專利名稱：一種葵花籽多肽的制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葵花籽的深加工，具體是一種葵花籽多肽的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代研究表明，很多用蛋白酶水解的植物多肽具有抗氧化、清除自由基或阻斷亞 硝化合成等功能，可以作為食品或保健品的原料。例如專利CN101284872 (200810064296. 8) 公開的玉米蛋白制備抗氧化活性肽；專利CN101228918 (200710017281. 1)公開的核桃多肽 抗氧化粉。有些小分子多肽透皮吸收效果好，涂抹到皮膚上，不但能抵抗化妝品自身的氧 化，而且能夠清除人體自由基，抑制人體膠原蛋白和彈性蛋白的降解，降低皮膚衰老進(jìn)程， 從而起到抗皺、保持肌膚彈性的效果。例如日本的美能多化妝品株式會社的研究人員從大 米的米膠蛋白中提取出一種新型多肽類物質(zhì)，能有效抑制皮膚皺紋、松弛等現(xiàn)象，可以作為 功能性化妝品基料。植物多肽的抗氧化活性和安全性使其成為今后功能性食品和化妝品開 發(fā)的方向之一。向日葵是我國重要的油料作物之一，每年的葵花籽產(chǎn)量約為420多萬噸?？ㄗ?蛋白營養(yǎng)價值高，其氨基酸組成，除賴氨酸的含量較低外，其余必需氨基酸均達(dá)到或高于聯(lián) 合國糧農(nóng)組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)?？ㄗ阎械鞍缀繛?9% 43%，其中包括清蛋白、球蛋白、谷 蛋白和醇溶蛋白等。長期以來，葵花籽榨油后的餅粕絕大多數(shù)用作肥料或者飼料，沒有得到 進(jìn)一步的加工利用。國內(nèi)外關(guān)于葵花籽蛋白制取活性多肽的研究報道較少，而且大多采用 單酶水解方式，其水解度較低，小分子多肽的得率也較低，如任健等人采用堿性蛋白酶、風(fēng) 味蛋白酶或者1. 398中性蛋白酶對葵花蛋白進(jìn)行單酶水解研究，水解度僅達(dá)到8 12. 5% (任健，鄭喜群.中性蛋白酶對葵花分離蛋白水解作用的研究.中國油脂，2007，8;劉歡，任 健.堿性蛋白酶對脫脂葵花粕酶解條件的研究.糧油加工，2008，1 ；杜國軍，任健.風(fēng)味蛋 白酶對脫脂葵花粕酶解條件的研究.糧油加工，2010，2)，還有采用木瓜蛋白酶(白羽.酶 法制備葵花籽肽的研究.食品與機(jī)械，2007，10)或1.398枯草桿菌中性蛋白酶(陳潔.葵 花濃縮蛋白的酶法改性研究.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2008，5)對葵花籽蛋白進(jìn)行水解，水解度僅為 4 15.6%。另外張國華采用堿性蛋白酶和胃蛋白酶兩步水解制備葵粕多肽(葵粕多肽抗 皮膚光老化作用的研究.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22)，其水解時間過長，能耗較大，不 適用于工業(yè)化生產(chǎn)。目前超聲波輔助技術(shù)已運(yùn)用在生物酶解解蛋白過程中，如專利 CN101457247 (200810207956. 3)公開的用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和V8蛋白酶等蛋白酶中 的一種或多種酶進(jìn)行快速水解蛋白質(zhì)的方法；專利CN101003826 (200610097286. 5)公開的 采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶或木瓜蛋白酶及這些酶的組合水解紫菜蛋白前，先用 超聲波預(yù)處理蛋白酶液后再混入紫菜溶液中進(jìn)行酶解，明顯縮短水解時間，但是，這種連續(xù) 使用單一頻率的超聲波輔助酶解的方法，往往會造成酶活力下降、蛋白質(zhì)作用位點(diǎn)被破壞 等問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種時間短，能耗較低，酶解效 率高，小分子多肽得率大的葵花籽多肽的制備方法以及葵花籽多肽在功能食品和化妝品中 的用途。本發(fā)明提供的一種葵花籽多肽的制備方法，包括如下步驟1)、提取蛋白葵花籽經(jīng)粉碎、脫脂后，用堿溶酸沉法提取葵花籽分離蛋白，真空干 燥后備用；2)、堿性蛋白酶水解稱取葵籽分離蛋白，按4% 8%的質(zhì)量百分濃度溶于水，加 入堿性蛋白酶，加酶量為分離蛋白的1. 5 % 2. 5 %，混合均勻，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0 9. 5，在超聲波發(fā)生器中恒溫50 60°C，先于20 28KHz超聲頻率水解2_3h，再于28 40KHz的超聲頻率下水解l_3h，在兩階段超聲水解過程中，每隔5-12min超聲處理l_4min ；3)、復(fù)合酸性蛋白酶水解上述處理液用HCl調(diào)節(jié)pH 2. 5 4. 5，加入復(fù)合酸性蛋 白酶，加酶量為分離蛋白的4% 6%，控制溫度在35 45°C，在24 40KHz超聲頻率下水 解4 6h，期間每隔6-12min超聲處理l-3min，沸水浴5 10分鐘滅酶，經(jīng)微濾、超濾膜分 離純化，得到分子量在3000Da以下多肽占90%以上的產(chǎn)品。所述的復(fù)合酸性蛋白酶是米曲霉酸性蛋白酶、宇佐美曲霉酸性蛋白酶、青霉產(chǎn)酸 性蛋白酶、黑曲霉酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意兩種或三種。在本發(fā)明的葵花籽蛋白水解過程中，之所以要采用不同頻率的超聲波進(jìn)行間斷處 理，其一，是因為超聲波長時間作用，可能會造成酶的失活，導(dǎo)致酶解效能降低；其二，在蛋 白酶酶解反應(yīng)初期采用較低頻率、較長時間超聲波處理，主要是為了促進(jìn)酶與底物之間的 相互作用和接觸面積；而隨著水解時間的加長，會出現(xiàn)較多難水解的疏水性肽鍵，此時用較 高頻率的超聲波有利于這類肽鍵的斷裂，但處理時間不宜過長，每次處理時間比酶解初期 縮短。在第二階段-復(fù)合酸性酶水解過程中采用不同的超聲波頻率，還要兼顧不同組合的 酸性蛋白酶有不同的超聲波頻率適應(yīng)范圍，超出一定的超聲波頻率范圍，酶解活性會下降。葵花籽多肽在制備功能食品和化妝品中的應(yīng)用體外試驗發(fā)現(xiàn)，該葵花籽多肽產(chǎn)品對羥自由基(· 0H)、超氧陰離子自由基(O2 ·) 和DPPH ·自由基的清除率分別達(dá)到55. 37% 98. 79%,55. 43% 96. 87%和48. 7% ~ 73. 56 %,對亞硝酸鹽的清除率達(dá)到68. 4% 98. 5 %，對亞硝胺合成的阻斷率達(dá)到 52. 1 % 90. 75 %，另外對紅細(xì)胞氧化溶血的抑制率達(dá)到43. 02 % 81. 4 %，與Vc和谷胱甘 肽相比，葵花籽多肽的抗氧化活性較強(qiáng)，可作為一種高效天然抗氧化劑，用于功能食品和化 妝品中的添加劑。以D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠為模型，灌胃葵花籽多肽，可以顯著降低小鼠血清中 丙二醛含量(P <0.01)，并能提高皮膚組織中羥脯氨酸的含量(P <0.01)，具有延緩皮膚 衰老、恢復(fù)皮膚彈性的效果，可以添加到化妝品，起到美容護(hù)膚的作用；以四氯化碳誘導(dǎo)小 鼠化學(xué)性肝損傷為模型，灌胃葵花籽多肽，能顯著降低小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨 酶的活力(P <0.01)以及血清中丙二醛的含量(P < 0. 01)，葵籽多肽對于化學(xué)性肝損傷具 有保護(hù)作用，可以作為一種安全的保肝保健品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果1.本發(fā)明采用酸性復(fù)合蛋白酶進(jìn)行第二階段酶解，而這種復(fù)合酸性酶水解方式，可以得到更多的小分子葵花籽多肽。與用堿性蛋白酶和胃蛋白酶組合的兩階段酶解葵花籽 蛋白相比，3000Da以下小肽所占比例含量高，制備酶解效率高，并且抗氧化功能更強(qiáng)，。2.本發(fā)明針對堿性蛋白酶和復(fù)合酸性蛋白酶的特性不同，分別采用不同頻率的超 聲波進(jìn)行間斷處理，有效地提高了酶解效率。同傳統(tǒng)不加超聲波輔助的酶解工藝相比，葵花 籽蛋白水解度提高了 15 25 %，多肽得率提高10 20 %，最大多肽得率可以達(dá)到96. 7 %。 同時也可縮短水解葵花籽蛋白時間12 30%，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。3.本發(fā)明制備的葵花籽多肽具有廣泛的應(yīng)用價值，可用于功能食品、化妝品等領(lǐng) 域，葵花籽多肽具有明顯的清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的作用，以及 抑制紅細(xì)胞氧化溶血的抗氧化活性，還有消除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的作用，而且動 物喂養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，該葵花籽多肽具有延緩皮膚衰老、提高皮膚中羥脯氨酸的含量，恢復(fù)皮膚 彈性的美容效果；還能起到保護(hù)肝臟，預(yù)防化學(xué)性肝損傷等多種保健作用。


圖1是實施例1制備的葵花籽多肽的Superdex G_75凝膠色譜圖
具體實施例方式實施例1將葵花籽粉碎、脫脂后，用堿溶酸沉法提取分離蛋白，取20g分離蛋白按溶于 250mL水中，調(diào)pH9. 0，加入0. 3g堿性蛋白酶，在超聲波功率密度為0. 3ff/cm2的超聲波發(fā) 生器中水浴50°C。于24KHz的超聲頻率水解2h，期間每隔12min超聲處理3min ；后2h于 36KHz的超聲頻率處理，每隔8min超聲處理lmin。調(diào)節(jié)pH到2. 5 3. 5，溫度38°C，加入0. 9g米曲霉酸性蛋白酶和1. Og胃蛋白酶， 混合均勻，先用24KHz頻率水解3h，后用36KHz頻率超聲水解2h，此階段每隔IOmin超聲處 理3min，最后沸水浴中滅酶8min，該樣品水解度為17. 93%，多肽得率為92. 19%。樣品的 SuperdexG-75凝膠色譜圖見圖1，圖中共有P1 P6有6個吸收峰，SuperdexG-75凝膠色譜 分析得到相對分子量Mr與洗脫體積Ve的回歸方程IogMr = -0. 1809Ve+6. 5617，由此計算 得知多肽樣品小于3000Da的多肽含量在90%以上。酶解液經(jīng)0. 22 μ m的微濾膜和3000Da 的超濾膜分離純化，得到分子量小于等于3000Da的葵花籽多肽產(chǎn)品。經(jīng)體外試驗測定，此產(chǎn)品對亞硝酸鹽的清除率達(dá)到72. 8%，對亞硝胺合成的阻斷 率為67. 9% ；取小鼠紅細(xì)胞制成紅細(xì)胞懸液，加入葵花籽多肽，其對紅細(xì)胞氧化溶血抑制率 達(dá)到80. 23%。把該產(chǎn)品以400、600和800mg/kg體重的劑量對四氯化碳誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損 傷小鼠模型進(jìn)行灌胃，在灌胃8周后，顯著降低小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活 力(P <0.01)，以及血清中丙二醛含量(ρ <0.01)，能起到保肝護(hù)肝的作用。實施例2葵花籽粉碎、脫脂后，用堿溶酸沉法提取分離蛋白。取分離蛋白20g溶于300ml 水中，調(diào)pH8. 5，加入0. 4g堿性蛋白酶，在功率密度為0. 2 0. 47ff/cm2的超聲波發(fā)生器中 60°C水浴，于20KHz超聲頻率水解3h，期間每隔IOmin超聲處理3min，再于28KHz的超聲頻 率水解2h，期間每隔IOmin超聲處理2min ；用HCl調(diào)pH4. 0，加入米曲霉酸性蛋白酶和黑曲霉酸性蛋白酶各0. 85g，于28KHz超聲頻率水解2h ；再在32KHz的超聲頻率下水解2h，水解過程中每隔6min超聲處理2min ； 最后沸水浴中滅酶lOmin。經(jīng)過兩階段水解的蛋白水解度為17. 7%，多肽得率為90. 44% 0 酶解液經(jīng)過0.22 μ m的微濾膜和3000道爾頓(Da)的超濾膜分離純化，得到分子量小于等 于3000Da的葵花籽多肽產(chǎn)品。經(jīng)測定，該產(chǎn)品其對· OH、O2 ·和DPPH ·的清除率分別達(dá)到83. 2 %、78. 6 %和 70. 5%，對亞硝酸鹽的清除率達(dá)到81. 7%，對亞硝胺合成的阻斷率達(dá)到89. 1%;取小鼠紅細(xì) 胞制成紅細(xì)胞懸液，加入葵花籽多肽，其對紅細(xì)胞氧化溶血抑制率達(dá)到76. 5 %。把該產(chǎn)品以 400和600mg/kg體重的劑量對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠進(jìn)行灌胃，在灌胃8周后，測定小 鼠血清中丙二醛含量相對于模型組分別降低30%和35%，皮膚中羥脯氨酸含量相對于模 型組分別提高了 22%和58. 7%0實施例3葵花籽粉碎、脫脂后，用堿溶酸沉法提取分離蛋白。取20g分離蛋白溶于400mL水 中，調(diào)pH8. 0，加入堿性蛋白酶0. 5g，在55°C超聲波發(fā)生器中于28KHz的超聲頻率處理3h， 期間每隔IOmin超聲處理3min，在于32KHz的超聲頻率處理lh，每隔8min超聲處理lmin。調(diào)節(jié)pH 3. 0，加入米曲霉酸性蛋白酶、黑曲霉酸性蛋白酶和胃蛋白酶各0.8g，在 溫度36°C，24 32KHz超聲頻率下水解5h，期間每隔IOmin超聲處理2min。水解結(jié)束后沸 水浴滅酶IOmin。該樣品水解度為21 %，多肽得率為96. 75%,酶解液經(jīng)0. 22 μ m的微濾膜 和3000Da的超濾膜分離純化，得到分子量小于等于3000Da的葵花籽多肽產(chǎn)品。經(jīng)測定，此產(chǎn)品對·0Η、02 和DPPH ·的清除率分別達(dá)到97. 2%,95. 6%和73. 5%, 具有顯著的抗氧化活性。把該產(chǎn)品以400和600mg/kg體重的劑量對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰 老小鼠進(jìn)行灌胃，在灌胃8周后，測定小鼠血清中丙二醛含量相對于模型組分別降低34% 和45%，皮膚中羥脯氨酸含量相對于模型組提高45%和60. 1%，能起到延緩皮膚衰老的作 用。實施例4葵花籽粉碎、脫脂后，用堿溶酸沉法提取分離蛋白。取20g分離蛋白溶于450mL水 中，調(diào)pH8. 0，加入堿性蛋白酶0. 45g，在58°C超聲波發(fā)生器中于24KHz的超聲頻率處理3h， 期間每隔8min超聲處理3min，在于28KHz的超聲頻率處理lh，每隔8min超聲處理2min。調(diào)節(jié)pH 3. 5，加入宇佐美曲霉酸性蛋白酶和黑曲霉酸性蛋白酶各0.9g，在溫度 40°C，于24KHz超聲頻率水解2h ；再在32KHz的超聲頻率下水解lh，水解過程中每隔8min超 聲處理2min ；水解結(jié)束后沸水浴滅酶lOmin。該樣品水解度為18. 5%，多肽得率為91. 3%， 酶解液經(jīng)0. 22 μ m的微濾膜和3000Da的超濾膜分離純化，得到分子量小于等于3000Da的 葵花籽多肽產(chǎn)品。經(jīng)測定，此產(chǎn)品對亞硝酸鹽的清除率達(dá)到78. 4%，對亞硝胺合成的阻斷率 達(dá)到81. 3% ；取小鼠紅細(xì)胞制成紅細(xì)胞懸液，加入葵花籽多肽，其對紅細(xì)胞氧化溶血抑制率 達(dá)到77. 5%，具有顯著的抗氧化活性。把該產(chǎn)品以400、600和800mg/kg體重的劑量對四氯 化碳誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷小鼠模型進(jìn)行灌胃，在灌胃8周后，顯著降低小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn) 氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活力(P < 0. 01)，以及血清中丙二醛含量(ρ < 0. 01)，能起到保肝護(hù) 肝的作用。實施例5葵花籽粉碎、脫脂后，用堿溶酸沉法提取分離蛋白。取20g分離蛋白溶于500mL水中，調(diào)pH9. 0，加入堿性蛋白酶0. 35g，在60°C超聲波發(fā)生器中于20KHz的超聲頻率處理3h， 期間每隔8min超聲處理3min，在于36KHz的超聲頻率處理lh，每隔8min超聲處理lmin。
調(diào)節(jié)pH4. 0，分別加入0. 9g青霉產(chǎn)酸性蛋白酶和0. 85g胃蛋白酶，混合均勻，在 溫度38°C，于28KHz超聲頻率水解3h ；再在36KHz的超聲頻率下水解lh，水解過程中每隔 IOmin超聲處理Imin ；水解結(jié)束后沸水浴滅酶lOmin。該樣品水解度為17. 95%，多肽得率 為91. 18%，酶解液經(jīng)0. 22μπι的微濾膜和3000Da的超濾膜分離純化，得到分子量小于等于 3000Da的葵花籽多肽產(chǎn)品。把該產(chǎn)品以400、600和800mg/kg體重的劑量對四氯化碳誘導(dǎo) 的化學(xué)性肝損傷小鼠模型進(jìn)行灌胃，在灌胃8周后，顯著降低小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷 草轉(zhuǎn)氨酶的活力(P < 0. 01)，以及血清中丙二醛含量(ρ < 0. 01)，能起到保肝護(hù)肝的作用。
權(quán)利要求
一種葵花籽多肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)、葵花籽經(jīng)粉碎、脫脂后，用堿溶酸沉法提取葵花籽分離蛋白，真空干燥后備用；2)、稱取葵籽分離蛋白，按4％～8％的質(zhì)量百分濃度溶于水，加入堿性蛋白酶，加酶量為分離蛋白的1.5％～2.5％，混合均勻，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0～9.5，在超聲波發(fā)生器中恒溫50～60℃，先于20～28KHz超聲頻率水解2 3h，再于28～40KHz的超聲頻率下水解1 3h，在兩階段超聲水解過程中，每隔5 12min超聲處理1 4min；3)、上述處理液用HCl調(diào)節(jié)pH 2.5～4.5，加入復(fù)合酸性蛋白酶，加酶量為分離蛋白的4％～6％，控制溫度在35～45℃，在24～40KHz超聲頻率下水解4～6h，期間每隔6 12min超聲處理1 3min，沸水浴5～10分鐘滅酶，經(jīng)微濾、超濾膜分離純化，得到葵花籽多肽產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的一種葵花籽多肽的制備方法，其特征在于所述的復(fù)合酸性蛋白 酶是米曲霉酸性蛋白酶、宇佐美曲霉酸性蛋白酶、青霉產(chǎn)酸性蛋白酶、黑曲霉酸性蛋白酶和 胃蛋白酶中的任意兩種或三種。
3.如權(quán)利要求1所述的一種葵花籽多肽的制備方法制得的葵花籽多肽在制備功能食 品中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的一種葵花籽多肽的制備方法制得的葵花籽多肽在制備化妝品 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種葵花籽多肽的制備方法，步驟包括將葵花籽分離蛋白加水溶解，采用堿性蛋白酶和復(fù)合酸性蛋白酶兩階段酶水解葵花籽分離蛋白制備多肽，在水解過程中，實施超聲波間斷變頻輔助酶解處理；酶解液經(jīng)微濾、超濾后得到葵花籽多肽。本發(fā)明針對不同的蛋白酶采用不同的超聲波頻率和處理時間，有效提高了葵花籽蛋白的水解度和多肽得率，比傳統(tǒng)工藝的生產(chǎn)效率明顯提高。制得的產(chǎn)品具有清除自由基、消除亞硝酸鹽、阻斷亞硝胺合成、抑制紅細(xì)胞氧化、美容護(hù)膚和抗肝損傷等多種保健功能，可用于制備功能食品和化妝品。
文檔編號A23J3/34GK101904406SQ201010218910
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者王常青, 王海鳳 申請人:山西大學(xué)