專利名稱：用于表達(dá)環(huán)形肽的表達(dá)盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于表達(dá)環(huán)形肽的表達(dá)盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白內(nèi)含肽(Intein)是一種“自私”的或“寄生性”的蛋白或其編碼基因，其框 內(nèi)插入宿主蛋白，和宿主蛋白一起翻譯成由N-端外現(xiàn)肽(Extein)、內(nèi)含肽、C-端的外現(xiàn)肽 組成的前體蛋白，隨后前體蛋白在內(nèi)含肽的作用下發(fā)生自我剪接，內(nèi)含肽從前體蛋白中釋 放出來，并將剩下的外顯肽連接成成熟的功能蛋白。自從1987年首次發(fā)現(xiàn)內(nèi)含肽以來，到 2009年11月為止已經(jīng)在真核、原核、古細(xì)菌甚至病毒等幾乎所有生物中發(fā)現(xiàn)了 490多種、 100-800個(gè)氨基酸大小不等的內(nèi)含肽(劉萱，趙志虎，劉傳喧.內(nèi)含肽介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng) 及其應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志，2003，23 (2) 17-24. ；http //tools, neb. com/inbase/ list, php)ο普通內(nèi)含肽由具有自我剪接活性的N-端剪接域、C-端剪接域以及中間的歸巢內(nèi) 切酶(Homing endonuclease)區(qū)域三部分構(gòu)成，歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域?qū)τ趦?nèi)含肽介導(dǎo)的 蛋白剪接并不是必須的，可以剔除從而得到微小內(nèi)含肽。有時(shí)包含內(nèi)含肽的前體蛋白由兩 個(gè)不同基因組成，這種內(nèi)含肽又叫做分裂型(Split)內(nèi)含肽。來源于藍(lán)細(xì)菌Synechocystis sp. PCC6803的DNA聚合酶III的α亞單位DnaE就是一個(gè)分裂型內(nèi)含肽，就分別由dnaE_n、 dnaE-c兩個(gè)基因組成，其中dnaE-n編碼一個(gè)N-端的外顯肽以及一個(gè)122個(gè)氨基酸的內(nèi) 含肽，而dnaE-c則編碼一個(gè)37個(gè)氨基酸的內(nèi)含肽以及一個(gè)C-端外顯肽(Wu H，Hu Z，Liu X Q. Protein trans-splicing by a split intein encoded in asplit DnaE gene of Synechocystis sp.PCC6803[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95(16) :9226_9231.)。與線性多肽相比，環(huán)肽由于分子構(gòu)象受到一定的限制，具有半衰期較長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)相對(duì) 復(fù)雜、生理活性多樣和特異性高等特點(diǎn)，能夠作為先導(dǎo)化合物用于新藥開發(fā)。目前，一些生 理活性環(huán)肽，如胰島素、催產(chǎn)素、抗體、真菌毒素，已被成功合成并廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)、醫(yī)藥 領(lǐng)域。目前，從分裂型內(nèi)含肽介導(dǎo)的環(huán)肽文庫(kù)中，已經(jīng)成功篩選得到了可以抑制DNA腺嘌 呤甲基轉(zhuǎn)移酶、ClpXP蛋白酶、HIV出芽以及α -synuclein蛋白聚集從而降低其毒性等的 多種小分子環(huán)月太(Kritzer J A, Hamamichi S, McCaffery J M, etal. Rapid selection of cyclic peptides that reduce α -synuclein toxicity inyeast and animal models[J]. Nat Chem Biol,2009,9 (5) :655_663. ；Naumann T A,Tavassoli A,Benkovic S J. Genetic selection of cyclic peptide Dammethyltransferase inhibitors[J]. Chembiochem, 2008,9(2) 194-197. ；TavassoliA,Lu Q，Gam J，et al. Inhibition of HIV budding by a genetically selected cyclicpeptide targeting the Gag-TSGlOl interaction[J]. ACS Chem Biol,2008，3 (12) :757_764. ；Cheng L,Naumann T A,Horswi11 A R,et al. Discovery ofantibacterial cyclic peptides that inhibit the ClpXP protease[J]. Protein Sci, 2007，16(8) :1535-1542.)，提示分裂型內(nèi)含肽介導(dǎo)的環(huán)形小分子文庫(kù)，可能是活性小分子 或者先導(dǎo)化合物的一種重要來源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于表達(dá)環(huán)形肽的表達(dá)盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的表達(dá)盒是如下(a)或(b)或(c)的DNA分子(a)序列表的序列2自5’末端第6至510位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列2所示的DNA分子；(c)將氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因插入(a)或(b)所述DNA分子的酶切位點(diǎn)得到的 DNA分子；所述限制性內(nèi)切位點(diǎn)為NdeI酶切位點(diǎn)、KpnI酶切位點(diǎn)和BamHI酶切位點(diǎn)中的兩 個(gè)；所述氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶如序列表的序列4所示。所述(C)中的DNA分子具體可為將氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因插入序列表的序列2 所示的DNA分子的NdeI酶切位點(diǎn)和BamHI酶切位點(diǎn)得到的DNA分子；所述氯霉素乙?；D(zhuǎn) 移酶基因如序列表的序列3所示。本發(fā)明還保護(hù)含有任一所述DNA分子的重組載體或重組菌。所述重組載體可為將任一所述DNA分子插入pET_28a質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重 組質(zhì)粒，具體可為將任一所述DNA分子插入pET-28a質(zhì)粒的NcoI和SalI間得到的重組質(zhì) 粒。所述重組菌可為將所述重組載體導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌。所述大腸桿菌具體 可為大腸桿菌BL21(DE3)。本發(fā)明還保護(hù)(a)或(b)所述DNA分子在表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用。所述外源蛋白具體可為氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶；所述氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶具體可如 序列表的序列4所示。所述應(yīng)用可通過用IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)工程菌表達(dá)實(shí)現(xiàn)； 所述工程菌是將pET-28a/Int-C-CAT-N轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)得到的重組菌；所述 pET-28a/Int-C-CAT-N是將(c)所述DNA分子插入pET_28a質(zhì)粒的NcoI和SalI間得到的 重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供的表達(dá)盒中，含有分裂型DnaE內(nèi)含肽，設(shè)有外源基因的插入位點(diǎn)，可 以大大提高外源基因的表達(dá)量。將本發(fā)明的表達(dá)盒插入表達(dá)載體可以得到重組質(zhì)粒，該重 組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌可以作為高通量篩選模型，進(jìn)行特定生物活性小分子環(huán) 肽的篩選等工作。本發(fā)明提供的的表達(dá)盒，可以用于蛋白環(huán)形突變體、環(huán)肽小分子文庫(kù)構(gòu)建 與表達(dá)的高效表達(dá)載體，為分裂型內(nèi)含肽DnaE的體內(nèi)外自我剪接機(jī)制的研究、小分子環(huán)肽 文庫(kù)的構(gòu)建與篩選等奠定了基礎(chǔ)。


圖1為基因設(shè)計(jì)、合成、組裝與克隆、鑒定詳細(xì)流程。圖2為初步序列和優(yōu)化后序列的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。圖3為原始序列、初步序列、優(yōu)化后序列的比較。圖4為原始序列、初始序列、優(yōu)化后序列的氨基酸密碼子使用頻率比較。圖5為PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的電泳圖；1 =PCR產(chǎn)物；2 酶切產(chǎn)物。圖6為表達(dá)盒的測(cè)序結(jié)果。
圖7為表達(dá)盒的應(yīng)用(介導(dǎo)環(huán)形分子的形成)；1 :BL21(DE3) ；2 :BL21(DE3) (pET-28a/IntCN) (IPTG-) ；3 :BL21 (DE3) (pET_28a/IntCN) (IPTG+) ；4 :BL21 (DE3) (pET-28a/IntC-CAT-N)(IPTG-) ；5 :BL21(DE3)(pET-28a/IntC-CAT_N)(IPTG+)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。實(shí)施例1、用于制備環(huán)肽的表達(dá)盒的制備制備流程見圖1。一、初步序列的設(shè)計(jì)1、從NCBI中使用GeneID :P74750檢索獲得來源于藍(lán)細(xì)菌Synechocystis sp. PCC6803的分裂型內(nèi)含肽DnaE-c、DnaE-n結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。藍(lán)細(xì)菌 Synechocystissp. PCC6803的分裂型內(nèi)含肽DnaE如序列表的序列1所示。DnaE_n如序列 表的序列1自氨基末端第776至897位氨基酸殘基所示，DnaE-c如序列表的序列1自氨基 末端第898至934位氨基酸殘基所示。2、將DnaE-c (37個(gè)氨基酸)、DnaE-n (122個(gè)氨基酸)前后顛倒、融合，得到初步的 共159個(gè)氨基酸的模板氨基酸序列及其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列(原始序列)。3、由于選擇的模板序列來源于藍(lán)細(xì)菌，其氨基酸密碼子的使用頻率與大腸桿菌 中的存在較大區(qū)別，為了避免密碼子偏性影響基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，根據(jù)DnaE 的模板氨基酸序列，選擇大腸桿菌作為表達(dá)宿主，利用Gene Design 3. O的反向翻譯模塊 Reverse Translation module進(jìn) 亍反向翻譯，得至Ij初步序列。二、初步序列的優(yōu)化1、重復(fù)序列分析重復(fù)序列的存在，對(duì)于后續(xù)基因的合成、寡核苷酸的組裝等過程將帶來不利影響。 利用隨機(jī)重復(fù)序列分析軟件Tandem Repeats Finder，對(duì)初步序列進(jìn)行重復(fù)序列的分析，發(fā) 現(xiàn)初步序列中不存在嚴(yán)重的重復(fù)序列。2、同義密碼子調(diào)整和復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)分析除了基因的密碼子、起始位點(diǎn)的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)外，包括整個(gè)編碼區(qū)在內(nèi)的全部基 因復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)，可能是影響基因表達(dá)的另一個(gè)重要因素。為了剔除初步序列中的復(fù)雜高 級(jí)結(jié)構(gòu)，利用UNAFold軟件的DNA、RNA Folding模塊，對(duì)初步序列的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)在初步序列中，存在大大小小的14個(gè)復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，可能會(huì)影響最終基因的高效表 達(dá)。為了克服上述影響，選擇大腸桿菌中的同義密碼子，利用Gene Design 3. O的密 碼子替換(Codon Juggling)模塊對(duì)初步序列進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化之前，初步序列的lOObp、 300bp附近，分別存在一個(gè)復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，而本次優(yōu)化以后，這兩處的高級(jí)結(jié)構(gòu)被分解成 兩個(gè)較小的結(jié)構(gòu)，復(fù)雜性大大降低(見圖2)。經(jīng)過優(yōu)化，一些復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)甚至被完全剔 除，最終使全序列的高級(jí)結(jié)構(gòu)從14個(gè)降低到7個(gè)。重復(fù)進(jìn)行步驟1和步驟2，最后得到477bp的優(yōu)化后序列。
原始序列、初步序列以及優(yōu)化后序列的比較見圖3。在不改變氨基酸序列的前提 下，優(yōu)化后序列與原始序列約有1/4(118處)存在差異。氨基酸密碼子使 用頻率的分析發(fā) 現(xiàn)原始序列中大腸桿菌偏性使用密碼明顯偏低，而優(yōu)化后序列中大腸桿菌偏性密碼使用 頻率得到明顯提高。優(yōu)化后序列雖然在第25個(gè)氨基酸、96個(gè)氨基酸附近偏性密碼子使用頻 率低于初步序列，但仍然明顯高于原始序列的使用頻率(見圖4)，這兩處的改變，大大降低 了局部的復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)，應(yīng)該不會(huì)影響基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)。三、表達(dá)盒DNA的獲得 1、多克隆位點(diǎn)、限制性酶切位點(diǎn)以及保護(hù)性堿基的添加利用GeneDesign 3. 0 的限制性酶切位點(diǎn)添加(Restriction site addition)、短 序列添加(short sequence addition)模塊并結(jié)合 Tandem Repeats Finder 進(jìn)行重復(fù)序 列的分析，在DnaE-c、DnaE-n兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間添加一段含有Ndel、KpnI, BamHI酶切位點(diǎn) (下劃線部分)以及三種不同框架的終止密碼(陰影部分)的短的核苷酸linker序列即 CATATGTAACTGAGTAG GTACC GGATCC, linker序列的添加可以方便外源基因或者隨機(jī)短肽文 庫(kù)在Ndel、BamHI位點(diǎn)克隆，與分裂型內(nèi)含肽實(shí)現(xiàn)框內(nèi)融合。同時(shí)在5’ _、3’ -端添加限制 性酶切位點(diǎn)Ncol、Sail, PstI、終止密碼TAATGA以及保護(hù)性堿基，得到534bp的完整序列 (含有DnaE以及合適酶切位點(diǎn)、中間linker序列)。2、表達(dá)盒DNA的獲得利用Tandem Repeats Finder對(duì)上述完整序列進(jìn)行重復(fù)序列分析、優(yōu)化直到不存 在嚴(yán)重的重復(fù)序列以后，得到優(yōu)化后的最終含有分裂型DnaE基因、合適Linker序列以及酶 切位點(diǎn)的序列，即本發(fā)明的表達(dá)盒(見序列表的序列2)。序列2所示的表達(dá)盒由531個(gè)核 苷酸組成，自5’末端第6-116位核苷酸為DnaE-c的編碼基因，第117-144位核苷酸為多克 隆位點(diǎn)Linker，第145-510位核苷酸為DnaE-n的編碼基因。四、表達(dá)盒DNA的制備以表達(dá)盒的核苷酸序列為出發(fā)點(diǎn)，利用GeneDesign 3. 0的建筑預(yù)制件設(shè)計(jì) (Building Block Design)模塊，將全長(zhǎng)531bp的表達(dá)盒劃分成44_61nt長(zhǎng)度不等、相互互 補(bǔ)的14個(gè)寡核苷酸片段，進(jìn)行寡核苷酸片段的合成。14個(gè)寡核苷酸片段見表1。表1用于組裝分裂型DnaE內(nèi)含肽的不同寡核苷酸序列 合成表1所示的14條寡核苷酸片段，等摩爾混合后作為模板，以最外圍的Seql和 Seql4為引物，通過重疊PCRJf 14條片段進(jìn)行一次性組裝，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。電泳圖見 圖5，電泳顯示，PCR產(chǎn)物約53 Ibp。分離、純化PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NcoI和SalI進(jìn)行雙酶切、回收酶切產(chǎn)物；用 限制性內(nèi)切酶NcoI和SalI雙酶切pET-28a質(zhì)粒(Novagen，產(chǎn)品目錄號(hào)69864_3)，回收載 體骨架；將酶切產(chǎn)物與載體骨架連接；將連接產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，得 到了重組質(zhì)粒pET-28a/IntCN(在pET_28a質(zhì)粒的NcoI和SalI酶切位點(diǎn)之間插入了序列 表的序列2所示的PCR產(chǎn)物)。重組質(zhì)粒pET-28a/IntCN用NcoI和SalI進(jìn)行雙酶切，酶切 產(chǎn)物的電泳圖見圖5。實(shí)施例2、表達(dá)盒的應(yīng)用一、重組菌甲的制備以pET_14b (Novagen，產(chǎn)品目錄號(hào)69674)為模板，用CAT基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因；CAT基因)。CAT ^@I^lJ 5' -ggcatatggagaaaaaaatcactggatat-3'；5， -aaggatcccgccccgccctgccactc-5，。分離、純化PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NdeI和BmaHI進(jìn)行雙酶切、回收酶切產(chǎn) 物；用限制性內(nèi)切酶NdeI和BmaHI雙酶切重組質(zhì)粒pET-28a/IntCN，回收載體骨架；將酶 切產(chǎn)物與載體骨架連接；將連接產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pET-28a/ Int-C-CAT-N(在pET-28a/IntCN的NdeI和BmaHI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列3 所示的CAT基因；DnaE-c編碼基因、DnaE-n編碼基因與中間插入的CAT基因表達(dá)可形成 IntC-CAT-N融合蛋白)。用重組質(zhì)粒pET-28a/Int-C-CAT_N轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen，產(chǎn)品目錄
7號(hào)69387-3)，得到重組菌甲。二、重組菌乙的獲得用重組質(zhì)粒pET-28a/IntCN轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌乙(對(duì)照)。三、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)量的檢測(cè)分別將初始濃度相同(均為OD = 0. 1)的大腸桿菌BL21 (DE3)、重組菌甲和重組菌 乙培養(yǎng)3小時(shí)，然后加入IPTG(使其終濃度為ImM)誘導(dǎo)表達(dá)，重組菌甲和重組菌乙均設(shè)置 不用IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，然后離心，收集菌液進(jìn)行SDS-15%聚丙烯酰胺凝膠 電泳。電泳圖見圖7。由圖7可見大腸桿菌BL21(DE3)、IPTG誘導(dǎo)的重組菌乙，未經(jīng)誘 導(dǎo)的重組菌乙中，都檢測(cè)不到預(yù)期分子量的IntC-CAT-N融合蛋白(43.8KD)和預(yù)期分子量 的CAT蛋白(25.7KD) ；IPTG誘導(dǎo)的重組菌甲，未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌甲中，都檢測(cè)到預(yù)期分子量 的IntC-CAT-N融合蛋白，IPTG誘導(dǎo)可以使融合蛋白的表達(dá)量增加；只有IPTG誘導(dǎo)的重組 菌甲中可以檢測(cè)到預(yù)期分子量的CAT蛋白(由融合蛋白中釋放)和Int-NC(融合蛋白釋放 CAT蛋白后經(jīng)自身剪接得到的翻譯后加工產(chǎn)物)。以上結(jié)果與分裂型內(nèi)含肽可以介導(dǎo)環(huán)形分子的形成等相關(guān)文獻(xiàn)相關(guān)報(bào)道 一致(Muralidharan V，Muir T M. Protein ligation :an enabling technology for thebiophysical analysis of proteins[J]. Nat Meth，2006，3(6) :429-438·； VolkmannG，Murphy P W, Rowland E E，et al. Intein—mediated cyclization of bacterialacyl carrier protein stabilizes its folded conformation but does not abolishfunction[J]· J Biol Chem，2010，285 (12) :8605_8614.)，表明本發(fā)明合成的表達(dá) 盒的確可以進(jìn)行自身翻譯后的剪接加工，導(dǎo)致環(huán)形分子CAT突變體的形成。
權(quán)利要求
如下(a)或(b)或(c)的DNA分子(a)序列表的序列2自5’末端第6至510位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列2所示的DNA分子；(c)將氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因插入(a)或(b)所述DNA分子的酶切位點(diǎn)得到的DNA分子；所述酶切位點(diǎn)為NdeI酶切位點(diǎn)、KpnI酶切位點(diǎn)和BamHI酶切位點(diǎn)中的兩個(gè)；所述氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶如序列表的序列4所示。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述(c)中的DNA分子為將氯霉素乙 酰基轉(zhuǎn)移酶基因插入序列表的序列2所示的DNA分子的NdeI酶切位點(diǎn)和BamHI酶切位點(diǎn) 得到的DNA分子；所述氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因如序列表的序列3所示。
3.含有權(quán)利要求1或2所述DNA分子的重組載體或重組菌。
4.如權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將權(quán)利要求1所述DNA 分子插入pET-28a質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將權(quán)利要求1所述DNA 分子插入pET-28a質(zhì)粒的NcoI和SalI酶切位點(diǎn)間得到的重組質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權(quán)利要求4或5所述重 組載體導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌。
7.如權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
8.權(quán)利要求1中(a)或(b)所述DNA分子在表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述外源蛋白為氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶；所述 氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶如序列表的序列4所示。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用通過用IPTG誘導(dǎo)工程菌表達(dá)實(shí) 現(xiàn)；所述工程菌是將pET-28a/Int-C-CAT-N轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)得到的重組菌；所述 pET-28a/Int-C-CAT-N是將權(quán)利要求2所述DNA分子插入pET_28a質(zhì)粒的NcoI和SalI酶 切位點(diǎn)間得到的重組質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于表達(dá)環(huán)形肽的表達(dá)盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了(a)或(b)或(c)的DNA分子(a)序列2自5’末端第6至510位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列2所示的DNA分子；(c)將氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因插入(a)或(b)所述DNA分子的酶切位點(diǎn)得到的DNA分子。本發(fā)明提供的表達(dá)盒中，含有分裂型DnaE內(nèi)含肽，設(shè)有外源基因的插入位點(diǎn)，可以大大提高外源基因的表達(dá)量。本發(fā)明提供的的表達(dá)盒，可以用于蛋白環(huán)形突變體、環(huán)肽小分子文庫(kù)構(gòu)建與表達(dá)的高效表達(dá)載體，為分裂型內(nèi)含肽DnaE的體內(nèi)外自我剪接機(jī)制的研究、小分子環(huán)肽文庫(kù)的構(gòu)建與篩選等奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101892230SQ201010219679
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月28日
發(fā)明者王洋, 趙志虎, 趙珺 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所