì)粒與對照相比沒有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，這說明截短型變異體已經(jīng)喪失了促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力。
權(quán)利要求
1.氨基酸序列為SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示的截短型TRAIL變異體在細(xì)胞中活化NF- κ B和治療炎癥中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用為活化NF-κB和炎性蛋白-I β (ΜΙΡ-1 β /CCL4)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3 α (MIP-3 a/CCL20)以及白介素8 (IL8/CXCL8)的啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用不是通過細(xì)胞凋亡引起的。
4.如權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞為截短型TRAIL變異體普遍表達(dá)的人源細(xì)胞，包括人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞、組織相容性淋巴瘤細(xì)胞、人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞為293T和HCT116細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的截短型TRAIL變異體在治療炎癥反應(yīng)藥物制備中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于活化NF-κB和炎性蛋白-I β (ΜΙΡ-1 β /CCL4)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3 α (MIP-3 a/CCL20)以及白介素8 (IL8/CXCL8)的啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述應(yīng)用不是通過細(xì)胞凋亡引起的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述細(xì)胞為截短型TRAIL變異體普遍表達(dá)的人源細(xì)胞，包括人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞、組織相容性淋巴瘤細(xì)胞、人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述細(xì)胞為293T和HCT116細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于腫瘤壞死因子-(TNF-)相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-(TNF-)-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL))領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及TRAIL的7個(gè)截短型TRAIL變異體(AK，E2，E3，E4，DA，BX424和BX439)，其中DA與TRAILβ編碼的蛋白質(zhì)序列完全相同，而BX424則和TRAILδ蛋白質(zhì)序列完全相同。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在這些截短型變異體中，除了BX439之外，都有不同程度的活化NF-κB的能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)DA，BX424和E4能夠顯著活化巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β(MIP-1β/CCL4)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α(MIP-3α/CCL20)以及白介素8(IL8/CXCL8)啟動(dòng)子報(bào)告基因。本發(fā)明TRAIL的變異體在治療炎癥反應(yīng)中具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P29/00GK102908612SQ20111021922
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月2日
發(fā)明者王平章, 盧艷, 李長清, 李娜, 石太平, 于鵬, 馬大龍 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司