專利名稱：一種口服免疫阻斷豬生長抑素作用的轉化子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程領域，尤其涉及一種口服免疫阻斷豬生長抑素作用的轉化子 及其應用。
背景技術：
我國的地方豬種與國外品種相比，具有對周圍環(huán)境的高度適應性、耐粗放管理、抗 病性強、繁殖力高、肉質好等特點。但由于我國地方豬種生長慢、飼料利用率低，隨著外來高 生產(chǎn)性能品種的大量引入，殘酷的市場競爭使我國地方豬種的數(shù)量在急劇下降，有些品種 甚至瀕?；蜈呌跍缃^，如素以腌制金華火腿而著稱的金華豬數(shù)量已大大減少。外來豬種雖 然生長快、飼料利用率高，但肉質風味差，隨著生活水平的提高，人們已越來越注重肉的品 質，目前市場對高品質瘦肉的需求量迅猛增長，這種轉變給我們提出了培育生長快、風味佳 新品種、品系的要求和挑戰(zhàn)。提高動物生長速度一直是動物生產(chǎn)研究人員所努力的目標。但目前通過傳統(tǒng)的遺 傳改良和營養(yǎng)調控手段來提高動物生產(chǎn)性能已很難再有大的進展。為了提高動物的生產(chǎn)性 能，在飼料中添加各種違禁藥物造成食物中毒的事件時有發(fā)生，因而研究一種安全、高效、 對人類無毒副作用的促動物生長方法是目前養(yǎng)殖業(yè)所面臨的迫切問題。如果把免疫學的方法應用于動物生產(chǎn)性能的調控，選擇對動物生長有抑制作用的 激素或因子與免疫增強因子融合表達或共同免疫來增強其免疫原性，作為抗原來免疫動 物，可誘發(fā)機體產(chǎn)生對抗該種激素或因子的抗體，從而抑制或減弱該激素或因子的生理功 能。該技術可望提高動物的生產(chǎn)性能，對那些生長慢的品種或品系意義尤其重大，且十分安 全無任何副作用。由于大腸桿菌、酵母菌等不能在動物腸道中定植，所以不能進行口服免疫，必須將 所表達的目的產(chǎn)物純化進行注射免疫。蛋白純化步驟大大增加了生產(chǎn)的成本和難度，使大 規(guī)模生產(chǎn)目的蛋白制劑難以實現(xiàn)。同時注射免疫程序也較繁瑣，不僅要耗費較大人力，對動 物的應激和傷害也較大。因此迫切需要研制出一種對動物生長起促進作用的安全、方便并 能進行大規(guī)模生產(chǎn)的口服制劑。乳酸菌是一類在食品中應用最廣泛的重要工業(yè)菌株，它包括乳酸乳球菌、乳酸桿 菌等十幾個屬，被公認為是安全的食品級微生物。乳酸菌本身就是一種益生菌，能調節(jié)腸道 微環(huán)境，幫助消化，抑制腸道有害微生物，防治腹瀉，促動物生長增重。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了 一種口服免疫阻斷豬生長抑素作用的轉化子及其應用，該轉化子可 以通過口服方式攝入并定植在豬腸道內，其分泌的融合蛋白能有效誘發(fā)豬體內產(chǎn)生抗豬生 長抑素的抗體，從而抑制或減弱內源生長抑素對豬生長的抑制作用。一種轉化子，包括受體菌和轉化到受體菌內部的重組載體，所述的受體菌為乳酸 乳球菌NZ9800，重組載體的原始載體為PNZ8112，重組載體的外源目的基因包括豬生長抑素基因、霍亂毒素B亞基基因以及細胞壁錨定子M6基因。生長抑素(Somatostatin，SST,GenBank 號NM_001009583)是一種 14 肽，除下丘 腦分泌外，胃腸道和胰腺等組織也能產(chǎn)生。SST不僅對生長激素有抑制作用，還能抑制胰島 素、甲狀腺素及一些促進消化吸收的胃腸激素的分泌和釋放，因而它是調節(jié)動物生長的一 個重要因子，在本發(fā)明中它作為免疫原。為了增強機體免疫應答，提高免疫效果，在抗原基因上連接霍亂毒素B亞基基因， 霍亂毒素B亞基(Cholera toxin B subunit，簡稱CTB，GenBank號U25679)為免疫增強子， 研究表明它是一種無毒性的非常有效的黏膜免疫佐劑，特別適合作為口服疫苗的免疫增強 佐劑蛋白。細胞壁錨定子M6 (GenBank號Ml 1338)可與乳酸乳球菌細胞膜上的蛋白相結合， 免疫原和免疫增強子被表達后分泌到胞外，通過細胞壁錨定子M6能夠固定在細胞壁上。原始載體pNZ8112含有強啟動子即乳鏈菌肽A(Nisin A)的啟動子NisA(GenBank 號AY303241)以及高效分泌型信號肽Usp45 (GenBank號M60178)，信號肽Usp45位于啟動 子NisA的下游，外源目的基因連接在信號肽的C端。所述的生長抑素基因、霍亂毒素B亞基基因、細胞壁錨定子M6基因、啟動子NisA 和信號肽Usp45的堿基序列如SEQ ID NO. 5 9所示。乳酸菌本身就是一種益生菌，能調節(jié)腸道微環(huán)境，幫助消化，抑制腸道有害微生 物，防治腹瀉，促動物生長增重。乳酸菌能在體內定植或短暫定植是它發(fā)揮生理功能的必要 條件。通過載體把目的基因如免疫原基因導入乳酸菌中，然后制成活菌制劑飼喂，引入動物 體內，產(chǎn)生外源目的基因的產(chǎn)物從而引起黏膜和體液免疫。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在腸道中能較長時 間定植的乳酸桿菌容易使動物對目的外源基因產(chǎn)物產(chǎn)生免疫耐受，而在腸道中短暫定植的 乳酸乳球菌不產(chǎn)生這種免疫耐受現(xiàn)象。本發(fā)明還提供上述轉化子在免疫阻斷豬生長抑素作用中的應用，通過將分泌表達 了外源目的基因產(chǎn)物的轉化子喂食給豬，乳酸乳球菌就會短暫定植在豬腸道內，從而引起 豬對外源目的基因產(chǎn)物產(chǎn)生免疫，即對乳酸菌表達的生長抑素產(chǎn)生免疫，產(chǎn)生抗生長抑素 的抗體，該抗體可減弱或抑制豬內源生長抑素對豬生長的抑制作用達到促進生長的目的。根據(jù)上述應用，本發(fā)明又提供了 一種利用上述轉化子制備的豬口服免疫制劑，它 包括培養(yǎng)基和分泌了外源目的基因產(chǎn)物的轉化子，該制劑制備和使用均十分方便。所述的培養(yǎng)基可以為能促進乳酸乳球菌生長的培養(yǎng)基，優(yōu)選為GM17培養(yǎng)基。在使 用時，上述口服免疫制劑中轉化子濃度最好為lX108cfu/mL lXlC^cfu/mL，使得腸道內 的乳酸乳球菌達到一定濃度，每次喂食量為20ml。本發(fā)明還提供了一種上述豬口服免疫制劑的制備方法，包括以下步驟將轉化子 置于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D_為0. 3 0. 5，加入乳酸菌肽繼續(xù)培養(yǎng)2 3h。所述的乳酸菌肽為表達誘導物，加入后濃度優(yōu)選為10 20ng/mL。本發(fā)明轉化子可以通過口服方式進入豬腸道，與注射免疫相比，降低直接與循環(huán) 系統(tǒng)接觸引起的毒性，增加疫苗的安全性。選用抗原基因/免疫增強因子(無毒性的霍亂 毒素B亞基)聯(lián)合免疫，增強了機體免疫應答，提高了免疫效果。


圖1為本發(fā)明乳酸乳球菌分泌蛋白Western印跡法檢測圖譜。
具體實施例方式GM17液體培養(yǎng)基胰蛋白胨2% ；酵母膏0. 5% ；Vc 0. 05% ；牛肉膏0. 5% ；乙酸鈉 0. 15% ；氯化鈉 0. 4% ;MgS04. 7H20 0. 25% ；葡萄糖 0. 5%，調至 pH 6.8。GM17 固體培養(yǎng)基 在上述培養(yǎng)基基礎上添加1. 6%的瓊脂。乳酸乳球菌NZ9800和載體pNZ8112均為商業(yè)化產(chǎn)品，來自荷蘭的NIZO food research。1、目的基因的構建及克隆表達(l)CTB-SST嵌合基因的構建上游引物(SEQID NO. 1)5，~GG |TCTAGA| ACACCTCAAAATATTACTG-3，引物結構為保護堿基(GG)-Xba I位點(框中序列)_CTB 5’端部分序列(下劃 線序列)下游引物(SEQID NO. 2)5，-TG iGGATCCl ACACGAAGTGAAAGTCTTCCAAAAGAAGTTCTTACAACCAGCGGGGCCGGGGC C ATTTGCCATACTAATTG-3 ‘引物結構保護堿基(TG)-BamH I位點(框中序列)_SST序列(下劃 線)-linker (粗斜體序列)-CTB 3’端部分序列(雙下劃線)。利用上述引物以霍亂弧菌基因組DNA(含CTB基因)為模板進行PCR擴增，PCR條 件為總反應體系為 50 ii 1，其中含 50ng 的 DNA 模板，lXPCRbuffer，1.5mM MgCl2,0. 2mM dNTP，0. 2iiM上下游引物，2. 5U Taq DNA聚合酶。PCR反應參數(shù)設置為94°C預變性1分鐘； 94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，35個循環(huán)；然后72°C后延伸5分鐘。由于下游引物自身帶有SST、連接子linker及CTB 3’端部分序列，因此經(jīng)PCR 后可直接得到CTB-SST嵌合基因。PCR產(chǎn)物用Xba I和BamH I酶切后克隆到pET28載體 (Invitrogen 公司)中。然后將含CTB-SST的pET28質粒轉化到E. coli DH5 a (Takara公司)感受態(tài)細胞 中，涂LB平板，37°C培養(yǎng)18-20h，挑取陽性斑擴大培養(yǎng)，然后抽提質粒，PCR和酶切鑒定抽提 的質粒中含有目的基因。(2) CTB-SST-M6重組表達載體的構建上游引物(SEQID NO. 3)5，-AA |GGATCC| AGAGTGTTTCCTAGGGG-3，引物結構為保護堿基(aa)-BamH I位點(框中序列)-M65’端部分序列(下劃線 序列)下游引物(SEQID NO. 4)5，-CG lAAGCTTl CTA GTTTTCTTCTTTGCGTT-3，引物結構為保護堿基(cg)-Hind III位點(框中序列)_終止子(粗斜體序
5列)-M63’端部分序列(下劃線序列)以化膿性鏈球菌基因組DNA (含M6基因)為模板，利用上述引物進行PCR(PCR條件 同上)，可得到兩端帶BamH I和Hind III酶切位點的PCR產(chǎn)物，用該兩種酶酶切PCR產(chǎn)物，重 組入已含CTB-SST的pET28載體中的CTB-SST基因下游(通過設計的BamH I位點將CTB-SST 與 M6 重組相連(Xba I)CTB-linker-SST (BamH I)禾 P (BamH I)M6_ 終止子(Hind III))。然后將含CTB-SST-M6嵌合基因的pET28質粒轉化到E. coli DH5a感受態(tài)細胞中， 涂LB平板，37°C培養(yǎng)18-20h，挑取陽性斑擴大培養(yǎng)，然后抽提質粒，PCR和酶切鑒定抽提的 質粒中含有目的基因。酶切條件為37°C酶切過夜；連接酶及條件T4DNA連接酶，16°C連接過夜。其他過 程均按常規(guī)方法進行。2、CTB-SST-M6嵌合基因在中間宿主菌中的克隆和在乳酸乳球菌中的表達(1)CTB-SST-M6嵌合基因在中間宿主菌中的克隆由于表達載體pNZ8112(NIZ0 food research (荷蘭))在乳酸乳球菌中的克隆拷 貝數(shù)很低，要想得到足夠的重組PNZ8112質粒(含CTB-SST-M6)，必須通過一個中間宿主菌 E. coli MC1061 (Invitrogen公司)來使pNZ8112質粒達到足夠的拷貝數(shù)。用氯霉素抗性篩選重組菌(10ug/ml氯霉素)pNZ8112上含氯霉素抗性基因， E. coli MC1061菌株本身不具氯霉素抗性，只有被轉化入pNZ8112質粒的E. coli MC1061才 能在含氯霉素的平板上生長。首先將目的基因(CTB-SST-M6)從pET28質粒中酶切(Xba I和Hindlll)下來，割 膠回收，重組入用相同酶切過的PNZ8112中，T4DNA連接酶16°C連接過夜，然后轉化E. coli MC1061感受態(tài)細胞，涂LB平板，37°C培養(yǎng)18_24h，挑取氯霉素平板上生長出的菌斑擴大培 養(yǎng)，然后抽提質粒，PCR和酶切鑒定抽提的質粒中含有目的基因。(2) CTB-SST-M6嵌合基因在乳酸乳球菌中的表達得到含目的基因(CTB-SST-M6)的重組E. coli MC1061后，將其擴大培養(yǎng)，使其中 的重組PNZ8112質粒得到足夠的拷貝數(shù)(每個宿主細胞約10 60份拷貝)，然后抽提重組 PNZ8112質粒，轉化入乳酸乳球菌NZ9800(NIZ0 food research (荷蘭))感受態(tài)細胞中，涂 布含有l(wèi)Oug/ml氯霉素的GM17平板(同樣用氯霉素抗性篩選重組菌)，于30°C培養(yǎng)48-60h， 挑取長出的菌斑擴大培養(yǎng)，抽提質粒，PCR和酶切鑒定抽提的質粒中含有目的基因。將含有陽性重組質粒的乳酸乳球菌轉接到5ml含氯霉素(終濃度為lOug/ml)的 GM17液體培養(yǎng)基中，在30°C、180r/min培養(yǎng)過夜后；按1 :25的比例稀釋至10ml新鮮培養(yǎng)基 中，30°C培養(yǎng)至0D600約為0. 4，然后加入終濃度為10ng/ml乳鏈菌肽nisin (Sigma公司) 誘導目的基因表達2-3h。(3)檢驗目的蛋白首先將菌體用溶菌酶處理，再用超聲波破碎，然后將經(jīng)超聲波破碎處理后的細胞 溶液用70%飽和硫酸銨沉淀后，10000g離心30min，將沉淀溶解于50mMol/L pH6. 0磷酸 緩沖液中，活性炭脫色后用50mMol/L的磷酸緩沖液透析至透析液中檢測不到銨根離子，直 接上 DEAE-Cellulose 52 柱(2cmX60cm，Pharmacia，預先用含 30mMol/L NaCl 的 pH6. 0、 20mMol/L的磷酸緩沖液平衡)，用緩沖體系(含30mMol/L NaCl的20mMol/L pH6. 0磷酸緩 沖液和含300mMol/L NaCl的20mMol/L pH6. 0磷酸緩沖液)進行線性梯度洗脫，先用起始
6緩沖液(含30mMol/L NaCl的20mMol/L pH6. 0磷酸緩沖液)洗柱后，再進行NaCl濃度為 30-300mMol/L的線形梯度洗脫，洗脫流速為12mL/h，用核酸/蛋白檢測儀監(jiān)測收集目的蛋 白，用去離子水透析過夜，再冷凍濃縮后于4°C保存，用常規(guī)Western blotting (Western印 跡法)檢測驗證，檢測方法如下首先用商品化的SST抗原(Sigma產(chǎn)品)免疫兔子，制備用于Westernblotting檢 測的一抗，用商品化的辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG抗體(Sigma產(chǎn)品)為二抗。為了 檢測目的蛋白CTB-SST-M6(基因大小為1674bp)是否被乳酸乳球菌表達，我們用純化的表 達產(chǎn)物和另一種已知SST融合蛋白(沙門氏菌鞭毛蛋白編碼基因(H-ld)_生長抑素，簡稱 H-ld-SST，基因大小為1542bp)做比較，如果用商品SST抗原免疫兔子所制備的一抗既能與 純化產(chǎn)物結合，又能與H-ld-SST蛋白結合，且蛋白分子量大小相符，則證明純化的表達產(chǎn)物 中含目的蛋白CTB-SST-M6。Western blotting結果圖1所示H_ld-SST和純化產(chǎn)物均能與 商品SST抗原免疫兔子所制備的一抗結合，顯示出所對應的蛋白條帶(H-ld-SST分子量為 40 50KD，CTB-SST-M6為50 60KD)，說明CTB-SST-M6融合蛋白被乳酸乳球菌成功表達。3、CTB-SST乳酸乳球菌口服免疫豬后的抗體產(chǎn)生情況隨機選取20只金華豬進行了重組乳酸菌口服免疫，將濃度為lX109cfu/mL的菌 液喂食剛斷奶的仔豬(87日齡)，每次喂食20ml，每周2次，喂食6周。當然可以根據(jù)實際 情況改變菌液濃度，一般選擇1 X 108 1 X 101(lCfU/mL。在首次免疫后6周、12周和19周分別抽取豬血，分離得到豬血清，用于檢測豬SST 抗體產(chǎn)生情況。采用ELISA間接法測定豬血清中的抗體水平，具體步驟如下用0. 5mg/ml的SST抗原(Sigma產(chǎn)品)包被96孔免疫板，每孔加抗原溶液100ml， 48°C包被過夜，然后用含1. 5% BSA(牛血清白蛋白，Sigma產(chǎn)品)的PBST溶液(含0.05% Tween-20的PBS溶液)封閉免疫板，37°C封閉2h。加入稀釋度為1 50的待測豬血清，洗 滌三次，再加稀釋度為1 1000的辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG抗體(Sigma產(chǎn)品)， 然后將10mg3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺(Sigma產(chǎn)品，酶的底物，可在辣根過氧化物酶作用下 顯藍色)溶解在0.025M磷酸鹽檸檬酸緩沖液中并加至免疫板各孔中，每孔50ml。底物顯 色后加0. 2M H2S04終止反應。然后用酶聯(lián)測定儀以波長450nm測定底物顯色后的光吸收 值(0D值)，將測得標本(即免疫豬血清標本)0D值(P)與陰性對照(未免疫豬血清標本) 0D值(N)相比，若P/N值大于或等于2.0，則所測樣本抗體為陽性，豬SST抗體產(chǎn)生情況檢 測結果如下表所示 4、CTB-SST乳酸菌活菌制劑主動免疫對豬生產(chǎn)性能的影響從上述被免疫的20只豬中選取抗體陽性的10只作為免疫組，另選10只未免疫豬 作為對照組。斷奶仔豬經(jīng)上述菌液主動免疫后生長情況良好，無死亡現(xiàn)象，不同階段進行稱 重，同時統(tǒng)計不同飼養(yǎng)日齡段日增重以及飼料轉化率，結果如下表所示本發(fā)明免疫制劑主動免疫對肥育豬體重的影響(單位kg) 同列中不同上標字母表示差異顯著，a, b表示p < 0. 05，a, c表示p < 0. 01。稱重結果顯示肥育期結束時(220日齡)經(jīng)本發(fā)明口服免疫制劑主動免疫的豬體 重比對照組增加12. 11% (P < 0. 01)。本發(fā)明免疫制劑主動免疫對不同日齡段肥育豬日增重的影響(單位kg) 同列中不同上標字母表示差異顯著，a, b表示p < 0. 05，a, c表示p < 0. 01。在整個動物試驗期(87-220日齡，共19周)，免疫組豬的平均日增重提高17. 53% (P < 0. 01)。本發(fā)明免疫制劑主動免疫對不同日齡段肥育豬飼料轉化率的影響 同列中不同上標字母表示差異顯著，a, b表示p < 0. 05，a, c表示p < 0. 01。在整個動物試驗期(87-220日齡，共19周)，免疫組豬的平均飼料轉化率提高 12. 08% (P < 0. 01)。以上數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明所研制的豬CTB-SST乳酸菌活菌制劑能刺激豬產(chǎn)生抗生長 抑素(SST)的抗體，減弱體內生長抑素對豬生長的抑制作用，提高了豬的生長速度和飼料
轉化率。
權利要求
一種轉化子，包括受體菌和轉化到受體菌內部的重組載體，其特征在于所述的受體菌為乳酸乳球菌NZ9800，重組載體的原始載體為pNZ8112，重組載體的外源目的基因包括豬生長抑素基因、霍亂毒素B亞基基因以及細胞壁錨定子M6基因。
2.權利要求1所述的轉化子在免疫阻斷豬內源生長抑素作用中的應用。
3.一種利用權利要求1所述的轉化子制備的豬口服免疫制劑，其特征在于包括培養(yǎng) 基和分泌了所述外源目的基因產(chǎn)物的轉化子。
4.根據(jù)權利要求3所述的豬口服免疫制劑，其特征在于所述的培養(yǎng)基為GM17培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權利要求3所述的豬口服免疫制劑，其特征在于所述的轉化子濃度為 1 X 108cfu/mL 1 X 10lclcfu/mL。
6.根據(jù)權利要求3所述的豬口服免疫制劑的制備方法，包括以下步驟將轉化子置于 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D6(K1為0. 3 0. 5，加入乳酸菌肽繼續(xù)培養(yǎng)2 3h。
7.根據(jù)權利要求6的制備方法，其特征在于所述的乳酸菌肽加入后濃度為10 20ng/mLo
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉化子，包括受體菌和轉化到受體菌內部的重組載體，所述的受體菌為乳酸乳球菌NZ9800，重組載體的原始載體為pNZ8112，重組載體的外源目的基因包括豬生長抑素基因、霍亂毒素B亞基基因以及細胞壁錨定子M6基因。本發(fā)明轉化子可以通過口服方式進入豬腸道，與注射免疫相比，降低直接與循環(huán)系統(tǒng)接觸引起的毒性，增加疫苗的安全性。選用抗原基因/免疫增強因子聯(lián)合免疫，增強了機體免疫應答，提高了免疫效果。
文檔編號C12R1/01GK101892189SQ20101021904
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月5日 優(yōu)先權日2010年7月5日
發(fā)明者牛冬 申請人:浙江大學