專利名稱：突變的源于黑曲霉113的植酸酶基因及其表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種突變的源于Aspergillus niger 113的植酸酶基因及其表達。
背景技術(shù)：
植酸酶是催化植酸(肌醇六磷酸)及植酸鹽水解成肌醇與磷酸的一類酶的總稱。 植酸酶作為一種單胃動物的飼料添加劑，它的飼喂效果已在世界范圍內(nèi)得到了確證。它可使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷的排出量減少40%，同時還可降低植酸的抗營養(yǎng)作用，因此在飼料中添加植酸酶對提高畜禽生產(chǎn)效益及降低植酸磷對環(huán)境的污染有
重要意義。自然界中產(chǎn)植酸酶的菌株有真菌、大腸桿菌、酵母等多種微生物，但不同來源的植酸酶的表達水平差異很大。近年來，通過基因工程手段在微生物反應(yīng)器中高效表達植酸酶國內(nèi)外已有很多成功的報道，例如1)來源于煙曲霉和枯草芽孢桿菌的植酸酶基因已在黑曲霉(Aspergillus niger)、漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、釀酒酵母 (Saccharomyces)中得到了成功的表達；2)來源于黑曲霉的植酸酶基因也成功地在畢赤酵母(Pichia pastoris)中獲得了高效表達。在分子水平上對目的基因進行改造，也可提高植酸酶的表達量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種突變的源于Aspergillus nigerll3的植酸酶基因及其表達。通過DNA Shuffling對植酸酶基因進行改造，使改造后的植酸酶基因具有更高的活性。本發(fā)明是對源于Aspergillus niger 113的植酸酶基因phylls進行 DNAShuffling。本發(fā)明首先采用一種高通量、高容量的DNA Shuffling技術(shù)，得到所述突變的源于 Aspergillus nigerll3的植酸酶基因，然后再采用一種高效的植酸酶活性的篩選技術(shù)對其進行高植酸酶活性轉(zhuǎn)化子的篩選。所述的突變的源于Aspergillus niger 113的植酸酶基因，含1350個堿基，編碼氨基酸450個。所述的突變的源于Aspergillus niger 113的植酸酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。所述的突變的源于Aspergillus nigerll3的植酸酶基因與野生型基因相比，在 121位將Glu氨基酸突變?yōu)閃ie。本發(fā)明利用DNA Shuffling對所述突變的源于Aspergillus niger 113的植酸酶基因PhyIls進行基因改造，在不改變氨基酸的情況獲得了在大腸桿菌(Escherichia coli)中的高效表達。與野生型的植酸酶比較，本發(fā)明的突變的源于Aspergillus niger113植酸酶基因的酶活性提高了 3. 1倍，同時k。at/Km值也提高了 0. 86倍。


圖1為本發(fā)明的突變的E121F植酸酶與野生型植酸酶3D結(jié)構(gòu)的比較。圖2為本發(fā)明的突變的E121F植酸酶與野生型植酸酶的最適溫度和最適pH值及熱穩(wěn)定性的比較，其中A為最適pH值的比較，B為最適溫度的比較，C為熱穩(wěn)定性的比較。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本發(fā)明所涉及的分子生物學(xué)實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書 [J.薩姆布魯克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學(xué)出版社。實施例1突變的源于Aspergillus niger 113的植酸酶基因的獲得1. DNA ShufflingDNA Shuffling 技術(shù)主要參考 Stemmer 等人DNA shuffling by random fragmentation and reassembly :in vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 1994(91) :10747_10751的文章，同時本申請也作了一些小的修改，具體操作如下首先用DNase I對源于Aspergillus niger 113的植酸酶基因phylls進行酶解， 然后把50-100bp的片段用10%的PAGE膠透析袋回收。隨后把回收的小片段作為模板進行無引物PCR。PCR反應(yīng)體系為=IOXPCR buffer 5. 0 μ 1 ；dNTPs (各2. 5mM) 4 μ 1 ；小片段模板 20 μ 1 ；r-Taq 0. 4 μ 1 (預(yù)變性后加入)；加無菌水定容至50 μ L。PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性10分鐘；94°C變性30s ；52°C退火30s ；72°C延伸50s ；共45個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。 然后再把PCR產(chǎn)物作為模板進行有引物PCR擴增，PCR反應(yīng)體系10XPCR buffer 5. 0 μ 1 ； dNTPs (各2. 5mM) 4 μ 1 ；無引物產(chǎn)物模板20 μ 1 ；r-Taq 0. 4 μ 1 (預(yù)變性后加入)；加無菌水定容至50 μ L0 PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性10分鐘；94°C變性30s ；52°C退火30s ；72°C延伸 90s ；共30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘，即獲得了含有突變位點的植酸酶基因，命名為E121F 突變植酸酶基因。其中，所述 PCR 擴增弓 I 物分別為(5，-aaggatccatgttggctgttccagcttctcg-3，)和 (5' -aagagctcttaagcaaagcattcagcccaa-3')。2.E121F突變植酸酶基因與載體pYPX251的連接將E121F突變植酸酶基因與載體ρΥΡΧ251分別用限制性內(nèi)切酶Bam HI和Mc I雙酶切。酶切反應(yīng)體系為:PCR產(chǎn)物或載體ρΥΡΧ251 8μ Ι,ΙΟΧΚ buf f er2 μ l，Bam HI和Sac I 酶各0. 5μ 1，加無菌水定容至40μ 1。37°C酶切10h，凝膠試劑盒回收片段和載體進行T4DNA 連接酶連接，連接體系為片斷20 μ 1，載體1 μ 1，T4DNA連接酶1 μ 1，連接酶Buffer 3μ 1,加無菌水定容至30μ 1。16°C連接過夜，電泳檢測結(jié)果顯示有一個大約41Λ的片段，用Bam HI和Me I雙酶切后跑電泳結(jié)果顯示有2. 8kb和1. 5kb兩條帶，說明連接成功。3.E121F突變植酸酶基因文庫的構(gòu)建將上述所得的連接物通過電擊轉(zhuǎn)入大腸桿菌ElectroMAX DHlOB TlPhage-Resistant E.coli。電擊常數(shù)為電壓1. 7kV，電阻200 Ω，電容25 μ F，脈沖時間 4. 3ms0把電擊轉(zhuǎn)化后的重組質(zhì)粒涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37°C生長過夜。4.高植酸酶活性轉(zhuǎn)化子的篩選次日，把上述在LB培養(yǎng)基上生長起來的轉(zhuǎn)化子用牙簽挑起放入LB液體培養(yǎng)基里面進行表達，16h后取少量上清液進行酶活性的初步測定。酶活性測定在96孔板里面進行，每一個孔里面含有100 μ 1 5福的植酸鈉，5111細胞上清液，37°C溫浴30min后，加入 100 μ 1鉬酸銨顯色劑，選取顏色迅速變黃而且顏色深的克隆子進行測序。5.高植酸酶活性的基因序列分析用弓I 物 W7 35-gtagcgtatgcgctcacgcaactgg-3' 禾口弓| 物 P35’ -gattctgaattggctgatactg-3‘對該篩選后的E121F突變植酸酶基因進行測序，結(jié)果顯示具有高植酸酶活性的突變子在121位Glu氨基酸突變?yōu)閃ie，其核苷酸序列如SEQ IN NO 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQID NO 2所示。用在線軟件Swiss-model對E121F突變的基因進行3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(參見圖1)，結(jié)果顯示E121這個氨基酸位于催化活性中心62R和 63H附近的一個α螺旋。實施例2E121F突變植酸酶基因的原核表達及酶學(xué)特性1.E121F突變植酸酶基因的原核表達將上述獲得的E121F突變的基因用引物P5(5， -gagagaccatggatgtcccattctgcatc-3，)和 P6(5， -gtctcgagtcatcgcgcgtc gctcagttcgat-3’)進行PCR擴增，以KOD Plus (Toyobo日本)為聚合酶，擴增條件依次為 94°C 30s，55°C 30s，72°C 90s，擴增30個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用Nco I和Xho I酶切后，連入相同酶切的載體pET48a(NEB公司)得到重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司)，將轉(zhuǎn)化子涂布在LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh。用凝膠-蛋白純化試劑盒 HisTrap HP (Amersham Biosciences公司)對其進行蛋白表達純化，SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果表明本發(fā)明的E121F突變植酸酶基因在大腸桿菌BL21得到高效表達。2.E121F突變植酸酶基因的酶學(xué)特性1)測定方法按照中華人民共和國國家標準《GB/T1863M-2002》進行，植酸酶活性定義是指樣品在植酸鈉濃度5. Ommol/L、溫度37°C、PH5. 5的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放出1 μ mol 無機磷，即為一個植酸酶活性單位，用U表示。用Lineweaver Burk 作圖法計算 Km 和 Vmax。最適溫度和最適pH值的測定參照熊愛生等人I so 1 at i on，char ac t er i ζ at i on， molecular cloning of the cDNA encoding a novel phytase from Aspergillus niger 113 and high expression in Pichia pastoris. BMBRreports. 2004(37) :282_291的方法，其結(jié)果參見圖2。
2)測定結(jié)果E121F突變植酸酶基因的酶活性為27. ^U/mg，其動力學(xué)參數(shù)如表1所示。表 權(quán)利要求
1.一種突變的源于Aspergillus niger 113的植酸酶基因，其特征在于，含1350個堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的源于Aspergillusniger 113的植酸酶基因，其特征在于，編碼氨基酸450個，其序列如SEQ ID NO 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的源于Aspergillusniger 113的植酸酶基因，其特征在于，在121位Glu氨基酸突變?yōu)閃ie。
4.權(quán)利要求1所述的突變的源于Aspergillusniger 113的植酸酶基因在原核表達中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種突變的源于Aspergillus niger 113的植酸酶基因及其表達。所述突變的植酸酶基因含1350個堿基，編碼氨基酸450個；所述突變的植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明的突變的源于Aspergillus niger 113的植酸酶基因在121位含有一個突變位點，將Glu氨基酸突變?yōu)镻he。與野生型的植酸酶比較，本發(fā)明的突變的源于Aspergillus niger 113植酸酶基因的酶活性提高了3.1倍，同時kcat/Km值也提高了0.86倍。
文檔編號C12N15/55GK102311963SQ20101021928
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月6日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生, 田永生, 許晶, 趙偉, 高峰 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院