專利名稱：一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可溶性融合蛋白，尤其是人Notch配體Delta-likel(hDlll)的截 短體、血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向蛋白質(zhì)基序R⑶和氨基末端融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽的一種血管靶 向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Notch信號(hào)途徑廣泛存在于多種生物體內(nèi)，且進(jìn)化上高度保守，在胚胎發(fā)育、血細(xì) 胞發(fā)育及腫瘤形成等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了四種Notch同源分子，即Notch 1-4，并發(fā)現(xiàn)了五種 Notch配體，分別是Jaggedl、2和Delta-likel、3、4。這些配體都是I型跨膜蛋白，N端有一 個(gè)結(jié)合Notch受體必需的DSL結(jié)構(gòu)域，由含6個(gè)半胱氨酸、3個(gè)甘氨酸的45個(gè)氨基酸組成； 配體胞外區(qū)還含有數(shù)量不等的EGF樣重復(fù)區(qū)；胞漿區(qū)很短，只有70-215個(gè)氨基酸殘基，保守 性差。其中，hDlll屬于果蠅Delta配體在人的同源物，由723個(gè)氨基酸組成，其胞外段中 有 1 個(gè) DSL 結(jié)構(gòu)域和 8 個(gè) EGF 樣重復(fù)區(qū)(Radtke F 等，EMB0 reports, 2005,6 1120-1125 ； PfisterS 等，J. Mol. Biol.，2003，333 :229_35 ；Ascano JM 等，J. Biol. Chem.，2003，278 8771-8779)。Notch受體和配體都屬于EGF樣超家族分子。其細(xì)胞外區(qū)包含的多個(gè)EGF樣重 復(fù)序列可以參與鄰近細(xì)胞表面的Notch配體和Notch受體之間相互作用。如Notchl的第 11-12個(gè)EGF樣重復(fù)序列可以與配體DSL結(jié)構(gòu)域相互作用，從而激活Notch信號(hào)途徑(Rebay I等，Cell, 1991，67 :687_699)。Notch信號(hào)的激活對(duì)細(xì)胞具有廣泛而復(fù)雜的作用。在干細(xì) 胞系統(tǒng)，Notch信號(hào)激活的主要作用是通過促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和存活、抑制干細(xì)胞的分化促 使干細(xì)胞維持在低分化狀態(tài)；在細(xì)胞的分化過程中，Notch信號(hào)途徑的作用主要是輔助細(xì) 胞在雙向分化時(shí)選擇其中的一個(gè)分化方向而抑制向另一個(gè)方向的分化，或者在細(xì)胞成熟過 程中抑制細(xì)胞的成熟；在分化的細(xì)胞，Notch信號(hào)的激活可以影響細(xì)胞的功能狀態(tài)。此外， Notch信號(hào)還參與多種復(fù)雜的病理過程，如腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞所處狀態(tài)不一，Notch 信號(hào)激活可以抑制腫瘤或者促進(jìn)腫瘤；Notch信號(hào)還是維持腫瘤干細(xì)胞的重要因素；此外， Notch信號(hào)途徑對(duì)腫瘤微環(huán)境的形成和維持具有關(guān)鍵作用Notch信號(hào)阻斷可以破壞腫瘤 新生血管的完整性，從而引起腫瘤組織缺氧而抑制腫瘤生長(zhǎng)，Notch信號(hào)的激活還是巨噬細(xì) 胞和樹突狀細(xì)胞發(fā)揮其抗腫瘤活性的關(guān)鍵因素。綜上所述，建立激活或者阻斷Notch信號(hào) 途徑的人工手段，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，Notch配體從N末端到DSL結(jié)構(gòu)域的片段足以激活Notch信號(hào)途徑 (FitzgeraldK 等，Development，1995，121 4275 ；Henderson ST 等，Mol. Biol. Cell.，1997， 8 1751 ；ParksAL等，Genetics，2006，174 1947-1961)。這些結(jié)果提示，如果能夠在大腸桿 菌中表達(dá)生產(chǎn)Notch配體的DSL結(jié)構(gòu)域片段，有可能提供一種人工的刺激Notch信號(hào)途徑 的手段，用于在體外和體內(nèi)研究Notch信號(hào)對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響，以及治療與血 管新生相關(guān)的某些疾病如惡性腫瘤和視網(wǎng)膜黃斑變性。因此，近年來有多個(gè)研究組先后利用真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了不同的Notch配體的DSL結(jié)構(gòu)域片段。但是活性分 析的結(jié)果卻不一致有些表達(dá)產(chǎn)物可以激活Notch信號(hào)，有些則沒有激活活性，有些甚至有 抑制Notch信號(hào)激活的活性?？傮w來說，激活活性不佳，無法在實(shí)驗(yàn)研究中獲得穩(wěn)定結(jié)果， 不能應(yīng)用于體內(nèi)?？扇苄訬otch配體對(duì)Notch信號(hào)的激活活性不佳的主要原因是在Notch受體的激 活過程中，在Notch受體的跨膜區(qū)附近要發(fā)生多個(gè)步驟的蛋白酶裂解反應(yīng)。當(dāng)Notch配體 和Notch受體結(jié)合后，Notch跨膜區(qū)的S2位點(diǎn)暴露，并收到ADAM金屬蛋白酶家族的TACE 或Kuz的酶切。這時(shí)，切割產(chǎn)生的游離的胞外區(qū)必需在錨定于細(xì)胞表面的Notch配體的作 用下，被表達(dá)Notch配體的細(xì)胞內(nèi)吞(Endocytosis)。然后，在、分泌酶的作用下，殘存在 細(xì)胞膜上Notch受體片段在跨膜區(qū)內(nèi)發(fā)生裂解，向細(xì)胞內(nèi)釋放出Notch受體胞內(nèi)段，引起 Notch信號(hào)途徑的激活。由這一過程可以看出，必需將Notch配體固定于固體(如細(xì)胞、塑 料培養(yǎng)皿等)表面，才能有效地激活Notch受體。血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向蛋白質(zhì)基序RGD是以精氨酸(R)-甘氨酸(G)_門冬氨酸(D)為 核心的多肽，可以特異識(shí)別血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的整合素分子，從而將與之融合的其他蛋白 分子錨定于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，該蛋白可 以結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，有效地刺激細(xì)胞的Notch受體的激活。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是它是由人Delta-likel即hDlll蛋白截短體、血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向蛋白質(zhì)基序R⑶和融合 的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成；其中hDlll蛋白截短體是hDlll第127-225位氨基酸。所述的hDlll第127-225位氨基酸包含負(fù)責(zé)與Notch受體結(jié)合的DSL結(jié)構(gòu)域和部 分上游序列；所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向蛋白質(zhì)基序RGD是該可溶性融合蛋白的羧基末端； 所述的融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽是該可溶性融合蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol， 并由No2的核酸序列編碼Nol :TrxHis-hDlll-RGD 的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap kygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq hmdspdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvc dehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry ；No2 :TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccag aaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagc ggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttt tctgccgtccccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaa agggccct&ctgc&c&g&gccg&tctgccg&gg&g&ttgcgg&gttcg&t&t0所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No3的氨基酸序列，并由 No4的核酸序列編碼No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列l(wèi)htdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrpr ddafghftc
gergekvcnpgwkgpyctepi ；
No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacc acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcct
cagaggc
accgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcg gccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatco所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No5的氨基酸序列，并由 No6的核酸序列編碼No5 :RGD基序的氨基酸序列crgdcgvry ；No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat。 所述氨基末端融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸 序列編碼
7
N。7TrXHi S的氨基酸序列
msclkiihltddSfdtdVlkadgailVdfWaeWCgpCkmiapildeiadeyqgkltVaklnidqnpgtapkygirg
iptlllfkngeVaatkVgalSkgqlkefldanlagSgSghmhhhhhhSSglVprgSgmkctaaakferqhmdSp
dl gtddddkamadi gS；
N。8TrXHiS的核酸序列
atgagCgataaaattattCaCCtgaCtgaCgaCagttttgaCaCggatgtaCtCaaagCggaCgggg(gatCCtCgtC
gatttCtgggCagagtggtgCggtCCgtgCaaaatgatCgCCCCgattCtggatgaaatCgCtgaCgaatatCagggc
aaaCtgaCCgttgCaaaaCtgaaCatCgatCaaaaCCCtgg(aCtgCgCCgaaatatggcatCCgtggtatCCCgaCt
]CtgCtgCtgttCaaaaaCggtgaagtgg(gg(aaCCaaagtgggtgCaCtgtCtaaaggtCagttgaaagagttCCtC
gaCgCtaaCCtggcCggttCtggttCtggCCatatgCaCCatCatCatCatCattCttCtggtCtggtgCCaCgCggttCt
ggtatgaaagaaaCCgCtgCtgCtaaattCgaaCgCCagCaCatggaCagCCCagatCtgggtaCCgaCgaCgaCg
aCaagg(Catgg(tgatatCggatCC。
所述血管靶向可溶性融合蛋白TrXHiS—hDll卜RGD是在大腸桿菌BL2l中用低溫誘導(dǎo)方法實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，并用針對(duì)HiS標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的TrXHiS—hDlll—RGD蛋白。
本發(fā)明的特點(diǎn)是TrXHiS—hDll卜RGD在體外可以通過基因工程進(jìn)行大量生產(chǎn)，應(yīng)用于體內(nèi)時(shí)可以結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，從而向內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞提供針對(duì)N。tCh受體的激活型刺激，可應(yīng)用于在體外和體內(nèi)研究N。tCh信號(hào)對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響，以及治療與血管新生相關(guān)的某些疾病如惡性腫瘤和視網(wǎng)膜黃斑變性。


圖l、融合蛋白的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建和作用模式 圖2、目的基因(hDll卜RGD)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；
圖3、表達(dá)載體pET32a—hDll卜RGD的結(jié)構(gòu)示意 圖4、表達(dá)載體pET32a—hDll卜RGD的酶切鑒定 圖5、TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白表達(dá)的蛋白電泳 圖6、TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白的純化的電泳圖及免疫印跡檢測(cè)；
圖7、TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白與血管內(nèi)皮細(xì)胞系的結(jié)合；
圖8、游離的TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白對(duì)Raji細(xì)胞N。tCh信號(hào)的激活作用；
圖9、游離的TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白對(duì)Raji細(xì)胞N。tCh信號(hào)的激活作用；
圖lo、與血管內(nèi)皮細(xì)胞系結(jié)合的TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白對(duì)Raji細(xì)胞N。tCh信號(hào)的激活作用；圖11、與血管內(nèi)皮細(xì)胞系結(jié)合的TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白對(duì)Raji細(xì)胞Notch 信號(hào)的激活作用。
具體實(shí)施例方式以下通過附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳盡的說明。1、構(gòu)建表達(dá)載體。圖1是融合蛋白的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建和作用模式圖。根據(jù)hDlll的序 列、RGD九肽的序列(CRGDCGVRY)和其對(duì)照DGR九肽的序列(CDGRCGVRY)設(shè)計(jì)引物，P1 :5’ -CGGGATCCCTCCACACAGATTCTCCTG-3‘ ；P2 5-CGGAATTCATATCGAACTCCGCAATCTCCTCGGCAGATCG GCTCTGTGCAGTAG-3’ ；P3 :5’ -CGGAATTCATATCGAACTCCGCATCGTCCATCGCAGATCGGCTCTGTGCAGTA G-3，。以pET32a-hDlll(127-225)(Shi ZX等，Protein Expr Purif. ，2008，59 242~248)為 模板，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增編碼hDlll-RGD和對(duì)照hDlll-DGR氨基酸的多核苷酸序列(其中 hDlll為其氨基酸的127-225位)(圖2)，瓊脂糖電泳回收后與pMD18_T載體16°C連接 2小時(shí)，熱休克轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10，擴(kuò)增后將目的片段亞克隆至表達(dá)載體pET32a (+)，構(gòu)建 pET32a-hDlll-RGD(圖 3)和 pET32a-hDlll_DGR，限制性酶切(圖 4)、測(cè)序鑒定。圖1、融合蛋白的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建和作用模式圖。圖2為目的基因(hDlll-RGD)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，1道(M)是分子 量標(biāo)志(DL2000)，2和3道(PCR)分別是擴(kuò)增hDlll的127-225位氨基酸片段融合DGR基 序(hDlll-DGR)和hDlll的127-225位氨基酸片段融合R⑶基序(hDlll-RGD)，箭頭所指為 擴(kuò)增片段。圖3、表達(dá)載體pET32a-hDlll_RGD的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為表達(dá)載體pET32a-hDlll_RGD的酶切鑒定圖；(質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶 EcoRI+NotI和EcoRI+BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。M道是marker DL2000,1-5 道分別是不同克隆的酶切結(jié)果)2、誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。將表達(dá)載體 pET32a(+)、pET32a_hDlll、pET32a-hDlll_DGR 和pET32a-hDlll-RGD分別以熱休克法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布含100 y g/ml氨芐青霉素 LB平板，37°C培養(yǎng)12小時(shí)后挑取單克隆接種到含100 u g/ml氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基， 200rpm，37°C培養(yǎng)12h，以轉(zhuǎn)接到新鮮LB(+)培養(yǎng)基中，200rpm，37°C培養(yǎng)3h后，加入終 濃度 1. OmM 的 IPTG，200rpm, 28_30°C培養(yǎng) 24h。3、獲得TrxHis-hDlll-RGD和TrxHis_hDlll_DGR的包涵體蛋白。離心收集細(xì)菌， 200 u 1/ml培養(yǎng)基PBS重懸細(xì)菌，超聲裂菌，加入1 % Triton-X100,混勻，4°C靜置30分鐘， 4°C離心收集上清和沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TrxHis-hDlll能以可溶形式存在于裂解上 清中，而TrxHis-hDlll-RGD和TrxHis-hDlll-DGR蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中 (圖 5)。圖5為TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白表達(dá)的蛋白電泳圖。將質(zhì)粒pET32a(+)、 pET32a-hDl 11、pET32a_hDl 11-DGR 和 pET32a_hDl 11-RGD 分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21，小體積培 養(yǎng)后IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，然后取全細(xì)菌裂解物、裂解上清(可溶性組分)和裂解沉 淀(即包涵體)分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。M是分子量標(biāo)志(由上到下分別是250KD，150KD, 100KD,75KD,50KD,37KD,25KD,20KD)
4、純化包涵體蛋白。pET32a(+)空載體蛋白TrxHis從細(xì)菌裂解上清中純化， TrxHis-hDlll-DGR和 TrxHis-hDlll-RGD 以鎳離子螯合柱(Invitrogen ProBondTM)純化包 涵體蛋白，為了減小誤差，將TrxHis-hDlll也從包涵體中純化，所有純化步驟以ProBondTM 純化手冊(cè)操作。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn) (Immuno-blot)，見在 TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR、TrxHis-hDlll-RGD 都可檢測(cè)到大 小正確的蛋白條帶(圖6)。圖6為TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白的純化及免疫印跡檢測(cè)。從轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒 pET32a-hDlll、pET32a-hDlll-DGR 和 pET32a_hDlll_RGD 的轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 的裂解上清 或過復(fù)性上清用鎳金屬螯合柱純化含有His標(biāo)簽的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析。M道是蛋白 分子量標(biāo)志。下圖是融合蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果，一抗是抗His標(biāo)簽抗體。5、蛋白活性測(cè)定。A.ECV304細(xì)胞爬片的免疫熒光染色。24孔板底部鋪一片圓形蓋玻片，然后 接種1 X 105ECV304,分別在各孔加入5 ii g/ml表達(dá)的蛋白TrxHis、TrxHis-hDlll、 TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis-hDlll-RGD, 48h 后棄去培養(yǎng)基，4% 多聚甲醛固定，抗 His 的單抗染色過夜，第二天用PBS洗滌后，抗小鼠IgG-FITC染色兩小時(shí)，之后PBS洗滌， Hoechst染色10min，PBS洗滌，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。見只有加入 TrxHis-hDlll-RGD的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，且定位于細(xì)胞表面(圖7)。圖7為TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白與血管內(nèi)皮細(xì)胞系的結(jié)合。體外培養(yǎng) 內(nèi)皮細(xì)胞系 ECV304，加入純化的蛋白 TrxHis、TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis-hDlll-RGD，48h后用抗His抗體進(jìn)行免疫熒光染色，Hoechst染色細(xì)胞核，熒光 顯微鏡觀察。B.實(shí)時(shí)定量檢測(cè)重組蛋白TrxHis-hDll 1-RGD激活Notch下游基因Hes 的表達(dá)。六孔板接種lX106Raji細(xì)胞，分別在各孔加入5iig表達(dá)的蛋白TrxHis和 TrxHis-hDlll-RGD, 12h后TRzol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Notch下 游基因Hesl和Hes5的表達(dá)變化。結(jié)果顯示TrxHis-hDlll-RGD可以有效地刺激Hotch信 號(hào)下游基因Hesl和Hes5的表達(dá)(圖8，圖9)，提示具有激活Notch信號(hào)的活性。圖8為游離的TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白對(duì)Raji細(xì)胞Notch信號(hào)的激活作用。 培養(yǎng)Raji細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入純化的蛋白TrxHis和TrxHis-hDlll-RGD，12h后收獲細(xì) 胞，提取總RNA，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Notch下游基因Hesl的表達(dá)水平P < 0. 05)。圖9為游離的TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白對(duì)Raji細(xì)胞Notch信號(hào)的激活作用。 培養(yǎng)Raji細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入純化的蛋白TrxHis和TrxHis-hDlll-RGD，12h后收獲細(xì) 胞，提取總RNA，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Notch下游基因Hes5的表達(dá)水平P < 0. 05)。為了更進(jìn)一步確定表達(dá)的TrxHis-hDlll-R⑶事結(jié)合于整合素分子，并且能更 好的激活Notch信號(hào)，將培養(yǎng)皿接2X105ECV304細(xì)胞，48h后加入終濃度為10 y g/ml的 絲裂霉素作用2. 5h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗一遍后，換新的培養(yǎng)液，接種1X106ECV304細(xì) 胞，分別在各孔加入 5 ii g/ml 表達(dá)的蛋白TrxHis、TrxHis-hDlll, TrxHis-hDlll-DGR ^P TrxHis-hDlll-RGD, 12h后TRzol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Notch 下游基因Hesl和Hes5的表達(dá)變化。結(jié)果顯示與非細(xì)胞表面錨定的TrxHis-hDlll相比， TrxHis-hDlll-RGD可以更有效地有效地刺激Notch信號(hào)下游基因Hesl和Hes5的表達(dá)(圖 10，圖11)，提示具有激活Notch信號(hào)的活性。
圖10為與血管內(nèi)皮細(xì)胞系結(jié)合的TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白對(duì)Raji細(xì)胞Notch 信號(hào)的激活作用。培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，用絲裂霉素C抑制細(xì)胞增殖，向培養(yǎng)液加入純化的蛋 白 TrxHis、TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis_hDlll_RGD，2. 5h 后換液，在加入 Raji細(xì)胞，培養(yǎng)12h后收獲Raji細(xì)胞，提取總RNA，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Notch下游基 因Hesl的表達(dá)水平(* P < 0. 05)。圖11為與血管內(nèi)皮細(xì)胞系結(jié)合的TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白對(duì)Raji細(xì)胞Notch 信號(hào)的激活作用。培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，用絲裂霉素C抑制細(xì)胞增殖，向培養(yǎng)液加入純化的蛋 白 TrxHis、TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis_hDlll_RGD，2. 5h 后換液，再加入 Raji細(xì)胞，培養(yǎng)12h后收獲Raji細(xì)胞，提取總RNA，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Notch下游基 因Hes5的表達(dá)水平< 0. 01)。由以上可制得本發(fā)明這種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，它是由人 Delta-likel即hDlll蛋白截短體、血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向蛋白質(zhì)基序RGD和融合的TrxHis表 達(dá)標(biāo)簽組成；其中hDlll蛋白截短體是hDlll第127-225位氨基酸。所述的hDlll第127-225位氨基酸包含負(fù)責(zé)與Notch受體結(jié)合的DSL結(jié)構(gòu)域和部 分上游序列；所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向蛋白質(zhì)基序RGD是該可溶性融合蛋白的羧基末端； 所述的融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽是該可溶性融合蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol， 并由No2的核酸序列編碼Nol TrxHis-hDlll-RGD 的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap kygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq hmdspdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvc dehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry ；No2 TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacg acaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagc ggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttt tctgccgtccccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaa agggccctactgcacagagccgatctgccgaggagattgcggagttcgatat。所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-R⑶具有No3的氨基酸序列，并由 No4的核酸序列編碼No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列l(wèi)htdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrpr ddafghftc
cagaggc
accgct
gergekvcnpgwkgpyctepi ；
No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacc acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcct
tcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcg gccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatc。所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-R⑶具有No5的氨基酸序列，并由 No6的核酸序列編碼
列編碼

kygirg rqhmdsp
No5 :RGD基序的氨基酸序列 crgdcgvry ；
No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat0
所述氨基末端融合TrxHis表達(dá)標(biāo)簽，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸序 No7 :TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakdwfe
dlgtddddkamadigs ； No8 :TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg
atcctcgtc
12
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatcc0所述血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD是在大腸桿菌BL21中用低溫 誘導(dǎo)方法實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，并用針對(duì)His標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的 TrxHis-hDlll-RGD 蛋白。本發(fā)明的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD在體外可以通過基因 工程進(jìn)行大量生產(chǎn)，應(yīng)用于體內(nèi)時(shí)可以結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，從而向內(nèi)皮細(xì)胞和其他 細(xì)胞提供針對(duì)Notch受體的激活型剌激，還可應(yīng)用于在體外和體內(nèi)研究Notch信號(hào)對(duì)細(xì)胞 增殖、分化和凋亡的影響，以及治療與血管新生相關(guān)的某些疾病如惡性腫瘤和視網(wǎng)膜黃斑變性。序列表序列號(hào)Nol :TrxHis-hDlll-RGD的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap kygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq hmdspdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvc dehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry序列號(hào)No2 :TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccag aaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagc ggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttt tctgccgtcc agggcc
ccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaa
ctactgcacagagccgatctgccgaggagattgcggagttcgatat 序列號(hào)No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列
lhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrpr
ddafghftc
cagaggc accgct
gergekvcnpgwkgpyctepi
序列號(hào)No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacc acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcct
tcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcg
gccacttca

kygirg hmdsp
cctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatc
序列號(hào)No5 :RGD基序的氨基酸序列
crgdcgvry
序列號(hào)No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat 序列號(hào)No7 :TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq
dlgtddddkamadigs 序列號(hào)No8 :TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttga aagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatcc
權(quán)利要求
一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis hDll1 RGD，其特征是它是由人Delta like1即hDll1蛋白截短體、血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向蛋白質(zhì)基序RGD和融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成；其中hDll1蛋白截短體是hDll1第127 225位氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述的hDlll第127-225位氨基酸包含負(fù)責(zé)與Notch受體結(jié)合的DSL結(jié)構(gòu)域和部分上 游序列；所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向蛋白質(zhì)基序RGD是該可溶性融合蛋白的羧基末端；所述 的融合的TrxHis表達(dá)標(biāo)簽是該可溶性融合蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol，并由 No2的核酸序列編碼Nol :TrxHis-hDlll-RGD 的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsPdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry ； No2 :TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc tcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatc agggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcc cgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagt tcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccac gcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggcc gcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctg ccgtccccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggcc
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列編碼No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列l(wèi)htdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrprddaf ghftcgergekvcnpgwkgpyctepi ；No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcggcca cttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatco
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No5的氨基酸序列，并由No6 的核酸序列編碼No5 :RGD基序的氨基酸序列 crgdcgvry ；No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述氨基末端融合TrxHis表達(dá)標(biāo)簽，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸序列編 碼No7 :TrxHis的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsPdlgtddddkamadigs ； No8 :TrxHis的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc tcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatc agggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcc cgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagt tcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccac3gcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggatcc。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特 征是所述血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD是在大腸桿菌BL21中用低溫誘 導(dǎo)方法實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，并用針對(duì)His標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的 TrxHis-hDlll-RGD 蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，它由人Delta-like1蛋白截短體即hDll1第127-225位氨基酸、血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向蛋白質(zhì)基序RGD和TrxHis表達(dá)標(biāo)簽組成；表達(dá)載體是pET32a/hDll1-RGD。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后采取28-30℃低溫誘導(dǎo)24h實(shí)現(xiàn)與TrxHis可溶性融合表達(dá)，用針對(duì)His標(biāo)簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的TrxHis-hDll1-RGD蛋白。TrxHis-hDll1-RGD在體外可以通過基因工程進(jìn)行大量生產(chǎn)，應(yīng)用于體內(nèi)時(shí)可以結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，從而向內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞提供針對(duì)Notch受體的激活型刺激，還可應(yīng)用于在體外和體內(nèi)研究Notch信號(hào)對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響，以及治療與血管新生相關(guān)的某些疾病如惡性腫瘤和視網(wǎng)膜黃斑變性。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101891824SQ20101022147
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者何飛, 趙星成, 韓驊 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)