專利名稱：產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的鏈格孢菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鏈格孢菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，尤其涉及一種可以產(chǎn)生α -L-鼠李 糖苷酶(EC 3.2. 1.40)的鏈格孢菌株及其培養(yǎng)方法與在柚苷水解中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
柚苷是柑橘類果汁加工過(guò)程中的主要苦味物質(zhì)，目前柚苷的脫除主要分為物理法 和酶法。物理法存在可控性差、影響產(chǎn)品質(zhì)量和風(fēng)味、工藝較復(fù)雜等缺點(diǎn)，而酶法由于操作 簡(jiǎn)單、易于控制、能夠較好的保留產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到重視。α -L-鼠李糖 苷酶能夠?qū)㈣周账?，水解產(chǎn)物的苦味大大小于柚苷，從而改進(jìn)果汁口感。現(xiàn)報(bào)道的α -L-鼠李糖苷酶大多來(lái)源于細(xì)菌，其穩(wěn)定性較差；真菌來(lái)源的酶性質(zhì) 穩(wěn)定，但種類有限。因此尋找新的能夠產(chǎn)生具有較強(qiáng)α-L-鼠李糖苷酶活性且酶性質(zhì)穩(wěn)定 的真菌菌種，對(duì)柑橘類果汁的酶法脫苦有著重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有微生物酶法工業(yè)應(yīng)用中產(chǎn)α -L-鼠李糖苷酶的真菌微生物種類有限，特 別是產(chǎn)生具有較強(qiáng)水解活性且穩(wěn)定性好的α-L-鼠李糖苷酶的微生物種類有限的不足，本 發(fā)明的目的是提供一種新分離的可產(chǎn)生較強(qiáng)水解活性且穩(wěn)定性好的α-L-鼠李糖苷酶的 鏈格孢菌株，此菌產(chǎn)生的α-L-鼠李糖苷酶可以高效催化柚苷的水解。發(fā)明概述本發(fā)明的要點(diǎn)是提供一種產(chǎn)生α -L-鼠李糖苷酶的鏈格孢Ll (Alternaria sp. Li)菌株以及其特征、培養(yǎng)方法及應(yīng)用于水解柚苷的方法。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有 鏈格孢菌應(yīng)用于水解柚苷的報(bào)道。發(fā)明詳述產(chǎn)α -L-鼠李糖苷酶的鏈格孢Ll (Alternaria sp. Li)菌株，該菌株2010年3月 25日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3688。鏈格孢Ll菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，2 3天菌落鋪展，產(chǎn)生大量菌絲體， 菌落初白色，3天左右時(shí)變?yōu)榍嗪稚?，并伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)漸變?yōu)楹稚涟岛稚?，基?nèi)菌 絲產(chǎn)生水溶性褐色色素。分生孢子梗生于氣生菌絲的側(cè)面和頂端，分隔處有隘縮，分生孢子 單生或成鏈生于分生孢子梗上，為倒梨形或卵形，具有橫、縱、斜隔膜，成磚格狀分隔，表面 具有疣突，呈褐色或深褐色。該菌株的18S rDNA在GenBank的登錄號(hào)為FJ946316，與一株 鏈格孢菌的18S rDNA序列(GenBankNo. EU827605. 1)同源性為99%。產(chǎn)α -L-鼠李糖苷酶的鏈格孢Ll (Alternaria sp. Li)菌株的培養(yǎng)方法，步驟如 下取菌種保藏編號(hào)為CGMCC No. 3688的鏈格孢Ll菌株接種至新鮮斜面培養(yǎng)基活化 48 60小時(shí)，活化溫度為28 30°C，取活化后的鏈格孢Ll菌株接種于種子培養(yǎng)液，培養(yǎng) 48小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28 30°C，即得；
所述斜面培養(yǎng)基成分如下馬鈴薯200-220g/L，葡萄糖20-25g/L，瓊脂15_20g/L， PH自然；優(yōu)選斜面培養(yǎng)基成分為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂16g/L ；所述種子培養(yǎng)液成分如下玉米漿30-35mL/L，酵母粉5_7g/L，磷酸氫二鉀5_7g/ L，pH自然；優(yōu)選種子培養(yǎng)液成分為玉米漿30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氫二鉀5g/L。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)溫度為28°C。產(chǎn)α -L-鼠李糖苷酶的鏈格孢Ll菌株水解柚苷方面的應(yīng)用。所述產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的鏈格孢Ll菌株水解柚苷方面的應(yīng)用，步驟如下(1)取經(jīng)種子培養(yǎng)液培養(yǎng)后的鏈格孢Ll菌株，按體積百分比3%的接種量轉(zhuǎn)接于 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液中搖床培養(yǎng)42 48小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28 30°C，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分；(2)將步驟(1)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液培養(yǎng)后的鏈格孢Ll抽濾，得菌絲體；(3)將步驟(2)制得的菌絲體用液氮研磨，得破碎菌絲體；(4)將步驟(3)制得的破碎菌絲體按質(zhì)量體積比1 5懸浮于pH6. OUOmM的醋酸 緩沖液，充分混勻，得粗酶液；(5)將步驟(4)制得的粗酶液與50mM-100mM的柚苷溶液按體積比1 2混合，水 解柚苷；水解溫度為40 50°C，水解時(shí)間為10 240分鐘；步驟⑷所述質(zhì)量體積比單位為g/mL。所述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液成分如下玉米漿30_35mL/L，酵母粉5_7g/L，磷酸氫二鉀 5_7g/L，柚苷5-7g/L，pH自然；優(yōu)選產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液成分為玉米漿30mL/L，酵母粉5g/L， 磷酸氫二鉀5g/L，柚苷5g/L。優(yōu)選的，所述步驟(1)中的搖床培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。優(yōu)選的，所述步驟(5)中柚苷溶液的溶劑為pH6. OUOmM的醋酸緩沖液；優(yōu)選的，柚 苷溶液濃度為100mM。優(yōu)選的，所述步驟(5)中水解時(shí)間為40分鐘。上述斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)液和產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液pH無(wú)須調(diào)整，使用前都在115°C 高溫下滅菌30分鐘。本發(fā)明菌株鏈格孢(Alternaria sp. ) Ll菌株培養(yǎng)簡(jiǎn)單，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，水解效率 高，酶活穩(wěn)定，具有很強(qiáng)的工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，可應(yīng)用于食品工業(yè)中柑橘類 果汁的酶法脫苦等領(lǐng)域。


圖1是鏈格孢(Alternaria sp.)Ll菌株產(chǎn)生的α -L-鼠李糖苷酶水解柚苷后樣 品的高壓液相色譜圖；Α、B、C分別為反應(yīng)O分鐘、10分鐘、30分鐘時(shí)的樣品曲線，峰1為柚苷。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不僅限于此。實(shí)施例中的鏈格孢Ll (Alternaria sp. Li)菌株，該菌株2010年3月25日保藏在 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3688。實(shí)施例中培養(yǎng)基組分均為市售產(chǎn)品。
實(shí)施例1 (1)形態(tài)學(xué)特征觀察用接種環(huán)挑取鏈格孢Ll CGMCC No. 3688孢子接到馬鈴薯培養(yǎng)基平板上，置28°C 培養(yǎng)。在馬鈴薯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，2 3天菌落鋪展，產(chǎn)生大量菌絲體，菌落初白色，3天 左右時(shí)變?yōu)榍嗪稚?，并伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)漸變?yōu)楹稚涟岛稚?。基?nèi)菌絲體產(chǎn)生水溶性 褐色色素?cái)U(kuò)散到培養(yǎng)基中，反面呈青褐色至褐色。分生孢子梗生于氣生菌絲的側(cè)面和頂端， 分隔處有隘縮，分生孢子單生或成鏈生于分生孢子梗上，為倒梨型或卵形，具有橫、縱、斜隔 膜，成磚格狀分隔，表面具有疣突，呈褐色或深褐色。上述馬鈴薯培養(yǎng)基成分是馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH自然。馬 鈴薯去皮，切成塊煮沸30分鐘，然后用紗布過(guò)濾取汁，再加糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1L， 115°C滅菌30分鐘。(2) 18S rDNA序列測(cè)定和分析用基因組提取試劑盒(BioFlux)提取鏈格孢(Alternaria. sp)Ll基因組DNA，以 基因組DNA為模板，采用真菌18S rDNA通用上游引物NSl (5’ -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’ ) 和下游引物 FS2(5，-TAGGNATTCCTCGTTGAAGA-3，)PCR 擴(kuò)增 18S rDNA 序列。PCR 反應(yīng)體系 50μ L =IOXPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP 混合物 4 μ L，20 μ mol/L 引物各 2 μ L，模板 2 μ L，LATaq酶1 μ L，無(wú)菌水34 μ L。PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，51°C 退火30秒，72°C延伸1. 5分鐘，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘。所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工 生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，大小為1524堿基，將該序列于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST核苷 酸比對(duì)分析,與一株鏈格孢菌的18S rDNA序列(GenBank No. EU827605. 1)同源性為99%。鏈格孢L1CGMCC No. 368818S rDNA 的 GenBank 登錄號(hào)為 FJ946316。實(shí)施例2 一種鏈格孢Ll菌株的培養(yǎng)方法，步驟如下取鏈格孢Ll菌株(菌種保藏號(hào)CGMCC No. 3688)接種至新鮮斜面培養(yǎng)基活化48 小時(shí)，溫度為28°C，取活化后的鏈格孢Ll菌株接種于15mL種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時(shí)。該斜面培養(yǎng)基成分為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂16g/L，pH自然。115°C 滅菌30分鐘。該種子培養(yǎng)液成分為玉米漿30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氫二鉀5g/L，pH自然。 115°C滅菌30分鐘。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，該菌株具有非常高的穩(wěn)定性，數(shù)代后產(chǎn)酶能力沒(méi)有降低。實(shí)施例3 利用鏈格孢Ll菌株產(chǎn)生的α _L_鼠李糖苷酶水解柚苷，具體步驟如下采用實(shí)施例2所述方法培養(yǎng)鏈格孢Ll菌株(菌種保藏號(hào)CGMCC No. 3688)，后轉(zhuǎn)接 于500mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)42小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28°C，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分，鏈 格孢Ll菌株在上述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)產(chǎn)酶良好，其中，產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液成分為玉米漿30mL/L， 酵母粉5g/L，磷酸氫二鉀5g/L，柚苷5g/L，pH自然。將經(jīng)過(guò)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液培養(yǎng)后的鏈格 孢Ll菌株抽濾獲得菌絲體，將菌絲體用液氮進(jìn)行研磨，研磨后的破碎菌絲體按質(zhì)量體積比 1 5 (g/mL)的比例懸浮于pH6. OUOmM的醋酸緩沖液，充分混勻，得粗酶液。取50 μ L上述粗酶液，與100 μ L、pH6. 0醋酸緩沖液配制的IOOmM的柚苷溶液混
5合，50°C水浴搖床反應(yīng)，不同時(shí)間取樣，進(jìn)行高壓液相色譜分析。對(duì)上述水解產(chǎn)物進(jìn)行分析，反應(yīng)進(jìn)行10分鐘，約有60%的柚苷發(fā)生水解；反應(yīng)進(jìn) 行30分鐘，約有98%的柚苷水解(如圖1所示)；反應(yīng)進(jìn)行40分鐘后，柚苷被完全水解。上述HPLC分析所用設(shè)備及條件=Agilent 1200LC高壓液相色譜儀；Agilent G1314B 紫外檢測(cè)器；ZORBAX Eclipse XDB-C18 ft (4. 6X 150mm)；流動(dòng)相為 23% 乙腈，流速 為lmL/min，柱溫25°C。樣品煮沸離心，加入乙腈稀釋到一定濃度，用0. 2 μ m濾膜過(guò)濾后進(jìn) 樣分析。
權(quán)利要求
產(chǎn)α L 鼠李糖苷酶的鏈格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株，該菌株2010年3月25日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.3688。
2.權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)生α-L-鼠李糖苷酶的鏈格孢Ll (Alternaria sp. Li)菌 株的培養(yǎng)方法，步驟如下取菌種保藏編號(hào)為CGMCC No. 3688的鏈格孢Ll菌株接種至新鮮斜面培養(yǎng)基活化48 60小時(shí)，活化溫度為28 30°C，取活化后的鏈格孢Ll菌株接種于種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小 時(shí)，培養(yǎng)溫度為28 30°C，即得；所述斜面培養(yǎng)基成分如下馬鈴薯200-220g/L，葡萄糖20-25g/L，瓊脂15-20g/L，pH自 然；所述種子培養(yǎng)液成分如下玉米漿30-35mL/L，酵母粉5_7g/L，磷酸氫二鉀5_7g/L，pH 自然。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)基成分為馬鈴薯200g/ L，葡萄糖20g/L，瓊脂16g/L ；種子培養(yǎng)液成分為玉米漿30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氫二鉀 5g/L。
4.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)溫度為28°C。
5.產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的鏈格孢Ll菌株水解柚苷方面的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下(1)取經(jīng)種子培養(yǎng)液培養(yǎng)后的鏈格孢Ll菌株，按體積百分比3%的接種量轉(zhuǎn)接于產(chǎn)酶 發(fā)酵培養(yǎng)液中搖床培養(yǎng)42 48小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28 30°C，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分；(2)將步驟(1)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液培養(yǎng)后的鏈格孢Ll抽濾，得菌絲體；(3)將步驟(2)制得的菌絲體用液氮進(jìn)行研磨，得破碎菌絲體；(4)將步驟(3)制得的破碎菌絲體按質(zhì)量體積比1 5懸浮于pH6. OUOmM的醋酸緩沖 液，充分混勻，得粗酶液；(5)將步驟(4)制得的粗酶液與50mM-100mM的柚苷溶液按體積比1 2混合，水解柚 苷；水解溫度為40 50°C，水解時(shí)間為10 240分鐘；步驟(4)所述質(zhì)量體積比單位為g/mL ；產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液成分如下玉米漿30-35mL/L，酵母粉5_7g/L，磷酸氫二鉀5_7g/L，柚 苷 5-7g/L，pH 自然。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液成分為玉米漿30mL/ L,酵母粉5g/L，磷酸氫二鉀5g/L，柚苷5g/L。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中的搖床培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
9.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(5)中柚苷溶液的溶劑為pH6.0、 IOmM的醋酸緩沖液；柚苷溶液濃度為100mM。
10.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(5)中水解時(shí)間為40分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及鏈格孢菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，尤其涉及一種可以產(chǎn)生α-L-鼠李糖苷酶的鏈格孢菌株及其培養(yǎng)方法與在柚苷水解中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種產(chǎn)生α-L-鼠李糖苷酶的鏈格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株、特征、培養(yǎng)方法及其應(yīng)用于水解柚苷的方法。該菌株已于2010年3月25日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.3688。菌株鏈格孢(Alternaria sp.)L1菌株培養(yǎng)簡(jiǎn)單，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，水解效率高，酶活穩(wěn)定，具有很強(qiáng)的工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，可應(yīng)用于食品工業(yè)中柑橘類果汁的酶法脫苦等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101914451SQ20101022078
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者劉倩, 盧麗麗, 肖敏 申請(qǐng)人:山東大學(xué)