專利名稱：痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬臨床微生物鑒定技術領域，具體涉及一種快速鑒定痰樣本病原菌的試劑 盒及檢測方法。
背景技術：
傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)和生化分析，已不能滿足對各種病原微生物的診斷以及流行病學 研究，研究者不僅希望在分子水平上對各種細菌和病毒進行研究，同時希望檢驗方法更快 速、準確，通量更高，人為影響因素要盡可能減少，便于構建標準化的操作流程。PCR以及定 量PCR的方法無法獲得分子診斷的黃金標準-基因序列，而且受檢測菌種的限制，每種菌種 需要特異的PCR引物和或探針，大大限制了其在細菌鑒定中的應用；而利用常規(guī)的DNA測序 技術對大片段的DNA進行序列測定，在速度和消耗上不能滿足對大規(guī)模樣本快速檢測的要 求。在實際工作中，很短的一段保守/特異序列的測定就可滿足對分子診斷的需要。由于 IBsrRNA序列在所有的細菌種都存在，能夠滿足進行比較的要求，因此以1 6SrRNA序列分析 為基礎，采取毒力和毒素基因鑒定方法，在最短的時間內鑒定未知細菌，對細菌性新發(fā)傳染 病做出準確判定。焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，通量高、操作方 便，便于構建標準化操作流程，因此廣受研究者青睞，并在很多方面已應用于臨床微生物的 分型鑒定及耐藥檢測。Pyrosequencing (焦磷酸測序)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行 電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便。Pyrosequencing技術是由4種酶催化的同 一反應體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP 與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(PPi)。 PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應 中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。Monstein等(2001)用焦磷酸測序技術檢測幽門螺桿菌16S rRNA基因16S rDNA的 Vl和V3區(qū)序列，將胃鏡活檢標本中得到的23個幽門螺桿菌標本依據(jù)其Vl區(qū)的核苷酸序列 差異，鑒定出8種不同的等位基因類型，除11個樣本與幽門螺桿菌26695株序列一致、1個 樣本與199株的序列一致外，根據(jù)Vl區(qū)的改變表現(xiàn)為有1個或2個核苷酸的突變或單個核 苷酸的插入而分為4個等位基因類型。另有2個標本的V3區(qū)出現(xiàn)C至T轉換，證明此技術 可滿足對臨床病原菌標本的快速鑒定和分型。Urmer stad等(2001)利用焦磷酸測序技術 對106株不同血清型的單核細胞增生李斯特氏菌進行了分型，根據(jù)inIB基因第1575位和 1578位核苷酸的變化，將血清型l/2a和l/2c分為一組，l/2b和3b分為一組，而血清型4b 又可分為2個組。該技術還被應用于百日咳桿菌(Bordetella pert ussis)與副百日咳桿 菌(Parapert ussis)等細菌的快速鑒定及分型(Ronaghi等，1999)。Martin等(2006)運 用此技術對百日咳桿菌毒力相關PtxSl基因進行了分型鑒定，并與定量PCR作了方法學的 比較，結果顯示兩種方法具有很好的一致性，焦磷酸測序技術適合百日咳桿菌的大規(guī)模篩 選。此外，Alistair等(2003)用焦磷酸測序技術檢測腸球菌的23s rRNA上的抗利奈唑胺位點，并與PCR-RFLP方法比較，結果顯示了 100%的一致性。Mar jo等(2005)用焦磷酸測 序技術檢測鳥分支桿菌，肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌，空腸彎曲桿菌，流感(嗜血)桿菌等多種 病原體的23S rRNA基因2058位多態(tài)性，以獲得病原體的大環(huán)內脂抗藥性信息。趙錦榮等 (2005)建立了基于焦磷酸測序技術的高通量檢測耐利福平結核分支桿菌的方法，并用傳統(tǒng) 的測序方法進行驗證，結果顯示了 100% —致性，他們認為這種方法具有自動化程度高和結 果準確等特點，相比傳統(tǒng)的測序，具有更快速，簡便等特點，適用于耐利福平結核分支桿菌 的快速高通量的檢測。然而，上述報道均是建立在純化的菌株或無菌體液單一菌種的檢測，臨床上痰液 樣本有很多正常菌群的存在，這種多種細菌存在的情況通過細菌16S rRNA通用 引物擴增后 用通用引物測序所產生的序列為正常菌群和致病菌的混合序列，而這種混合序列難以直接 通過序列比對的方式解決；本發(fā)明通過設計針對痰液標本中的優(yōu)勢正常菌_奈瑟菌屬和小 韋榮球菌的特異引物，將兩條特異引物與細菌通用引物按一定的比例混合進行PCR擴增， PCR產物經單鏈純化步驟去除奈瑟菌和小韋榮球菌的擴增片段而只留下致病菌的擴增序列 來達到對痰液樣本中正常菌群進行屏蔽的目的。屏蔽后的PCR產物經焦磷酸測序后所產生 的序列為致病菌的單一序列，該單一序列與數(shù)據(jù)庫比對即可判斷致病菌種屬。該方法能一 次測序區(qū)分痰液樣本中致病菌。迄今為止國內外未見一次測序區(qū)分痰液樣本中致病菌的產 品和報道，因此臨床上如果要快速獲得痰液樣本細菌感染的信息，需要等3-7天或更長時 間。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種可靠準確的痰樣本細菌快速鑒定的試劑
品.ο本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述試劑盒的檢測方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下一種痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒，它包括(1)擴增細菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO=I 和SEQID NO 2所示引物對；(2)屏蔽奈瑟菌屬細菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的特異引物其核苷酸序列如SEQID NO 3和SEQ ID NO 2所示引物對；(3)屏蔽小韋榮球菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的特異引物其核苷酸序列如SEQ IDNO 4和SEQ ID NO 2所示引物對；(4)測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；(5)親和素標記的磁珠；其中，SEQ ID NO :1在其5，端標記生物素；在一次檢測中共同使用。上述痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒，具體包括如下試劑(1)液化試劑0. 2M NaOH ；(2)洗滌試劑0· 9% NaCl 溶液；(3) DNA 提取試劑5% (w/v) g/mLChelex 100 緩沖液，20mg/mL 蛋白酶 K ；
其中，Chelex 100 緩沖液具體為含 0. 03% (w/v) g/mL SDS, 1% (v/v) Tween-20, 1% (v/v)NP-40。(4)反應液PCR Buffer，特異引物SEQ ID NO :1 2，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具體為:0· 1% (ν/ν)ΝΡ-40,0. 02% (ν/ν)明膠，0· 06% (w/v) g/ mL BSA，0. 1% (ν/ν) Tween-20,0. 06Μ ρΗ8· 9Tricine。(5)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate， 結合緩沖液，退火緩沖液；其中，結合緩沖液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl, ImM EDTA,0. 1 % (ν/ν) Tween-20 ；退火緩沖液具體為20mM ρΗ 7. 6Tris_Acetate，2mM 醋酸鎂。(6)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物 APS，熒光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)?！N痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒，它包括上述的所有核苷酸序列的堿基互補序 列，也就是包括(1)擴增細菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 5 和SEQ ID NO 6所示引物對；(2)屏蔽奈瑟菌屬細菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的特異引物其核苷酸序列如SEQID NO 7和SEQ ID NO 6所示引物對；(3)屏蔽小韋榮球菌16S rRNA的Vl可變區(qū)的特異引物其核苷酸序列如SEQ IDNO 8和SEQ ID NO 6所示引物對；(4)測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示；(5)親和素標記的磁珠；其中，SEQ ID NO 5在其5’端標記生物素；在一次檢測中共同使用。上述痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒，具體包括如下試劑(1)液化試劑0· 2MNa0H ；(2)洗滌試劑0· NaCl 溶液；(3) DNA 提取試劑5% (w/v) g/mL Chelex 100 緩沖液，20mg/mL 蛋白酶 K ；其中，5%(w/v) g/mL Chelex 100 緩沖液具體為含 0. 03% (w/v) g/mL SDS, 1% (v/v)Tween-20，1 % (ν/ν)ΝΡ-40。(4)反應液PCR Buffer，特異引物 SEQ ID NO :3 4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具體為:0· 1% (ν/ν)ΝΡ-40,0. 02% (ν/ν)明膠，0· 06% (w/v) g/ mL BSA，0. 1% (ν/ν) Tween-20,0. 06Μ ρΗ8· 9Tricine。(5)單鏈純化試劑75% (v/v)乙醇溶液，0. 2M NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate， 結合緩沖液，退火緩沖液；其中，結合緩沖液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl，ImM EDTA，0. 1 % (v/v) Tween-20 ；退火緩沖液具體為20mM ρΗ 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸鎂。(6)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。本發(fā)明所述的細菌為狹義的細菌，包括假單胞菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、克雷伯菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬。上述痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒的檢測方法包括如下步驟(1)痰樣本前處理；(2)提取細菌DNA(3)以步驟⑵所得DNA為模板，利用通用引物及屏蔽引物進行細菌16S rRNA的 Vl可變區(qū)的PCR擴增；(4)步驟(3)得到的PCR擴增產物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化；(5)將步驟(4)得到的純化的PCR產物進行焦磷酸測序；(6)測序結果與數(shù)據(jù)庫比對判斷種屬。步驟(2)中，所述的PCR擴增體系為10 X PCR Buffer 5 μ L, SEQ ID NO :10· 3μ L， SEQ ID NO 21 μ L, SEQ ID NO :36μ L, SEQ ID NO 46 μ L, Template 0. 2ng, dNTPS200mM, taqE 2U，加無菌水至 50 μ L ；PCR 擴增條件為-MV 3min ；94°C 25s, 42°C 30s, 72°C 20s, 28 個循環(huán)；72°C 3min。或者將SEQ ID NO :5替換上述SEQ ID NO :1 JfSEQ ID NO :6替換上述 SEQ ID NO :2 JfSEQ ID NO 7 替換上述 SEQ ID NO :3，同時將 SEQ ID NO :8 替換上述 SEQ ID NO :4，其它PCR擴增體系和條件相同。有益效果本發(fā)明的試劑盒利用焦磷酸測序技術測定的Vl反向區(qū)段的序列和數(shù) 據(jù)庫比對判斷種屬。應用此試劑盒能一次測序區(qū)分痰樣本細菌可用于呼吸道細菌感染的臨 床診斷。不僅為臨床診療贏得了寶貴的搶救時間，而且具有成本低廉，操作方便，特異性強 的優(yōu)點。本發(fā)明方法可以使痰樣本細菌種屬鑒定縮短到5小時，成本為傳統(tǒng)鑒定法的三分 之一，另外，通過序列比對鑒定細菌是菌種鑒定的終極方法，特別是對一些難鑒定菌序列比 對鑒定更具優(yōu)勢。


圖1為1例痰標本致病菌檢測結果圖，Vl區(qū)測序結果為陰性。圖2為1例痰標本致病菌檢測結果圖，Vl區(qū)測序結果為 AACGGACGAGAAGCTTGCTTCTCTG，與數(shù)據(jù)庫比對判定為金黃色葡萄球菌。圖3為1例痰標本致病菌檢測結果圖，Vl區(qū)測序結果為GGGGAAGGTAGCTTGCTACTGG， 與數(shù)據(jù)庫比對判定為鮑曼不動桿菌。圖4為1例菌株檢測結果圖，Vl區(qū)測序結果為GTAGCACAGAGAGCTTG，與數(shù)據(jù)庫比對 判定為肺炎克雷伯菌。圖5為1例菌株檢測結果圖，Vl區(qū)測序結果為GTAGCAGGAGAAAGGTGTCGTTTC，與數(shù) 據(jù)庫比對判定為流感嗜血桿菌。圖6為1例菌株檢測結果圖，Vl區(qū)測序結果為GCAGCATGATCTAGCTTG，與數(shù)據(jù)庫比 對判定為皮氏伯克霍爾德。圖7為1例菌株檢測結果圖，Vl區(qū)測序結果為AACAGACGAGGAGCTTGCTCCTC，與數(shù)據(jù) 庫比對判定為表皮葡萄球菌。圖8為1例菌株檢測結果圖，Vl區(qū)測序結果為GTAACATGAAGAAGCTTGCTTC，與數(shù)據(jù)庫比對判定為奇異變形桿菌。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 試劑盒的制備方法。(1)液化試劑0. 2M NaOH,購于上海試四赫維化工有限公司。(2)洗滌試劑0. 9% NaCl溶液，購于上海試四赫維化工有限公司。(3) DNA 提取試劑 5% (w/v) g/mL Chelex 100 緩沖液含 0· 03% (w/v) g/mL SDS (購于杭州熒光泰 生物技術有限公司)，1% (v/v)Tween-20(購于美國Sigma公司)，1% (ν/ν)NP-40 (購于美 國Sigma公司),20mg/mL 蛋白酶 K (購于 Amresco)。(4)反應液PCR Buffer 0. 1 % (ν/ν) NP-40,0. 02 % (ν/ν)明膠(購于美國 Sigma 公司)， 0. 06% (w/v) g/mL BSA (購于美國 Sigma 公司)，0· (v/v) Tween-20 (購于美國 Sigma 公 司)，0. 06MpH8. 9Tricine (購于 Merck 公司)，特異引物SEQ ID NO :1 4 或 SEQ ID NO 5 8，2mM，MgCl2 購于美國Sigma公司，0. 2mM dNTPs 購于上海鼎國生物技術有限公司，2U/y L Taq DNA 聚合酶購自美國 Fermentas 公司。(5)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液購于杭州長征化學試劑有限公司，0. 2Μ NaOH:購于上海試四赫維化工有限公司，IOmM Tris-Acetate (ρΗ 7.6) :Tris_base 購于美國 Sigma 公司，無水乙酸購于杭 州化學試劑有限公司，結合緩沖液由IOmM Tris-HCl (Tris-base購于美國Sigma公司，鹽酸購于杭州化 學試劑有限公司)，2M NaCl (購于上海試四赫維化工有限公司)，ImM EDTA(購于杭州化學 試劑有限公司)，0. (v/v) Tween 20 (購于美國Sigma公司)組成，退火緩沖液由20mM Tris-Acetate (ρΗ 7. 6) (Tris-base 購于美國 Sigma 公司， 無水乙酸購于杭州化學試劑有限公司)，2mM醋酸鎂(購于上海試四赫維化工有限公司)組 成。親和素標記的磁珠(購于 GE healthcare Bioscience AB)。(6)測序試劑DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶購于QIAGEN公司，底物APS和熒光素購于QIAGEN公司，四種 dNTP (dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)購于 QIAGEN 公司。實施例2 檢測方法。儀器Bio-RadS1000PCR 儀，Beckman Microfuge 22R 臺式微量冷凍離心機，北京六一瓊脂糖凝膠電泳儀、上海培清凝膠成像系統(tǒng)，QIAGEN PyroMark Q96ID測序儀。(1)痰樣本前處理(Ia)在痰樣本中加入等量的液化試劑，搖晃混勻，室溫靜置10 20分鐘；
(Ib)吸取ImL液化后的痰液至1. 5mL滅菌離心管中，13000rpm離心lOmin，去上 清；(Ic)在沉淀中加入ImL洗滌試劑，震蕩混勻，13000rpm離心lOmin，去上清；(Id)重復步驟(Ic) 一次。(2)提取細菌DNA，具體包括如下步驟(2a)在(1)所獲得的沉淀中加入5% (w/v) g/mL Chelex 100緩沖液200 μ L和蛋 白酶 Κ2 μ L (20mg/mL, )，56°C孵育 60min,煮沸 15min。(2b) 13000rpm離心10分鐘，取上清2 μ L作為DNA模板備用。(3)以步驟⑵所得DNA為模板，利用通用引物和屏蔽引物進行細菌16S rRNA的 Vl可變區(qū)的PCR擴增；其中，所述的PCR 擴增體系為10Xbuffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L，SEQ ID NO 21 μ L, SEQ ID NO 36 μ L, SEQ ID NO 46 μ L, Template 0. 2ng, dNTPS 200mM, taqE2U, 加無菌水至 50 μ L ；PCR 擴增條件為94°C 3min ；94°C 25s, 42°C 30s, 72°C 20s, 28 個循環(huán)； 72°C 3min?；蛘邔?SEQ ID NO :5 替換上述 SEQ ID NO :1 JfSEQ ID NO :6 替換上述 SEQ ID NO :2，將 SEQ ID NO :7 替換上述 SEQ ID NO :3，同時將 SEQ IDNO :8 替換上述 SEQ ID NO :4， 其它PCR擴增體系和條件相同。(4)步驟(3)得到的PCR擴增產物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化 在使用前，保證所有溶液都達到室溫； 在 PSQ 96 板中加入 45 μ 1 annealing buffer，然后每孔加入 SEQ ID NO :2 測 序引物(IOuM) IuL ； 使用Vertex混勻S印harose beads，將需要使用的s印haroe beads總量(每樣 本3yL)轉移至Ij 一個Eppendorf■管中，在s印harose bead中力口入binding buffer，使得平 均每個樣品約有50 μ L的體積，將混合物混勻； 將以上混合物加入PCR產物(50 μ L反應體積)中，每樣本50 μ L，將PCR產物在 常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結合； 在Vacuum prep workstation中，四個樣品板中依次加入180mL高純水、70%乙 酉享、washing buffer 禾口 120ml Denaturation buffer ；^iTJFvacuum prep workstation 的栗，vacuum prep tool 在高純水中i青洗 30
vacuum prep tool PCR , MM sepharose beads, vacuum prep tool 放入70%乙醇中5秒,然后移到denatureation buffer中5秒，再移到washing buffer中 清洗10秒，把吸頭放在相應含有測序引物的板孔的上方，不要接觸液面，關掉泵，將vacuum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放s印harose beads ； 使用高純水清洗vacuum pap tool。將放有樣品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫后 放入測序儀中。(5)將步驟(4)得到的純化的PCR產物進行焦磷酸測序；
(6)測序結果與美國國家生物信息技術中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫比對判斷種屬。將本 發(fā)明方法用于8例臨床痰標本的鑒定，測序圖如圖1-8所示。本發(fā)明方法與痰 標本經微生物培養(yǎng)、致病菌分純后用法國生物梅里埃的微生物鑒定系統(tǒng)做比對，結果一致。
權利要求
一種痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒，其特征在于它包括(1)擴增細菌16S rRNA的V1可變區(qū)的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示引物對；(2)屏蔽奈瑟菌屬細菌16S rRNA的V1可變區(qū)的特異引物其核苷酸序列如SEQID NO3和SEQ ID NO2所示引物對；(3)屏蔽小韋榮球菌16S rRNA的V1可變區(qū)的特異引物其核苷酸序列如SEQ IDNO4和SEQ ID NO2所示引物對；(4)測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；(5)親和素標記的磁珠；其中，SEQ ID NO1在其5’端標記生物素；在一次檢測中共同使用。
2.根據(jù)權利要求1所述的痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒，其特征在于它包括如下試劑(1)液化試劑0.2MNa0H ；(2)洗滌試劑0.9%NaCl溶液；(3)DNA提取試劑5% (w/v) g/mL Che lex 100 緩沖液，20mg/mL 蛋白酶 K ；(4)反應液PCRBuffer，特異引物 SEQ ID N0:1 4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ U LTaqDNA聚合酶；(5)單鏈純化試劑75%(v/v)乙醇溶液，0. 2MNa0H，lOmM pH 7. 6Tris_Acetate，結合 緩沖液，退火緩沖液；(6)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒 光素和dNTP。
3.一種痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒，其特征在于它包括權利要求1所述的所有核苷 酸序列的堿基互補序列，也就是包括(1)擴增細菌16SrRNA的VI可變區(qū)的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6所示引物對；(2)屏蔽奈瑟菌屬細菌16SrRNA的VI可變區(qū)的特異引物其核苷酸序列如SEQIDN0 7和SEQ ID NO 6所示引物對；(3)屏蔽小韋榮球菌16SrRNA的VI可變區(qū)的特異引物其核苷酸序列如SEQ IDN0 8 和SEQ ID NO 6所示引物對；(4)測序引物其核苷酸序列如SEQID NO 6所示；(5)親和素標記的磁珠；其中，SEQ ID NO 5在其5，端標記生物素； 在一次檢測中共同使用。
4.根據(jù)權利要求3所述的痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒，其特征在于它包括如下試劑(1)液化試劑0.2M NaOH ；(2)洗滌試劑0.9%NaCl溶液；(3)DNA提取試劑5% (w/v) g/mLChelex 100 緩沖液，20mg/mL 蛋白酶 K ；(4)反應液PCRBuffer，特異引物 SEQ ID N0:5 8，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ U LTaq DNA聚合酶；(5)單鏈純化試劑75%(v/v)乙醇溶液，0. 2M NaOH, 10mM pH 7. 6Tris_Acetate，結合 緩沖液，退火緩沖液；(6)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒 光素和dNTP。
5.一種痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒的檢測方法，其特征在于它包括如下步驟(1)痰樣本前處理；(2)提取細菌DNA;(3)以步驟⑵所得DNA為模板，利用通用及屏蔽引物進行細菌16SrRNA的VI可變區(qū) 的PCR擴增；(4)步驟(3)得到的PCR擴增產物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化；(5)將步驟(4)得到的純化的PCR產物進行焦磷酸測序；(6)測序結果與數(shù)據(jù)庫比對判斷種屬。
6.根據(jù)權利要求5所述的痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟 (3)中所述的 PCR 擴增體系為10 X buffer 5 u L, SEQ ID NO 10. 3u L, SEQ ID NO 21 u L, SEQ ID NO :36u L, SEQ ID NO :46u L, Template 0. 2ng, dNTPS 200mM，taqE2U，加無菌水至 50 ii L ;PCR 擴增條件為94°C 3min ；94°C 25s，42°C 30s，72°C 20s, 28 個循環(huán)；72°C 3min。
7.根據(jù)權利要求5所述的痰樣本細菌快速鑒定的試劑盒的檢測方法，其特征在于步 驟(3)中所述的 PCR 擴增體系為:10XPCR Buffer 5 u L, SEQ ID NO :50. 3u L, SEQID NO: 6 luL, SEQ ID NO :76u L, SEQ ID NO 86 u L, Template 0. 2ng, dNTPS 200mM, taqE 2U, 加無菌水至 50ii L ；PCR 擴增條件為94°C 3min ；94°C 25s，42°C 30s,72°C 20s, 28 個循環(huán)； 72 °C 3min。
全文摘要
本發(fā)明涉及臨床微生物鑒定領域，提供了一種快速鑒定痰樣本中細菌的試劑盒及方法。該試劑盒包括2條通用引物擴增細菌16S rRNA的V1可變區(qū)，2條特異引物屏蔽奈瑟菌屬細菌16S rRNA的可變區(qū)，2條特異引物屏蔽小韋榮球菌16S rRNA的可變區(qū)，1條測序引物測定V1正向區(qū)段的序列，親和素標記的磁珠，測序結果與數(shù)據(jù)庫比對判斷種屬。應用此試劑盒能一次測序區(qū)分痰樣本中的細菌，可用于痰樣本中細菌感染的臨床診斷。不僅為臨床診療贏得了寶貴的搶救時間，而且具有成本低廉，操作方便，特異性強的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/04GK101864491SQ201010221270
公開日2010年10月20日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權日2010年7月7日
發(fā)明者任緒義, 呂江峰, 虞閏六 申請人:杭州迪安醫(yī)學檢驗中心有限公司