專利名稱：gp350/220的非剪接變異體的制作方法
皰疹病毒組的一個成員，非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒(EBV)，引起人的傳染性單核細(xì)胞增多。該疾病侵襲90％以上的人群。健康分析者估測在美國每年該疾病的花費是100百萬。該病毒主要是通過與排出該病毒的個體交換唾液而傳播的。被EBV感染的兒童大多數(shù)無癥狀或者有非常微弱的癥狀，而青少年和成年人感染后發(fā)展成為典型的傳染性單核細(xì)胞增多，特征為發(fā)燒，咽炎和腺病。已經(jīng)感染過病毒的人群在其余生中保留抗EBV抗體，并且因此對進(jìn)一步的感染有免疫力。目前沒有商品EBV疫苗出售。
除了感染特性以外，已經(jīng)證明EBV將淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為快速分裂細(xì)胞因此牽涉幾種不同的淋巴瘤包括伯基特淋巴瘤和口腔毛細(xì)胞粘膜白斑病中。已經(jīng)在鼻咽腫瘤的組織樣本中檢測到EBV。據(jù)估測世界范圍內(nèi)有80,000例鼻咽癌發(fā)生并且在中國的少數(shù)民族人群中更流行。
對于EBV的活的，減毒疫苗的研制已經(jīng)并且仍然是個問題。由于存在與EBV相關(guān)的潛在的致癌特性，研究者難于得到使用活疫苗的方法。本發(fā)明通過創(chuàng)制制備亞單位疫苗的方法和組合物而克服了與活疫苗研制有關(guān)的問題，所述方法和組合物不需要使用潛在的致癌活疫苗。亞單位疫苗使用一種或多種來自于激發(fā)免疫應(yīng)答和授予免疫性的病毒的抗原蛋白。
兩種較重要的抗原性EBV蛋白是糖蛋白gp350/300和gp220/200，它們構(gòu)成了病毒包膜部分和通過與細(xì)胞膜蛋白CD21發(fā)生作用允許病毒顆粒結(jié)合到并且加入人靶細(xì)胞。參見奈麥如，病毒雜志611416(1987)。長期來已經(jīng)將它們選出作為亞單位疫苗候選物但是難于從天然來源獲得有抗原性的活性蛋白以及由于重組生產(chǎn)的產(chǎn)量較低妨礙了研究者和疫苗研制者的工作。在文獻(xiàn)中這些蛋白質(zhì)有不同的分子量范圍(其中一種蛋白質(zhì)的分子量為350或300千道爾頓(kD)和另一種蛋白質(zhì)的分子量為220或200kDs)。在本文中將gp350或300蛋白質(zhì)稱作為gp350蛋白質(zhì)和將gp220或200蛋白質(zhì)稱作為gp200蛋白質(zhì)?？傊?，兩種蛋白質(zhì)在本文中稱為gp350/220蛋白質(zhì)。
可選擇一種經(jīng)剪接的單基因編碼并且導(dǎo)致產(chǎn)生gp350和gp220mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；已知沒有天然存在的在gp350/220基因剪接位點處的變異體該基因產(chǎn)生兩種表達(dá)產(chǎn)物，gp350和gp220蛋白質(zhì)。gp350/220DNA序列的開放讀框是2721堿基對。該整個閱讀框架編碼gp350的907個氨基酸。參見授權(quán)給凱夫的U.S.專利No.4,707,358(1987)。剪接形式的閱讀框架具有2130個堿基并且轉(zhuǎn)譯為gp220蛋白質(zhì)，一種710個氨基酸的序列。gp350蛋白質(zhì)和gp220蛋白質(zhì)的理論分子量是分別為95kD和70kD。經(jīng)檢測，表達(dá)的gp350蛋白質(zhì)和gp220蛋白質(zhì)的分子量是不定的并且分別為約350千道爾頓和220千道爾頓(kD)。該蛋白質(zhì)的廣泛糖基化是預(yù)測的和實際的分子量有差異的原因。對于任何一個細(xì)胞，以約6∶1到1∶1的摩爾比產(chǎn)生gp350蛋白質(zhì)和gp220蛋白質(zhì)。例如，對于由EBV持久感染的B95-8細(xì)胞，該比例似乎是不定的并且有時接近于6∶1的范圍。參見，米勒，美國國家科學(xué)院院報，69383(1972)。
類似地，至今為止重組生產(chǎn)的這些蛋白質(zhì)通常得到所產(chǎn)生的gp350蛋白質(zhì)和gp220蛋白質(zhì)的混合物。迄今為止，已經(jīng)在大鼠垂體，中國倉鼠卵巢VERO(非洲綠猴腎)細(xì)胞，以及酵母細(xì)胞中表達(dá)了gp350/220蛋白質(zhì)。參見王，J.Virol.611796(1982)，Motz，Gene44353(1986)和艾米尼，病毒學(xué)166387(1988)。已經(jīng)利用牛乳頭瘤病毒表達(dá)系統(tǒng)在鼠成纖維細(xì)胞中制備gp350/220蛋白質(zhì)。參見，Madej，Vaccine10777(1992)。還已經(jīng)利用痘苗病毒的實驗室和疫苗株表達(dá)gp350/220蛋白質(zhì)。經(jīng)修飾的重組形式的EBVgp350/220DNA和蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。特別是已經(jīng)制備了失去跨膜序列的gp350/220基因的截短的重組構(gòu)建體。所述構(gòu)建體仍產(chǎn)生兩種gp350和gp220的混合物，但是失去了允許蛋白質(zhì)分泌的跨膜區(qū)域。參見，費納提，基因病毒學(xué)雜志73449(1992)和梅者，疫苗10777(1992)。也已經(jīng)在大腸桿菌中制備和表達(dá)了含有g(shù)p350/220的各種重組生產(chǎn)的限制性片段和融合蛋白。參見1991年7月24公開的EP專利公開0173254。
因此，迄今為止涉及gp350/220的對EBV的研究已經(jīng)集中于使天然gp350/220序列獲得有效表達(dá)或者集中于失去跨膜區(qū)的經(jīng)修飾的序列，結(jié)果產(chǎn)生兩種不同剪接形式的天然或失去跨膜區(qū)的蛋白質(zhì)的混合物，或集中于生產(chǎn)與β半乳糖苷酶融合蛋白形式的抗原決定族片段序列。
部分純化的gp350/220制劑是已知的。參見，F(xiàn)inerty，J.Gen.Virology73449(1992)(重組生產(chǎn)的，部分純化的)。對于天然gp350/220蛋白質(zhì)，在大多數(shù)情況下，純化步驟導(dǎo)致蛋白質(zhì)的抗原性失活，使之不適合用于亞單位疫苗中。但是，在科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)報道了從天然(即非重組)來源獲得的高度純化的具抗原活性的gp350/220蛋白質(zhì)制劑。參見，Dvaid，J.Immunol.Methods108231(1988)。將其它的重組疫苗病毒表達(dá)的gp350/220蛋白質(zhì)用于接種于cottontoptamarin，使之抵抗EBV誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞瘤。參見，Morgan，J.Med.Virology25189(1988)，Mackett，EMBO J.43229(1985)和Mackett，VACCINES’86，pp293(Lerner RA，Chanock RM，Brown FEds.，1986，Cold Spring Harbor Laboratory)。但是，目前還沒有對病毒gp350/220DNA序列進(jìn)行工程化以便能夠表達(dá)該基因的兩種剪接方式的任何一種，從而能夠并且確保生產(chǎn)純化的gp350或gp220蛋白質(zhì)。還沒有制備出能表達(dá)gp350或gp220蛋白質(zhì)的任何一種的重組病毒或突變病毒。
通常，剪接位點有利于使前mRNA分子加工為mRNA。對于多瘤病毒，要求剪接位點有利于有效地積累晚期mRNA。多瘤病毒轉(zhuǎn)錄物中的3’或5’剪接位點的變更降低或完全阻礙mRNA的積累。參見，Treisman，Nature292595(1981)。在SV40病毒中，可切除的間插序列有利于從核中輸出mRNA和mRNA在核中的穩(wěn)定性。并且由于這些內(nèi)含子/外顯子連接序列有利于小的，核的，RNP顆粒結(jié)合，因此認(rèn)為剪接前的mRNA不能正確地與加工途徑相連接。已經(jīng)證明在外顯子/內(nèi)含子剪接位點處的點突變降低了外顯子/內(nèi)含子裂解和可以干擾前-mRNA加工，核運輸和穩(wěn)定。參見，Ryu，病毒雜志634386(1989)和Gross，Nature 286634(1980)。
因此，直到本發(fā)明，剪接位點的修飾對有EBVgp350/220序列編碼的蛋白質(zhì)的功能表達(dá)和抗原性的影響充其量是未知的并且是不可預(yù)測的。
其它的背景文獻(xiàn)包括如下所述。在Straus，Annal of Int.Med.11845(1993)中總體上評述EBV生物學(xué)和疾病。在Baer，Nature310207(1984)中描述了EBV BLLFI開放讀框。由Beisel，病毒雜志54665(1985)和Biggin，EMBO J.31083(1984)d的論文和在Kieff等人(1987)的美國專利No.4,707,358中描述了非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒gp350/220DNA和氨基酸序列。在Lees，Virology195578(1993)中公開了非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒A型和B型編碼gp350/220糖蛋白的DNA序列的比較結(jié)果。在Thorley-Lawson，Proc.Natl.Acad.Sci.775307(1980)中公開了展示抗EBV的gp350/220糖蛋白的中和活性的單克隆抗體。最近，在Mount，Nucleic Acids Res.10459(1982)中公開了供體和受體剪接位點的剪接位點共有序列。
一方面本發(fā)明提供了EBV gp350/220DNA序列的非剪接變異體。本發(fā)明的DNA序列包括一種編碼表達(dá)的同源gp350蛋白質(zhì)的分離的DNA序列。編碼gp350蛋白質(zhì)的DNA序列的特征在于含有相同于或基本相同于

圖1的核苷酸序列，其中供體和受體剪接位點處的天然核苷酸被非天然核苷酸或其片段取代。該DNA序列包括編碼序列兩側(cè)的5’和3’非編碼序列以及進(jìn)一步包括氨基末端信號序列。附圖1描述了非編碼序列和用星號指出了假設(shè)的信號序列。但是，應(yīng)該明白本發(fā)明的DNA序列可以排除一些或所有側(cè)翼或信號序列。通過在編碼gp350/220蛋白質(zhì)的基因DNA序列的供體和受體剪接位點處導(dǎo)入突變可產(chǎn)生本發(fā)明的非剪接變異DNA序列。這種方法排除了gp220蛋白質(zhì)的生產(chǎn)以便僅生產(chǎn)gp350蛋白質(zhì)。
因此，另一方面本發(fā)明包括均一的gp350蛋白質(zhì)，和通過在合適的表達(dá)控制序列控制的條件下在合適的原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)EBVgp350/220DNA序列的非剪接的變異體而制備蛋白質(zhì)的方法。對于本文中使用的術(shù)語gp350蛋白質(zhì)，均一是沒有或基本上沒有g(shù)p220蛋白質(zhì)。我們注意到在哺乳動物或昆蟲細(xì)胞中重組產(chǎn)生的均一gp350蛋白質(zhì)在迄今為止的科學(xué)文獻(xiàn)中沒有報道過。
在另一方面，提供了另外具有導(dǎo)致產(chǎn)物分泌的缺失的均一gp350蛋白質(zhì)。所述缺失包括去除跨膜區(qū)或去除跨膜區(qū)和保留C-末端的gp350。所述附加修飾的DNA序列和由其編碼的蛋白質(zhì)是本發(fā)明的又一方面。
還提供了一種重組DNA分子，包括載體DNA和編碼均一gp350蛋白質(zhì)的DNA序列。該DNA分子提供了與合適的調(diào)節(jié)序列可操作結(jié)合的gp350序列，所述調(diào)節(jié)序列能夠在選定的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)均一gp350的復(fù)制和表達(dá)。本發(fā)明還提供了用于表達(dá)重組均一gp350的用所述DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面涉及所述的DNA分子和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，涉及用于生產(chǎn)重組均一gp350蛋白質(zhì)或其片段的新方法。在該方法中在合適的允許所述重組DNA表達(dá)的條件下培養(yǎng)用一種與能控制該蛋白質(zhì)表達(dá)的合適調(diào)節(jié)或表達(dá)控制序列可操作連接的DNA序列(或如上文中描述的重組DNA分子)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，所述DNA序列編碼均一gp350蛋白質(zhì)或其片段。然后采用合適的常規(guī)手段從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中收集所表達(dá)的蛋白質(zhì)。該方法可以使用許多已知的細(xì)胞作為宿主細(xì)胞；目前優(yōu)選的是哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。
本發(fā)明的DNA序列和蛋白質(zhì)可用于生產(chǎn)具有EBV抗原決定簇的治療和免疫原化合物。所述化合物可用于亞單位疫苗，用于預(yù)防治療和預(yù)防EBV相關(guān)的疾病，例如傳染性單核細(xì)胞，伯基特淋巴瘤或鼻咽癌。因此，另一方面本發(fā)明包括用于預(yù)防和治療人的EBV相關(guān)狀況和疾病例如傳染性單核細(xì)胞，伯基特淋巴瘤或鼻咽癌的治療和/或免疫原的藥物組合物。所述治療和/或免疫原的藥物組合物包括與藥物學(xué)上可接受的載體例如氫氧化鋁，鹽水和磷酸緩沖鹽水(如本發(fā)明已知的)混合的能有效誘導(dǎo)免疫原性量的一種或多種本發(fā)明的均一gp350蛋白質(zhì)?！罢T導(dǎo)免疫原性的”是指其量足以刺激哺乳動物產(chǎn)生抗EBV的抗體。另一種可選擇的方法，活性形式可以以含有脂質(zhì)體的聚合體的形式給藥。對于預(yù)防應(yīng)用，所述藥物組合物可以配制成為施用于人患者的亞單位疫苗?？梢杂米阌诖碳げ∪诵纬煽贵w的劑量免疫接種患者；并且在六個月或一年之后再接種。
因此本發(fā)明的又一方面是通過給患者特別是人患者施用與合適載體結(jié)合的能有效誘導(dǎo)免疫原性量的均一gp350蛋白質(zhì)而治療EBV相關(guān)疾病和狀態(tài)的方法。
本發(fā)明的又一方面是通過給患者施用與合適載體結(jié)合的能有效誘導(dǎo)免疫原性量的均一gp350蛋白質(zhì)而刺激抗EBV的免疫應(yīng)答。
附圖1描述了gp350/220的DNA和氨基酸序列(Beisel，病毒雜志54665(1985))。指明了供體和受體剪接位點。用水平箭頭描述跨膜區(qū)并且用星號表示假設(shè)的信號序列的末端。在左邊顯示核苷酸的編號；在右邊顯示氨基酸的編號。
附圖2描述了gp350缺失和定點突變的結(jié)構(gòu)。標(biāo)明為pMDTM和pMSTOP的質(zhì)粒圖譜用于舉例說明本發(fā)明的非剪接的gp350/220變異體。在(A)部分中，近似地按比例顯示了gp350蛋白質(zhì)的線性模型以及與編碼克隆，BLLF1(見下文)。指明了蛋白質(zhì)上的N-末端信號肽序列(SS)和跨膜區(qū)(TM)并且在基因圖上指明了重要的限制性圖譜。將gp350基因克隆于兩個片段，HindIII/BfaI BLSH1片段和BanI/HindIIIBLSH2片段中。利用聚合酶鏈反應(yīng)從所指明的BLLF1區(qū)制備SCYT。在(B)中，顯示了pDTM，pSTOP，pMDTM，和pMSTOP的克隆方案(質(zhì)粒未按比例顯示)。實施例1和2詳細(xì)描述了克隆步驟。用相應(yīng)的限制性位點，使用的克隆載體和gp350基因片段標(biāo)記質(zhì)粒圖譜。用星號顯示pMDTM，和pMSTOP的剪接位點。
附圖3描述了由SDS-PAGE分析的由pMDTM克隆產(chǎn)生的均一gp350蛋白質(zhì)的免疫沉淀的結(jié)果。分泌截短形式的gp350/220蛋白質(zhì)的陽性對照(GH3Δ19)細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞以及幾種pMDTM克隆用35S-甲硫氨酸在代謝過程進(jìn)行標(biāo)記5.5小時；從得到的組織培養(yǎng)上清液免疫沉淀出均一的gp350蛋白質(zhì)。對于每一種細(xì)胞類型，在5％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)上將標(biāo)記的組織培養(yǎng)上清液(S)和gp350/220沉淀(Ip)樣品進(jìn)行電泳。在左邊指示分子量標(biāo)記物的位置。
附圖4描述了來自CHO細(xì)胞表達(dá)的pMDTM克隆的蛋白質(zhì)，如實施例3.4的Northern印跡分析結(jié)果。
公開了包含編碼非剪接的gp350蛋白質(zhì)變異體的克隆的EBV DNA序列組合物和方法。正如所解釋的，本文中所述非剪接變異體是指均一gp350蛋白質(zhì)。通常，當(dāng)gp350/220基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時由于基因的RNA剪接作用產(chǎn)生兩種基因產(chǎn)物gp350和gp220。本發(fā)明僅允許產(chǎn)生一種基因產(chǎn)物gp350。本發(fā)明涉及從gp350基因中去除一些或整個RNA剪接位點信號并且在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因。當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)gp350/220基因時在該基因中導(dǎo)入突變以便阻止產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的220kD形式。結(jié)果僅產(chǎn)生編碼gp350的mRNA轉(zhuǎn)錄物。通過利用gp350/220基因非剪接變異體而去除gp220的表達(dá)導(dǎo)致相對gp220而言gp350的產(chǎn)生增加。gp220的產(chǎn)生不是生產(chǎn)有效抗EBV疫苗所必須的，因為gp350含有在gp220中發(fā)現(xiàn)的所有有效的抗原位點。
因此，本發(fā)明的一方面提供了編碼基本上相同于gp350的多肽的DNA序列，所不同的是通過用非天然核苷酸取代天然核苷酸已經(jīng)修飾了編碼氨基酸501的供體剪接位點密碼子和編碼氨基酸698的受體剪接位點密碼子。優(yōu)選地是用非天然核苷酸取代天然核苷酸以便保留相同的氨基酸序列。特別是，在該實施例中，在供體剪接位點的天然核苷酸AAGT(核苷酸1500到1504)和GG受體剪接位點側(cè)翼的天然核苷酸A和T(核苷酸2091和2094)分別用核苷酸GTCA和T和A取代。因此，在供體位點取代的結(jié)果保留第500位的氨基酸谷氨酸和第501位的絲氨酸是相同的。另外，在受體位點取代的結(jié)果保留第697位的氨基酸蘇氨酸和第698位的甘氨酸是相同的。
類似地，采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的在下文中將詳細(xì)描述的接受可以方便地完成除特別列舉以外的取代。
因此，本發(fā)明一方面包括均一的gp350蛋白質(zhì)。均一gp350蛋白質(zhì)的進(jìn)一步的特征在于其氨基酸序列基本上相同于附圖1顯示的氨基酸1-907位，氨基酸1-862位或氨基酸1-907位并且除去氨基酸863-881位的序列，各帶有或沒有N-末端的18個氨基酸的信號序列。另外，提供了均一的gp350蛋白質(zhì)的類似物并且包含突變體，其中氨基酸序列發(fā)生變異但是保留了抗原活性并且與均一的gp350蛋白質(zhì)的相應(yīng)區(qū)域相比優(yōu)選的是具有至少80％，更優(yōu)選的是具有90％，最優(yōu)選的是具有95％的同源性。實施例包括與附圖1的氨基酸序列相比具有最小變異特別是保守的氨基酸取代的蛋白質(zhì)和多肽；保守的取代是那些與其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸族之內(nèi)發(fā)生的取代。通常遺傳上編碼的氨基酸可劃分為四個族(1)酸性＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)堿性＝賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性＝丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)未帶電荷的極性＝甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。有時將苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸一起劃分為芳香族氨基酸。例如，有理由預(yù)期用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸隔離地取代亮氨酸或類似的保守取代一種氨基酸對抗原活性或功能特性沒有巨大影響。
本發(fā)明具有g(shù)p350的純化較簡單的優(yōu)點。由于gp350和gp220具有類似的生化特性，在gp350制備時經(jīng)常共純化gp220。僅表達(dá)gp350/220基因的非剪接變異體的細(xì)胞使蛋白質(zhì)的純化簡單化。這將降低生產(chǎn)gp350的費用。本發(fā)明也使對用于gp350純化的起始材料進(jìn)行生化定性變?yōu)楹唵?。由于僅存在一個品種，可在不考慮存在第二個品種的情況下完成蛋白質(zhì)含量分析和氨基酸序列分析。
另外本發(fā)明具有增加gp350產(chǎn)生的優(yōu)點。阻止gp350基因剪接可將細(xì)胞從雙重產(chǎn)生gp350和gp220變?yōu)閮H產(chǎn)生gp350。在一些細(xì)胞中，估測gp220的濃度為gp350濃度的30％-100％。由于去除了基因的剪接，gp350的產(chǎn)生隨著gp220產(chǎn)生的損失而提高。
由Beisel，病毒雜志54665(1985)和Biggin，EMBO J.31083(1984)描述了gp350/220基因的DNA序列并且描述于附圖1中。該基因是2721堿基的開放讀框，編碼907個氨基酸并且產(chǎn)生約95kD的一級轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物。預(yù)定的和實際的值之間的差異代表該蛋白質(zhì)被廣泛地糖基化。將591個堿基(編碼197個氨基酸)剪接以便產(chǎn)生gp220。gp350/220基因產(chǎn)物的表觀分子量隨著所使用的檢測系統(tǒng)的類型，不同類型的細(xì)胞中使用的糖基化位點，轉(zhuǎn)譯后的不同加工方法或選擇性基因的突變而變化。對于不同的gp350/220基因非剪接位點變異體的產(chǎn)物，所測定的值是不同的，但是術(shù)語“均一gp350蛋白質(zhì)”包括非剪接位點變異體的基因產(chǎn)物，非強(qiáng)制性地含有其它的缺失或突變例如C-末端缺失和/或本文中公開的跨膜區(qū)修飾。術(shù)語“gp220蛋白質(zhì)”是指具有分子量約220kD的另一種剪接的gp350/220基因產(chǎn)物。通過將gp350/220基因與基于其它基因，主要是真核生物體的基因的共有的供體和受體剪接序列進(jìn)行比較可識別gp350/220基因中的剪接位點。由Mount，Nucleic Acids Res.1 459(1982)從研究其它基因的剪接位點得出的共有序列是供體ACAG/G*T*AGAGT]]>受體TCN11CTA*G*/G]]>上述帶星號的堿基代表在所有的剪接位點100％出現(xiàn)的堿基(高度保守)。有兩個堿基或一個堿基的位置代表保守位置(非強(qiáng)調(diào)的位置)。斜線位置表示實際的剪接位點。
在gp350/220基因中通過對gp350/220基因的DNA序列測序(Biggin，EMBO J.31083(1984))顯示供體剪接位點出現(xiàn)于核苷酸1501之后，受體剪接出現(xiàn)于核苷酸2092之后。(本文中使用的和附圖1使用的編號對應(yīng)于Biggin的編號)。在EBV的B型菌株該剪接位點出現(xiàn)于相應(yīng)的基因區(qū)(供體剪接位點出現(xiàn)于A1501之后，受體剪接出現(xiàn)于A2029之后)。本發(fā)明包括利用A或B菌株或另一種EBV菌株的剪接位點以便從gp350/220基因產(chǎn)生單一的mRNA而制備的組合物。在該實施例中使用了B95-8菌株的A型病毒形式的DNA序列，盡管使用B型菌株的DNA序列是相同的，因為A和B型菌株的轉(zhuǎn)譯基因產(chǎn)物98％是相同的。B菌株失去了507-520位的氨基酸和570-576位的氨基酸。由于A型菌株含有所有可能的gp350抗原位點因而使用A型菌株。另一種方法，根據(jù)本文的觀點使用具有菌株特異性序列的EBV gp350/220以便產(chǎn)生EBV菌株特異性的均一gp350蛋白質(zhì)，它具有特異于特定菌株的免疫特性并且因此用于免疫和/或治療組合物中以便預(yù)防或治療菌株特異性EBV相關(guān)疾病。表1顯示供體和受體剪接位點的野生型核苷酸和氨基酸序列。
為了預(yù)防gp350/220基因的RNA剪接，將突變導(dǎo)入到gp350/220基因的核酸序列以便取代RNA剪接位點的有關(guān)堿基對。為了使剪接位點失去功能，優(yōu)選地，在形成供體或受體位點框架的兩個高度保守堿基中的至少一個堿基應(yīng)該被非保守堿基取代，更優(yōu)選地至少兩個高度?？蓧A基應(yīng)該被突變?yōu)榉潜Ｊ貕A基。其它保守堿基，剪接位點之外的兩個以上堿基也可以被非保守剪接位點堿基取代以便進(jìn)一步降低剪接位點的識別。將供體和受體位點改變以便破壞剪接機(jī)理。優(yōu)選地，供體和受體在四個高度保守剪接位點堿基位置之一至少各含有一種變化，并且優(yōu)選地，至少在四個高度保守剪接位點堿基位置之二各含有兩種變化。如果期望一個剪接位點沒有突變以便保持野生型氨基酸序列，那么優(yōu)選地將至少兩個突變導(dǎo)入到其它剪接位點。
在gp350/220剪接位點的突變可以使隨后表達(dá)的氨基酸序列發(fā)生變化。優(yōu)選地所述變化應(yīng)該是保守的氨基酸取代。與氨基酸序列中非保守的取代相反，保守的氨基酸取代將幫助保存抗原位點可以制備保守的氨基酸變化，只要該堿基的變化(幾個堿基變化)導(dǎo)致非變異的供體/受體堿基發(fā)生合適的變化。例如，利用除GGU以外的特異于Gly的密碼子可以在供體剪接位點以Gly取代Ser501(利用GGU會保存G核苷酸并且不會在剪接信號產(chǎn)生所需的GT取代)。另外，在受體剪接位點，以Gly698取代Ala將是保守的變化，但是由于所有的Ala密碼子是以高度保守的G核苷酸起始的，這不會產(chǎn)生所需的取代。雖然脯氨酸也可能是一種保守的氨基酸變化，但是不能用脯氨酸取代野生型氨基酸，因為它會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生修飾，從而掩飾一個或多個gp350抗原位點。表1顯示野生型序列中的可接受的保守的氨基酸取代。在表1的底部是用保守的氨基酸序列突變的實施例。
表1
雖然本發(fā)明的一方面包含gp350/220的非剪接變異體，但是其它的gp350/220的編碼序列的突變體也是令人滿意的。為了生產(chǎn)可溶性gp350蛋白質(zhì)(“可溶性蛋白質(zhì)”是在溶液中游離的或與膜結(jié)合但是不與膜整合)，例如，以便避免由于表達(dá)整合膜蛋白形式的全長gp350而產(chǎn)生的細(xì)胞毒性問題，通過缺失整個或部分其DNA編碼序列而對gp350的膜跨越區(qū)(已知也稱為跨膜區(qū))進(jìn)行修飾。gp350/220的膜跨越區(qū)包含861位(甲硫氨酸)-881位(丙氨酸)氨基酸。參見，Beisel，病毒雜志54665(1985)。優(yōu)選地，缺失跨膜區(qū)的至少8個氨基酸，更優(yōu)選地缺失至少12個氨基酸，最優(yōu)選地缺失18和21之間的氨基酸。因此，另一方面，本發(fā)明提供了gp350/220DNA的非剪接變異體和/或gp350均一蛋白質(zhì)，特別是在gp350/220DNA和/或gp350均一蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)至少有一個缺失，從而導(dǎo)致可溶性均一gp350蛋白質(zhì)的表達(dá)。
除了缺失整個或部分非剪接gp350/220變異體的跨膜區(qū)，如本文描述的根據(jù)本發(fā)明也可以缺失跨膜區(qū)后面的含有881-907位的氨基酸的C-末端序列。因此另一方面本發(fā)明包含進(jìn)一步由缺失整個或部分DNA編碼序列和/或氨基酸序列(gp350/220的跨膜區(qū))，并且甚至進(jìn)一步由缺失其余的C-末端DNA和/或gp350/220的氨基酸序列而修飾的gp350/220DNA的非剪接變異體和/或gp350均一蛋白質(zhì)。
因此，另一方面本發(fā)明包含編碼本發(fā)明的均一gp350蛋白質(zhì)的非剪接的DNA序列變異體。所述DNA序列包含編碼1-907位氨基酸的附圖1的DNA序列并且進(jìn)一步含有本文所述的核苷酸取代以便去除供體和受體剪接位點。所述DNA序列非強(qiáng)制性地含有截短的DNA序列，其中缺失了編碼整個或部分跨膜區(qū)和包含861-881位的C末端的核苷酸，并且含有缺失變異體，其中缺失了編碼含有861-881位的整個或部分跨膜區(qū)的核苷酸。編碼均一gp350蛋白質(zhì)的本發(fā)明的DNA序列也含有能在合適的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，或要不是遺傳密碼子簡并能在所述條件下與附圖1的分離出的DNA序列雜交的DNA。因此，基于等位變異，種變異或故意修飾，本發(fā)明的DNA序列在非編碼序列，信號序列或編碼序列中可以含有修飾。
利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法可以構(gòu)建本文中公開的這些非剪接變異gp350/220 DNA序列?？梢圆捎弥亟M方法，或者利用已知方法表達(dá)本發(fā)明的修飾DNA序列以便生產(chǎn)本發(fā)明的均一gp350蛋白質(zhì)?？蓪⑺鲋亟M蛋白質(zhì)純化并且摻入到藥物組合物中用于預(yù)防治療和防止EBV相關(guān)疾病。
可利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的合適表達(dá)控制系統(tǒng)在不同的細(xì)胞類型中重組表達(dá)本發(fā)明的非剪接的變異gp350/220DNA。本領(lǐng)域內(nèi)已知和可行的合適的細(xì)胞包括但不限于酵母細(xì)胞例如啤酒酵母，細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌和哺乳動物細(xì)胞例如GH3，CHO，NSO，MDCK和C-127細(xì)胞。根據(jù)與所使用的細(xì)胞類型和表達(dá)控制系統(tǒng)的相容性選擇適應(yīng)于細(xì)胞類型的載體。優(yōu)選地，使用表達(dá)gp350/220基因的分泌產(chǎn)物的細(xì)胞和載體。通常例如，利用已經(jīng)用常規(guī)技術(shù)修飾而含有表達(dá)所需蛋白質(zhì)的DNA序列的pBR322的衍生物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在本發(fā)明中其中所述的DNA序列是有或沒有編碼C-末端和/或膜跨越區(qū)的序列的EBV gp350的非剪接變異體。pBR322含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的基因，用作為標(biāo)記物。參見，Bolivar，Gene295(1977)。通常使用的表達(dá)控制序列即用于轉(zhuǎn)錄起始的啟動子和非強(qiáng)制性包括的操縱基因或加強(qiáng)子，包括β-內(nèi)酰胺酶和lac啟動子系統(tǒng)(參見Chang，Nature1981056(1977))，色氨酸啟動子系統(tǒng)(參見Goeddel，Nucleic AcidsRes.84057(1980))和λ衍生的PL啟動子和N-基因核糖體結(jié)合位點(參見Shimatake，Nature292128(1981))。但是，可以使用與原核宿主細(xì)胞相容的可行的啟動子系統(tǒng)或表達(dá)控制系統(tǒng)。在授權(quán)給Itakura(1982)的美國專利No.4,356,270，授權(quán)給Riggs(1984)的4,431,739和授權(quán)給Rutter(1984)的4,440,859中列舉了其它的宿主細(xì)胞，質(zhì)粒和表達(dá)載體。
也可以將昆蟲細(xì)胞用作為宿主細(xì)胞以便利用昆蟲細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。對于在昆蟲細(xì)胞表達(dá)的情況，通常表達(dá)系統(tǒng)的成分包括經(jīng)常為細(xì)菌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移載體和一種具有與轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源的野生型桿狀病毒(從而允許異源基因同源重組到桿狀病毒基因組中)以及合適的昆蟲宿主細(xì)胞和生長培養(yǎng)基，所述轉(zhuǎn)移載體含有桿狀病毒基因組的一個片段和用于插入異源基因的或待表達(dá)便利的限制性位點。
目前，將外源基因?qū)氲紸cNPV中的最常用的轉(zhuǎn)移載體是pAc373。也已經(jīng)設(shè)計了許多本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的其它載體。例如包括pVL985(它將多角體蛋白起始密碼子ATG改變?yōu)锳TT，并且在ATT的下游的32堿基對處導(dǎo)入了BamHI克隆位點；參見Luckow和Summers，Viorlogy(1989)1731)。
通常該質(zhì)粒還含有多角體蛋白聚腺苷酸化信號(Miller等人(1980)Ann.Rev.Microbiol.，42177)和原核的氨芐青霉素抗性(amp)基因和用于在大腸桿菌中選擇和繁殖的復(fù)制原點。
桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體通常含有桿狀病毒啟動子。桿狀病毒啟動子是能夠結(jié)合桿狀病毒RNA聚合酶并且啟動編碼序列(例如結(jié)構(gòu)基因)下游(5’-3’)轉(zhuǎn)錄成為mRNA的任何DNA序列。啟動子具有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，通常置于接近編碼序列5’末端。通常該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)包括RNA聚合酶結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄起始位點。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體也可以具有稱為加強(qiáng)子第二結(jié)構(gòu)域，如果存在該加強(qiáng)子，通常遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因。表達(dá)可以是被調(diào)節(jié)的或組成型的。對于昆蟲細(xì)胞表達(dá)技術(shù)，參見EP專利公開155476。-酵母，例如釀酒酵母亦可用作宿主細(xì)胞。能得到并使用多種細(xì)胞株。另外，適應(yīng)于酵母表達(dá)的質(zhì)粒載體是已知的，啟動子和表達(dá)控制系統(tǒng)也是已知的。參見例如，Myanohara，Proc.natl.Acad.Sci.801(1983)(PHO5啟動子)，EP專利公開012873(引導(dǎo)序列)，Kurtz，Mol.Cell.Biol.6142(1986)，Ito，J.Bacteriol.153163(1983)和Hinnen，Proc.natl.Acad.Sci.751929(1979)(轉(zhuǎn)化程序和合適載體)。
當(dāng)然也可以將來自多細(xì)胞生物體的真核細(xì)胞用作為表達(dá)編碼所需蛋白質(zhì)和多肽的基因的宿主細(xì)胞。有用的宿主細(xì)胞系包括VERO和HeLa細(xì)胞，和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。與所述細(xì)胞相容的表達(dá)載體也是可用的并且典型包括啟動子和表達(dá)控制序列，例如SV4的早期和晚期啟動子(參見，F(xiàn)iers，Nature273113(1978))和來自多瘤病毒，腺病毒2，牛乳頭狀瘤病毒或鳥肉瘤病毒的啟動子。在授權(quán)給Mather(1992)的美國專利申請No.5,122,469，授權(quán)給Axel(1983)的4,399,216，授權(quán)給Axel(1987)的4,634,665，授權(quán)給Levinson(1987)的4,713,339，授權(quán)給Ringold(1987)的4,656,134，授權(quán)給Kellems(1989)的4,822,736，授權(quán)給Fiers(1989)的4,874,702中列舉了宿主細(xì)胞，啟動子，選擇性標(biāo)記和技術(shù)。
利用適合于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如在CohenProc.Natl.Acad.Sci.692110(1972)中公開的用于原核細(xì)胞的CaCl2處理法和在Graham，Virology52546(1978)公開的用于哺乳動物細(xì)胞的CaPO4沉淀法可完成合適的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。按照在Hsiao，Proc.Natl.Acad.Sci.763829(1979)或如在Klebe，Gene25333(1983)公開的方法完成酵母的轉(zhuǎn)化。
利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)連接法和限制性技術(shù)可構(gòu)建含有非剪接變異gp350序列(有或沒有在本文中公開的導(dǎo)致C-末端和/或膜跨越區(qū)的其它修飾)的合適的載體。通過在標(biāo)準(zhǔn)條件下，特別是通常由限制性酶制造商提供的條件下用合適的限制性酶處理而進(jìn)行位點特異性DNA裂解。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳以便按大小將切割的片段分離，并且通過在四個脫氧核苷酸三磷酸存在下用大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段處理使片段的末端成平齊末端。用S1核酸酶處理將單鏈部分水解。利用例如本領(lǐng)域內(nèi)已知的氨基亞磷酸二乙酯(diethyl phospho anidite)方法合成寡核苷酸。參見，美國專利No.4,415,732(1983)。在標(biāo)準(zhǔn)條件和溫度下利用T4DNA連接酶完成連接，通過用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌或COS細(xì)胞證實正確的連接。利用氨芐青霉素，四環(huán)素或其它抗菌素或利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它標(biāo)記選擇成功的轉(zhuǎn)化體。
在文獻(xiàn)中對所述重組DNA技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)解釋。參見，例如，
薩姆布魯克等，分子克隆實驗室手冊，第二版(1989)；DNA克隆，第I及II卷(DN，格拉夫編1985)；寡核苷酸合成(MJ.蓋特編1984)；核酸雜交(BD海姆斯編1984)；轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯(BD海姆斯編1984)；動物細(xì)胞培養(yǎng)(RI弗萊施尼編1986)；B.坡堡，分子克隆實施指南(1984)；哺乳動物基因轉(zhuǎn)運載體(JH米勒編1987，冷泉實驗室)；斯科普，蛋白純化原則和實踐，第二版(1987斯普林格-沃拉登NY)和免疫學(xué)實驗手冊Vols I-IV(DM Weired1986)。
本文中提及的所有出版物引入本文作參考。
因此另一方面本發(fā)明包含含有非剪接變異gp350/220DNA序列的載體和宿主細(xì)胞和進(jìn)一步包含通過在能使均一gp350蛋白質(zhì)表達(dá)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞制造非剪接變異gp350/220蛋白質(zhì)的方法，所述宿主細(xì)胞含有攜帶與表達(dá)控制序列連接的非剪接變異gp350/220DNA序列的載體。
利用常規(guī)的糖蛋白純化技術(shù)例如但不限于超濾，自由流動的電泳，凝膠過濾層析，親和層析，SDS-PAGE，差示NH4SO4沉降，凝集素柱，離子交換柱和本領(lǐng)域內(nèi)已知的疏水柱，從細(xì)胞和培養(yǎng)基成分中純化表達(dá)的均一gp350。利用SDS-PAGE或凝集素親和柱最容易純化gp350的小批量的分析制劑，利用液體層析最容易純化用于疫苗或免疫應(yīng)答試驗的所述小批量制劑。對于用于疫苗組合物的商品顯著量的gp350的大批量生產(chǎn)，允許的是將超濾，凝膠過濾，離子交換，和疏水作用層析結(jié)合應(yīng)用。
可將本發(fā)明的純化，均一gp350蛋白質(zhì)用于治療和/或免疫組合物中，用于治療和預(yù)防EBV相關(guān)的狀況和疾病例如，傳染性單核細(xì)胞增多，伯基特淋巴瘤，鼻咽癌。所述藥物組合物包含與藥物學(xué)上可接受的載體例如助劑/抗原呈遞系統(tǒng)例如鋁混合的能有效誘導(dǎo)免疫原性量的一種或多種本發(fā)明的均一gp350蛋白質(zhì)。也可以使用其它的助劑/抗原呈遞系統(tǒng)例如MF59(Chiron Corp.)，QS-21(Cambridge Biotech Corp.)，3-DMPL(3-脫?；?單磷酰脂A)(RibiImmunoChem Research，Inc.)，臨床級的不完全弗氏助劑(IFA)，fusogenic脂質(zhì)體，水溶性聚合體或Iscoms(免疫刺激復(fù)合物)。其它的典型的藥物學(xué)上可接受的載體或溶液是氫氧化鋁，鹽水和磷酸緩沖鹽水。該組合物可以是全身給藥，優(yōu)選地以可接受的皮下或肌內(nèi)溶液形式皮下或肌內(nèi)給藥。通過表皮劃破或體腔接種也可完成接種。所述溶液的制備，包括pH，等滲性，穩(wěn)定性等等是本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)。所使用的劑量由醫(yī)生考慮已知可改變藥物作用的各種因子決定的，例如身體狀況，體重，性別，食物，疾病的嚴(yán)重性，給藥時間和其它臨床因子。典型的劑量范圍包括約1μg-約1000μg之間的蛋白質(zhì)。
在實施本發(fā)明的治療方法時，給需要治療或預(yù)防的人患者施用誘導(dǎo)免疫原性有效量的均一gp350蛋白質(zhì)。所施用的每劑量含有約1μg-約1000μg范圍內(nèi)的誘導(dǎo)免疫原性有效量的本發(fā)明的組合物。所施用的劑量的數(shù)目隨著上面介紹的因子而變化。在下面的實施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實施例是為了描述本發(fā)明而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實施例1gp350/220跨膜區(qū)和跨越C末端的跨膜區(qū)的缺失以便制備pDTM和pSTOP來自EBV B95-8菌株(Miller，等人，1972)的gp350/220基因以稱為BLLF1的開放讀框形式存在于BamHI文庫中(Baer，Nature310207，1984)。為了制備所需的構(gòu)建體(顯示于附圖2B中)，將gp350/220分兩個部分克隆1)BLSH1，2.3kb的HindIII/BfaI3’片段和2)BLSH2，337b.p.BanI/HindIII 5’片段(附圖2A)。將這些片段克隆到中間載體以便實現(xiàn)C-末端胞質(zhì)和/或轉(zhuǎn)膜編碼區(qū)的缺失。由于在編碼gp350轉(zhuǎn)膜(TM)區(qū)的區(qū)域的5’末端存在BfaI位點，可將其用于構(gòu)建TM區(qū)的缺失和帶有鄰近的C末端缺失的TM區(qū)缺失。利用BfaI，可以制備僅保留TM區(qū)的兩個氨基酸的缺失(表2)。
1.從pSTG1和pSTG3構(gòu)建pDTM質(zhì)粒pDTM由失去了整個TM編碼區(qū)的gp350/220核酸序列組成。利用兩個中間載體pSTG1和pSTG3可制備該構(gòu)建體。利用BLLF1克隆靶序列可制備450bp PCR產(chǎn)物，SYCT，它在TM區(qū)的3’末端導(dǎo)入了BfaI位點(附圖2)。所使用的PCR引物如下
BfaIPrimer1GG ATC CTA GAC TGC GCC TTT AGG CGT ABLLF1 ... GAC TGC GCC TTT AGG CGT A..
A.A. ... Asp Cys Ala Phe Arg Arg...
↑____End of TM RegionPrimer2GGA TCC TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTGBLLF1...... TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTG引物1的BfaI位點用于將SCYT的BfaI/XmaI片段克隆到pSTG1。引物1的其余部分對應(yīng)于由克隆BLLF1編碼的氨基酸序列。引物2對應(yīng)于gp350/220開放讀框之外的該基因3’端的區(qū)域。用BfaI和XmaI切割SCYT PCR片段以便產(chǎn)生136堿基對片段，該片段與第二個片段，BLSH1HindIII/BfaI片段一起克隆到pTM11以制備pSTG1?？缭紹faI位點的測序分析結(jié)果顯示整個TM氨基酸編碼區(qū)被缺失，僅留下氨基酸Met和Leu(參見表2)。將第三個BLLF1片段，BLSH2克隆到pTM11以制備pSTG3。將gp350/220基因編碼序列之外的16堿基對BanI/XbaI寡核苷酸接頭用于將BLSH2BanI/HindIII片段克隆到pSTG3。將2.4HindIII/XmaI pSTG1片段與0.3XbaI/HindIII pSTG3片段一起克隆到pEE14載體(Celltech，England)得到整個pDTM構(gòu)建體。
2.利用載體pSTG2和pSTG3構(gòu)建pSTOP質(zhì)粒pSTOP含有失去了TM區(qū)和帶有鄰近的C末端胞質(zhì)區(qū)的TM區(qū)的gp350/220基因。為了制備該構(gòu)建體，制備一個相當(dāng)于BfaI粘性末端16堿基對的BfaI/EcoRI寡核苷酸接頭，它在三個框架中帶有終止密碼子(底下劃線)如下所示TAT AGA CTA GTC TAG GA TCT GAT CAG ATC CTT AA上排序列的5’延伸臂(TA)是一個BfaI限制性位點的粘性末端并且下排序列的5’延伸臂(TTAA)是EcoRI粘性末端。將該16堿基對接頭用于將BLSH1HindIII/BfaI片段克隆到pTM11以制備pSTG2。將2.3kb pSTG2HindIII/EcoRI片段和pSTG30.3kb XbaI/HindIII片段克隆到pEE14以制備pSTOP。
3.野生型，pDTM和pSTOP序列的TM區(qū)域的比較野生型，pDTM和pSTOP3’末端的gp350DNA的寡核苷酸序列和轉(zhuǎn)譯的氨基酸序列以及氨基酸序列顯示于下文表2中。箭頭表示野生型跨膜區(qū)(TM)的起始點和末端。僅來自跨膜區(qū)的兩個氨基酸保留于pDTM和pSTOP中，即Met861和Leu862(也參見附圖1)。在pSTOP中終止密碼子緊接Leu862之后，在pDTM中缺失的跨膜區(qū)的前面位置標(biāo)記為“ΔTM”。(在該表中，顯示了天然氨基酸)。
表23’End of gp350Wild-Type Sequence...AAC CTC TCC ATG CRAGTA CTG.....GTC ATG GCG GACTGC GCC...Asn Leu Ser Met Leu862 Val Leu.....Val Met Ala Asp882 Cys Ala↑↑TM start TM end3’End of pSTOP...AAC CTC TCC ATG CTA TAG ACT AGT TCT AGG...
...Asn Leu Ser Met Leu862STOP3’End of pDTM...AAC CTC TCC ATG CTA GAC TGC GCC...
...Asn Leu Ser Met Leu862Asp882Cys Ala...
∧ΔTM實施例2去除gp350/220基因供體和受體剪接位點以便制備pMDTM和pMSTOP為了獲得均一產(chǎn)生的gp350蛋白質(zhì)，將gp350/220剪接位點的高度保守和保守堿基改變。在供體剪接位點改變四個堿基，包括在100％的所有剪接位點中出現(xiàn)的高度保守GT對。兩個保守的供體位點堿基，AA，被GT取代。將高度保守的(不變)供體剪接位點堿基從GT改變?yōu)镃A。在受體剪接位點，僅將高度保守的受體剪接位點堿基之一改變以便保存氨基酸序列。如表2顯示的將第二個保守的受體剪接位點堿基改變。表3概括了在gp350/220基因的供體和受體剪接位點改變的堿基。
表3EBV gp350/220基因剪接位點的變化供體剪接douor donorWild-type GAA A↓GT mutant GAG*T*C*A*Glu Ser501Glu Ser501Acceptor Splice siteacceptor acceptorWild-type ACA G↓GT mutant ACT*GGA*Thr Gly698Thr Gly698在突變序列中用星號標(biāo)記由寡核苷酸堿基誘變改變的堿基。有箭頭表示實際的剪接位點，并且顯示了所編碼的氨基酸。注意沒有由于核苷酸取代改變該氨基酸序列。
利用寡核苷酸介導(dǎo)的誘變可完成對野生型gp350/220供體剪接位點和受體剪接位點DNA序列的這些核苷酸取代。按照Zoller，M.E.和Smith，M.(1983)Methods of Enzymol.100468的方法利用一種修飾的噬菌體載體，M13TAC產(chǎn)生突變。利用多接頭上的Asp718和BamHI限制性位點，與含有Asp718和粘性末端的19bp寡核苷酸接頭一起將gp350/220核苷酸序列的BamHI/XhoI片段克隆到質(zhì)粒M13TAC的多接頭。利用實施例1的質(zhì)粒M13DTM和M13STOP(附圖2)進(jìn)行誘變。
將兩個42-聚體寡核苷酸， Pr供體1和Pr受體1用于誘變。將每個設(shè)計成為與供體或受體剪接位點中間的gp350/220基因序列互補。不與gp350/220基因互補的唯一寡核苷酸區(qū)域是代表所需突變的堿基。誘變的寡核苷酸如下PrDonor1Primer GGT CAT GTC GGG GGC CTT TG  A CTC TGT GCC GTT GTC CCA TGG**  * *EBV GGT CAT GTC GGG GGC CTT AC  T TTC TGT GCC GTT GTC CCA TGGPrAcceptor1Primer CTG TGT TAT ATTT TC ACC TC  C AGT TGG GTG AGC GGA GGT TAG* *EBV CTG TGT TAT ATT TTC ACC AC  C TGT TGG GTG AGC GGA GGT TAG將誘變寡核苷酸序列標(biāo)記為“引物”，而跨越gp350/220基因剪接位點的DNA序列標(biāo)記為“EBV”。用星號表示由誘變改變的堿基。長劃線表示剪接位置。
將寡核苷酸Pr供體1和Pr受體1與單鏈克隆的M13DTM和M13STOP雜交。將T4DNA聚合酶全酶用于生產(chǎn)雙鏈M13DNA并且用雙鏈DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用載體M13TAC，在X-gal和異硫丙基半乳糖存在下根據(jù)顏色從白色變化為藍(lán)色可鑒別含有所需突變的任何克隆。挑取藍(lán)色噬菌體并且使之生長，將跨越剪接接頭的DNA測序結(jié)果用于最終鑒別突變克隆，稱為M13-MDTM和M13-MSTOP.
在鑒別出含有所需突變之后，從M13-MDTM和M13-MSTOP中切割出BamHI/XhoI片段并且連接到pDTM或pSTOP主鏈以便分別制備pMDTM和pMSTOP構(gòu)建體。按照實施例3描述將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞以便表達(dá)非剪接的變異gp350/220DNA序列。
實施例3gp350在CHO細(xì)胞中的表達(dá)1.gp350/220基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染用于從哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高含量本發(fā)明的均一gp350蛋白質(zhì)的方法涉及構(gòu)建含有多拷貝異源gp350DNA序列的細(xì)胞。將異源DNA序列可操作連接到可控制的標(biāo)志上，在本實施例中該標(biāo)志是谷氨酰胺合成酶基因，細(xì)胞利用甲硫氨酸sulphoximine可擴(kuò)增該基因。
按照下文討論，根據(jù)Crockett.Bio/Technology8662(1990)和在Celltech Instrution Munual描述的用于谷氨酰胺合成酶基因擴(kuò)增的系統(tǒng)可將實施例2中制備的pMDTM和pMSTOP載體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。
將CHO-K1細(xì)胞(ATCC CCR61)保持于補充了10％胎牛血清，100單位/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素，MEM(改良的伊格爾氏培養(yǎng)基)非基本氨基酸，和1mM丙酮酸鈉(都來自于JRH Biosciences)的無谷氨酰胺的EMEM(伊格爾氏基本必要培養(yǎng)基)。該培養(yǎng)基也補充了60mg/ml谷氨酸，60mg/ml天冬酰胺，7mg/ml腺嘌呤，7mg/ml鳥嘌呤，7mg/ml胞嘧啶，7mg/ml尿嘧啶，和2.4mg/ml胸腺嘧啶(都從Sigma獲得)。在整個轉(zhuǎn)染期間使用該培養(yǎng)基配方，以及按照該配方制備的衍生物。
轉(zhuǎn)染前一天，將3×106CHO-K1細(xì)胞播種到10-cm培養(yǎng)皿中。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，每個培養(yǎng)皿用10ml無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。利用常規(guī)的CaPO4沉淀技術(shù)得到的質(zhì)粒DNA。在37℃將各種質(zhì)粒DNA沉淀個10μg與CHO-K1細(xì)胞和2ml無血清培養(yǎng)基一起培養(yǎng)4.5小時。四個質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染子個制備三個重復(fù)。然后用溶于HEPES-緩沖鹽水中的15％甘油將細(xì)胞休克1.5分鐘。在用無血清培養(yǎng)基洗滌之后，用含有血清的培養(yǎng)基喂養(yǎng)細(xì)胞并且培養(yǎng)24小時。
第二天將培養(yǎng)基改變使之含有10％滲析過的胎牛血清(JRHBioscience)并且通過加入25μM甲硫氨酸sulphoximine(Sigma)進(jìn)行擴(kuò)增。每隔3-5天再用含有甲硫氨酸sulphoximine的培養(yǎng)基喂養(yǎng)細(xì)胞，直到大約13-14天之后擴(kuò)增的克隆大到足于挑取。通過用一個200μl無菌的移液管嘴從培養(yǎng)皿中刮下菌落而挑取克隆并且轉(zhuǎn)移到96孔平板的一個孔中的沒有甲硫氨酸sulphoximine的培養(yǎng)基中。1-2天之后用加了25μM甲硫氨酸sulphoximine的培養(yǎng)基替代孔中的培養(yǎng)基。4天之后收集培養(yǎng)上清液利用ELISA檢測法分析蛋白質(zhì)產(chǎn)物，如下文中討論的。
還用pEE14對照載體(不含有EBV序列)單獨轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，也挑取24個CHO-pEE14并且轉(zhuǎn)移到平板上用作為對照。(基于在甲硫氨酸sulphoximine上能生存而鑒定對照克隆)。
2.ELISA檢測轉(zhuǎn)染之后，挑取241個CHO-pMDTM克隆和158個CHO-pMSTOP克隆并且使之生長。檢測這些克隆的上清液中產(chǎn)生的gp350蛋白質(zhì)。用在50mM硼酸鈉緩沖液，pH9中稀釋2000倍的親和純化的兔抗gp350/220抗體(抗體MDPE；Andrew Morgan贈送)包被96孔平板。將該平板在37℃培養(yǎng)3-4小時并且利用一個Nunc Immuno洗滌器用PBS+0.05％吐溫20洗滌3次。在吸干之后，在37℃用溶于PBS+0.01％Thimerosal中的2％BSA培養(yǎng)封閉該平板半小時并且再次洗滌。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照細(xì)胞的上清液加到這些孔中并在37℃培養(yǎng)2小時。然后在37℃用在PBS洗滌緩沖液中稀釋的1mg/ml的一級檢測抗體，一種抗gp350/220的鼠單克隆抗體(抗體#C65221MBiodesignInternational)培養(yǎng)該平板1小時。洗滌之后在37℃用溶于PBS+0.05％BSA和0.01％Thimerosal中的0.7μg/ml抗鼠免疫球蛋白的辣根過氧化物酶結(jié)合的羊F(ab)2片段(人Ig吸附的；BiosourceInternational)二級抗體培養(yǎng)該平板1小時。在室溫下用溶于穩(wěn)定的過氧化物底物緩沖液(Pierce Chemicals)的ABTS(Pierce Chemicals)洗滌該平板并且顯色半小時。用1％SDS終止反應(yīng)，利用MolecularDevices Vmax ELISA平板計數(shù)器在405和650nm波長處對該平板進(jìn)行計數(shù)。24個pMDTM和18個pMSTOP克隆檢測為分泌gp350的陽性。將顯示最強(qiáng)ELISA信號的克隆轉(zhuǎn)移到24孔平板上并且進(jìn)一步在Western Blot和放射免疫沉淀分析中檢測。
3.Western Blot和放射免疫沉淀分析中檢測在開始篩選時，在Western Blot中分析pMDTM轉(zhuǎn)染的組織培養(yǎng)上清液的活性。在5％SDS-PAGE凝膠上純化CHO細(xì)胞上清液，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜過夜，并且用抗gp350抗體探測。發(fā)現(xiàn)7個pMDTM克隆在Western Blot分析中顯示gp350陽性。
進(jìn)一步采用存在gp220的放射免疫沉淀方法檢測在Western Blot分析中顯示陽性的pMDTM克隆。在6個平板孔中將選出的轉(zhuǎn)化pMDTM細(xì)胞，pEE14對照和GH3Δ19對照細(xì)胞(下文描述)培養(yǎng)過夜以便在試驗當(dāng)天有3/4的細(xì)胞匯合。每個孔大約含有5×106細(xì)胞。為了進(jìn)行標(biāo)記，從每個孔中除去培養(yǎng)基并且用0.7ml添加了100μCiS35甲硫氨酸的無甲硫氨酸MEM(10％胎牛血清)替代。在37℃將細(xì)胞培養(yǎng)5.5小時，然后以4000rpm微離心5分鐘。通過加入10μlSepharose-蛋白質(zhì)A(Sigma)和20μl單克隆抗gp350/220(抗體#C65221MBiodesign International)在4℃旋轉(zhuǎn)過夜而將上清液中的均一gp350蛋白質(zhì)免疫沉淀。然后在室溫下微離心機(jī)中以2000rpm沉淀該混合物2分鐘，用數(shù)倍體積的磷酸緩沖鹽水洗滌4次。在最后洗滌之后從沉淀中除去所有的液體并且用50μl蛋白質(zhì)凝膠樣品緩沖液替代。將含有沉淀的免疫復(fù)合物的樣品煮沸5分鐘并且在5％SDSPAGE上電泳。免疫沉淀物相當(dāng)于與蛋白質(zhì)樣品緩沖液以1∶1混合的組織培養(yǎng)上清液的凝膠樣品。將該凝膠干燥并且用Hyperfilmβ-Max(Amersham)放射自顯影。
附圖3顯示放射免疫沉淀的SDSPAGE分析的放射自顯影結(jié)果。用作為陽性對照的細(xì)胞系是GH3Δ19(Elliot Keiff贈送；Whang，等人，1987)。GH3Δ19細(xì)胞分泌失去了轉(zhuǎn)膜和C末端胞質(zhì)區(qū)的截短形式的gp350/220蛋白質(zhì)。為了用作為陰性對照，單獨用pEE14載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并且同時用pMDTM轉(zhuǎn)染通過甲硫氨酸sulphoximine選擇。在附圖3，奇數(shù)泳道顯示上清液(“S”)，偶數(shù)泳道顯示免疫沉淀(“Ip”)。在對照泳道2，來自GH3Δ19對照細(xì)胞的沉淀產(chǎn)生約220和350KD的兩個強(qiáng)蛋白質(zhì)譜帶，表明以1∶1的比例產(chǎn)生截短的剪接變體gp350和gp220蛋白質(zhì)。正如所期望的在泳道1這些免疫沉淀譜帶集中了放射標(biāo)記的組織培養(yǎng)上清液(非免疫沉淀樣品)。也正如所期望的由于pEE14載體不含有g(shù)p350/220構(gòu)建體，在陰性對照沒有顯示任何譜帶(泳道4)。
在泳道6，8和10來自pMDTM克隆上清液的免疫沉淀的SDSPAGE分析結(jié)果顯示有一個約350KD的單一強(qiáng)譜帶，相當(dāng)于對照泳道2中的GH3Δ19對照的較高分子量種類。但是與GH3Δ19對照泳道相反，泳道6，8和10沒有另一個約220KD的強(qiáng)譜帶，雖然泳道8顯示遷移在稍微較低分子量的一個較微弱的譜帶。這可能代表一種降解產(chǎn)物，一種共沉淀的細(xì)胞產(chǎn)物或者由于錯翻譯或突變產(chǎn)生的少量gp220蛋白，所述突變將缺失的供體和受體剪接位點返回到天然的核苷酸或氨基酸序列。在其它5個所檢測的MTDM重復(fù)中發(fā)現(xiàn)約350KD處的強(qiáng)單譜帶(資料未顯示)。
在泳道6和泳道10完全沒有220KD的譜帶是由于來自MDTM上清的無效沉淀是不可能的，因為在S35-標(biāo)記的GH3Δ19對照泳道(2)容易觀察到220KD的譜帶。利用含有野生型剪接位點的實施例1的pDTM構(gòu)建體進(jìn)行另一個分析結(jié)果顯示在350和220KD處有兩個強(qiáng)譜帶。因此這些結(jié)果證明剪接位點的缺失導(dǎo)致產(chǎn)生沒有g(shù)p220蛋白的gp350蛋白。
對在CHO細(xì)胞系，或其它的哺乳動物或非哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)的均一gp350蛋白質(zhì)進(jìn)一步測量，利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法包括例如凝集素親和層析，反相HPLC，F(xiàn)PLC，凝膠過濾等等技術(shù)從細(xì)胞系的限制性培養(yǎng)基分離或純化均一gp350蛋白質(zhì)。參見David，J.Immunol.Methods108231(1988)和Madej，Vaccine10777(1992)。
4.pMDTM蛋白質(zhì)的Northern Blot分析法在該試驗中我們采用Northern Blot分析法證明MDTM-1細(xì)胞制備gp350RNA和不制備gp220RNA，在另一個水平上證實剪接位點突變阻礙了gp220產(chǎn)生。
從pDTM制備與gp350互補的DNA探針，參見實施例1。分離464bp XhoI/PstI pDTM片段形式的gp350/220探針模板XP464。XP464識別gp350和gp220。為了制備gp350特異性探針AN537，用NcoI和NdeI切割pDTM，分離兩個重疊的580bp片段，用XmnI切割該混合物以去除污染片段并且用AluI切割產(chǎn)生位于gp350/220剪接位點內(nèi)部的一個537bp Alu/NdeI片段。AN537特異于gp220之外的剪接區(qū)，因而特異于gp350信使。利用DNA片段XP464和AN537采用32P-dCTP缺口轉(zhuǎn)譯(Amersham)標(biāo)記DNA探針。
基本上按照Chomczyunski和Sacchi，Anal.Biochem.，162156-59(1987)的方法制備總細(xì)胞RNA。從CHO-pEE14(陰性對照細(xì)胞系，參見實施例1)，CHO-MDTM-1和CHO-DTM-7細(xì)胞，90％鋪滿，各兩個T-250培養(yǎng)瓶吸取培養(yǎng)基，裂解細(xì)胞并且刮入到變性緩沖液(10ml 4M 硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，pH7，0.5％sarkosyl，100mM 2-巰基乙醇)。10ml裂解液中各補充1ml2M乙酸鈉，pH4，10ml飽和酚，pH4.5，和2ml氯仿/異戊醇；將裂解液在冰上放置15分鐘，在4℃以10000×g旋轉(zhuǎn)20分鐘，除去上層水相。通過加入1倍體積的異丙醇在4℃從水相沉淀RNA1小時，在4℃形成沉淀，重懸于變性緩沖液并且再沉淀。在70％乙醇中將RNA洗滌1次，在Speed-Vac中干燥并且重懸于DEPC處理的水中。
在15％甲酰胺和6％甲醛中，65℃將DTM-7和MDTM-1總細(xì)胞RNA變性15分鐘，在1％瓊脂糖/6.6％甲醛凝膠上電泳，并且通過毛細(xì)作用轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并且用標(biāo)記的XP464和AN537探測。通過煮沸5分鐘使DNA探針變性，在65。C的5×SSPE中雜交過夜，在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下洗滌硝酸纖維素膜。利用Bio-Rad磷光體成象儀(phospho image)進(jìn)行放射自顯影。
來自CHO-MTDM細(xì)胞的總細(xì)胞RNA的Northern印跡顯示剪接突變在阻礙gp220特異性RNA產(chǎn)生中的效果。正如對于gp350特異性探針預(yù)期的，gp350特異性探針，AN537僅結(jié)合到MDTM-1和DTM-7細(xì)胞中的一種類型的RNA上(附圖4，泳道1和2)。特異于gp350和gp220RNA的XP464探針識別DTM-7的兩個類型和MTDM-1的單個較高分子量譜帶(附圖4，泳道4和3)，正如所預(yù)期的，如果剪接突變阻礙，MTDM中產(chǎn)生gp220信使。即使對于gp350特異性RNA，MTDM泳道過載，沒有清晰的gp220RNA觀察到。MTDM-1和DTM-7泳道中g(shù)p350信使的表觀移動有差異的原因尚不知。與DTM-7相比，MTDM-7類型過載，影響其在凝膠上的遷移。在凝膠上gp350信使遷移在靠近大核糖體RNA譜帶處，這可能影響了表觀分子量。或者存在與gp350DNA序列互補的單一類型的情況表明該信號代表gp350RNA。因此，供體和受體剪接位點中的突變有效地阻礙gp220信使的產(chǎn)生，正如Northern印跡判斷的。該結(jié)果進(jìn)一步由利用特異于gp350/220的單克隆抗體進(jìn)行的放射自顯影證實，也可以以MDTM-1和DTM-7上清液的Western印跡分析證實。
實施例4檢測均一gp350蛋白質(zhì)的免疫原活性將純化的均一gp350蛋白質(zhì)摻入到用于給藥的合適的賦形劑中并且按照如下所述給藥。
根據(jù)David，J.Immunol.Methods108231(1988)和Allison，J.Immunol.Methods 95175(1986)的方法，將溶于0.4％(v/v)吐溫80Pluronic L121和角鯊烯和(Thr1)MDP在磷酸緩沖鹽水中混合制備2×助劑-賦形劑溶液。
在給藥當(dāng)天通過加入等體積的蛋白質(zhì)和助劑-賦形劑制備給藥組合物。其蛋白質(zhì)含量應(yīng)該在5mg-50mg/劑量范圍內(nèi)。
在0，21和42天用3次0.1ml肌內(nèi)注射免疫接種BALB/c。每次注射10天之后從retro-orbital sinus獲取預(yù)免疫接種的血或連續(xù)取血。
根據(jù)實施例3描述的方法采用ELISA測定血清抗體水平。根據(jù)Moss，J Gen.Virol.17233(1972)和De Schryver，Int.J.Cancer13353(1974)的方法由其體外抑制EBV轉(zhuǎn)化胎心臟淋巴細(xì)胞的能力對血清中的EBV中和抗體進(jìn)行定量測定。
另一種方法，在0，21，42，63和84天給新西蘭白兔肌內(nèi)注射接種5劑量的在前面所述助劑中乳化的蛋白質(zhì)。每次接種的劑量應(yīng)該在約5μg-50μg的范圍內(nèi)。末次劑量注射之后兩星期取血清，檢測抗體對該抗原的效價，檢測對來自B95-8細(xì)胞的病毒gp350/220的交叉反應(yīng)抗體和根據(jù)Emini.Virology166387(1988)的方法檢測體外EBV中和活性。
由于已經(jīng)確立EBV gp350/220蛋白質(zhì)能夠在EBV感染的動物模型中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫作用，參見Epstein，Clin，Exp.Immunol 63485(1986)，預(yù)期通過以均一gp350蛋白質(zhì)組合物給藥可獲得類似的陽性結(jié)果。
本文中應(yīng)用的所有出版物引入本文作參考。前面的詳細(xì)描述是為了更清楚地了解，不應(yīng)該認(rèn)為限制本發(fā)明，因為對本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員而言，本發(fā)明內(nèi)的修改是顯而易見的。
序列表5(1)一般資料(i)申請人Spaete，Richard and Jackman，Winthrop，T.
(ii)發(fā)明名稱gp350/220的非剪接變異體(iii)序列數(shù)19(iv)相應(yīng)地址(A)收件人Cooley Godward Castro Huddleson&Tatum(B)街道5Palo Alto Square(C)城市Palo Alto(D)州California(E)國家USA(F)ZIP94306(v)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型Floppy disk(B)計算機(jī)IBM PC Compatible(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，ersion#1.25(vi)現(xiàn)在申請資料(A)申請?zhí)?8/229,291(B)申請日April18，1994(C)分類(Viii)代理人/律師資料(A)姓名Luann Cserr(B)登記號31,822(C)檔案號AVIR-003/00US(ix)電訊資料(A)電話415-843-5163(B)傳真415-857-0663(C)電傳380816CooleyPA(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度27堿基對
(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單(D)拓樸未知(ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GGATCCTAGA CTGCGCCTTT AGGCGTA(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單(D)拓樸未知(ii)分子類型寡聚體DNA(xi)SEQ ID NO2序列描述GACTGCGCCT TTAGGCGTA(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度6氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓補線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO3Asp Cys Ala Phe Arg Arg1 5(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓樸未知(ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4
GGATCCTCTG TTCCTTCTGC TCCAGTG(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5TCTGTTCCTT CTGCTCCAGT G(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度16個堿基(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6TATAGACTAG TCTAGG(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度18個堿基(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO7ATCTGATCAG ATCCTTAA(2)SEQ ID NO8的資料
(i)序列特征(A)長度39個堿基(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8AACCTCTCCA TGCTAGTACT GGTCATGGCG GACTGCGCC(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO9Asn Leu Ser Met Leu Val Leu Val Met Ala Asp Cys Ala1 510(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10AACCTCTCCA TGCTATAGAC TAGTTCTAGG(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度5個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO11Asn Leu Ser Met Leu1 5(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12AACCTCTCCA TGCTAGACTG CGCC(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO13Asn Leu Ser Met Leu862Asp882Cys Ala1 5(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基(B)類型核酸(C)鏈單
(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GGTCATGTCG GGGGCCTTTG ACTCTGTGCC GTTGTCCCAT GG(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO15GGTCATGTCGGGGGCCTTACTTTCTGTGCCGTTGTCCCAT GG(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型寡聚體DNA(xi)序列描述SEQ ID NO16CTGTGTTATATTTTCACCTCCAGTTGGGTGAGCGGAGGTT AG(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)長度3833堿基(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)湮粗?ii)分子類型cDNA(xi)特點(A)名稱/鍵CDS(B)位置1014..3734
(xi)序列描述GAATTCCATA AATGAAACAC GCTGGTCAGG TGTTAAAACT TCCTCCCAGA TTTTCGTGAG 60GCTCCTGTGT ATAGCCATAT AGTCAAAGAA AATACTGTAG CGGGGATTAC AGCTCTGTAC 120AATGTTACCC ACGGAGCTCT GAACATACAA CCACTGGCGA TCCCCGGGGG TACATCGCGG 180CAGCTTAAAG GTGCCGGCGG AAAAGGTCAC GTGACACCTA CGGCCACCTG TGCACCCAAG 240TGTCGCCTGG AGATGTACGA ATGTGGGAGT CGTCTGGTGA TCGGTGTAGC TGTACATCCA 300GCTGCTGTAT GCCTGGTAAC CCATAGGCCA TCCGGCGGCC AGGGTTTGCA GTCTCCATTT 360GGCCTGATCT CTACGAGAAG GTGGATTTCT CCGACGATCT CTAATGGCCT GTCGAATGGC 420CATGGCATAC ATTATGTACA TCTCGGTATT TGAAATCTGG ATCCGAAAAA CTGGTCTATG 480GCTCGTGTGT CGATGCGCTG AAACCAACGG CAACAAATTA CTTACCTTGT TGTTGTGTGA 540TGGGTAAAAA CACACATCAC ACACTTAGGC CATAGGGATG CTCACCGTAG CCGCGGCTCC 600AATCGCTTGA AGAAGTGTTC TTAGATCTAG TGGAAACCTG CGGAGAATGG CTTCTCGCCC 660AGGGAGATCC GGCTGGGGTG GGAGCATGGG TCGTGCTGGA GCTGACCCAC CGGCATCATG 720ATCGACCCGC TTTCTCTTCG TACCCTTCTG GGCCGGCTCC AGGTGGGCAT CTTCTGCTTC 780CTTTTCTGAG CTGCTATCTG ATAACTCTAT GAGGACATTT TCCCAATCTC CCGCCGATAC 840CTGTTCCTGC ACAACCGAGG TAGATGGGAC TTCTTCTTCC ATGTTGTCAT CCAGGGCCGG 900GGGACCCGGC GTGTCCTTGT CCATTTTGTC TGCAACAAAA GTGTGACTCA CCAACACCGC 960ACCCCCCTTG TACCTATTAA AGAGGATGCT GCCTAGAAAT CGGTGCCGAG ACA ATG 1016Met1GAG GCA GCC TTG CTT GTG TGT CAG TAC ACC ATC CAG AGC CTG ATC CAT 1064Glu Ala Ala Leu Leu Val Cys Gln Tyr Thr Ile Gln Ser Leu Ile HisCTC ACG GGT GAA GAT CCT GGT TTT TTC AAT GTT GAG ATT CCG GAA TTC 1112Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu Tle Pro Glu Phe20 25 30CCA TTT TAC CCC ACA TGC AAT GTT TGC ACG GCA GAT GTC AAT GTA ACT 1160Pro Phe Tyr Pro Thr Cys Asn Val Cys Thr Ala Asp Val Vsn Val Thr35 40 45ATC AAT TTC GAT GTC GGG GGC AAA AAG CAT CAA CTT GAT CTT GAC TTT 1208Ile Asn Phe Asp Val Gly Gly Lys Lys His Gln Leu Asp Leu Asp Phe50 55 60 65GGC CAG CTG ACA CCC CAT ACG AAG GCT GTC TAC CAA CCT CGA GGT GCA 1256Gly Gln Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val Tyr Gln Pro Arg Gly Ala70 75 80TTT GGT GGC TCA GAA AAT GCC ACC AAT CTC TTT CTA GTG CTC CTC CTT 1304Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu Leu Leu85 90 95GGT GCA GGA GAA TTG GCT CTA ACT ATG CGG TCT AAG AAG CTT CCA ATT 1352Gly Ala Gly Glu Leu Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys Lys Leu Pro Ile100 105 110AAC GTC ACC ACC GGA GAG GAG CAA CAA GTA GTA AGC CTG GAA TCT GAT 1400Asn Val Thr Thr Gly Glu Glu Gln Gln Val Ser Leu Glu Ser Val Asp115 120 125GTC TAC TTT CAA GAT GTG TTT GGA ACC ATG TGG TGC CAC CAT GCA GAA 1448Val Tyr Phe Gln Asp Val Phe Gly Thr Met Trp Cys His His Ala Glu130 135 140 145ATG CAA AAC CCC GTG TAC CTG ATA CCA GAA ACA GTG CCA TAC ATA AAG 1496Met Gln Asn Pro Val Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr Ile Lys150 155 l60TGG GAT AAC TGT AAT TCT ACC AAT ATA ACG GCA GTA GTG AGG GCA CAG 1544Trp AsP Asn Cys Asn Ser Thr Asn Ile Thr Ala Val Val Arg Ala Gln165 170 175GGG CTG GAT GTC ACG CTA CCC TTA AGT TTG CCA ACG TCA GCT CAA GAC 1592Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Thr Ser Ala Gln Asp180 185 190TCG AAT TTC AGC GTA AAA ACA GAA ATG CTC GGT AAT GAG ATA GAT ATT 1640Ser Asn Phe Ser Val Lys Thr Glu Met Leu Gly Asn Glu Ile Asp Ile195 200 205GAG TGT TTC ATG GAG GAT GGC GAA ATT TCA CAA GTT CTG CCC GGA GAC 1688Glu Cys Ale Met Glu Asp Gly Glu Ile Ser Gln Val Leu Pro Gly Asp210 215 220 225AAC AAA TTT AAC ATC ACC TGC AGT GGA TAC GAG AGC CAT GTT CCC AGC 1736Asn Lys Phe Asn Ile Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro Ser230 235 240GGC GGA ATT CTC ACA TCA ACG AGT CCC GTG GCC ACC CCA ATA CCT GGT 1784Gly Gly Ile Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Ile Pro Gly245 250 255ACA GGG TAT GCA TAC AGC CTG CGT CTG ACA CCA CGT CCA GTG TCA CGA 1832Thr Gly Tyr Ala Tyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser Arg260 265 270 1880TTT CTT GGC AAT AAC AGT ATC CTG TAC GTG TTT TAC TCT GGG AAT GGAPhe Leu Gly Asn Asn Ser Ile Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn Gly275 280 285CCG AAG GCG AGC GGG GGA GAT TAC TGC ATT CAG TCC AAC ATT GTG TTC 1928Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys Ile Gln Ser Asn Ile Val Phe290 295 300 305TCT GAT GAG ATT CCA GCT TCA CAG GAC ATG CCG ACA AAC ACC ACA GAC 1976Ser Asp Glu Ile Pro Ala Ser Gln Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr Asp310 315 320ATC ACA TAT GTG GGT GAC AAT GCT ACC TAT TCA GTG CCA ATG GTC ACT 2024Ile Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val Thr325 330 335TCT GAG GAC GCA AAC TCG CCA AAT GTT ACA GTG ACT GCC TTT TGG GCC 2072Ser Glu Asp Ala Asn Ser Pro Asn Val Thr Val Thr Ala Phe Trp Ala340 345 350TGG CCA AAC AAC ACT GAA ACT GAC TTT AAG TGC AAA TGG ACT CTC ACC 2120Trp Pro Asn Asn Thr Glu Thr Asp Phe Lys Cys Lys Trp Thr Leu Thr355 360 365TCG GGG ACA CCT TCG GGT TGT GAA AAT ATT TCT GGT GCA TTT GCG AGC 2168Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn Ile Ser Gly Ala Phe Ala Ser370 375 380 385AAT CGG ACA TTT GAC ATT ACT GTC TCG GGT CTT GGC ACG GCC CCC AAG 2216Asn Arg Thr Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Aal Pro Lys390 395 400ACA CTC ATT ATC ACA CGA ACG GCT ACC AAT GCC ACC ACA ACA ACC CAC 2264Thr Leu Ile Ile Thr Arg Thr Ala Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr His405 410 415AAG GTT ATA TTC TCC AAG GCA CCC GAG AGC ACC ACC ACC TCC CCT ACC 2312Lys Val Ile Phe Ser Lys Ala Pro Glu Ser Thr Thr Thr Ser Pro Thr420 425 430TTG AAT ACA ACT GGA TTT GCT GAT CCC AAT ACA ACG ACA GGT CTA CCC 2360Leu Asn Thr Thr Gly Phe Ala Asp Pro Asn Thr Thr Thr Gly Leu Pro435 440 445AGC TCT ACT CAC GTG CCT ACC AAC CTC ACC GCA CCT GCA AGC ACA GGC 2408Ser Ser Thr His Val Pro Thr Asn Leu Thr Ala Pro Ala Ser Thr Gly450 455 460 465CCC ACT GTA TCC ACC GCG GAT GTC ACC AGC CCA ACA CCA GCC GGC ACA 2456Pro Thr Val Ser Thr Ala Asp Val Thr Ser Pro Thr Pro Ala Gly Thr470 475 480ACG TCA GGC GCA TCA CCG GTG ACA CCA AGT CCA TCT CCA TGG GAC AAC 2504Thr Ser Gly Ala Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Ser Pro Trp Asp Asn485 490 495GGC ACA GAA AGT AAG GCC CCC GAC ATG ACC AGC TCC ACC TCA CCA GTG 2552Gly Thr Glu Ser Lys Ala Pro Asp Met Thr Ser Ser Thr Ser Pro Val500 505 510ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC CCA GCA GTG ACT ACC 2600Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr Thr515 520 525CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC CCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC 2648Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr Thr Pro Thr530 535 540 545CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC TTG GGA AAA ACA AGT CCT ACC TCA GCA 2696Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala550 555 560GTG ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC TTG GGA AAA ACA 2744Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys Thr565 570 575AGC CCC ACC TCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC 2792Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro580 585 590ACC TTG GGA AAA ACA AGC CCC ACC TCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC CCA 2840Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro595 600 605AAT GCC ACC GGC CCT ACT GTG GGA GAA ACA AGT CCA CAG GCA AAT GCC 2888Asn Ala Thr Gly Pro Thr Val Gly Glu Thr Ser Pro Gln Ala Asn Ala610 615 620 625ACC AAC CAC ACC TTA GGA GGA ACA AGT CCC ACC CCA GTA GTT ACC AGC 2936Thr Asn His Thr Leu Gly Gly Thr Ser Pro Thr Pro Val Val Thr Ser630 635 640CAA CCA AAA AAT GCA ACC AGT GCT GTT ACC ACA GGC CAA CAT AAC ATA 2984Gln Pro Lys Asn Ala Thr Ser Ala Val Thr Thr Gly Gln His Asn Ile645 650 655ACT TCA AGT TCA ACC TCT TCC ATG TCA CTG AGA CCC AGT TCA AAC CCA 3032Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Met Ser Leu Arg Pro Ser Ser Asn Pro660 665 670GAG ACA CTC AGC CCC TCC ACC AGT GAC AAT TCA ACG TCA CAT ATG CCT 3080Glu Thr Leu Ser Pro Ser Thr Ser Asp Asn Ser Thr Sar His Met Pro675 680 685TTA CTA ACC TCC GCT CAC CCA ACA GCT GGT GAA AAT ATA ACA CAG GTG 3128Leu Leu Thr Ser Ala His Pro Thr Gly Gly Glu Asn Ile Thr Gln Val690 695 700 705ACA CCA GCC TCT ATC AGC ACA CAT CAT GTG TCC ACC AGT TCG CCA GAA 3176Thr Pro Ala Ser Ile Ser Thr His His Val Ser Thr Ser Ser Pro Glu710 715 720CCC CGC CCA GGC ACC ACC AGC CAA GCG TCA GGC CCT GGA AAC AGT TCC 3224Pro Arg Pro Gly Thr Thr Ser Gln Ala Ser Gly Pro Gly Asn Ser Ser725 730 735ACA TCC ACA AAA CCG GGG GAG GTT AAT GTC ACC AAA GGC ACG CCC CCC 3272Thr Ser Thr Lys Pro Gly Glu Val Asn Val Thr Lys Gly Thr Pro Pro740 745 750CAA AAT GCA ACG TCG CCC CAG GCC CCC AGT GGC CAA AAG ACG GCG GTT 3320Gln Asn Ala Thr Ser Pro Gln Ala Pro Ser Gly Gln Lys 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Leu Val Met Ala870 875 880GAC TGC GCC TTT AGG CGT AAC TTG TCT ACA TCC CAT ACC TAC ACC ACC 3704Asp Cys Ala Phe Arg Arg Asn Leu Ser Thr Ser His Thr Tyr Thr Thr885 890 895CCA CCA TAT GAT GAC GCC GAG ACC TAT GTA TAAAGTCAAT AAAAATTTAT3754Pro Pro Tyr Asp Asp Ala Glu Thr Tyr Val900 905TAATCAGAAA TTTGCACTTT CTTTGCTTCA CGTCCCCGGG AGCGGGAGCG GGCACGTCGG3814GTGGCGTTGG GGTCGTTTG 3833(2)SEQ ID NO19(i)序列特征(A)長度907氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO19Met Glu Ala Ala Leu Leu Val Cys Gln Tyr Thr Ile Gln Ser Leu Ile1 5 10 15His Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu Ile Pro Glu20 25 30Phe Pro Phe Tyr Pro Thr Cys Asn Val Cys Thr Ala Asp Val Asn Val35 40 45Thr Ile Asn Phe Asp Val Gly Gly Lys Lys His Gln Leu Asp Leu Asp50 55 60Phe Gly Gln Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val Tyr Gln Pro Arg Gly65 70 75 80Ala Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu Leu85 90 95Leu Gly Ala Gly Glu Leu Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys Lys Leu Pro100 105 110Ile Asn Val Thr Thr Gly Glu Glu Gln Gln Val Ser Leu Glu Ser Val115 120 125Asp Val Tyr Phe Gln Asp Val Phe Gly Thr Met Trp Cys His His Ala130 135 140Glu Met Gln Asn Pro Val Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro yrr Ile145 150 155 160Lys Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn Ile Thr Ala Val Val Arg Ala165 170 175Gln Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Tnr Ser Ala Gln180 185 190Asp Ser Asn Phe Ser Val Lys Thr Glu Met Leu Gly Asn Glu Ile Asp195 200 205Ile Glu Cys Ile Met Glu Asp Gly Glu Ile Ser Gln Val Leu Pro Gly210 215 220Asp Asn Lys Phe Asn Ile Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro225 230 235 240Ser Gly Gly Ile Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Ile Pro245 250 255Gly Thr Gly Tyr Ala Tyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser260 265 270Arg Phe Leu Gly Asn Asn Ser Ile Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn275 280 285Gly Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys Ile Gln Ser Asn Ile Val290 295 300Phe Ser Asp Glu Ile Pro Ala Ser Gln Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr305 310 315320Asp Ile Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val325 330 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355 360 365Thr Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn Ile Ser Gly Ala Phe Ala370 375 380Ser Asn Arg Thr Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro385 390 395 400Lys Thr Leu Ile Ile Thr Arg Thr Ala Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr405 410 415His Lys Val Ile Phe Ser Lys Ala Pro Glu Ser Thr Thr Thr Ser Pro420 425 430Thr Leu Asn Thr Thr Gly Phe Ala Asp Pro Asn Thr Thr Thr Gly Leu435 440 445Pro Ser Ser Thr His Val Pro Thr Asn Leu Thr Ala Pro Ala Ser Thr450 455 460Gly Pro Thr Val Ser Thr Ala Asp Val Thr Ser Pro Thr Pro Ala Gly465 470 475 480Thr Thr Ser Gly Ala Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Ser Pro Trp Asp485 490 495Asn Gly Thr Glu Ser Lys Ala Pro Asp Met Thr Ser Ser Thr Ser Pro500 505 510Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr515 520 525Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr Thr Pro530 535 540Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser545 550 555 560Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys565 570 575Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser580 585 590Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr595 600 605Pro Asn Ala Thr Gly Pro Thr Val Gly Glu Thr Ser Pro Gln Ala Asn610 615 620Ala Thr Asn His Thr Leu Gly Gly Thr Ser Pro Thr Pro Val Val Thr625 630 635 640Ser Gln Pro Lys Asn Ala Thr Ser Ala Val Thr Thr Gly Gln His Asn645 650 655Ile Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Met Ser Leu Arg Pro Ser Ser Asn660 665 670Pro Glu Thr Leu Ser Pro Ser Thr Ser Asp Asn Ser Thr Ser His Met675 680 685Pro Leu Leu Thr Ser Ala His Pro Thr Gly Gly Glu Asn Ile Thr Gln690 695 700Val Thr Pro Ala Ser Ile Ser Thr His His Val Ser Thr Ser Ser Pro705 710 715 720Glu Pro Arg Pro Gly Thr Thr Ser Gln Ala Ser Gly Pro Gly Asn Ser725 730 735Ser Thr Ser Thr Lys Pro Gly Glu Val Asn Val Thr Lys Gly Thr Pro740 745 750Pro Gln Asn Ala Thr Ser Pro Gln Ala Pro Ser Gly Gln Lys Thr Ala755 760 765Val Pro Thr Val Thr Ser Thr Gly Gly Lys Ala Asn Ser Thr Thr Gly770 775 780Gly Lys His Thr Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr785 790 795 800Thr Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Thr Pro Arg Pro Arg Tyr Asn Ala805 810 815Thr Thr Tyr Leu Pro Pro Ser Thr Ser Ser Lys Leu Arg Pro Arg Trp
820 825 830Thr Phe Thr Ser Pro Pro Val Thr Thr Ala Gln Ala Thr Val Pro Val835 840 845Pro Pro Thr Ser Gln Pro Arg Phe Ser Asn Leu Ser Met Leu Val Leu850 855 860Gln Trp Ala Ser Leu Ala Val Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Val Met865 870 875 880Ala Asp Cys Ala Phe Arg Arg Asn Leu Ser Thr Ser His Thr Tyr Thr885 890 895Thr Pro Pro Tyr Asp Asp Ala Glu Thr Tyr Val900 90權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA序列，在表達(dá)時，它編碼均一的gp350蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征還在于其具有這樣的核苷酸序列，其中至少附圖1的501位的編碼絲氨酸的一個天然核苷酸被非天然核苷酸取代并且其中至少編碼698位甘氨酸的一個天然核苷酸被非天然核苷酸取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其中所述的均一gp350蛋白質(zhì)進(jìn)一步的特征在于編碼選自于下列的氨基酸序列(a)附圖1的氨基酸19-氨基酸862。(b)附圖1的氨基酸1-氨基酸862。(c)附圖1的氨基酸19-氨基酸862和氨基酸882-氨基酸907。(d)附圖1的氨基酸1-氨基酸862和氨基酸882-氨基酸907。(e)氨基酸1-氨基酸907，其中缺失了編碼至少跨膜區(qū)8個氨基酸的核苷酸。
4.一種含有權(quán)利要求1，2或3所述的DNA序列的載體。
5.用權(quán)利要求1，2或3的DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述DNA序列可操作連接到能指導(dǎo)所述DNA序列復(fù)制和表達(dá)的表達(dá)控制序列。
6.用于生產(chǎn)均一gp350蛋白質(zhì)的方法，包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞并且從所述細(xì)胞分離所述均一gp350蛋白質(zhì)。
7.一種均一gp350蛋白質(zhì)，按照權(quán)利要求6所述方法制備。
8.一種均一gp350蛋白質(zhì)，其中編碼供體和受體剪接位點的一個或多個天然核苷酸被不同于天然核苷酸的取代核苷酸取代，所述取代核苷酸保存了供體和受體的氨基酸序列。
9.一種藥物組合物，含有與藥物學(xué)上可接受的載體混合的權(quán)利要求7或8的均一gp350蛋白質(zhì)。
10.均一gp350蛋白質(zhì)在制備藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物適應(yīng)于預(yù)防治療EBV相關(guān)的疾病或狀況。
全文摘要
提供了含有g(shù)p350DNA和氨基酸序列的組合物，以及含有所述序列的載體和宿主細(xì)胞。也提供了在沒有g(shù)p220蛋白質(zhì)產(chǎn)生的情況下用于重組制備gp350蛋白質(zhì)的方法，提供了含有所述蛋白質(zhì)的藥物組合物及其預(yù)防應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK1152940SQ95193673
公開日1997年6月25日 申請日期1995年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月18日
發(fā)明者R·施佩特, W·T·杰克曼 申請人:阿維龍公司