專利名稱：針對病毒性肝炎病原體的多重pcr檢測試劑盒及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物科學領域，具體涉及一種針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測 試劑盒及其制備和應用。
背景技術：
病毒性肝炎嚴重威脅人類健康，亦是我國的常見病和多發(fā)病。慢性肝炎可進展為 肝纖維化，并發(fā)展成為肝硬化、終末期肝病等。在各臨床類型肝炎中，單純感染率為61.4%， 二重感染率為32. 4%，三重感染率為6. 5%。粗略估算，我國每年用于肝炎對癥治療的直接 醫(yī)療費用超過1000億元人民幣。除甲、乙、丙、戊型肝炎病毒所引發(fā)的肝炎外，目前業(yè)已證 實，人巨細胞病毒(HCMV)、單純皰疹病毒(HHV)等均可引起病毒性肝炎。引起病毒性肝炎的 病毒絕大多數都可經由輸血傳播。輸血醫(yī)學是現代醫(yī)學中不可或缺的重要支撐手段，隨著 臨床醫(yī)療技術的發(fā)展和社會老齡化程度的提高，其重要性進一步突顯。同時，潛在的病毒一直是威脅血液安全的重要因素。由于血液制品的使用數量大， 應用范圍廣，因此其社會影響也是巨大的。除正常獻血者中潛伏的病毒感染外，還有數目龐 大的肝炎患者，而在這些臨床型肝炎患者中，還有10 20%的急慢性肝炎病原不明。因此 加強病原學診斷技術不僅可以提高血液制品的安全，還將為臨床上病毒性肝炎的正確診斷 提供可靠依據，具有較大的發(fā)展前景。目前，針對病原體的檢測主要集中在兩方面，一是通過免疫方法如，ELISA等檢測 病原體抗原/抗體，二是通過分子生物學手段如PCR檢測病原體核酸。這些檢測方法都存 在共同的缺點，就是檢測花費時間長，一次實驗僅能得到一種結果。而對于病毒性肝炎病原 體除HBV、HCV有常規(guī)的檢測方法外，很多病原體都缺乏有效地檢測手段。通常的PCR技術僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用于單一 致病因子等的鑒定。而與之對應的，多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復合 PCR,該技術是在同一 PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR 反應，其反應原理、反應試劑和操作過程與一般PCR相同。多重PCR技術可用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定、某些遺傳病及癌基因的 分型鑒定等。多重PCR技術的特點包括高效性，在同一 PCR反應管內同時檢出多種病原微 生物，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一份標本就可檢測多種病原體；系統 性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測；經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢 出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。由于 該技術具有上述優(yōu)點，因此逐漸得到本領域技術人員的重視。然而，在多重PCR技術的實際應用過程中，由于在同一反應管內添加多條引物， 因此如何提高引物的特異性避免非特異的擴增、如何減少多條引物之間形成的二聚體、如 何調控PCR反應試劑的濃度及其反應條件，使之對每個目的片段都能達到有效的擴增等問 題，都限制了多重PCR技術的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種針對病毒性肝炎病原體的多重 PCR檢測試劑盒及其制備和應用。本發(fā)明采用如下技術方案解決上述技術問題一種針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括如下七種 引物對中的一種或兩種至七種的組合，所述七種引物對分別特異對應于甲型肝炎病毒、乙 型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型和單純皰 疹病毒6型。較佳的，所述多重PCR檢測試劑盒中還含有對應上述各種組合的標準病毒陽性對 照品，所述陽性對照品為將上述病毒的PCR擴增片段與pGEM-T Easy載體相連構成含相應 病毒片段的質粒；具體的，所述陽性對照品為分別對應于對應于甲型肝炎病毒、乙型肝炎病 毒、丙型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型和單純皰疹病毒6 型的標準病毒陽性對照品，且所述標準病毒陽性對照品為將使用對應于各種病毒的引物對 進行PCR擴增的產物與pGEM-T Easy載體相連構成的質粒。優(yōu)選的，所述多重PCR檢測試劑盒中還含有dNTP、Mg2+(l. 5_5mM)、RT-PCR反應液、 逆轉錄酶和DNA聚合酶一步法酶混合液、RNase抑制劑、DEPC -H2O和瓊脂糖；上述物質也可 以通過市售途徑獲得。所述七種引物對可以單獨包裝，也可以以兩種至七種組合混合后裝配于試劑盒 中；當混合裝配引物對時，混合引物對按照甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人 巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型和單純皰疹病毒6型這七種引物對的摩 爾數為 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 的比例混合。較佳的，所述引物對在反應體系中的終濃度依次為200nmol/L、200nmol/L、 200nmol/L、200nmol/L、200nmol/L、200nmol/L 和 200nmol/L。優(yōu)選的，本發(fā)明的試劑盒中，所述七對特異性引物的序列分別如下表中所示 本發(fā)明第二方面提供了一種用于多種病毒性肝炎病原體的鑒定檢測的方法，該方 法包括1)采集樣本病毒核酸；2)形成PCR反應體系，該PCR反應體系包括多重引物、dNTP、Mg2+、逆轉錄-PCR反 應液、逆轉錄酶和DNA聚合酶一步法酶混合液、RNase抑制劑和DEPC · H2O ；3)將步驟1)中制得的病毒核酸、陽性對照品分別加入到步驟2)中制得的混合液 中，制得PCR反應液；4)使用本發(fā)明的PCR反應液，進行PCR擴增反應得到擴增后的核酸片段；5)將步驟4)中擴增后得到的核酸片段進行電泳鑒定，即可判斷樣本中所含有的 肝炎病毒種類。較佳的，步驟2)中，所述多重引物的濃度為100 500nmol/L、所述dNTP的濃度為 150-400mmol/L、Mg2+ 的濃度為 1. 5_5mmol/L、RNase 抑制劑為 1-5U。較佳的，步驟3)中，所述病毒核酸包括DNA和RNA，且所述PCR反應液中加入的病 毒核酸為l_5ug。較佳的，步驟4)中，所述PCR擴增反應的條件為50°C 30min,95°C 15min，然后 94°C 30s, 55°C lmin，72°C 3min 交替進行 35 個循環(huán)，然后在 72°C延伸 lOmin。較佳的，步驟5)中，所述電泳鑒定是使用瓊脂糖重量百分比為1 1. 5%的瓊脂糖 凝膠進行電泳鑒定。本發(fā)明中，所述作為模板的樣本病毒核酸可以由本領域技術人員根據現有提取方 法進行分離制備。優(yōu)選的分離制備方法使用QIAamp MinElute Virus Spin kit即可純化 DNA也可以純化RNA，具體操作見試劑說明書。主要包括裂解病毒，過柱分離病毒核酸，洗脫 雜質，收集核酸。本發(fā)明中，所述PCR反應體系中的dNTP、Mg2+、逆轉錄-PCR反應液、逆轉錄酶和DNA 聚合酶一步法酶混合液、RNase抑制劑和DEPC -H2O均可以由本領域技術人員通過市售途徑獲得。本發(fā)明第三方面提供了用于檢測多重病毒性肝炎病原體的特異性引物，其序列如SEQ ID NO 1-14 中所示。本發(fā)明第四方面提供了一種病毒陽性對照品，所述病毒陽性對照品為將上述病毒 的PCR擴增片段與pGEM-T Easy載體相連構成含相應病毒片段的質粒。較佳的，所述病毒陽性對照品是由包括如下步驟的制備方法制得1、分離甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病 毒1型、單純皰疹病毒6型等病毒核酸；2、形成PCR反應體系，該PCR反應體系包括多重引物、dNTP、Mg2+、逆轉錄-PCR反 應液、逆轉錄酶和DNA聚合酶一步法酶混合液、RNase抑制劑和DEPC · H2O ；3、將步驟1中制得的的病毒核酸加入到步驟2制得的混合液中，制得PCR反應液；4、進行PCR擴增反應并回收PCR產物，然后進行電泳鑒定；5、pGEM_T Easy載體連接反應將步驟4中制得的PCR產物連接到pGEM_TEasy載 體中，然后經轉化、陽性克隆鑒定、酶切鑒定和抽提質粒即可制得病毒陽性對照品。較佳的，步驟4中，針對RNA病毒的PCR擴增反應的反應條件為50°C 30min, 95°C 15min，然后 94°C 30s, 55°C 30s，72°C 30 交替進行 30 個循環(huán)，然后在 72°C延伸 IOmin ； 針對DNA病毒的PCR擴增反應條件為95°C 15min，然后94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s交替 進行30個循環(huán)，然后在72°C延伸3min。較佳的，步驟5中，所述載體連接反應的步驟為在滅菌Eppendorf管中加入2μ 1 的PCR純化產物、1 μ 1的pGEM-T Easy載體、5 μ 1的2XT4DNA連接酶快速連接buffer、l μ 1 WT4DNA連接酶和1μ 1的ddH20，然后將連接反應管混勻，4°C孵育過夜。步驟5中，所述轉化、陽性克隆鑒定、酶切鑒定和抽提質粒步驟可由本領域技術人 員根據現有技術進行確定。較佳的，所述轉化的具體步驟為(1)取1只100 μ 1感受態(tài)細胞懸液(如是冷凍保存液，則需在冰上化凍)，加入 10 μ 1連接反應液；(2)以上樣品搖勻后，冰浴30min，每隔3分鐘輕彈混勻；(3) 42°C水浴放置90秒，快速將管轉移到冰浴中2min ；(4)向上述管中加入0. SmlLB液體培養(yǎng)基，使總體積達到0. 9ml，搖勻后于37°C， 180 X g振蕩培養(yǎng)90min，使受體菌恢復正常生長狀態(tài)，表達抗生素基因產物；(5)將細菌培養(yǎng)液4000 X g，離心2min，棄800 μ 1上清，其余打勻后取50 μ 1涂 LB (Amplr 平板)；(6)待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)板于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。較佳的，所述陽性克隆鑒定的具體步驟為①滅菌的牙簽挑取轉化平板上的大腸桿菌單菌落，接種于3mlLB液體培養(yǎng)基中 (含氨芐青霉素 100 μ g/ml)，37°C，200rpm/min 過夜；②采用質粒抽提試劑盒，提取質粒并電泳鑒定。較佳的，所述酶切鑒定的具體步驟為I.酶切反應按順序在滅菌的0. 5ml Eppendorf管中加入如下溶液形成酶切反應體系 II.輕彈幾次使之混合均勻，在離心機上瞬時離心，用膜封住離心管口 ；III. 37°C水浴過夜；IV.取上述酶切反應物溶液10 μ 1，瓊脂糖凝膠(1. 0% )電泳，觀察酶切反應情 況；V.選擇出一個酶切陽性樣品，劃板培養(yǎng)，并在滅菌甘油管中保種；VI.將初步鑒定好的細菌進行測序鑒定。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果在本發(fā)明中，利用病毒特點和核酸的性質?；谶@些特點和性質檢測血液等制品 中病毒性肝炎的病毒的存在情況。與其它病毒檢測方法相比，本發(fā)明有幾個明顯的優(yōu)點和 有益效果。1.具有高效性、系統性和經濟簡便性；2.多種病原體在同一反應管內同時檢出， 可大大節(jié)省時間和試劑，節(jié)約經費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。


圖1陽性對照品的檢測結果電泳圖。圖2乙型肝炎病毒標本的檢測結果電泳圖。圖3人巨細胞病毒標本的檢測結果電泳圖。圖4單純皰疹病毒1型標本的檢測結果電泳圖。
具體實施例方式下面結合實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制 本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī) 條件如 Sambrook 等人，分子克隆試驗手冊(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。本發(fā)明提供了一種針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測試劑盒，該試劑盒包 括七種引物對中的一種或兩種至七種的組合，該七種引物對分別特異對應于甲型肝炎病 毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型和 單純皰疹病毒6型。上述引物的使用方式為單獨組合使用或者多種引物形成混合物以后使用。
除此以外，本發(fā)明的試劑盒還可以包括反應液、聚合酶，以及標準病毒陽性對照 品。該標準病毒陽性對照品為將上述病毒核酸的PCR擴增片段與pGEM-T Easy載體相連構 成含相應病毒核酸片段的質粒。該試劑盒中，所述“多種引物形成混合物”的含義，是指不同的引物按照質量比 (摩爾比)混合形成的混合引物；所述“單獨組合使用”的含義，是指不同的引物對分別獨立 包裝，使用時針對性地選擇并混合，也包括將七種不同引物對中的兩種或多種組合先行混 合后形成混合引物后再選擇使用。實施例1針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測試劑盒的制備1、病毒陽性對照品的制備1)分離甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病 毒1型、單純皰疹病毒6型病毒的病毒核酸；2)形成PCR反應體系，該PCR反應體系包括多重引物、dNTP、Mg2+、逆轉錄-PCR反 應液、逆轉錄酶和DNA聚合酶一步法酶混合液、RNase抑制劑和DEPC · H2O ；其中，所述多重 引物序列以及產物大小參見表1中所示；表1七對特異性引物的序列及擴增產物大小 3)將步驟1)中制得的的病毒核酸加入到步驟2)中制得的混合液中，制得PCR反 應液；4)進行PCR擴增反應并回收PCR產物，然后進行電泳鑒定；針對RNA病毒的PCR 擴增反應的反應條件為50°C 30min,95°C 15min，然后94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30交替進 行30個循環(huán)，然后在72°C延伸IOmin ；針對DNA病毒的PCR擴增反應條件為95°C 15min, 然后94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s交替進行30個循環(huán)，然后在72°C延伸3min ；5)pGEM-T Easy載體連接反應將步驟4)中制得的PCR產物連接到pGEM-TEasy 載體中，然后經轉化、陽性克隆鑒定、酶切鑒定和抽提質粒即可制得病毒陽性對照品。其中， 載體連接反應的步驟為在滅菌Eppendorf管中加入2 μ 1的PCR純化產物、1 μ 1的pGEM_T Easy載體、5 μ 1的2 X T4DNA連接酶快速連接buffer、1 μ 1的T4DNA連接酶和1 μ 1 WddH2O, 然后將連接反應管混勻，4°C孵育過夜。其中，PCR產物片段與pGEM-T Easy載體的連接步驟為使用DNA連接試劑盒，并參 考試劑盒中的使用說明進行。其中，所述轉化的具體步驟為(1)取100 μ 1感受態(tài)細胞懸液，加入10 μ 1連接反應液；(2)以上樣品搖勻后，冰浴30min，每隔3分鐘輕彈混勻；(3) 42°C水浴放置90秒，快速將管轉移到冰浴中2min ；(4)向上述管中加入0. SmlLB液體培養(yǎng)基，使總體積達到0. 9ml，搖勻后于37°C， 180 X g振蕩培養(yǎng)90min，使受體菌恢復正常生長狀態(tài)，表達抗生素基因產物；(5)將細菌培養(yǎng)液4000 X g，離心2min，棄800 μ 1上清，其余打勻后取50 μ 1涂 LB (Amplr 平板)；(6)待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)板于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。其中，所述陽性克隆鑒定的具體步驟為①滅菌的牙簽挑取轉化平板上的大腸桿菌單菌落，接種于3mlLB液體培養(yǎng)基中 (含氨芐青霉素 100 μ g/ml)，37°C，200rpm/min 過夜；②采用質粒抽提試劑盒，提取質粒并電泳鑒定。其中，所述酶切鑒定的具體步驟為I.酶切反應按順序在滅菌的0. 5ml Eppendorf管中加入如下溶液形成酶切反應體系 II.輕彈幾次使之混合均勻，在離心機上瞬時離心，用膜封住離心管口 ；III. 37°C水浴過夜；IV.取上述酶切反應物溶液10 μ 1，瓊脂糖凝膠(1. 0% )電泳，觀察酶切反應情 況；V.選擇出一個酶切陽性樣品，劃板培養(yǎng)，并在滅菌甘油管中保種；VI.將初步鑒定好的細菌進行測序鑒定。本實施例中，所述作為模板的樣本病毒核酸可以由本領域技術人員根據現有提取 方法進行分離制備。分離制備方法使用QIAamp MinElute Virus Spin kit即可純化DNA也 可以純化RNA，具體操作見試劑說明書。主要包括裂解病毒，過柱分離病毒核酸，洗脫雜質， 收集核酸。實施例2、多重PCR檢測體系的配制和組裝1、引物的合成引物由美國應用生物系統公司ABI合成，七種引物對(SEQ ID NO 1 14)分別特 異對應于甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、 單純皰疹病毒2型和單純皰疹病毒6型病毒，具體如表1中所示。將對應每一種類型病毒 的引物對混合包裝，混合包裝時，混合引物對按照甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎 病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型和單純皰疹病毒6型這七種引 物對的摩爾數為1 1 1 1 1 1 1的比例混合。同時，將實施例中制得的對應 各種組合的標準病毒陽性對照品分別單獨包裝。將dNTP、Mg2+(l. 5-5mM)、RT-PCR反應液、逆轉錄酶和DNA聚合酶一步法酶混合液、 RNase抑制劑、DEPC · H2O和瓊脂糖，以及實施例1中制備的標準病毒陽性對照品，還有合成 的引物對分裝后組成多重PCR檢測體系試劑盒。實施例3、陽性對照品的檢測應用實施例2中得到的多重PCR檢測試劑盒，對實施例1中制得的陽性對照品中 的甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒1、2型、單純 皰疹病毒6型進行檢測。檢測方法如下形成PCR反應體系，該PCR反應體系包括多重引物、dNTP、Mg2+、逆轉錄-PCR反應 液、逆轉錄酶和DNA聚合酶一步法酶混合液、RNase抑制劑和DEPC · H2O ；將實施例1中制 得的陽性對照品分別加入到上述混合液中，制得PCR反應液；使用該PCR反應液，分別進行 PCR擴增反應得到擴增后的核酸片段；將擴增后得到的核酸片段使用瓊脂糖重量百分比為 1 1. 5%的瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定，即可判斷樣本中所含有的肝炎病毒種類。PCR反應液中，多重引物的終濃度為200nmol/L、dNTP的濃度為150mmol/L、Mg2+的 濃度為1. 5mmol/L、RNase抑制劑為3U。PCR擴增反應的條件為50°C 30min,95°C 15min，然 后94°C 30s, 55°C lmin，72°C 3min交替進行35個循環(huán)，然后在72°C延伸lOmin。其中，PCR反應體系中的dNTP、Mg2+、逆轉錄-PCR反應液、逆轉錄酶和DNA聚合酶 一步法酶混合液、RNase抑制劑和DEPC · H2O。檢測結果如圖1所示。在六種病毒性肝炎的陽性對照品中，驗證多重PCR擴增體系。其中，HHV1、HHV2的引物為通用引物。瓊脂糖凝膠電泳顯示，應用多重PCR擴增體系在病毒性肝炎病原體的陽 性克隆對照品中均有陽性條帶，條帶大小與預期結果(預期結果如表1中所示)相符。以 上結果說明，該擴增體系在陽性標本品中可以得到有效擴增，條帶清晰，特異性好。實施例4、乙型肝炎病毒標本的檢測應用本發(fā)明的多重PCR檢測體系，以乙型肝炎病毒標本為例，驗證多重PCR反應體 系，反應條件同實施例3，結果如圖2所示。在乙型肝炎病毒的血清陽性標本中，應用多重 PCR擴增，檢測病毒性肝炎病原體的存在。瓊脂糖凝膠電泳顯示，引用多重PCR擴增體系在 乙型肝炎病毒標本中有陽性條帶，條帶大小與預期結果相符。以上結果說明，該擴增體系在 陽性標本品中可以得到有效擴增，條帶清晰，特異性好。實施例5、人巨細胞病毒標本的檢測應用本發(fā)明的多重PCR檢測體系，以人巨細胞病毒標本為例，驗證多重PCR反應體 系，反應條件同實施例3，結果如圖3所示。在人巨細胞病毒的陽性標本中，應用多重PCR擴增，檢測病毒性肝炎病原體的存 在。瓊脂糖凝膠電泳顯示，應用多重PCR擴增體系在人巨細胞病毒標本中有陽性條帶，條帶 大小與預期結果相符。以上結果說明，該擴增體系在陽性標本品中可以得到有效擴增，條帶 清晰，特異性好。實施例6、單純皰疹病毒1型標本的檢測應用本發(fā)明的多重PCR檢測體系，以單純皰疹病毒1型標本為例，驗證多重PCR反 應體系，反應條件同實施例3，結果如圖4所示。在單純皰疹病毒1型的陽性標本中，應用多重PCR擴增，檢測病毒性肝炎病原體的 存在。瓊脂糖凝膠電泳顯示，應用多重PCR擴增體系在單純皰疹病毒1型標本中有陽性條 帶，條帶大小與預期結果相符。以上結果說明，該擴增體系在陽性標本品中可以得到有效擴 增，條帶清晰，特異性好。
權利要求
一種針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括七種引物對中的一種或兩種至七種的組合，所述七種引物對分別特異對應于甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型和單純皰疹病毒6型。
2.如權利要求1中所述的針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測試劑盒，其特征在 于，所述多重PCR檢測試劑盒中還含有分別對應于對應于甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙 型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型和單純皰疹病毒6型的 標準病毒陽性對照品，且所述標準病毒陽性對照品為將使用對應于各種病毒的引物對進行 PCR擴增的產物與pGEM-T Easy載體相連構成的質粒。
3.如權利要求1中所述的針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測試劑盒，其特征在于， 所述多重PCR檢測試劑盒中還含有dNTP、Mg2+、RT-PCR反應液、逆轉錄酶和DNA聚合酶一步 法酶混合液、RNase抑制劑、DEPC · H2O和瓊脂糖。
4.如權利要求1中所述的針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測試劑盒，其特征在于， 所述兩種至七種引物對相互分離裝配于試劑盒中。
5.如權利要求1中所述的針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測試劑盒，其特征在于， 所述兩種至七種組合混合后裝配于試劑盒中，且混合引物對按照甲型肝炎病毒、乙型肝炎 病毒、丙型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型和單純皰疹病毒 6型這七種引物對的摩爾數為1 21 2:1 2:1 2:1 2:1 2:1 2的比例混合。
6.如權利要求1 5中任一所述的針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測試劑盒，其 特征在于，所述七對特異性引物的序列依次分別為SEQ ID NO :1 14所示。
7.一種用于多種病毒性肝炎病原體的鑒定檢測的方法，該方法包括1)采集樣本病毒核酸；2)形成PCR反應體系，該PCR反應體系包括多重引物、dNTP、Mg2+、逆轉錄-PCR反應液、 逆轉錄酶和DNA聚合酶一步法酶混合液、RNase抑制劑和DEPC · H2O ；3)將步驟1)中制得的病毒核酸、陽性對照品分別加入到步驟2)中制得的混合液中，制 得PCR反應液；4)使用步驟3)中得到的PCR反應液進行PCR擴增反應得到擴增后的核酸片段；5)將步驟4)中擴增后得到的核酸片段進行電泳鑒定，即可判斷樣本中所含有的肝炎 病毒種類。
8.如權利要求7中所述的用于多種病毒性肝炎病原體的鑒定檢測的方法，其特征在 于，步驟2)中，所述多重引物的濃度為100 500nmol/L、所述dNTP的濃度為150-400mmol/ L、Mg2+的濃度為1. 5-5匪ol/L、RNase抑制劑為1-5U。
9.權利要求7中所述的用于多種病毒性肝炎病原體的鑒定檢測的方法，其特征在于， 步驟4)中，所述PCR擴增反應的條件為50°C 30min,95°C 15min，然后94°C 30s, 55°C lmin, 72°C 3min交替進行35個循環(huán)，然后在72°C延伸IOmin。
10.用于檢測多重病毒性肝炎病原體的特異性引物對，為以下所述七種引物對中的一種1)特異于甲型肝炎病毒的引物對2其中一個序列是TTAGCATGGAGCTGTAGGA ； 另一個序列是AATGCATCCACTGGATGAGAG ；2)特異于乙型肝炎病毒的引物對其中一個序列是TCTTCAACCACCAGCACGG G ； 另一個序列是GAACCACTGAACAAATGGCA ；3)特異于丙型肝炎病毒的引物對其中一個序列是GTGATGGGAAGCTCCTACGG ； 另一個序列是GGGGTCCAGGTCACAACA ；4)特異于人巨細胞病毒的引物對其中一個序列是GCCGGATTGTGGATTTCGT ； 另一個序列是CAAACGCAAATCAGCATCCT ；5)特異于單純皰疹病毒1型的引物對其中一個序列是TAGCTGGTGTGTTCGGTGTG ； 另一個序列是CACCACCGACCTCAAGTACA ；6)特異于單純皰疹病毒2型的引物對其中一個序列是TAGCTGGTGTGTTCGGTGTG ； 另一個序列是CACCACCGACCTCAAGTACA ；7)特異于單純皰疹病毒6型的引物對其中一個序列是GTGGGGGAACCTGTGCCTGA ； 另一個序列是TTGTACTGCGTGTGGTATCT。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物科學領域，具體涉及一種針對病毒性肝炎病原體的多重PCR檢測試劑盒及其制備和應用。本發(fā)明的多重PCR檢測試劑盒包括七種引物對中的一種或兩種至七種的組合，所述七種引物對分別特異對應于甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型和單純皰疹病毒6型。本發(fā)明的多重PCR檢測試劑盒可有效用于檢測病毒性肝炎病原體，生產方法和使用操作簡單、方便，準確率高，可節(jié)省時間和試劑，節(jié)約經費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。
文檔編號C12Q1/70GK101886140SQ20101022035
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月6日 優(yōu)先權日2010年7月6日
發(fā)明者劉曉穎, 張敬敬, 王迅, 邵俊杰 申請人:上海市血液中心