專利名稱：檢測(cè)真蛋白含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛奶及其奶制品質(zhì)量檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)，特別是涉及一種一種檢測(cè)牛奶中 真蛋白含量的方法。
背景技術(shù)：
牛奶營養(yǎng)豐富、容易消化吸收、食用方便、物美價(jià)廉，人稱“白色血液”，是最理想的 天然食品。但三鹿牌嬰幼兒奶粉、皮革蛋白粉等事件的出現(xiàn)，對(duì)中國奶業(yè)造成了致命的打 擊，生鮮乳及乳制品的蛋白質(zhì)摻假問題也日益受到社會(huì)各界的重視。如何快速準(zhǔn)確地檢測(cè) 生鮮乳及乳制品中的真蛋白，保證乳品的安全、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)，重新樹立起消費(fèi)者的信心，已成 為限制中國奶業(yè)發(fā)展的重要問題。凱氏定氮法是目前測(cè)定蛋白質(zhì)最常用的方法，但這種方法在操作上并不是一種非 常理想的檢測(cè)方法，耗時(shí)長，而且容易受銨鹽類等含氮化合物的干擾，使測(cè)得的蛋白質(zhì)的含 量比實(shí)際值虛高。因此，需要一種專一特異性的能夠直接測(cè)定牛奶及奶制品中真蛋白含量 的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述已有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)牛奶中真 蛋白含量的方法，利用酶促反應(yīng)中底物濃度與酶解初速度的關(guān)系，通過pH-stat法建立了 酪蛋白濃度與酶解初速度的關(guān)系曲線，檢測(cè)牛奶樣品時(shí)，只需檢測(cè)酶解初速度便可得到其 中的真蛋白含量，同時(shí)由于該方法檢測(cè)的是真蛋白，也能防止不法商人添加類似三聚氰胺 的摻假行為。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種檢測(cè)真蛋白含量的方法，包括以下步驟步驟一、分別配制濃度為HpH^HH5的酪蛋白溶液，濃度范圍是0 35mg/ml ；步驟二、求解濃度為H1的酪蛋白溶液的水解初速度步驟2. 1、樣品的預(yù)處理量取酪蛋白溶液，置于酶反應(yīng)器中，溫度恒定為 50 60°C，用磁力攪拌器恒溫?cái)嚢瑁瑴y(cè)定此時(shí)溶液的pH值，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值于 7. 00-8. 00 ；步驟2. 2、PH-Stat法測(cè)定酶解初速度在上述步驟2. 1中的酪蛋白溶液中加入濃度為28. 67-229. 32u/ml的胰蛋白酶 lml，混合均勻，開始記錄反應(yīng)時(shí)間和pH的變化，同時(shí)pH計(jì)持續(xù)記錄pH值的變化；當(dāng)？!1值降到￡1(7.00<￡1<7.95)時(shí)，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為a+0. 05，pH值每 上升0. 01，記錄一次反應(yīng)時(shí)間和氫氧化鈉溶液消耗體積；pH值上升0. 05，共記錄5次反應(yīng)時(shí)間和5次氫氧化鈉溶液的消耗體積，5次時(shí)間之 和在5分鐘之內(nèi)；根據(jù)五次反應(yīng)時(shí)間之和與五次氫氧化鈉溶液消耗總體積的關(guān)系做圖，斜率即是該濃度下酶解初速度V1 (微升/秒)；步驟三、實(shí)驗(yàn)方法如步驟二，分別可以得到H2、H3、H4、H5的酪蛋白溶液水解初速度 V2, V3, V4, V50步驟四、根據(jù)酪蛋白濃度對(duì)應(yīng)的酶解初速度，建立兩者之間的線性關(guān)系曲線。步驟五、檢測(cè)牛奶樣品時(shí)，只需檢測(cè)牛奶中蛋白質(zhì)的酶解初速度，代入步驟四所求 的線性方程中，便可得到牛奶中的蛋白質(zhì)含量。酪蛋白溶液的濃度&、!12、!13、!14、H5分別為 6. 60,8. 25,11. 00,16. 50,33. 00mg/ml。步驟2. 1中的恒定溫度是55°C，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值于7. 50，步驟2. 2中，在 步驟2. 1中的酪蛋白溶液中加入濃度為171. 99u/ml的胰蛋白酶1ml。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果可以是1、本發(fā)明巧妙的利用了酶動(dòng)力學(xué)中，在一級(jí)反應(yīng)時(shí)蛋白質(zhì)含量與酶解初速度的線 性關(guān)系，可以準(zhǔn)確的檢測(cè)牛奶中的真蛋白含量。2、本發(fā)明具備蛋白質(zhì)底物專一特異性，不受其他物質(zhì)干擾，三聚氰胺等不會(huì)發(fā)生 反應(yīng)作用，不會(huì)產(chǎn)生虛假結(jié)果。3、本發(fā)明測(cè)定速度快，牛奶中真蛋白的測(cè)定在7-8分鐘內(nèi)完成。4、該方法操作快速簡(jiǎn)便，需要的儀器設(shè)備少，成本低，對(duì)測(cè)定的環(huán)境條件要求低， 無污染。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖
和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但不應(yīng)以 此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明一種檢測(cè)牛奶中真蛋白含量的方法，主要是利用蛋白質(zhì)與酶解初速度的關(guān) 系，建立蛋白質(zhì)與酶解初速度的關(guān)系曲線，通過檢測(cè)酶解初速度進(jìn)而求得牛奶中真蛋白的 含量。具體實(shí)施步驟如下A、分別配制濃度為 6. 60,8. 25、11. 00、16. 50,33. 00mg/ml 的酪蛋白溶液。B、以濃度為6. 60mg/ml的酪蛋白溶液求水解初速度為例1、樣品的預(yù)處理量取30ml的6. 60mg/ml的酪蛋白溶液，置于50ml的酶反應(yīng)器 中，溫度恒定為55°C，于磁力攪拌器恒溫?cái)嚢?min，測(cè)定此時(shí)溶液的pH值，用0. lmol/L NaOH溶液調(diào)pH值于7. 50。2、pH-stat法測(cè)定酶解初速度在上述1中加入濃度為171. 99u/ml的胰蛋白酶 lml，混合均勻，開始記錄反應(yīng)時(shí)間和pH的變化(pH計(jì)持續(xù)記錄pH值的變化)。當(dāng)pH值降 到 7. 45 時(shí)用 0. lmol/L NaOH 溶液調(diào) pH 為 7. 50，pH值每上升0. 01，記錄一次反應(yīng)時(shí)間和氫氧化鈉溶液消耗體積；pH值上升0. 05，共記錄5次反應(yīng)時(shí)間和5次氫氧化鈉溶液的消耗體積，5次時(shí)間之 和在5分鐘之內(nèi)；根據(jù)五次反應(yīng)時(shí)間之和與五次氫氧化鈉溶液消耗總體積的關(guān)系做圖，斜率即是該 濃度下酶解初速度V1 (微升/秒)。C、實(shí)驗(yàn)方法如B，分別可以得到8. 25,11. 00,16. 50,33. 00mg/ml的酪蛋白溶液水
解初速度V2，V3，V4，V5。
D、根據(jù)酪蛋白濃度對(duì)應(yīng)的酶解初速度，建立兩者之間的線性關(guān)系曲線y = 0. 1177x(擬合度 R2 = 0. 9927)。E、檢測(cè)牛奶樣品時(shí)，只需檢測(cè)牛奶中蛋白質(zhì)的酶解初速度，代入D所求的線性方 程中，便可得到牛奶中的蛋白質(zhì)含量。下面舉例說明鮮牛奶中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定取市售5種不同品牌鮮牛奶，分別檢測(cè)其含有的蛋白質(zhì)含量。具體操作如下1、樣品的預(yù)處理量取30ml的鮮牛奶溶液，置于50ml的酶反應(yīng)器中，溫度恒定為 550C，于磁力攪拌器恒溫?cái)嚢?min，測(cè)定此時(shí)溶液的pH值，用0. lmol/L NaOH溶液調(diào)pH值 于 7. 50。2、pH-stat法測(cè)定酶解初速度在上述1中加入濃度為171. 99u/ml的胰蛋白酶 lml，混合均勻，開始記錄反應(yīng)時(shí)間和pH的變化(pH計(jì)持續(xù)記錄pH值的變化)。當(dāng)pH值降 到7. 45時(shí)用0. lmol/L NaOH溶液調(diào)pH % 7. 50,記錄反應(yīng)時(shí)間、和0. lmol/L氫氧化鈉溶 液消耗體積(μ 1)。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，記錄5次時(shí)間和5次NaOH溶液的消耗體積。根據(jù)時(shí)間 (s)與NaOH溶液消耗體積(μ )的關(guān)系作圖，斜率即是該鮮牛奶的酶解初速度Vjyl/s)。3、將求得的酶解初速度代入D所求的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，便可得到該鮮牛奶中所含的蛋 白質(zhì)含量。4、結(jié)果判定以中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一雙縮脲法作為比對(duì)方法，結(jié)果統(tǒng) 計(jì)如表1。表 1 對(duì)兩種方法求得的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明兩種方法所測(cè)得的結(jié)果無顯 著性差異，其測(cè)量結(jié)果一致。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。任何 所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種的更動(dòng)與 潤飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)視權(quán)利要求書所界定范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)真蛋白含量的方法，其特征在于包括以下步驟步驟一、分別配制濃度為H1、H2、H3、H4、H5的酪蛋白溶液，濃度范圍是0～35mg/ml；步驟二、求解濃度為H1的酪蛋白溶液的水解初速度步驟2.1、樣品的預(yù)處理量取酪蛋白溶液，置于酶反應(yīng)器中，溫度恒定為50～60℃，用磁力攪拌器恒溫?cái)嚢?，測(cè)定此時(shí)溶液的pH值，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值于7.00-8.00；步驟2.2、pH-stat法測(cè)定酶解初速度在上述步驟2.1中的酪蛋白溶液中加入濃度為28.67-229.32u/ml的胰蛋白酶1ml，混合均勻，開始記錄反應(yīng)時(shí)間和pH的變化，同時(shí)pH計(jì)持續(xù)記錄pH值的變化；當(dāng)pH值降到a(7.00＜a＜7.95)時(shí)，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為a+0.05，pH值每上升0.01，記錄一次反應(yīng)時(shí)間和氫氧化鈉溶液消耗體積；pH值上升0.05，共記錄5次反應(yīng)時(shí)間和5次氫氧化鈉溶液的消耗體積，5次時(shí)間之和在5分鐘之內(nèi)；根據(jù)五次反應(yīng)時(shí)間之和與五次氫氧化鈉溶液消耗總體積的關(guān)系做圖，斜率即是該濃度下酶解初速度V1(微升/秒)；步驟三、實(shí)驗(yàn)方法如步驟二，分別可以得到H2、H3、H4、H5的酪蛋白溶液水解初速度V2，V3，V4，V5；步驟四、根據(jù)酪蛋白濃度對(duì)應(yīng)的酶解初速度，建立兩者之間的線性關(guān)系曲線；步驟五、檢測(cè)牛奶樣品時(shí)，只需檢測(cè)牛奶中蛋白質(zhì)的酶解初速度，代入步驟四所求的線性方程中，便可得到牛奶中的蛋白質(zhì)含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)真蛋白含量的方法，其特征在于酪蛋白溶液的濃度氏、 H2、H3、H4、H5 分別為 6. 60,8. 25,11. 00,16. 50,33. 00mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)真蛋白含量的方法，其特征在于步驟2.1中的恒定溫度 是55°C，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值于7. 50，步驟2. 2中，在步驟2. 1中的酪蛋白溶液中加入 濃度為171. 99u/ml的胰蛋白酶1ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)真蛋白含量的方法，包括以下步驟步驟一、分別配制濃度為H1、H2、H3、H4、H5的酪蛋白溶液；步驟二、求解濃度為H1的酪蛋白溶液的水解初速度步驟三、實(shí)驗(yàn)方法如步驟二，分別可以得到H2、H3、H4、H5的酪蛋白溶液水解初速度V2，V3，V4，V5。步驟四、根據(jù)酪蛋白濃度對(duì)應(yīng)的酶解初速度，建立兩者之間的線性關(guān)系曲線。步驟五、檢測(cè)牛奶樣品時(shí)，只需檢測(cè)牛奶中蛋白質(zhì)的酶解初速度，代入步驟四所求的線性方程中，便可得到牛奶中的蛋白質(zhì)含量。本發(fā)明方法檢測(cè)牛奶樣品時(shí)，只需檢測(cè)酶解初速度便可得到其中的真蛋白含量。
文檔編號(hào)C12Q1/37GK101886112SQ20101022095
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者席怡, 徐斐, 陳亞鋒 申請(qǐng)人:上海理工大學(xué)